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ASOCIACIÓN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN

BAUTISTA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOQUÍMICA Y NUTRICION

GUIA DE PRACTICAS

Dr. Carlos Ramírez Velasco


Dr. José Chuquipiondo Ludeña
Dr. Jesús Díaz Franco
Dr. Félix Tipacti Alvarado

LIMA – PERU

2005
NORMAS DE SEGURIDAD Y BIOSEGURIDAD

Todo el personal que trabaje en un laboratorio de Bioquímica, Fisiológico, Microbiológico,


Biológico en general, o ingresa a él, debe seguir reglas de seguridad y bioseguridad. Las
normas de seguridad son obligatorias y son esenciales no solamente para la para la
acreditación académica, sino porque consisten en practicas que otorgan seguridad y
protección al personal, alumnos e investigadores que trabajan en los laboratorios
bioquímicos, fisiológicos, bacteriológicos, biológicos, químicos, etc. Muy especialmente en
el campo médico donde trabajamos con muestras ó material biológico que es considerado
potencialmente infeccioso o infeccioso. La máxima seguridad y protección es necesaria en
estos casos.

PRACTICAS GENERALES
Se prohíbe fumar, comer y aplicarse cosméticos, para evitar la diseminación de agentes
infecciosos o productos químicos tóxicos de las manos hacia la boca. Con el fin de evitar el
contacto con agentes infecciosos o diseminarlos, debe utilizarse alguna prenda protectora
sobre la ropa, como el guardapolvo, mandil, ó la bata de laboratorio. Estas prendas de
protección externa no deben usarse fuera del laboratorio. Los zapatos han de ser de punta y
talón cerrado. No es conveniente que las personas que trabajan en el laboratorio usen lentes
de contacto debido al desprendimiento de vapores y a las salpicaduras que pueden
producirse. Los lentes de contacto inhiben el lagrimeo y permiten que las sustancias
permanezcan más tiempo en la córnea.

Se recomienda el uso de lentes de protección o protectores para la cara a las personas que
usan lentes de contacto, en particular si hay alto riesgo de vapores, aerosoles o salpicaduras.
La joyería de tipo colgante, el cabello largo y barba son riesgosos, ya que es posible que
entren en contacto con muestras u otras superficies, o se enreden o queden atrapados en
instrumentos con movimiento, como máquinas rotatorias o centrífugas . Se prohíbe
estrictamente pipetear con la boca todo tipo de muestra, reactivo, agua o cualquier otra
sustancia biológica.

LAVADO DE MANOS

El lavado de manos es una de las principales maneras de evitar la diseminación de agentes


infecciosos. Aunque se utilicen guantes, el lavado de manos es necesario. porque es posible
que éstos tengan huecos microscópicos. Al tratar con pacientes, es necesario lavarse las
manos tras atender a cada uno de ellos aunque se utilicen guantes.

LIMPIEZA

No debe permitirse que la basura, los desperdicios biológicos, infecciosos, y el material de


vidrio sucio se acumulen en grandes cantidades en el laboratorio. Los recipientes con
muestras de desecho y agentes etiológicos deben taparse cuando no se estén empleando. Es
necesario limpiar con frecuencia las superficies de trabajo con algún desinfectante al
comenzar y terminar cada turno. El personal de laboratorio fisiològico es responsable de
mantener el área de trabajo limpia y sanitaria, aunque haya servicio de limpieza adicional por
parte de la institución.

ETIQUETAS Y SEÑALES

Todos los recipientes que contienen productos químicos deben etiquetarse con claridad,
indicando el nombre del producto y cualquier precaución para su manejo. Las áreas en que
se almacenan productos inflamables, peligrosos o tóxicos y carcinógenos, o en las cuales se
utilizan, deben estar marcadas claramente. Las áreas en que se almacenan o analizan sangre
o líquidos corporales deben estar marcadas claramente con el signo de riesgo biológico.

DESECHO DE DESPERDICIOS

Existen normas de la OSHA con respecto al desecho de productos biològicos. El desecho de


materiales biológicos, como desperdicios infecciosos, se examina y regula en la actualidad
por leyes específicas del Ministerio de Salud Pública.
AGUJAS Y OBJETOS PUNTIAGUDOS

Las agujas y otros objetos puntiagudos constituyen un riesgo físico y de


infección potencial para el personal de laboratorio fisiològico.. Todas las
agujas desechables y demás objetos punzantes deben colocarse en un
recipiente resistente a la perforación y a prueba de fugas, marcado con
el símbolo de riesgo biológico.

Estos recipientes se descartan, siguiendo las políticas de la institución, cuando están llenos
hasta la mitad o las tres cuartas partes. La mayoría de las instituciones incineran los
recipientes que contienen objetos punzantes.Inmediatamente después de usada una aguja
deberá incinerarse y para ello existen en la actualidad equipos especiales incineradores de
agujas llamados destructores de agujas. Nunca deberá volverse a colocar la tapa de las
agujas a menos que se utilice algún dispositivo como pinzas, diseñadas para este fin, para
evitar la punción cutánea accidental. Las agujas nunca deben cortarse, ya que esto puede
provocar salpicaduras de sangre o de otros líquidos al medio.

SEGURIDAD CONTRA INCENDIOS

TIPOS DE INCENDIOS

En el laboratorio Bioquímico Fisiológico u otros laboratorios biológicos se requieren


líquidos inflamables y combustibles para ciertos procedimientos y en ellos también existe el
riesgo potencial de incendios eléctricos y de basura. El científico del laboratorio debe
comprender estos peligros y la manera de afrontarlos en caso de urgencia. Los incendios se
clasifican de la clase A hasta la D.

Los incendios de clase A ocurren con combustibles ordinarios, como madera o papel; los de
la clase B ocurren con líquidos inflamables; en los de la clase C participan circuitos
eléctricos energetizados, sin importar el combustible, y los de la clase D, son producidos por
metales combustibles como el sodio. Para cada tipo de incendio se requiere un extinguidor
diferente y adecuado, con el fin de controlar de manera eficiente el fuego y evitar que se éste
se extienda.

EXTINGUIDORES

Los EXTINGUIDORES contra incendios contienen diferentes sustancias y están marcados


según el tipo de incendio para el que deben emplearse. Los extinguidores clase A están
llenos de agua y nunca deben utilizarse para incendios de tipo eléctrico, ya que el agua
puede conducir la electricidad de regreso a la persona que tiene el extintor en las manos. Los
extinguidores clase B contienen productos químicos secos, espuma acuosa que forma una
capa (AFFF) o dióxido de carbono. Los extinguidores clase C están llenos de dióxido de
carbono o Halon; los de la clase D de un polvo seco especial que contiene un enlazante
termoplástico que permite que el agente forme una corteza sólida al calentarse. Hay
extinguidotes que pueden emplearse para incendios de clases A a C.

Contienen un polvo seco y pueden utilizarse con eficacia y seguridad para las tres clases de
incendios. Generalmente este tipo de extinguidores es el que se compra para uso en el hogar
o en las oficinas. Sin embargo, si se emplea para incendios de equipo eléctrico en el
laboratorio, es probable que sea difícil o imposible eliminar posteriormente dicho polvo de
los instrumentos. Por tanto, se recomiendan los extinguidores de dióxido de carbono o
Halon para incendios de equipo eléctrico.

CAUSAS Y PREVENCION
Las causas fundamentales de incendios en el laboratorio son descuido, falta de conocimiento
acerca de los productos químicos que se utilizan, permitir que se efectúen procedimientos
sin la vigilancia adecuada, sobrecarga de circuitos y llamas de gas abiertas. Es necesario
impartir periódicamente conferencias para instrucción sobre seguridad en el trabajo, con el
fin de recordar a los empleados la manera segura de proceder para evitar incendios y otros
tipos de accidentes así como refrescarles buen el uso del extinguidor.

En caso de que se produzca un incendio es necesario ponerse en contacto con el


departamento de bomberos o solicitar ayuda antes de intentar extinguirlo, Se pierde tiempo
vaso cuando se trata de apagar el incendio primero, se ve e es imposible y después se solicita
ayuda. Los pasos que deben seguirse en caso de incendio son:

1. Rescatar a cualquier persona que se encuentre en peligro.


2. Aislar el incendio cerrando alguna puerta.
3. Solicitar ayuda.
4. Intentar extinguido.
5. Evacuar las instalaciones en caso de que no se pueda apagar el fuego.

Por supuesto, cuando hay varias personas presentes, estos pasos pueden llevarse a cabo de
manera simultánea en un esfuerzo conjunto. Es necesario adiestrar al personal de laboratorio
en el uso de los extintores centra incendios. En general, el departamento de incendios de la
localidad o el comité de seguridad de la institución proporciona este entrenamiento.Revisar
con frecuencia la fecha de expiración de los extinguidotes y renovarlos.

SEGURIDAD QUIMICA

HOJA DE DATOS SOBRE SEGURIDAD DE MATERIALES

En agosto de 1987 la OSHA enmendó la norma Federal Hazard Communication Standard


-29CFR 1919.1200 (Right to Know/HCS Standard), haciéndola extensiva a todas las in-
dustrias, incluyendo las instalaciones para el cuidado de la salud. Esta norma establece que
los responsables de cada área determinen si se utilizan productos químicos peligrosos en el
trabajo y proporcionen a los empleados hojas con datos de seguridad en el uso del material
riresgoso y marquen adecuadamente los recipientes que contienen el producto, indicando el
riesgo, y se mantendrá una lista de productos químicos peligrosos , es decir, un inventario de
productos químicos, y proporcionen al empleado información y entrenamiento, y
desarrollen un programa de comunicación de riesgos por escrito.

Información que contiene la hoja de datos de seguridad para cada material ó grupo de
sustancias relacionadas ,de uso en Laboratorio fisiológico y otros Laboratorios biológicos:

1. Identificación del producto químico ( nombre químico,y sinónimo y/o nombre vulgar.)
2. Ingredientes peligrosos
3. Datos físicos
4. Datos de incendios y explosiones
5. Información de riesgos para la salud
6. Datos de reactividad
7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho
8. Información de protección personal
9. Precauciones especiales y comentario

SEGURIDAD BIOLOGICA

PROTECCION PERSONAL

La dispersión epidémica del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha revivido la


preocupación acerca de las enfermedades que se transmiten por la sangre entre las personas
que trabajan en el laboratorio. Se sabe que las personas que laboran en los laboratorios
médicos en general, fisiológicos, ó biológicos y otros relacionados con la salud en general,
conforman un grupo de alto riesgo para infecciones por virus de hepatitis B (RBV)
relacionadas con el trabajo y virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En 1987 los Centros
para el Control de las Enfermedades Trasmisibles (CDC) de USA., publicaron
recomendaciones para proteger a las personas que trabajan al cuidado de la salud y a otras
de adquirir la infección por HIV y se actualizaron nuevamente en 1988. Entre las
recomendaciones se aconseja que "se tomen precauciones congruentes al manejar sangre y
líquidos corporales de todos los pacientes y las muestras que se obtengan".

Esto se conoce como precauciones universales. Las recomendaciones incluyen el uso de


equipo para protección personal, como guardapolvos, mandiles, batas, guantes descartables
y protectores para los ojos al manipular sangre y líquidos corporales en el laboratorio. La
revisión de los CDC en 1988 recomendó usar equipo de protección personal para manejar
todas las sustancias biológicas y animales. Deben tratarse todas las secreciones y excre-
ciones corporales como potencialmente infecciosas, ya que hay otras enfermedades además
de HBV y HIV que se transmiten a través de diversas sustancias del organismo y de los
animales..
En 1991 la OSHA ( Occupational Safety and and Health Administration, de USA.) publicó
una Norma final en relación a la exposición ocupacional a patógenos que se transmiten por
la sangre (Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens). Esta regla indica que el patrón
debe proporcionar equipo de protección personal que no permita que los materiales poten-
cialmente infecciosos entren en contacto con la ropa, la piel, los ojos y la boca del trabajador
en condiciones normales de uso. La regla también indica la manera correcta de disponer de
objetos punzantes y otros desperdicios con riesgo biológico y señala la necesidad de
administrar la vacuna de HBV y el tratamiento tras alguna exposición a todos los empleados
que corran este riesgo.
Además de describir equipo de protección personal, dicha norma incluye instrucciones para
el lavado de manos, transporte de muestras, uso de pipetas, forma de recoger derrames,
desecho de desperdicios y descontaminación del equipo.
DERRAMES
Es muy importante desarrollar y tener políticas escritas y procedimientos para instruir a los
alumnos y a los empleados acerca de la manera de manejar derrames químicos y biológicos.
Existen en el comercio estuches con insumos para ambos tipos de derrames.. Si no existen
tales normas en la institución, el laboratorio debe desarrollarlas con el fin de asegurar el
ambiente de trabajo.
Es necesario que las personas que limpian algún derrame biológico utilicen guantes
descartables y bata de laboratorio. Se colocan toallas desechables sobre el derrame y se echa
desinfectante ( puede ser lejía diluida al 10% ó sol de fenol al 3% sobre ellas. Tras dejarlo
reposar 30 minutos, se recoge la sustancia y el desinfectante con material absorbente (los
cojinetes absorbentes son útiles para derrames grandes). A continuación se coloca el
material contaminado en un recipiente para desechos biológicos : bolsas de plástico
resistente de color rojo .Después de absorber la mayor parte de material, el área se limpia
con un desinfectante de fuerza intermedia o alta, por ejemplo, dilución de Lejía 1:10. La
solución desinfectante se absorbe con material desechable. El área se enjuaga con agua y se
seca para evitar que quede resbalosa. Es conveniente preparar un conjunto de utensilios para
limpiar derrames con riesgo biológico que contenga todos los materiales necesarios para
efectuar la limpieza de este tipo y tenerlo a la mano en el laboratorio en que se manejan
dichas muestras.

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO


DURANTE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO
1. Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y
responsabilidad.
2. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo
y distintivo de la Universidad.
3. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo
lapiceros y cuadernos.
4. Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.
5. Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las
indicaciones de los profesores de práctica sobre el uso del material y
equipos de laboratorio, así como el orden, limpieza y seguridad que
debe mantenerse.
6. Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un
único informe, el cual consta de las siguientes partes:
- Carátula.
- Objetivos.
- Marco Teórico.
- Desarrollo Experimental.
- Discusión de los resultados.
- Conclusiones.
- Cuestionario.
- Bibliografía
Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y
grupo
respectivo.
7. El inicio de la práctica es en la hora exacta programada. Se tendrá una
tolerancia de 10 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podrá
ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerará como una
inasistencia y no tendrá derecho a nota de informe de prácticas.
8. Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los
grupos, calificándose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que
acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota práctica.
9. Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual
pertenecerá a lo largo del semestre académico.
10. Por cada mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará
cargo del material y equipos recibidos así como de la presentación de
los informes.
11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el
responsable de mesa informará del hecho al profesor de prácticas,
TODO El GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAÑO CAUSADO, y deberá
repararlo a la brevedad posible, no más de una (01) semana después
del incidente.
12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el
fin de entregarlo en las mismas condiciones en las que fueron recibidos,
caso contrario se le descontará un punto en la nota de informe a todo el
grupo.
13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la
persona encargada del laboratorio.
14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y
limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.
Practica No. 2

ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES:
Se denomina Análisis Espectrofotométrico al conjunto de métodos de
análisis cuantitativos que se fundamentan en la medición de la
intensidad de la luz transmitida a través de una solución coloreada, ya
sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han
hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.

Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una
parte de la radiación queda absorbida por las moléculas del soluto
coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luz transmitida,
It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.

Io It

Luz incidente Luz transmitida

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en


forma selectiva determinadas radiaciones luminosas unas mas que
otras dejándolas pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de
dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina
“longitud de máxima absorción” o “lambda máximo”.

Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad


de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en
relación con el aumento del número de moléculas que se interpongan
entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo
con la concentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene
la solución, estos factores están considerados en la “Ley de Lambert y
Beer”, que rige los principios de la colorimetría y cuyas formas de
expresión son:

Log (Io/It) = E I c = A =
D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
It = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la
naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda.
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentración de la solución.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la
Transmitancia (T) y la relación entre ambas es logarítmica.
CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION
PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo


de un fotocolorìmetro, existen dos formas:
- Método de la curva standard o curva de calibración.
- Factor de calibración.

a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios


standares de concentraciones conocidas y progresivas para
luego construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el
que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las
concentraciones en las abcisas (Eje X). En la recta obtenida
(Función lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad
óptica de la muestra problema, hallando la concentración de la
misma en el eje de las abcisas.

b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calbraciòn es un


tèrmino que se relaciona con la concentración de una sustancia
con su absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una
sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).

Asì tenemos:

Fc = [ Standard ] / A

Donde:
Fc = factor de calibración.
A = absorbancia del tubo standard.
[ Standard ] = concentración del standard.

Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la


concentración de una muestra desconocida o problema (MP),
conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma
manera (diluciones) se podrá usar directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = A mp . Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor


de dilución (Fd) que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y
esta a su vez es:

Dil = Vol mp / Vol t

Donde:
Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la
dilución.
Vol t = Volumen total.

Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una


muestra problema se procederá usando la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc .
Fd

Donde:
A mp = Absorbancia de la muestra problema.
Fc = Factor de calibración.
Fd = Factor de dilución.
[ MP ] = Concentración de la muestra.

EXPERIMENTO

1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV


Bicromato de K 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml
Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml
Concentración (mg %)
Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%.
Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno
de los
tubos.
Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de
onda (‫)ג‬
en el espectrofotómetro.
2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la
gràfica de absorbancia vs concentración de bicromato de K .
3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de
la muestra problema que el profesor le hará entrega.
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones
standard utilizadas para construir las curvas de calibración
ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los
siguientes métodos:
- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de
calibración.
- Analíticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de
calibración del standard.

CUESTIONARIO:
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un
espectrofotómetro.
2.- ¿Qué diferencias existen entre un fotocolorìmetro y un
espectrofotómetro?.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no
visible con sus respectivas longitudes de ondas.
4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia.
5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:
Standard Standard Standard Standard Standard
1 2 3 4 5
Concentraci 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl
òn
Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200
Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes
muestras, sabiendo que sus absorbancias fueron:
Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350
PRACTICA No 3

LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO


ELECTROLITOS: SU CAPACIDAD
AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO
HUMANO

FUNDAMENTO BIOQUIMICO:
Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho
de que todos ellos tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-
NH2) es su conducto como electrolitos. Es costumbre considerar los
grupos COOH como de naturaleza acídica y los grupos NH2 como de
carácter básico.
Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los
aminoácidos como iones dipolares y la conducta de ellos durante su
titulación con ácido y álcalis de modo que se comportan como
verdaderas sustancias tampones, amortiguadores ò buffers, para el
sostenimiento del pH del medio interno dentro de estrechos límites
(7.35 a 7.45). Explicamos también el comportamiento amortiguador del
ion dipolar glicina al añadirle iones H+ o al añadirle OH- impidiendo las
variaciones bruscas del pH sanguíneo. La representación de un
aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiere que
se trata de una sustancia en la que el grupo amino actúa como una
base conjugada y el grupo COOH como un ácido. Se ha observado, sin
embargo, que esta formulación no es la correcta del estado iónico de un
aminoácido en solución acuosa. La verdadera representación es aquella
que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente: (Estructura A)
H H
R C COO- R C COOH
Estructura (A) NH3 Estructura (B) NH2

Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es


decir, al pH fisiológico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base
conjugada, esto es, como Ion carboxilato R-COO-; y al mismo pH, la
mayoría de los grupos amìnicos estàn predominantemente en la forma
protónica R-NH3+
La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de
los tejidos. La estructura (B) no puede existir a ningún pH. La
conveniencia nos enseña sin embargo que la estructura (B) se use por
razones didácticas y para explicar la mayoría de las ecuaciones que
entrañan reacciones distintas a las de los equilibrios protónicos. La
contribución más importante a la conducta de una proteína como
electrolito procede de los grupos ionizables existentes en las cadenas
laterales de los aminoácidos. La curva de titulaciòn de una proteína ò
aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por
el nùmero de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas
laterales de sus unidades de aminoácidos. Por estas razones las
soluciones de proteínas tienen una poderosa capacidad tampón.
Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los
sistemas biológicos y ha sido estudiada con especial cuidado con
relación a los amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es
controlado dentro de estrechos límites, tal como les expliqué en la clase
teórica. Les dije que los valores de pH sanguíneo varían dentro de lo
normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza valores por debajo
de 7.35 se produce acidosis; y cuando los valores de pH se elevan por
encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos
sistemas tampones que son:
1) El Sistema bicarbonato/Acido carbónico (pK: 6,1)
2) El sistema fosfato monosódico/disódico (pK:6,8)

La proteína más importante de la sangre del ser humano es la


Hemoglobina que tiene gran capacidad tampón en la proximidad del pH
7.4, lo cual se debe a su elevado contenido de histidina (grupo imidazol)
Aproximadamente el 60% de la capacidad tampón de la sangre total se
debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las proteínas del plasma
(seroalbúminas y globulinas).
Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una
sustancia que al ionizarse genera iones Hidrógeno, H+, una base es
toda sustancia capaz de aceptar estos iones hidrógeno. Como los ácidos
ceden protones y las bases los captan, a cada ácido le corresponde,
como es lógico, una base conjugada. Es decir, si un ácido cede un
protón, el ion, así formado, puede captarlo de nuevo comportándose
como base. Por lo tanto, los procesos de cesión ò captura de protones
transcurren de forma reversible:

Cesión de protones
AH A- + H+

Acido captación de protones base

El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.


Las soluciones que contienen ácidos débiles y sus sales se llaman
soluciones tampón, buffers ò amortiguadores. Su finalidad es impedir ò
amortiguar las bruscas variaciones del pH.
El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la
ecuación de Henderson-Haselbach:

SAL
pH = pK + log ------------
ACIDO

A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón


depende de la naturaleza del ácido que la integra y de la proporción
entre la sal y el ácido (logaritmo de la relación entre ambos) y no de las
concentraciones absolutas de cada uno de estos componentes. La
eficacia amortiguadora es máxima cuando el cociente de la relación
sal/ácido es próximo a la unidad.
El objetivo de la presente práctica es demostrar la capacidad tampón de
un sistema amortiguador empleando un ácido débil y la sal del ácido
débil y estudiar la curva de titulaciòn ò valoración de un ácido débil HA,
como el ácido acético (0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las
variaciones del pH con respecto a diferentes proporciones relativas
entre la sal y el ácido de una solución tampón. (el pKa del ácido acético
es 4.76) antes de agregar la base, el pH se debe solamente a la
presencia del ácido. Pero tan pronto como se añade algo de la base
(NaOH 0.1N), èsta reacciona con una cantidad equivalente del ácido y
forma una cantidad equivalente de sal y agua. El ácido débil más su sal
disuelta constituyen una solución tampón (par amortiguador), cuyo pH
puede calcularse mediante el uso de la ecuación de H-H: pH = pK – log
Sal/ácido.
Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios
en el pH con la adición de volúmenes definidos de una base conocida
(NaOH 0.1N).
Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de
pH vs los ml de base agregados y obtendremos así la curva de titulaciòn
para el ácido.
Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH,
instrumento que determina el pH en función de la fuerza electromotriz
(p de Nernst) de una celda formada por un electrodo de referencia, la
solución problema y un electrodo de vidrio muy sensible a los
hidrogeniones.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:


Potenciómetro.
Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).
Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).
Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).
Agua destilada.
Solución de CH3-COOH 0.1N.
Solución de NaOH 0.1N.
Papel milimetrado ò cuadriculado.

PARTE EXPERIMENTAL:
Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua
destilada señalados en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el
pH en cada uno de los 11 beakers con el potenciómetro:

Beaker Nº Acido acètico NaOH Agua PH


0.1 N (ml) 0.1N (ml) destilada
(ml)
1 20 0 20
2 20 2 18
3 20 4 16
4 20 6 14
5 20 8 12
6 20 10 10
7 20 12 8
8 20 14 6
9 20 16 4
10 20 18 2
11 20 20 0

En cada mesa los alumnos construirán su gràfica de valoración


colocando en las ordenadas los valores de pH en orden creciente y en el
eje de las abscisas los volúmenes de sol. NaOH 0.1N añadidos en cada
beaker.

pH
ml NaOH añadido
CUESTIONARIO:
1.- Graficar la curva de valores del pH vs. NaOH 0.1N.
2.- Identificar el punto de semi-valoración y máxima capacidad
tampón.
3.- Explique que es un par tampón, como funciona y porqué las
proteínas
sanguíneas son amortiguadores.
4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del ser
humano.

PRACTICA No 4

FACŢORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD


ENZIMATICA

Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados


enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando
la velocidad de reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son
sumamente especìficas en las reacciones que catalizan y en los compuestos
(llamados sustratos) sobre los que actúan.
La cinética enzimàtica es el estudio del comportamiento de la velocidad en
reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética
proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para calcular la
concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su
actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas
permiten describir de manera cuantitativa los tipos de inhibición enzimática y
el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.
La velocidad a la que procede una reacción enzimàtica está controlada en
parte por las concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que
progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas
de la desaparición de los correspondientes sustratos, en tanto que la
concentración de la enzima no se altere.

La actividad enzimàtica puede expresarse:


a) Por la desaparición del sustrato (S).
b) Por la aparición de productos (P).
c) Por modificación de cofactores (C).
El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse asì:

[E] + [S] [E] + [P]

C C'

Diversos factores modifican la actividad enzimàtica, tales como:


1) Concentración de sustrato [S]
2) Concentración de la enzima [E]
3) pH del medio
4) Influencia de la temperatura
5) Efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la


actividad enzimàtica de la amilasa salival sobre el almidón.
La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas
en componentes mas pequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es
producida por el páncreas exocrino y las glándulas salivales para ayudar a
digerir el almidón. La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa” por su
capacidad para romper los enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces
alfa-1,6 de los puntos de ramificación no se alteran. El producto final de la
acción de la alfa-amilasa sobre el almidón es la formación de dextrinas,
maltosas y algunas moléculas de glucosa. El pH óptimo al cual actúa es 6.9 a
7 y se requiere cloro para su activación.
En la práctica la actividad enzimàtica se medirá por la desaparición del
sustrato (disminución de la turbidez en los tubos que contienen almidón), la
cual se determinará en el espectrofotómetro a 650 nm.

EXPERIMENTO A
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA
Y DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III IV V VI


Solución almidón 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Buffer fosfato pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Solución salina (NaCl 1%) 2.8 ml 2.6 ml 2.4 ml 2.2 ml --- 2.2
ml
Agua destilada --- --- --- --- 2.2 ml ---
2) Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37° C, durante 5 minutos.
El tubo VI servirá de comparación para ver el efecto de la temperatura
sobre la acción enzimàtica por lo que se deja a temperatura ambiente.
3) Agregar la solución de enzima:

Tubos No. I II III IV V VI


Solución amilasa 0.4 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 1.6 ml 1.6
ml

4) Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20


minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura ambiente.
5) Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la
siguiente manera:

Tubos No. I II III IV V VI


HCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
de los tubos de reacción 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5
correspondientes agregar ml
Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5
ml

6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.


7) Leer las absorbancias al espectrofotòmetro a 650 nm.
8) La diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indicarà la
actividad enzimàtica para cada tubo.
9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimàtica en el eje Y vs
concentración de la enzima [E] en el eje X.

EXPERIMENTO B
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD
DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III IV V


Solución de almidón 1% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml
Buffer fosfato pH 6.6 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con
todos los cinco tubos de la misma manera que se hizo en el experimento
anterior y leer las absorbancias de dichos controles a 650 nm. Dichas
absorbancias se tomaràn como lecturas iniciales.
3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el
baño de agua a 37°C por 20 minutos.
4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las
lecturas de absorbancia se tomaràn ahora como lecturas finales.
5) Hacer la diferencia:

Actividad enzimàtica = Lectura inicial – Lectura final

El resultado de esta diferencia se considerarà como actividad


enzimàtica.

6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de


una gràfica de actividad enzimàtica contra [S] (Ecuación de Michaelis-
Menten) y una gràfica de dobles inversas: 1/actividad enzimàtica contra
1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk). Graficar en papel milimetrado.

EXPERIMENTO C
EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III


Solución de almidón 1% 5 ml 5 ml 5 ml
Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml
Buffer fosfato pH 6.6 2 ml --- ---
Buffer fosfato pH 3.7 --- 2 ml ---
Buffer fosfato pH 8.0 --- --- 2 ml

2) Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.


3) Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).
4) Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.
5) Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución
yodada, como en el experimento anterior.
6) Realizar el estudio crìtico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.
7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimàtica vs pH.

CUESTIONARIO:
1.- Cuàl es la importancia del Km.
2.- Què efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.
3.- Como se clasifican las enzimas?
4.- A que se llaman zimògenos e isoenzimas.
5.- Que son cofactores y mencione ejemplos.
PRACTICA No 5

EVALUACIÓN NUTRICIONAL BIOQUÍMICA Y


ANTROPOMETRICA

La evaluación nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud


de un individuo. Es un requisito indispensable siempre que se desea mejorar,
promover o mantener un buen rendimiento físico, un buen estado de salud y
nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel de rendimiento que se
tiene y que se puede alcanzar.
El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante
un diagnóstico que permita conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los
posibles factores socioalimentarios, económicos y de composición corporal,
que puedan afectar la participación y rendimiento de una persona.
Otros objetivos de realizar esta evaluación son:
 Detectar déficit de nutrientes específicos, riesgo de desnutrición o
sobrepeso.
 Brindar educación nutricional
 Seleccionar personas de acuerdo a la composición corporal, orientar el
trabajo físico y/o reubicar al niño en una actividad física determinada

ESTADO NUTRICIONAL : Es la condición de salud resultante en el tiempo, del


balance entre lo consumido y lo requerido. Está determinado por la calidad y
cantidad de los nutrientes consumidos y por la utilización de estos en el
organismo.
EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios,
bioquímicos y clínicos, que correlacionados entre sí, permiten dar un
diagnóstico nutricional y por tanto orientar el tratamiento o manejo nutricional.
Una evaluación completa debe incluir:

1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.


 Determina y compara los diferentes componentes (hueso, músculo,
grasa y residuo)
 Analiza según patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte,
nivel de rendimiento)
 Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad
física y estado nutricional.

- Parámetros incluidos:
 Talla actual, talla/edad,
 Peso actual, peso usual, peso esperado, peso/talla (Ref. NCHS,
Metropolitan life)
 Circunferencias (Volumen muscular)
 Diámetros (estructura ósea)
 Pliegues (% grasa)

2. Evaluación bioquímica: Permite conocer los niveles sanguíneos de los


parámetros bioquímicos, indicadores del estado nutricional.
 Confirma datos clínicos y dietarios
 Susceptible a variaciones en la interpretación según edad, sexo,
factores hereditarios o consumo inmediato de alimentos.

- Parámetros incluidos:
 Cuadro hemático (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos)
 Proteínas totales y diferenciales (albúmina / globulinas)

 C reatinina urinaria 24hs/ Talla


 Trasferrína y Ferritina
 Glicemia y Perfil de lípidos

3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.


 Observa y analiza signos y síntomas clínicos que puedan indicar
deficiencias nutricionales:

- Parámetros incluidos:
 Sueño, fatiga, aspecto físico, piel, cabello, uñas, labios.
 Apetito / hambre
 Cambios de peso
 Frecuencia cardiaca
 Cicatrización
 Lesiones frecuentes
 Tiempo de recuperación de las lesiones
 Comportamiento del deportista
4. Evaluación dietaria: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo
dietario actual, comparándolo con la recomendación para la edad, sexo y gasto
energético.
Permite orientar, prescribir, calcular y diseñar un plan alimentario adecuado,
ajustado a las necesidades nutricionales y calóricas, condición socioeconómica
y hábitos del deportista.

- Parámetros incluidos:
 Encuesta nutricional:
- Historia socioalimentaria
- Anamnesis alimentaria
- Conductas alimentarias
- Frecuencia de consumo de alimentos
- Antecedentes personales y familiares

 Evaluación cualitativa
- Número de porciones diarias por grupos de alimentos
 Evaluación cuantitativa
- Cantidad de kcal y nutrientes (grs promedio) consumidos, promedio /
día.
 Determinación de la recomendación calórica y de nutrientes
- Comparar con el consumo para determinar excesos o déficit y diseñar
fórmula dietaria prescrita.

EXPERIMENTO “A”

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:


Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan en un medio alcalino con el
ion cùprico del reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un
complejo de color violeta cuya máxima absorción se da a 540 nm.

NaOH
Cobre + proteína Complejo cupro-proteico

El dosaje de proteínas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la
alteración en una de las fracciones puede ser balanceada por una alteración
opuesta de otra fracción. Por lo tanto, es importante que adicionalmente se
determine la concentración de albúmina.
La albúmina también va a ser dosada por el método de Biuret, pero
previamente al suero se le hace un tratamiento con sulfato de sodio y eter
etílico para lograr la separación de las globulinas y permitir solo el dosaje de
albúminas.

REACTIVOS:
1.- Reactivo para proteínas (Biuret):
Solución de sulfato de cobre, hidróxido de sodio y tartrato.
2.- Solución de sulfato de sodio al 22.6%.
3.- Eter etílico.
4.- Standard de proteínas:
Solución patrón calibrada y estabilizada equivalente a 10.4 g/dl de
proteínas.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO:


Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:

Blanco Standard Muestra


(ml) (ml) (ml)
Suero diluido 1/20 --- --- 1
Standard --- 1 ---
Reactiivo Biuret 4 4 4
Agua destilada 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.


Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de proteínas (en g/dl), utilizando el


método del Factor de Calibración.
La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra
y standard para obtener una absorbancia neta, sin la intervención del color
propio del reactivo.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO:


Preparar un tubo de la siguiente manera:
- Suero sanguíneo.................................0.3 ml.
- Colocar 5 minutos al baño maría a 37ºC.
- Solución de sulfato de sodio................5.7 ml.
- Mezclar. Éter etílico............................4.0 ml.
- Mezclar. Tapar el tubo y centrifugar.
Inclinando el tubo, extraer con una pipeta el suero tratado que se
aprecia como un líquido claro que queda debajo del precipitado.

Blanco Standard Muestra


(ml) (ml) (ml)
Suero tratado --- --- 1
Standard --- 1 ---
Reactivo Biuret 4 4 4
Sulfato de sodio 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.


Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de albúmina (en g/dl) utilizando el


método del Factor de Calibración, en forma similar que para el caso de las
proteínas totales.
VALORES NORMALES:
Proteínas: 6.0 – 8.0 g/dl.
Albúmina: 3.5 – 5.5 g/dl.

CUESTIONARIO.-
1.- Qué diferencias hay entre desnutrición y malnutrición?
2.- Describa todos los tipos de proteínas plasmáticas y cuáles son sus
funciones.
3.- Cuáles son los tipos de desnutrición que existen y como se valoran?
4.- Que son la transferrina, prealbúmina y proteína transportadora de retinol y
cual es su
rol en la valoración del estado nutricional?
5.- Qué es el Índice de Masa Corporal, como se halla y cual es su
interpretación?

PRACTICA No 6

DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA,
INVESTIGACIÓN DE GLUCOSURIA

El mantenimiento de la glIicemia, o concentración plasmática de glucosa, en


los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los
órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal. La coordinación
de los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la
relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la
produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va
seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este
aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la
utilización de glucosa (por glucólisis, entre otras), aceleración de la
glucogenogénesis y disminución de la glucogenólisis; todo ello ocurre
principalmente mediante la secreción de insulina, una hormona pancreática de
tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina esté disminuida,
la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles
elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); así ocurre en las personas
que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I".
El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en
antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglicemia
significativa.
Experimento A: DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA
(concentración de glucosa en suero)
FUNDAMENTO TEÓRICO

Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un


aumento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce
de manera repentina y además es severa. Una hiperglicemia superior a 124
mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas, además se considera
tambièn un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de
posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas.
La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en
bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como
enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos.

Hay dos tipos de métodos químicos:

a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa.


Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores,
estos métodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa
verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.
b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural
al sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que
emplea orto-toluidina.

En cuanto a los métodos enzimáticos:


a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una
de NADPH, que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es
el método de referencia recomendado por las organizaciones
internacionales.
b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza
en esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la
muestra problema y de los standares. Se explica a continuación:

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la


oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de
hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-
aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La
intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente
inicialmente. El esquema de la reacción es el siguiente:
MATERIALES Y REACTIVOS

• Tubos de ensayo de 10 ml.


• Pipetas.
• Espectrofotómetro.
• Agua destilada.
• Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
• Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa,
peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se


separarà el suero. Hacer una dilución del suero midiendo exactamente
en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua
destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes
tubos:

Tubos: Blanco Standard Muestra


Suero diluido (ml) --- --- 1
Estándar de glucosa (ml) --- 1 ---
Reactivo de glucosa (ml) 3 3 3

Incubar los tres tubos en Baño Marìa de 37ºC por 15 minutos. Luego de
retirar del Baño Marìa, agregar:
Agua destilada (ml) 2 1 1

Mezclar bien la solución. Leer las absorbancias para cada una de las muestras
en el espectrofotómetro a 520 nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el


método del factor de calibración.

VALORES NORMALES

La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.

Para el diagnóstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia


en ayunas de 124 mg/dl ò mayor de 200 mg/dl en cualquier momento.
Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentren entre lo normal y
lo diabético, son clasificados en una categoría denominada “tolerancia
alterada a la glucosa” y requieren observación y pruebas
confirmatorias.

Experimento B: INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN


ORINA

FUNDAMENTO TEORICO

En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo


menos con los métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La
glucosuria (presencia de glucosa en orina) se presenta en la Diabetes Mellitus
pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la
glicemia es mayor de 180 mg/dl. La detección cualitativa de glucosa en orina
se basa en la acción de la glucosa, que reduce las sales de cobre en medio
alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el cual
contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 20 ml, pipetas, mechero Bunsen, Reactivo Benedict, pinzas porta
tubos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Tubos: I II
Orina normal (gotas) VIII ---
Orina DM (gotas) --- VIII
Reactivo de Benedict (ml) 5 5

Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja


enfriar. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde,
amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente. De
ser negativa la reacción permanecerá de color azul.

CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué es la Diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista
del

laboratorio?

2.-Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la glucosa.

3.- Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.

4.- Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de


Fehling.
5.- Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su
importancia en la diabetes?

PRACTICA No 7

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA


POST PRANDIAL

Definición de la Enfermedad Diabetes Mellitas.-

La Diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas


por la presencia de hiperglIcemia resultante de un defecto en la secreción de
insulina, en la acción insulínica, o en ambas.

Clasificación de DM
Diagnóstico

Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que


niveles elevados de glucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen
daños en la microvasculatura de retina y riñón

Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con


hiperglicemia que no llegan a cumplir los criterios de diabetes pero que
son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estos pacientes
presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la
tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa en ayunas anormal.
Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando
después de una prueba de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a
las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.
La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores
en ayunas son mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.

Experimento A: TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y


GLUCOSA POSTPRANDIAL
FUNDAMENTO TEÓRICO

Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por


mucho tiempo para diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia
disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto
para la Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que
los niveles importantes en ambos casos son los obtenidos a las dos
horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser de 75 gramos. El
disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la solución
más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por
parte del paciente.
Ayuna 70-110 mg/dl
s
30 min <200 mg/dl
1 <180 mg/dl
hora
2 <140 mg/dl
horas

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en


niños se debe utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso
del niño (1,75 g de glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia
recordar que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa
oral, se debe pedir una muestra de orina al paciente, para hacerle un
análisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si el paciente presenta
glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la
glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de
glucosa elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le
podría provocar al paciente un shock hiperglicémico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la
Organización Mundial de la Salud como por la American Diabetes
Association, estas son las relacionadas con la Diabetes Mellitus
Gestacional.
La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en
la ingesta en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la
hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los
niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la
prueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100
gramos de glucosa y hacer una curva de tres horas. Si dos de los
niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores indicados en la
siguiente tabla, se hace el diagnóstico de DMG.

Ayuna 105 mg/dl


s
1 hora 190 mg/dl
2 165 mg/dl
horas
3 145 mg/dl
horas

La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de


tolerancia a la glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal
y el de las dos horas.

Ayuna 70-110 mg/dl


s
2 <140 mg/dl
horas

MATERIALES Y REACTIVOS

• Tubos de ensayo de 5 ml.


• Micropipetas automáticas de 10 uL.
• Espectrofotòmetro.
• Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
• Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa,
peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se determinarà la glicemia en muestras obtenidas a una persona en


forma basal, a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra
sanguínea basal se le dà de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto
en 300 mL de agua con unas gotas de limòn. Las muestras de sangre
extraìdas de la persona seràn centrifugadas y se separaràn los sueros.
Para la determinación de las glicemias se utilizarà el método de la
glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Tubos: Blanco Standar Muestr Muestr Muestr Muestr


d a (0’) a (30’) a (60’) a
(120’)
Suero (uL) --- --- 10 10 10 10
Estándar de glucosa --- 10 --- --- --- ---
(uL)
Reactivo de glucosa 1 1 1 1 1 1
(ml)

Incubar los tres tubos en Baño Marìa de 37ºC por 5 minutos . Mezclar bien. Leer
las absorbancias para cada una de los tubos en el espectrofotòmetro a 500
nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras


utilizando el método del factor de calibración.

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel


milimetrado una gráfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la
glucosa.
2.- Como serìa esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un
intolerante a la glucosa.

3.- Que importancia tiene la detección de microalbuminuria en una persona.

4.- Qué son y en que casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un


paciente diabético.

5.- Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?


PRACTICA
Nº 8

DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA

La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce


principalmente en la fracción exocrina del páncreas y en las glándulas
salivales.
Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4
glucosìdicos de los polisacáridos como almidón y glicógeno.
En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a
elevarse en las primeras 2 a 3 horas de la enfermedad, alcanzando los
valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque,
declinando luego para volver a los niveles normales entre el 3º y 6º día.
También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la
enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la
actividad sérica ha alcanzado los niveles normales.
También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con
ulcera gástrica o duodenal perforada, obstrucción intestinal, obstrucción
de conductos biliares, pancreatitis crónica, hipertiroidismo, carcinoma
de cabeza de páncreas, administración de opiáceos y en general
cualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en
regiones próximas al páncreas.
Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la
secreción de amilasa salival, se asocian también con elevaciones en los
niveles de amilasa sérica.

PANCREATITIS AGUDA:

Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la


función pancreática normal debe ser restaurada una vez que la causa
primaria del evento agudo es superado.

Causas:

- Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)


- Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)
- Pancreatitis de causa idiopática: 30%
- Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Pán-creas Divisum
- Pancreatitis por condiciones metabólicas asociadas
- Hipertriacilgliceridemia
- Hiperparatiroidismo
- Hipercalcemia
- Hiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IV
- Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)
- Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y Central
- Pancreatitis por Metanol
- Pancreatitis traumática (Trauma abdominal)
- Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía
pancreatobiliar, transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis

PANCREATITIS CRÓNICA:

Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño


irreversible de la estructura y función pancreática. El curso clínico de la
pancreatitis crónica puede consistir en ataques recurrentes agudos o una
relativa progresión de síntomas.
En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la
Pancreatitis Crónica Obstructiva subsiguiente a la pancreatitis crónica. Ésta es
causada por la lesión obstructiva, es la forma más común de pancreatitis, la
que se caracteriza por cambios crónicos irreversibles.

Causas:

- Pancreatitis Alcohólica
- Pancreatitis Idiopática
- Pancreatitis Crónica Tropical
- Pancreatitis Hereditaria
- Pancreatitis por Hiperparatiroidismo
- Pancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal

Experimento A: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:


En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la
muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el
agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con
el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color
respecto de un sustrato control (sin muestra) es la medida de la
actividad enzimàtica, que se expresa en Unidades Amilolíticas (Smith &
Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogènicas
(Somogy)/decilitro.
MATERIALES Y REACTIVOS:
- Espectrofotómetro.
- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Tubos de ensayo y cubetas de lectura.
- Baño maría a 37ºC.
- Reloj de intervalos.
- Substrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con
buffer fosfato 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l.
- Reactivo de yodo: solución 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Preparar los siguientes tubos:

Control Muestra
Sustrato 1 ml 1 ml
Dejar unos minutos en baño de agua a 37ºC y agregar:
Muestra --- 20 uL
Incubar a 37ºC. A los 7’30” exactos, agregar:
Reactivo de yodo 1 ml 1 ml
Mezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar:
Agua destilada 8 ml 8 ml
Mezclar por inversión.
Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con
agua destilada.

Experimento B: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este


caso la muestra en lugar de suero es orina diluida la cual debe
obtenerse de la siguiente manera:
El paciente debe orinar descartando esta micción, dos horas después
vuelve a orinar y recoge toda la orina. Esta muestra, que corresponde a
dos horas de diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada. La
determinación se efectúa con 20 uL de esta dilución, obteniéndose el
resultado directamente en Unidades Amilo líticas/hora.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Para ambos experimentos se empleará la siguiente fórmula:

Abs. Control - Abs. Muestra


Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000
Abs. Control

Unidades: Una Unidad Amilolìtica (UA) es la cantidad de enzima


contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de
almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En esta
técnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos
en 1 ml de Sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a
incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidón durante 30 minutos.
Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la
muestra sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad
amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA:

Suero Orina
(UA/dl) (UA/hora)
Normal <120 <260
Pancreatitis aguda 300 a 12000 Más de 900
Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300
Parotiditis 200 a 350 350 a 750
Parotiditis con complicación Más de 350 Más de 750
pancreática
Procesos abdominales agudos (sin Normal Normal
pancreatitis)

CUESTIONARIO:
1.- Explique como se produce la activación de las enzimas producidas
por el páncreas exocrino ?
2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas:
lipasa, tripsina, elastasa y fosfolipasa A2?
3.- Explique como se produce la digestión completa del almidón en
nuestro tubo digestivo.
4.- Cuál es el cuadro clínico de una pancreatitis aguda?
5.- Qué otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el
diagnóstico de pancreatitis?
PRACTICA N° 09

CETOACIDOSIS DIABÉTICA
BASE BIOQUÍMICA.
La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglicemia y otros desarreglos que se
deben a una inadecuada acción de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea
porque exista un reducido nivel circulante de Insulina ó una resistencia de los
tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categorías –
a) Diabetes Tipo I ó Diabetes Insulino dependiente ó Diabetes juvenil
(llamada así porque se inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II ó no
insulino dependiente (diabetes de inicio en la edad madura). Puede
haber tipos intermedios que se superponen.
(A )LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la
dependencia de la Insulina significa que no solamente que la insulina
es necesaria para el óptimo control de la glucosa sanguínea, que
también podría ser cierto para la forma tipo II, sino que “sin Insulina
exógena el paciente es mas proclive a desarrollar CETOACIDOSIS
diabética.
(1) Se sabe que esto refleja una completa ó casi ausencia de insulina en estos
pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina ó la resistencia a la
insulina característico de los pacientes del tipo II.
(2) Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su
presencia en niños y adultos jóvenes y su presencia en las personas mas bien
delgadas que obesas.
( B ) LA DIABETES TIPO II comúnmente afecta a las personas de edad
madura, y con sobrepeso.
( 1 ) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce
cetoacidosis
( 2 ) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir
la severa hiperglicemia.
Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó
alterarse la tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades
que afectan la producción ó la acción de la Insulina, tales como la pancreatitis
crónica, el Síndrome de Cushing, la acromegalia, la alteración de los receptores
de insulina y otras.
El síntoma mas común que produce la hiperglicemia es la
poliuria(Aumento del volumen urinario) y la polidipsia( incremento en la
ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmótica inducida por la
glucosa. El incremento en la ingesta de agua es una respuesta a
deshidratación y sed..Se produce disminución de peso corporal, debido
a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectos catabólicos de la
disminución de la acción de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de
alimentos (Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones
metabólicas .Las infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son
frecuentes sobre todo en los casos no controlados debido a que la
hiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. La alteraciones
en la retina son precoces.
CET0ACIDOSIS DIABETICA:
Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de
insulina circulante es insuficiente para permitir una utilización de la
glucosa por los tejidos periféricos y para inhibir la producción de
glucosa y el catabolismo tisular. El incremento del Glucagon y el
aumento de las hormonas que aumentan en respuesta al stress ( como
la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del crecimiento)
contribuyen a los desarreglos metabólicos. La insuficiente cantidad de
insulina reduce la utilización periférica de glucosa y junto con el exceso
de glucagon incrementan la producción hepática de glucosa a través de
la estimulación de la gluconeogénesis y la glucogenolisis y la inhibición
de la glicólisis.La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos
suministra un flujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para
la gluconeogénesis.El resultado es la hiperglicemia .La diuresis osmótica
resulta de la elevación de la glucosa ( y cuerpos cetónicos ) y genera
hipovolemia, deshidratación y pérdida de sodio, fosfato de potasio y
otras substancias por la orina. La depleción del volumen estimula la
liberación de catecolaminas lo cual se opone a la acción de la insulina
en el hígado y contribuye a la LIPOLISIS.

CETOGENESIS:
La lipólisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de
catecolaminas moviliza los acidos grasos no esterificados desde sus
depósitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con el
glicerol para formar triacilgliceroles, el hígado desvía sus rutas
metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagon
incrementa el nivel de carnitina, que capacita a los ácidos grasos a
entrar en la mitocondria, donde ellos sufren beta oxidación hacia
cuerpos cetónicos. Además el glucagon disminuye el contenido
hepático de malonil CoA, que es un inhibidor de la oxidación de acidos
grasos.
ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos
cetónicos( acetoacetato y beta hidroxibutírico) excede la capacidad
corporal de metabolizarlos ó excretarlos. Sus H + son tamponados por el
bicarbonato, conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH
sanguíneo. Se encontrará entonces: hiperglicemia, hipercetonemia,
acidosis metabólica, disminución del bicarbonato, disminución del pH
sanguíneo y presencia en la orina de glucosa (glucosuria) y cuerpos
cetónicos ó cetonuria.
OBJETIVO DE LA PRACTICA.-
Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y
presencia de cuerpos cetónicos en la orina en presencia de Cetoacidosis
Diabética.
EXPERIMENTO A:
DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO
Reactivos y materiales:
HCl 0.01 N
NaOH 0.01 N
Fenoltaleína 20 mg% solución alcohólica
Alcohol corriente ó caprílico.
Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..
Pipetas de 5 ml graduadas al décimo
Pipetas de 1 ml graduadas al centésimo
Beakers de vidrio de 100 ó 50 ml
Baguetas de vidrio
Baño María de 37°C
Reloj de intervalos

Mètodo:
En un beaker de vidrio colocar:
5 ml de HCl 0.01 N
1 ml de suero
2 gotas de alcohol
Agitar y luego reposo 2 min.
Añadir 3 gotas del indicador Fenoltaleína.
Colocar a 37° C en Baño Marìa por 10 minutos.
Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado
pálido.
Anotar la cantidad de NaOH gastado.

Càlculos:
( 5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de
HCO3-

Considerar que:

a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3
b)Vol. de muestra usada en la titulación : 1 ml
c)Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro

Valores Referenciales (Normales): 22 á 34 mMol/Litro

EXPERIMENTO B:
INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA
Test de Rothera.- Esta prueba depende de la reacción entre la
Acetona y el nitroprusiato para formar un complejo coloreado púrpura
rojizo que indica la presencia de acetoacetato y/o acetona.

Reactivos para el test de la Rothera:


Cristales de sulfato de amonio
Solución de Nitroprusiato al 10% en soluciòn acuosa, la cual deberá ser fresca.
Amoniaco solución ( Hidróxido de amonio concentrado)
Muestra problema: orina
Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente
Pipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminales
Espátulas ó bajalenguas de madera.
Baguetas de vidrio.

Procedimiento:
NO SE DEBERÁ PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO
HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y
añadirle con la espátula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales.
Disolver con bagueta. Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10% . Mezclar
bien
Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca, lentamente, en
zona deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur ó pipeta de vidrio. Deberán
quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver la formación de un
anillo morado en la interfase en caso positivo para cuerpo cetónicos .Si no
aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:
1.- Explique la formación de cuerpos ce tónicos y porque se producen.
2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.
3.- Como se diagnostica a un paciente que està en cetoacidosis diabética?
4.- A qué se llama: exceso de bases y reserva alcalina.
5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje
tanto de bicarbonato en sangre como de cuerpos cetónicos en orina.
PRACTICA Nº10

PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y


FRACCIONADO

El nivel sèrico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de


numerosas investigaciones tanto en individuos sanos como
enfermos.
Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene
utilidad diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o
menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto que el
colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que
las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolèmicos.
Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de
contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de màs
de 40 años) con colesterolemia menor ò igual a 200 mg% es 3 veces menor que
entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos con más
de 260 mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución
de las lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad),
considerada como el “factor protector” y LDL (lipoproteínas de baja densidad),
consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones biológicas
inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición
y los resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores
aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como índices
predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los
valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO


FUNDAMENTOS DEL METODO:
El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa
(CHOD), previa hidròlisis enzimàtica de los ésteres mediante una
lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la
oxidación, produce la copulaciòn oxidativa del fenol con la 4-
aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la
peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia
máxima a 505 nm.
Lipasa
ésteres de colesterol colesterol + ácidos grasos
CHOD
Colesterol + O2 colesten-3-ona + H 2O2

POD
H2O2 + 4-AF 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona +
4 H 2O

REACTIVOS:
Standard: solución de colesterol 200 mg%
Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3
U/ml) y peroxidasa (20 U/l).
Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).
Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).
Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50
partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar
a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente
homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.

PROCEDIMIENTO:
En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard Muestra


Standard --- 20 uL ---
Muestra --- --- 20 uL
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.


Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:
Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor
de calibración. Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200
mg%

VALORES DE REFERENCIA:
Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de
dieta y de ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores
“normales”, pues la norma promedio de una población no necesariamente
refleja ausencia de riesgo patológico en el caso de colesterol.
Menos de 200 mg% valor deseable
200 a 239 mg% valor frontera
Mayor de 240 mg% valor alto

Experimento B: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO


FUNDAMENTOS DEL METODO:
Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando
selectivamente las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL)
mediante el agregado de Sulfato de Dextrán de PM 500,000 en presencia de
iones Mg++.
En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza
la determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema
más conveniente.

REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de
Cl2Mg.H2O

PROCEDIMIENTO:
En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo
Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 15 minutos en refrigeración. No colocar en el congelador.
Centrifugar a 3000 rpm.
Usar el sobrenadante como muestra.
En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard Muestra


Standard --- 20 uL ---
Sobrenadante --- --- 100 uL
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.


Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:
De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la
concentración del standard es de 45.7 mg%.

VALORES NORMALES:
30 – 65 mg%

Experimento C: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:


Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero
precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de
alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan
las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el colesterol ligado a las mismas
se determina empleando el sistema más conveniente.
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el
sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL.

REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en
polietilenglicol (PM 600).

PROCEDIMIENTO:
En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y añadir 0.1 ml de
Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.
Centrifugar a 3000 rpm.
Usar el sobrenadante como muestra.
En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard Muestra


Standard --- 20 uL ---
Sobrenadante --- --- 100 uL
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.


Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:

LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de


calibración)

La concentración del standard es de 62.4 mg%.

VALORES NORMALES:
Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%
Riesgo moderado : 140 a 190 mg%
Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%

CUESTIONARIO:
1.- Què es RIESGO CORONARIO y como se calcula?
2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?
3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.
4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.
5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.
PRACTICA Nº11

PERFIL LIPIDICO II: TRIACILGLICERIDOS

Los triacilglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo,
constituyendo por lo tanto una potente forma de almacenamiento de
energía.
El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del
organismo, se produce con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos
(dieta, actividad física, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que
los triglicéridos (uno de los más importantes vehículos para el transporte de
ácidos grasos) varíen también su concentración en respuesta a estos
factores fisiológicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado,
conduciendo a niveles anormales de triacilglicéridos circulantes. La
persistencia de esta condición, se asocia con numerosas patologías, tales
como enfermedad hepática, renal, hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular interés es el aumento de traciliglicéridos
en individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronóstica, respecto a
la probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del
50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias
coronarias son triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los
triacilglicéridos con la patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este
punto de vista está sustentado por el hecho de que un gran porcentaje de
pacientes con infarto de miocardio también exhiben hipertriacilgliceridemia.

Para la determinación de triacilglicéridos en suero se usará la determinación


enzimàtica de glicerol a partir de glicéridos.
Los métodos enzimàticos se basan en la determinación del glicerol
contenido en las moléculas de los traciliglicéridos, tras la hidrólisis (química
ò enzimática) para remover los àcidos grasos. La determinación enzimático
del glicerol ha sido usada durante muchos años; sin embargo, en estos
métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente
desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada con una
proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha posibilitado el empleo de métodos
directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente enzimàticos
eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de
altas temperaturas y mezclas de adsorciòn para la remoción de fosfolípidos.
Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos con lipasas,
que hidrolizan completamente los traciliglicéridos.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE TRIACILGLICERIDOS


EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:


Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de
glicerol a partir de glicéridos.
La primera etapa consiste en que los triacilglicéridos son hidrolizados
enzimàticamente por una lipoprotein lipasa específica, produciendo glicerol y
ácidos grasos.

lipoprotein lipasa
Triacilglicéridos Glicerol + 3 àcidos grasos

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia


de glicerolkinasa.

Glicerol kinasa
Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol


fosfato oxidasa (GPO), con producción de agua oxigenada.

GPO
Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

Finalmente el agua oxigenada asì formada produce la unión oxidativa del


fenol y la 4-aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD),
con formación de una quinonimina roja.

POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol 4-(p-benzoquinona
monoimino)fenazona + 4 H2O

REACTIVOS PROVISTOS:
- Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de
triacilglicéridos.
- Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.
- Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa
(GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina
trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:


- Standard: listo para usar.
- Reactivo de trabajo:
5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.
Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.
4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una
porción de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando
varias veces. Homogenizar y fechar.

MATERIAL REQUERIDO:
- Espectrofotómetro.
- Probeta, micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes
indicados.
- Frasco de vidrio color ámbar.
- Tubos de fotocolorìmetro o cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37ºC.
- Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:
Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros
lechosos.
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra),
colocar:

Tubos Blanco Standard Muestra


Muestra --- --- 10 uL
Standard --- 10 uL ---
Reactivo de Trabajo 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar.
Incubar 10 minutos en baño de agua a 37ºC.
Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con
agua destilada.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:


Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los
cálculos.
Para hallar la concentración de traciliglicéridos en el suero problema, se debe
utilizar el método del factor de calibración.

Triacilglicéridos (mg%) = M x Fc

Fc = 200 / S

M = Abs muestra – Abs blanco

S = Abs standard – Abs blanco

VALORES DE REFERENCIA:

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP)


provee los siguientes valores de triglicéridos:
Deseable: < 150 mg%.
Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.
Elevado: 200 – 499 mg%.
Muy elevado: > 500 mg%.

CUESTIONARIO:
1.- Describa las características principales de los lípidos y su
clasificación.
2.- Explique la importancia biológica de los triacilglicéridos.
3.- Como se produce la digestión y absorción de los
tracilglicéridos.
4.- Mencione la proporción de triacilglicéridos dentro de las
lipoproteínas y la
acción de la lipasa lipoproteica.
5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como
enzimáticos para
el dosaje de triacilglicéridos.
PRACTICA Nº12

MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA

Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo


proteico (síntesis y degradación).
Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos
compartimientos:
a) Compartimiento Proteico Visceral.
b) Compartimiento Proteico Somático esquelético.

Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de


Transferrina, Pre-albùmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su
relativamente corto tiempo de vida (albúmina es de 20 dìas) rinde una
estimación razonable del compartimiento proteico visceral. En esta pràctica
utilizaremos la Proteína Total y la Albúmina sèrica.
Las proteínas del compartimiento somático esquelético la evaluaremos
mediante la relación entre la excreciòn de la creatinina urinaria en 24 horas y
la talla de la persona, relación que es un fiel índice de la masa muscular
esquelética.
Asì mismo mediante el Peso y la Talla se evaluarà la masa corporal total.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y


ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:


Determinación de Proteínas Totales:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el iòn cùprico, en medio
alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya
intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.
Determinación de Albúmina:
La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica
de la Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en
medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco
de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

REACTIVOS:
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril
polièter (AAP).
Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (en polioxietilèn lauril éter).
Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con tìtulo
conocido de proteínas (Biuret ò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).

MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotómetro.
Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Tubos de ensayo.
Baño Marìa a 37ºC.
Reloj de intervalos

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:


En tres tubos colocar:

Blanco Standard Muestra


Agua destilada 50 uL --- ---
Suero Patrón --- 50 uL ---
Muestra --- --- 50 uL
Reactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.


Incubar durante 15 minutos en baño marìa a 37ºC.
Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:


En tres tubos colocar:

Blanco Standard Muestra


Suero Patrón --- 10 uL ---
Muestra --- --- 10 uL
Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.


Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Leer en espectrofotòmetro a 625 nm.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Proteínas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / S


Albùmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S

VALORES DE REFERENCIA:
PROTEÍNAS TOTALES : 6,1 a 7,9 g/dl.
ALBÚMINA : 3,5 a 4,8 g/dl.

Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

FUNDAMENTOS DEL METODO:


La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado,
previa desproteinizaciòn con àcido pìcrico, obteniéndose un
cromògeno que se mide a 510 nm.

REACTIVOS:
Reactivo 1: àcido pìcrico 41,4 mmol/l.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: soluciòn de creatinina 2 mg%

MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotometro.
Tubos de ensayo.
Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.
Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:

Blanco Standard Muestra


Standard --- 0,5 ml ---
Orina diluìda (1:50) --- --- 0,5 ml
Agua 1 ml 0,5 ml 0,5 ml
Reactivo 1 2 ml 2 ml 2 ml
Reactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Mezclar por inversión.


Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Leer en espectrofotòmetro a 510 nm.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S

Siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.
M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo standard.

VALORES DE REFERENCIA:
900 a 1,500 mg/24 horas.

VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

PROMEDIO DESNUTRICIÓN
POBLACIONAL
Relación CrU 24h / Talla Hombres: 830 Hombres: < 660
(mg 24h/m) Mujeres: 680 Mujeres: < 430
Relación Peso / Talla Hombres: 37 Hombres: < 30
(Kg/m) Mujeres: 34 Mujeres: < 29
Proteínas totales (g/dl) 7 <6
Albúmina (g/dl) 4 < 3,5

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración


nutricional de dicha persona sabiendo que es varón, pesa 60 Kg, su talla es
1,56 m y su volumen urinario en 24 horas fuè de 1000 ml.
2.- Como hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona
hubiera sido mujer?
3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.
4.- Què son las globulinas y cuàles son sus clases?
5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para
proteínas totales, albúmina, globulina y creatinina.
PRACTICA N°13

METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA

Base Bioquímica.-
La bilirrubina es un pigmento amarillo , que se produce en el ser humano a partir
del Núcleo HEM ( que es una Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol macrocíclico, molécula
que tiene insertado un átomo de Hierro ).Sobre este núcleo HEM actua la enzima
Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa meteno del anillo
tetrapirrólico y se abre la molécula , conviertiéndose en el pigmento verde Biliverdina, el
cual es subsecuentemente hidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reducciíon la realiza la
enzima citosólica biliverdina reductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada
mol de HEME catabolizado por esta ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO 2 y de ión
férrico.La producción diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el hombre es de
250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total producida se deriva de la
molécula del HEM de la Hb liberada a partir de los eritrocitos senescentes que son
destruídos en el sistema retículo endotelial del hígado, bazo y médula ósea. El 15%
remanente se produce a partir de la destrucción de las células precursoras de los eritrocitos
en la médula ósea ( llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene del catabolismo
de otras proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina,citocromos, peroxidasas
y que están distribuídas a través de todo el organismo.
Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada al hígado
asociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los hepatocitos , se
transporta y se conjuga al acido glucurónico ( UDP – glucuronilo transferasa) para
producir mono y diglucuronato de bilirrubina los cuales se excretan en la bilis.
y después de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los
glucorónidos de bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del
intestino delgado, y por la acción catalítica de la betaglucuronidasa del hígado, células
epiteliales intestinales y las bacterias.La bilirrubina no conjugada es posteriormente reducida
por la flora bacteriana anaeróbica intestinal para formar un grupo de tres tetrapirroles
incoloros colectivamente llamados Urobilinógenos que luego se reducen y forman tres
productos: estercobilinógeno, mesobilinógeno y urobilinógeno.Hasta el 20% de los
urobilinógenos producidos diariamente son reabsorvidos desde el intestino hacia la
circulación pára ir al hígado(Circulación entero.hepática). La mayor parte del urobilinógeno
reabsorvido es capatado por el hígado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2 a 5 %
entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte mas baja del tracto intestinal,
los tres urobilinógenos se oxidan espontáneamewnte y producen los pigmentos
estercobilina,mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos adquieren color marrón y que son
los pigmentos que le dan color a las heces. Existen enfermedades congénitas y
enefermedades adquiridas que afectan uno ó mas de los pasos involucrados en la
producción,capatación, depósito,metabolismo y excreción de la bilirrubina y la
hiprbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estos transtornos.Esta bilirrubinemia
puede ser a predominio No conjugado( Indirecta ) ó Conjugado( Directa) dependiendo del
tipo de desorden.
La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede de l
mg % , existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción de
mas bilirrubina de la que el hígado normal puede excretar o a la insuficiencia de un hígado
dañado para excretar la bilirrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de
daño hepático, la obstrucción de los conductos excretorios del hígado , previniendo la
excreciónde la bilirrubina, también causará hiperbilirrubinemia. En todos estos transtornos ,
la bilirrubinase acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta
concentración( aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los
cuales adquieren color amarillo, este transtorno se denomina ictericia. La concentracion de
bilirrubina en el suero es de gran valor , por eso en la presente practica la emplearemos.

Estado Bilirrubina Sérica Urobilinogeno Bilirrubina Urobilinógeno


Mg% Urinario Urinaria fecal

NORMAL Conjug: 0.1 a 0.4 mg 0.a 4 mg/24 hs Ausente 40 a 280 mg/ 24


No Conjug 0.2 a 0.7 hs

Iictericia Elevac.No Conjug Aumentado Ausente Aumentado


Hemolítica

Hepatitis Elevaciónes de Disminuído Presente Disminuído


Ambas,con
pred.Conjug
Ictericia Ausente Prresente Escaso o
Obstructiva Elecvación de ambas a ausente
predominio
Conjugada

Dentro de las causa de Ictericia Hemolítica tenemos:


Anemias hemolíticas,ictericia fisiológica neonatal( Inmedurez hepática para captación,
conjugación y secreción de la bilirrubina), Sindrme de Crigler-Najar ( Alteración de la
conjugación de bilirrubina),Enfermedad de Gilbert,Hiperbilirrubinemia tóxica(Agentes
farmacológicos).
Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA

FUNDAMENTO:
El suero sanguíneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanílico + Nitrito de
sodio) y se produce un complejo coloreado de color rojo violáceo debido a la presencia de
bilirrubina conjugada al ac. glucurónico (Directa) color que desarrola directamente.. La
Bilirubina no conjugada (Indirecta) requiere además la presencia de cafeína ó alcohol
metílico para que se desarrolle el color . Entonces para obtener la producción de color
debido a ambas bilirrubinas debemos añadir cafeína ó metanol y tendremos la producción
de un color debido a la suma de ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos
colores son comparados espectrofotométricamente con el color producido por una
solución standard de bilirrubina de concentración conocida.

REACCTIVOS NECESARIOS:
- Acido Sulfanílico en medio ácido
- Solución acuosa de nitrito de sodio
- Alcohol metílico ó solución de cafeína amortiguada
- Agua destilada
- Standard de Bilirrubina
- Preparación de reactivo Diazo( Sol. Nitrito de sodio + Sol ácido sulfanílico), según
intrucciones del profesor.
- Muestras problema
METODOLOGIA.-
Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados ,según la siguiente tabla:

Tubo Tubo Tubo Tubo


Reactivos Blanco Bilir Directa Bilir Total Standard de
Bilirrubina
(B) (D) (T) (mg %)
Muestra 200 uL 200 uL 200 uL ---
(suero)
Agua destilada 2,5 ml 2.5 ml --- ---
Sol Cafeína --- --- 2.5 ml 2,5 ml
Acido 200 uL --- --- ---
Sulfanílico
Reactivo Diazo --- 200 uL 200 uL 200 uL
Standard 200 uL

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.


Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.
Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro en
cero de Absorbancia con Agua destilada.
Anotar los resultados de cada lectura.

CALCULOS:
Bilirrubina Total mg% = ( T - B ) x Factor
Bilirrubina Conjugada (Directa) mg % = ( D – B ) x Factor
Bilirrubina No Conjugada(Indirecta ó Libre) = (Bilirrub.Total – Bilirrub.Directa)

VALORES DE REFERENCIA:
- Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/%
Total: hasta 1.0 mg/%

- Recièn nacidos =
Nacidos a tèrmino Prematuros
Sangre de cordòn 2.5 mg%
Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg%
Hasta las 48 horas 7.5 mg% 12.0 mg%
Del 3º al 5º dìa 12.0 mg% 24.0 mg%
Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del
adulto al mes del nacimiento.
En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan màs en alcanzar la normalidad,
dependiendo del grado de inmadurez hepàtica

Experimento B: INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA

El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se


encuantra en todas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4
mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos señalado en las clases teóricas por
la acción de las bacterias sobre los los pigmentos biliares excretados por el
hígado.También dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al
conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorvida sino que
: o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en UROBILINOGENO
( y derivados asociados) por acciópn de las bacterias del colon. El urobilinógeno se
puede reabsorver en el intestino delgado (Ïleon ) y en el colon y pasa a la circulación
portal , llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se
excreta con la orina .
Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno
( como en la enfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la
hemólisis, la excreción diaria del urobilinógeno aumentará en forma significativa Por
el contrario,si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstrucción biliar
extrahepática interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y ocasiona
un descenso notable en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno.
Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil para diferenciar las
posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de los
conductos biliares, la urobilina estará ausente en la orina.
La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una
excesiva destrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del
parénquima hepático. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina

Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno


en orina (Método Cualitativo).:
Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetil
aminobenzaldehido,para rendir un complejo coloreado rojo cereza
Reactivo de Ehrlich:
Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de
agua y y 75 ml de HCl concentrado.
Procedimiento:A 2 ml de orina en un tubo de prueba , añadirle 0.5 ml del Reactivo
de Ehrlich y mexclar bien. Observar el color de la mixtura.
Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán color.
Cantidades aumentadas(patológicas) del piegmento urobilinógeno producirán un
color rojizo cereza que se observa bien mirando el tubo desde arriba del tubo(boca
del tubo) contra un fondo blanco.
En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de las
tiras reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas
están impregnadas en el área correspondiente de una sal de metoxibenceno diazonio
estable que produce con el urobilinógeno, casi instantáneamente un complejo de
color rojo azoico.Se considera normal que en la zona reactiva para urobilinógeno no
se produzca decoloración alguna o que los colores que aprezcan sean mas claros que
los observados para l mg % .Esta prueba es específica para el urobilinógeno.

CUESTIONARIO:
1.- Explique la formación de la bilirrubina.
2.- En que casos se produce una elevación de la bilirrubina total , tanto a
expensas de la bilirrubina directa como de la indirecta.
3.- Como se forma el urobilinógeno y qué importancia tiene?
4.- Qué es la ictericia y como se evalúa.
5.- Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina.
PRACTICA Nº 14

TRANSAMINACION

IMPORTANCIA CLINICA:
Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que
catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoàcido,
en una de las màs importantes reacciones del metabolismo proteico. El interés
clìnico està centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transminasa
glutámico oxalacètica) y TGP (transaminasa glutámico pirùvica).
Estas enzimas tienen acciòn eminentemente intracelular, por lo que la
actividad sèrica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la
actividad serà evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran,
de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un
marcado aumento de la actividad de la TGO, debido a la liberación al torrente
sanguíneo de esta enzima, tan abundante en músculo cardìaco.
En este caso no existirà aumento en la actividad sèrica de TGP ò serà mínimo.
En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren
necrosis de tejido, habrà un incremento considerable de la actividad sèrica de
transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clìnicos como
ictericia.
En este caso, la TGP serà la enzima predominante debido a su gran
concentración en el tejido hepático.
Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambièn en traumas
accidentales o quirúrgicos y en distrofias musculares y algunas miopatías.

FUNDAMENTOS DEL METODO:


Una reacción de transaminación consiste en la interconversión de un grupo
amino (NH2-CH-COOH) de un aminoácido, con un grupo cetónico (O=C-COOH)
de un cetoácido. Este intercambio está catalizado por enzimas conocidas con
el nombre de transaminasas. En el suero humano, por lo general, se
determinan dos tipos principales: la Glutámico Oxalacética (TGO) y Glutámico
Pirúvica (TGP).
Ellas catalizan las siguientes reacciones:
TGO
l-aspartato + α-cetoglutarato oxalacetato + glutamato

TGP
l-alanina + α-cetoglutarato piruvato + glutamato

El oxalacetato y el piruvato así formados, reaccionan con el reactivo


2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4 – DNFH), generando fenilhidrazonas, las
cuales en medio alcalino (NaOH) producen un complejo coloreado cuya
intensidad es proporcional a la actividad enzimática de transaminasas
en la muestra.

REACTIVOS:
1.- Sustrato TGO:
Solución conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfa-
cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
2.- Sustrato TGP:Solución conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2
mmol/l de alfa-
cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
3.- Reactivo 2,4-DNFH:
Solución conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en ácido
clorhídrico
1 mmol/l.
Esta solución es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.
4.- Standard de Calibración:
Solución de piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de
calibraciòn.
Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de
TGO.
5.- Hidróxido de Sodio para Enzimas:
Solución de hidròxido de sodio 4 mol/l
Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco a 1 litro de
agua destilada para así alcanzar la concentración requerida de NaOH
0.4mol/l.
Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco
de plástico y no de vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color
pues los vapores pueden contaminar ambos reactivos.

EXPERIMENTO A
DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS (TGO Y
TGP)
EN SUERO
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO ò TGP EN SUERO:
Preparar los tubos:

Blanco Muestra
Sustrato (TGO ò TGP) 0.5 ml 0.5 ml
Colocar en baño de agua a 37ºC unos minutos y luego agregar:

Muestra (suero) --- 100 Ul


Agua destilada 100 uL ---
Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:

Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 ml


Mezclar. Dejar 10 minutos a 37ºC. Luego agregar:
NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el
espectrofotòmetro a 505 nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con
agua destilada. Nota: Para el cálculo de resultados se debe emplear una
curva de calibración.
( Ver experimento B)

EXPERIMENTO B

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA CURVA DE


CALIBRACIÓN PARA TRANSAMINASAS

Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de
calibración para TGO y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:
Pipetear en dos series de tubos:

Tubo Agua Sustrato Standard de TGO TGP


destilada (ml) calibración (U/l) (U/l)
(ml) (ml)
I 0.2 1.00 0.00 0 0
II 0.2 0.95 0.05 7 9
III 0.2 0.90 0.10 12 18
IV 0.2 0.85 0.15 20 25
V 0.2 0.80 0.20 28 37
VI 0.2 0.75 0.25 37 46
VII 0.2 0.70 0.30 48 56
VIII 0.2 0.60 0.40 81 79
IX 0.2 0.50 0.50 --- 113

Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibración de TGO y sustrato TGP
para la curva de calibración de TGP, respectivamente.

Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.


Mezclar. Incubar 10 minutos a 37ºC.
Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.
Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.
Leer la tramitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El
color es estable durante solo 30 minutos.
Restar a cada lectura la obtenida con el tubo Nº1, obteniéndose las
Absorbancias Netas.
Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje
vertical, y en el eje horizontal las U/l de TGO ó TGP según sea el caso, que se
indica en la tabla superior.
Determinar en el gràfico los puntos correspondientes a cada tubo. Uniéndolos
se obtienen las curvas respectivas para TGO y TGP.
Tener en cuenta que para cada técnica debe utilizarse el gràfico
correspondiente.

VALORES DE REFERENCIA:
Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si
bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles
de transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse
sospechosos.

CUESTIONARIO:
1.- Explique en que consiste el fenómeno de transaminaciòn y donde
se realiza en el organismo?
2.- Que relación existe entre las transaminasas y las enfermedades
hepáticas?
3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de
miocardio?
4.- Señale cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de
transaminasas?
5.- Existe variación de transaminasas con la edad?
PRACTICA Nº 15

BALANCE NITROGENADO

El objetivo de esta pràctica es evaluar el metabolismo proteico


empleando el Balance Nitrogenado. Explicaremos los parámetros mas
representativos de la excreta nitrogenada en general.
Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24
horas y la excreción de nitrógeno creatinìnico urinario en 24 horas
empleando la fòrmula de nitrógeno total estimado (NTE), según Ramírez
Velasco.

FORMULA: BN = INGESTA N – (NTE + 2)

NTE = N. UREICO + N. CREATININICO

Excreción fecal : 2 gr/24 horas.

N Ingerido: gr de proteínas/6.25

Nota: Si el paciente presenta albuminuria, añadir a la excreta:


Proteína urinaria/6.25

EXPERIMENTO A : DETERMINACIÓN DE CREATININA


URINARIA

La creatinina se forma endógenamente en el metabolismo muscular y


es removida de la sangre por filtración glomerular y excretada en la
orina sin ser reabsorbida en los túbulos. Por lo tanto, es el riñón el que
regula, como ùnico órgano excretor, el nivel de creatinina en la sangre.
Si se restringe la función renal aumenta la creatinina en el plasma,
proporcionalmente a la lesión orgánica. Un aumento continuo aunque
escaso del nivel de creatinina en suero debe considerarse como un
signo de pronóstico desfavorable, ya que puede tratarse de una
irreparable restricción de la función renal.
Como se forma en el organismo, los factores exógenos no pueden influir
su nivel sèrico. Por este motivo la determinación simultánea de la
creatinina en suero y orina permite el cálculo del clearence o
depuración de creatinina y representa un método excelente de la
medida de la filtración glomerular.

FUNDAMENTOS DEL METODO:

En un medio alcalino que contiene picrato, la creatinina presente en la


muestra, reacciona con éste formando un complejo rojizo, cuya mayor
absorción se dà a 530 nm.

Creatinina + picrato Complejo creatinina-


picrato

REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solución de ácido pícrico 0.05M
Reactivo 2.- Solución de hidróxido de sodio 0.75N

PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.
Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera
los 2000 ml la prueba debe realizarse sin diluirla, pero en el momento
de realizar los cálculos en vez de multiplicar el resultado por 2000, debe
multiplicarse por el volumen total (ml).
Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)


Orina diluida --- --- 0.02
Standard --- 1.0 ---
Agua 2.5 1.5 2.5
Reactivo 1 3.5 3.5 3.5
Reactivo 2 1.0 1.0 1.0

Mezclar bien.
Después de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud
de onda de 530 nm contra el blanco.

CALCULOS:
Abs muestra
Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000
Abs standard

VALORES NORMALES: 500 – 1500 mg/24 h.

Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrógeno creatinìnico.

EXPERIMENTO B : DETERMINACIÓN DE UREA


URINARIA

El producto final màs importante del metabolismo proteico es la UREA.


Esta es excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra
sustancia.
Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una
inadecuada función excretora y por consiguiente de la función renal.
La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de
excreciòn renal insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal,
son los estados en los cuales se altera la circulación por el riñòn y Post-
renal por obstrucción de las vìas urinarias. Por ello la información màs
exacta con respecto a la habilidad excretora de la urea por los riñones
requiere de una comparación de la concentración de urea en sangre
(BUN) y en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una
dieta hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo
valor proteico.

FUNDAMENTOS DEL METODO:


La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amonìaco y dióxido
de carbono, mediante una reacción catalizada por la enzima ureasa:

Ureasa
Urea + H2O CO2 + 2 NH3

El amonìaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito


de sodio formando azul de indofenol. La intensidad de color azul es
proporcional a la cantidad de urea en la muestra.

REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solución de fenol y nitroprusiato de sodio.
Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N
Enzima.- Solución de ureasa.
PROCEDIMIENTO:
Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.
Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)


Standard --- 0.01 ---
Orina diluida --- --- 0.01
Enzima 2 gotas 2 gotas 2 gotas

Mezclar e incubar los tubos en un baño marìa a 37°C por 5 minutos.


Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de
los tubos.
Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml
del Reactivo 2.
Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a
37°C por 5 minutos.
Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.
Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un
espectrofotómetro a 540 nm vs el blanco.

CALCULOS:
Abs muestra
Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilución
Abs standard

Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.

VALORES NORMALES:
Nitrógeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs.
Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.

BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)

BN = ...................... gr/24 hrs.

CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en la práctica , calcular el balance
nitrogenado del paciente sabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24
horas .
2.- De donde proviene la creatinina?
3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?
4.- A que se llama BUN y que representa?
5.- Para que sirve la depuración de creatinina en orina de 24 horas?
6.- Que mide el índice Creatinina Urinaria 24 hs/ Talla, y porqué.