Chavez Aa

Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú. Decana de América

Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Profesional de Microbiología y Parasitología
Evaluación de la actividad inhibitoria de Gentianella

alborosea y Gentianella nitida contra la infección por
virus Zika y virus Dengue-2 en la línea celular Vero-76
TESIS
Para optar el Título Profesional de Bióloga Microbióloga
Parasitóloga
AUTOR
Alys Mercedes CHÁVEZ ALVARADO
ASESOR
Dra. Egma Marcelina MAYTA HUATUCO
Lima, Perú
2023
Reconocimiento - No Comercial - Compartir Igual - Sin restricciones adicionales
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Usted puede distribuir, remezclar, retocar, y crear a partir del documento original de modo no
comercial, siempre y cuando se dé crédito al autor del documento y se licencien las nuevas
creaciones bajo las mismas condiciones. No se permite aplicar términos legales o medidas
tecnológicas que restrinjan legalmente a otros a hacer cualquier cosa que permita esta licencia.
Referencia bibliográfica
Chávez, A. (2023). Evaluación de la actividad inhibitoria de Gentianella alborosea

y Gentianella nitida contra la infección por virus Zika y virus Dengue-2 en la línea
celular Vero-76. [Tesis de pregrado, Universidad Nacional Mayor de San Marcos,
Facultad de Ciencias Biológicas, Escuela Profesional de Microbiología y
Parasitología]. Repositorio institucional Cybertesis UNMSM.
Metadatos complementarios
Datos de autor
Nombres y apellidos Alys Mercedes Chávez Alvarado
Tipo de documento de identidad DNI
Número de documento de identidad 47290522
URL de ORCID https://orcid.org/0000-0002-1982-9762
Datos de asesor
Nombres y apellidos Egma Marcelina Mayta Huatuco
Tipo de documento de identidad DNI
URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-8471-1675
Datos del jurado
Presidente del jurado
Nombres y apellidos Enrique Walter Mamani Zapana
Tipo de documento DNI
Miembro del jurado 1
Nombres y apellidos Miguel Angel Francisco Talledo Rivera
Miembro del jurado 2
Nombres y apellidos Domingo Iparraguirre Leon
Datos de investigación
Línea de investigación A.1.3.1. Salud Pública
Virología Clínica Molecular

Grupo de investigación inmunopatogénesis y antivirales -
VIRMOLPA
Perú. Universidad Nacional Mayor de San

Marcos. Vicerrectorado de Investigación y
Posgrado. Programa de Proyectos de
Investigación conFinanciamiento para Grupos
de Investigación. B19100951-PCONFIGI.
Agencia de financiamiento
Perú. Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. Vicerrectorado de Investigación y
Posgrado. Programa de Promoción de Tesis
de Pregrado. B19100454-PTPGRADO.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Edificio: Facultad de Ciencias Biológicas.
Laboratorio de Virología Clínica y Molecular.
País: Perú
Ubicación geográfica de la Departamento: Lima
investigación Provincia: Lima
Distrito: Lima
Latitud: -12.0583
Longitud: -77.083
Año o rango de años en que se

Agosto 2019 - julio 2022
realizó la investigación
Virología
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.02
URL de disciplinas OCDE
Biología celular, Microbiología
Ciencias de las plantas, Botánica

A mi hermano Hans por todo su apoyo, cariño, guía, alegría y esa fortaleza y nobleza
que lo hace cada día mejor y admirable, eres lo más preciado e importante del mundo
para mí.
A mis padres Julián y Julia por todo su amor, confianza y apoyo incondicional, por
cuidarme y amarme tanto y por mostrarme que en la vida todo se puede si uno se
esfuerza y es buena persona.
A Dorian y Churrita por llenarme la vida de amor, alegría y pelitos.
i
AGRADECIMIENTOS
A mama Meche, que me cuida y me bendice. Agradezco a mis padres por ser el mejor
ejemplo de fortaleza, superación, trabajo y sobre todo de sencillez, humildad y
solidaridad, a mi hermano Hans, sin ti no lo hubiera logrado Moe, gracias por
cuidarme, apoyarme, defenderme y quererme tanto, tu fortaleza me inspira, estoy
orgullosa de ti siempre. Agradezco a toda mi familia, mis tíos, primos, sobrinos y en
especial a mi segunda madre mi tía Magnita, a los que son como mis hermanos
mayores Juber y Luchi, a mi querida prima Tania, a mi prima Heelen por todo tu
apoyo, comprensión y por mostrarme que ser familia va más allá de los lazos
sanguíneos, a las pequeñas Adeliz y Nilda por quererme tanto y por toda la felicidad
que tuvimos juntas y que seguimos teniendo, a mi tía Aida por su inmenso cariño y
protección, a mis abuelitos que están en el cielo Eusebio, Moisés y Gorgonia (Usicho,
Moshe y Culcuchita) grandes personas, ejemplos de una vida feliz y plena, a mi
abuelita Paula que aún está conmigo.
A mis amadas mascotas, que me enseñaron lo que significa amar incondicionalmente,

siguen presentes en mi corazón y me llenan de dicha desde el cielo. A Kripto Brad, mi
hermoso bebé kriptoniano. A Dorian y Churrita por su maravillosa existencia y todo su
amor.
A la Dra. Egma Mayta, mi asesora, por su confianza en mí en todos estos años en los
que soy miembro del laboratorio, por su apoyo y guía. Al Dr. Mauro Mariano por su
amabilidad y su ejemplo en vida.
Al Dr. Enrique Mamani por creer en mí, por su apoyo incondicional, guía, ejemplo y
preciada amistad. Al profesor Juan Sulca por su guía y esmero incondicional en este
trabajo, por inculcarme y formarme en el camino a la ciencia y la investigación, por su
amistad y sus consejos.
A la profesora Giovana Vadillo por compartir sus conocimientos, el apoyo a cada paso
del estudio de las plantas y por cada aventura en los viajes de investigación. A la
profesora Ingrid Collantes de la Universidad Nacional de Ingeniería por la cooperación
entre nuestras dos grandes universidades, por los conocimientos compartidos y su
gran labor.
A los miembros y amigos del Laboratorio de Virología Clínica y Molecular: Dilan

Agüero, Lucero Alva (Lu), Patrick Gonzales, Eduardo Urbano, Bernardo Quispe,
Rubén Arancibia, Harumy Rojas, Katty Paz, Any Velásquez, Brenda Ojanama, , Arturo
ii
Liñan, Joe Hermosilla, Adrían Quintana y María Alejandra Salas por todos los gratos
momentos juntos. Especialmente a mis amigos Lucas Sevilla y Karla Vásquez quienes
me recibieron e integraron al laboratorio desde el primer día y me hicieron sentir
bienvenida y a mi gran amigo José Vilela por su gran amistad y apoyo todos estos
años. Un agradecimiento especial a Sandra Landazabal y Stefany Valdiviano por
todas las noches en vela en el laboratorio, por su valiosa amistad y apoyo sin el cual
no hubiera sido posible este trabajo, nos unimos ante la adversidad y las tres juntas
salimos adelante.
A mis amigos de Micro base 12 Natalí Soto, Sarita Tupa, Alicia Palomino, Vivian
Paredes, Lizeth Laura, Brenda Caso, a mi mejor amiga Astrid Chumpitaz, a mi amigo
Poll Gonzales, Freddy Egusquiza, Kevin Flores, Kenyo Villanueva, David Cayulla,
Diego Marroquín por su amistad y todos los momentos vividos estos años.
A mis amigos de la facultad Diego Macedo, Wendy Lizárraga, Karen Barboza, Carlos
Llanos y Katherine Swahili Cárdenas, en especial a uno de mis mejores amigos Renzo
Winder Punil.
Al profesor Tito Libio por sus inquebrantables principios, al profesor Abad Flores por su
apoyo, al profesor León por la oportunidad y apoyo, a mi padrino el profesor Juan
Jiménez, a la profesora Débora Alvarado por ser ejemplo de principios y fortaleza.
A la hermana de vida y mejor amiga Naiza Pérez, gracias por tu amistad, apoyo,
comprensión, por no rendirte conmigo y por valorarme en tu vida. A mi gran amigo
Alex Pineda por estar pendiente de mí, por alentarme con cada llamada, mensaje,
audio, por los ánimos en los momentos difíciles.
Al doctor Luis Pineda por el gran apoyo que significa en mi vida, por todas sus
enseñanzas, por ser mi guía en los momentos difíciles, su preocupación y cariño.
A la señora Nelly Loayza y el señor Oscar Calle por su apoyo, cariño, confianza y por
cuidarme y valorarme.
Y finalmente pero no menos importante le agradezco al señor Armandito Alvarado,

César, señor Cacsire y Elmer por cada uno de los minutos extra que me dieron en los
laboratorios, por su paciencia y buena voluntad hacia mí.
iii
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ............................................................................................ iv
RESUMEN ................................................................................................................... ix
ABSTRACT .................................................................................................................. x
ABREVIATURAS ........................................................................................................ xi
LISTADO DE TABLAS Y FIGURAS.......................................................................... xiii
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
II. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 2
2.1 Generalidades.................................................................................................... 2
2.2 Clasificación ZIKV Y DENV ................................................................................. 2
2.3 Género Flavivirus ................................................................................................ 3
2.4 Ciclo de vida ........................................................................................................ 4
2.5 Tratamiento para la infección por DENV y ZIKV .................................................. 6
2.6 Vector.................................................................................................................. 7
2.7 Virus Zika ............................................................................................................ 7
2.7.1 Estructura viral .......................................................................................... 7
2.7.2 Genotipos ................................................................................................. 9
2.7.3 Tropismo ZIKV .......................................................................................... 9
2.7.4 Manifestaciones clínicas ZIKA.............................................................. 9
2.7.4.1 Infección aguda por ZIKV .................................................................... 9
2.7.4.2 Complicaciones de la infección aguda por ZIKV ............................. 10
2.7.4.3 Síndrome de Guillian-Barré ............................................................ 10
2.7.4.4 Infección congénita ......................................................................... 11
2.7.5 Patogénesis ............................................................................................ 12
2.7.6 Epidemiología ......................................................................................... 13
2.7.7 Ciclo de transmisión ............................................................................... 14
2.7.8 Distribución geográfica ........................................................................... 14
2.7.9 Vigilancia epidemiológica ........................................................................ 15
iv
2.7.10 Avances en terapia antiviral .................................................................. 15
2.7.11 Vacunas................................................................................................ 16
2.8 Virus Dengue..................................................................................................... 17
2.8.1 Serotipos virus Dengue........................................................................... 17
2.8.2 Estructura Viral ....................................................................................... 18
2.8.3 Tropismo DENV ...................................................................................... 19
2.8.4 Manifestaciones clínicas ......................................................................... 20
2.8.4.1 Dengue ........................................................................................... 20
2.8.4.2 Dengue Grave (DG)........................................................................ 21
2.8.5 Patogénesis ............................................................................................ 22
2.8.6 Epidemiología ......................................................................................... 23
2.8.7 Ciclo de transmisión ............................................................................... 24
2.8.8 Distribución geográfica ........................................................................... 26
2.8.9 Vigilancia epidemiológica ........................................................................ 26
2.8.10 Avances en terapia antiviral .................................................................. 27
2.8.11 Vacunas................................................................................................ 27
2.9 Plantas Antivirales ............................................................................................. 29
2.9.1 Estudios de Principios Activos ................................................................ 29
2.10 Gentianella alborosea y Gentianella nitida ....................................................... 30
2.10.1 Gentianella alborosea ........................................................................... 31
2.10.1.1 Taxonomía ...................................................................................... 31
2.10.1.2 Distribución geográfica .................................................................... 31
2.10.1.3 Medicina Tradicional ........................................................................ 32
2.10.1.4 Composición Química ..................................................................... 32
2.10.2 Gentianella nitida ............................................................................... 33
2.10.2.1 Taxonomía ...................................................................................... 33
2.10.2.2 Distribución geográfica .................................................................... 33
2.10.2.3 Medicina Tradicional ........................................................................ 33
2.10.2.4 Composición Química ..................................................................... 34
v
2.11 Aceites Esenciales .......................................................................................... 35
2.11.1 Actividad antiviral de los Aceites Esenciales ......................................... 35
2.12 Hidrodestilación por arrastre de vapor para la obtención de aceites esenciales ..

.......................................................................................................................... 36
2.13 Cultivo Celular ............................................................................................... 38
2.14 Prueba de Neutralización por Reducción De Placas (PRNT)...................... 38
2.15 Prueba de Reducción de Placas (PRP) ........................................................ 39
III. HIPÓTESIS .......................................................................................................... 40

IV. OBJETIVOS ........................................................................................................ 40
V. MATERIALES...................................................................................................... 41
5.1 Material Biológico .............................................................................................. 41
5.2 Reactivos .......................................................................................................... 41
5.3 Equipos ............................................................................................................. 42
5.4 Materiales Generales ........................................................................................ 42
VI. METODOLOGÍA .................................................................................................. 43

6.1 Colecta de Gentianella alborosea y Gentianella nitida ....................................... 43
6.2 Extracción de Aceites Esenciales ...................................................................... 44
6.3 Activación de Líneas Celulares ......................................................................... 44
6.4 Prueba de citotoxicidad de los aceites esenciales de Gentianella alborosea y

Gentianella nitida..................................................................................................... 46
6.5 Propagación de semillas virales de ZIKV Y DENV-2 en la línea celular Vero-76 ..

.......................................................................................................................... 47
6.6 Cosecha Viral .................................................................................................... 47
6.7 Titulación de la Semilla Viral.............................................................................. 48
6.7.1 Prueba de plaqueo para titulación de ZIKV en la línea celular VERO-76 ..

...................................................................................................................... 48
6.7.2 Prueba de plaqueo para titulación de DENV-2 en la línea celular VERO-

76 .................................................................................................................... 48
6.8 Prueba de Reducción De Placas (PRP) ............................................................ 50
6.8.1 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV ............................................ 50
6.8.2 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2 ....................................... 51
vi
6.9 Análisis Estadísticos .......................................................................................... 51
VII. RESULTADOS .................................................................................................... 52

7.1 Extracción de los aceites esenciales.................................................................. 52
7.1.1 Extracción del aceite esencial de Gentianella alborosea......................... 52
7.1.2 Extracción del aceite esencial de Gentianella nitida................................ 52
7.2 Prueba de Citotoxicidad de los aceites esenciales: ............................................ 53
7.2.1 Prueba de Citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella alborosea en

línea celular VERO-76. .................................................................................... 53
7.2.2 Citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella nitida en línea celular

VERO-76. ........................................................................................................ 53
7.3 Titulación Viral: .................................................................................................. 54
7.3.1 Ensayo de Placa para titulación de ZIKV en la línea celular VERO-76 ......
...................................................................................................................... 54
7.3.2 Ensayo de placa para titulación de DENV-2 en la línea celular VERO-76 ...
...................................................................................................................... 55
7.4 Prueba de Reducción De Placas (PRP) ............................................................ 56
7.4.1 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV ............................................ 56
7.4.1.1 Prueba de Reducción de Placas utilizando el aceite esencial de

Gentianella alborosea ................................................................................... 56

Gentianella nitida .......................................................................................... 58
7.4.1.3 Control viral (CV) para ZIKV .............................................................. 60
7.4.2 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2 ....................................... 61

Gentianella alborosea ................................................................................... 61

Gentianella nitida .......................................................................................... 63
7.4.2.3 Control viral (CV) para DENV-2 ......................................................... 65
VIII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS .......................................................................... 66
IX. CONCLUSIONES ................................................................................................ 71
X. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 72
vii
XI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 73
XII. ANEXOS.............................................................................................................. 86
ANEXO 1: Colecta de Gentianella alborosea y Gentianella nitida ........................... 86
ANEXO 2: Constancias de Identificación ................................................................. 91
ANEXO 3: Composición de Medios de Cultivo Celular ............................................ 93
ANEXO 4: Cálculos Numéricos de los Procedimientos ........................................... 95
ANEXO 5: Prueba de Citotoxicidad de los aceites esenciales sobre la Línea celular

Vero-76 ................................................................................................................... 96
ANEXO 6: Efecto Citopático (ECP) del ZIKV y DENV-2 sobre la línea celular Vero-76
.......................................................................................................................... 97
ANEXO 7: Placas de los Ensayos de Titulación de ZIKV y DENV-2 ........................ 99
ANEXO 8: Prueba de Reducción de Placa (PRP) ................................................. 101
ANEXO 9: Flujogramas ......................................................................................... 106
viii
RESUMEN
Los virus Zika (ZIKV) y Dengue (DENV) del género Flavivirus, son patógenos
emergentes ampliamente distribuidos en las regiones tropicales y subtropicales del
planeta representando una amenaza inminente para las poblaciones de regiones
endémicas y un importante problema global de salud pública por mitigar. ZIKV se
encuentra asociado con el desarrollo de microcefalia y otras malformaciones fatales en
humanos, mientras DENV puede inducir desde un cuadro de enfermedad leve hasta
llegar a un síndrome de fiebre hemorrágica grave (FHD) / choque por dengue (DSS).
Hasta ahora ninguna terapia específica ha sido aprobada para tratar ZIKV ó DENV,
por lo que existe una fuerte necesidad del desarrollo de antivirales.
El objetivo del presente estudio consistió en evaluar el potencial de la actividad

antiviral de las plantas medicinales Gentianella alborosea y Gentianella nitida frente a
la infección por ZIKV y DENV-2 en la línea celular VERO-76. Los aceites esenciales
fueron obtenidos mediante sistema de hidrodestilación por arrastre de vapor, usando
éter de petróleo como solvente. Para la prueba de citotoxicidad se utilizó la línea
celular VERO-76 en monocapa en placas de cultivo celular de 96 pozos. El aceite
esencial fue diluido en tween 80–etanol (2:1) por triplicado, encontrando un punto de
corte no citotóxico para el aceite esencial de Gentianella alborosea a la concentración
140.5 µg/ml y de 131.4 µg/ml para Gentianella nitida. El efecto antiviral fue evaluado a
través de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) obteniendo un porcentaje de
inhibición de 54.30% para ZIKV con Gentianella alborosea a una concentración de
46.83 µg y un 41.2% de inhibición con Gentianella nitida a una concentración de 43.8
µg. Asimismo, DENV-2 presentó un 51.7% de inhibición por Gentianella alborosea a
una concentración de 28.10 µg y de 42.11% con Gentianella nitida a una
concentración de 26.28 µg. Los aceites esenciales de Gentianella alborosea y
Gentianella nitida muestran un efecto potencial antiviral frente a ZIKV y DENV-2, por lo
que se sugiere futuros estudios relacionados.
Palabras Clave: Zika, Dengue, Gentianella alborosea, Gentianella nitida, antivirales,

aceite esencial, VERO-76.
ix
ABSTRACT
Zika virus (ZIKV) and Dengue virus (DENV) belonging to the Flavivirus genus are
emerging pathogens widely distributed in tropical and subtropical regions of the world
representing an imminent threat to populations in endemic regions and an important
global public health problem to mitigate. ZIKV is associated with the development of
microcephaly and other fatal malformations in humans, while DENV can induce mild to
severe dengue hemorrhagic fever syndrome (DHF)/dengue shock syndrome (DSS).
Until now, no specific therapy has been approved to treat ZIKV or DENV, so there is a
strong need for the development of antivirals.
The objective of the present study was to evaluate the potential antiviral activity of the
medicinal plants Gentianella alborosea and Gentianella nitida against ZIKV and DENV-
2 infection in the VERO-76 cell line. The essential oils were obtained by means of a
hydrodistillation system using petroleum ether as solvent. For the cytotoxicity test, the
VERO-76 cell line was used in monolayer in 96-well cell culture plates. The essential
oil was diluted in tween 80-ethanol (2:1) in triplicate, finding a non-cytotoxic cut-off
point for the essential oil of Gentianella alborosea at concentration 140.5 µg/ml and
131.4 µg/ml for Gentianella nitida. The antiviral effect was evaluated through the
Plaque Reduction Test (PRT) obtaining an inhibition percentage of 54.3% for ZIKV with
Gentianella alborosea at a concentration of 46.83 µg and 41.2% inhibition with
Gentianella nitida at a concentration of 43.8 µg. Likewise, DENV-2 showed 51.7%
inhibition by Gentianella alborosea at a concentration of 28.1 µg and 42.11% inhibition
by Gentianella nitida at a concentration of 26.28 µg. The essential oils of Gentianella
alborosea and Gentianella nitida show a potential antiviral effect against ZIKV and
DENV-2, which is why future related studies are suggested.
Keywords: Zika, Dengue, Gentianella alborosea, Gentianella nitida, antiviral activity,

essential oil, VERO-76.
x
ABREVIATURAS
ADE : Amplificación de la infección dependiente de anticuerpos

(Antibody-dependent Enhancement)
AE : Aceite esencial
AINES : Antiinflamatorios no esteroideos
ARNg : ARN genómico viral
CDC : Centro para el Control de Enfermedades
CZS : Síndrome de Zika congénito
DENV : Virus del Dengue
DENV-2 : Virus del Dengue serotipo 2.
DF : Fiebre del dengue (Dengue Fever)
DHF : Fiebre hemorrágica del Dengue (Dengue Hemorrhagic fever)
DMEM : Medio Eagle modificado Dubelcco
DMSO : Dimetil sulfóxido
DSS : Síndrome de Shock por Dengue (Dengue Shock Syndrome)
ECP : Efecto citopático
HSV-1 : Virus herpes simple 1
HSV-2 : Virus herpes simple 2
IAV : Virus de influenza tipo A
IFN : Interferón
IgY : Anticuerpos derivados de yema de huevo,
MC : Medio de crecimiento
MNCC : Concentración máxima no citotóxca
mi-ARN : microARN
MM : Medio de mantenimiento
OAS : fenómeno del antígeno original
OMS : Organización Mundial de la Salud
ORF : Marco de lectura abierto
PRNT : Prueba de Neutralización por Reducción de Placas
PRP : Prueba de Reducción de Placas.
qRT-PCR : Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con
transcriptasa inversa.
RdRP : ARN dependiente de ARN polimerasa
RE : Retículo endoplásmico
xi
SARS-CoV-2 : Coronavirus relacionado al síndrome respiratorio agudo
severo-2
DE : Desviación estándar
SE : semana epidemiológica
si-ARN : ARN pequeño de interferencia
TLR : Receptores tipo toll
UTR : Regiones no traducidas
YFV : Virus de la fiebre amarilla
ZIKV : Virus del Zika
xii
LISTADO DE TABLAS Y FIGURAS
LISTADO DE TABLAS
TABLA 1. Relación peso de Gentianella alborosea procesada en gramos (g) y

cantidad de aceite esencial obtenido en peso (g) y volumen (ml).
TABLA 2. Relación peso de Gentianella nitida procesada en gramos (g) y cantidad de

aceite esencial obtenido en peso (g) y volumen (ml).
TABLA 3. Resultados de la Prueba de Citotoxicidad de diluciones del aceite esencial

de Gentianella alborosea sobre la línea celular VERO-76.
TABLA 4. Resultados de la Prueba de Citotoxicidad de diluciones del aceite esencial

de Gentianella nitida sobre la línea celular VERO-76.
TABLA 5. Titulación de semilla viral de ZIKV pasaje 3 en la línea celular VERO – 76
TABLA 6: Titulación de semilla viral de DENV-2 en la línea celular VERO – 76
TABLA 7. Ajuste de cálculo de título viral para DENV-2.
TABLA 8. Resultados de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el ZIKV

utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea.
TABLA 9. Resultados de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el ZIKV

utilizando el aceite esencial de Gentianella nitida.
TABLA 10. Controles virales obtenidos en las Pruebas de Reducción de Placas (PRP)
contra ZIKV.
TABLA 11. Resultados de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el DENV-2

utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea.
TABLA 12. Resultados de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el DENV-2

TABLA 13. Controles virales obtenidos en las Pruebas de Reducción de Placas (PRP)
contra DENV-2.
xiii
LISTADO DE FIGURAS
Figura 01. Representación esquemática del árbol de distancias de los cuatro grupos
ecológicos de Flavivirus
Figura 02. ARN viral circular durante la replicación de los Flavivirus.
Figura 03. Ciclo de vida de los Flavivirus
Figura 04. Mapa global de la distribución prevista de Aedes aegypti
Figura 05. Diagrama del virus del Zika
Figura 06. Conjuntivitis y exantema generado por ZIKV
Figura 07. Países con riesgo de presentación de ZIKV
Figura 08. Distintas plataformas de vacunas disponibles para la prevención y el control

de la infección por ZIKV en humanos
Figura 09. Diagrama del virus del Dengue
Figura 10. Transmisión de virus del Dengue
Figura 11. Países con riesgo de presentación de DENV
Figura 12. Resumen de los ensayos de eficacia de las vacunas contra DENV en niños
de América Latina y Asia.
Figura 13. Gentianella alborosea (Gentianaceae) encontrada en Cajamarca-Perú
Figura 14. Estructura química del sesterperpeno Alborosin aislado de Gentianella

alborosea.
Figura 15. Flores de Gentianella nitida.
Figura 16. Estructura química del secoiridoide Amaronitidina.
Figura 17. Aparato tipo Clevenger modificado: Procedimiento de Hidrodestilación por

arrastre de vapor.
Figura 18. Distribución de las diluciones de los aceites esenciales, los controles de
tween–etanol y control celular.
xiv
Figura 19. Diagrama de cajas de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el
ZIKV utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea.
Figura 20. Porcentaje de Inhibición obtenido sobre el ZIKV en cada dilución del aceite
esencial (AE) de Gentianella alborosea.
Figura 21. Diagrama de cajas de la Prueba Reducción de Placas (PRP) para el ZIKV
esencial (AE) de Gentianella nitida.
Figura 23. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en las
Pruebas de Reducción de Placas (PRP) contra ZIKV.
Figura 24. Diagrama de cajas de la Prueba de Inhibición por Reducción de Placas

(PIRP) para el DENV-2 utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea.
Figura 25. Porcentaje de Inhibición obtenido sobre el DENV-2 en cada dilución del
aceite esencial (AE) de Gentianella alborosea.
Figura 26. Diagrama de cajas de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el

DENV-2 usando el aceite esencial de Gentianella nitida.
Figura 27. Porcentaje de Inhibición obtenido sobre el DENV-2 en cada dilución del
aceite esencial (AE) de Gentianella nitida.
Figura 28. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en la
prueba de reducción de placas (PRP) contra DENV-2.
xv
I. INTRODUCCIÓN
Los virus del Dengue (DENV) y Zika (ZIKV) son importantes problemas globales de
salud pública, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales, donde se está
ampliando las zonas de cobertura debido al incremento de los insectos vectores dado
por el calentamiento global. DENV es uno de los patógenos letales en las regiones
climáticas cálidas del mundo (Begum, Das, Mukherjee, & Ray, 2019), mientras Zika se
encuentra asociado con el desarrollo de microcefalia y otras malformaciones fetales en
humanos (Lahon et al., 2016).
Debido a la gran importancia de ZIKV y DENV como problemas globales de salud

pública, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales del planeta, a la
extensión de las zonas de presencia de los insectos vectores debido al cambio
climático de origen antropogénico y a la falta de vacunas eficaces y antivirales para
combatirlos, los estudios de componentes con potencial antiviral se han extendiendo
durante las últimas décadas. Se ha destacado el estudio de prometedores compuestos
bioactivos para desarrollar antivirales presentes como metabolitos secundarios en
plantas medicinales ampliamente usadas en medicina tradicional en las regiones
afectadas, donde los esfuerzos enfocados en el control y el desarrollo de nuevos
tratamientos son cada vez más requeridos (Ichsyani et al., 2017; Meneses, Torres, et
al., 2009; Nogueira Sobrinho et al., 2021) .
El presente estudio ha evaluado el potencial antiviral in vitro de los aceites esenciales

obtenidos de las plantas originarias de Sudamérica, Gentianella alborosea y
Gentianella nitida contra ZIKV y DENV-2, en la línea celular VERO-76, mediante la
Prueba de Reducción de Placas (PRP).
1
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades
Zika es una enfermedad emergente reportada por primera vez en Uganda en un mono
centinela en 1947 y posteriormente fue encontrada en infecciones humanas en África y
Asia entre 1960 y 1980, acompañada de una enfermedad leve, siendo el primer gran
brote reportado en Micronesia en 2007. Entre 2013-2015 ZIKV fue asociado con el
síndrome de Guillain Barré y casos de microcefalia en la Polinesia Francesa y en
Brasil, siendo desde el 2016 declarada emergencia de salud pública de interés
internacional, por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Centro para el
Control de Enfermedades (CDC) al confirmarse su asociación con microcefalia y otras
complicaciones neurológicas neonatales mientras se extendía por las Américas
(Kindhauser et al., 2016).
El dengue es la enfermedad transmitida por mosquitos más ampliamente distribuida en

las regiones tropicales y subtropicales, particularmente en Asia y América latina. El
dengue es endémico en más de 100 países y se estima que más de 2.500 millones de
personas (40% de la población mundial) está en riesgo de contraer la infección
(Aliyu et al., 2019; Stanaway et al., 2016). Se calcula que DENV produce alrededor de
390 millones de infecciones (96 millones de ellas sintomáticas) y 20.000 muertes cada
año (OPS/OMS, 2019). En los últimos 40 años, la incidencia de DENV en la población
humana se ha ido multiplicando y en las últimas dos décadas se ha ido convirtiendo en
el Arbovirus de mayor importancia clínica (Corrales-Aguilar 2012).
Tanto Zika como Dengue al tener transmisión vectorial, presentan una gran
problemática en las regiones tropicales y subtropicales endémicas, por ende, la
importancia del desarrollo de nuevos tratamientos y terapias antivirales.
2.2 Clasificación ZIKV Y DENV
ZIKV y DENV pertenecen a la familia Flaviviridae, género Flavivirus. El genoma viral

está compuesto de ARN lineal, monocatenario, de sentido positivo, rodeado por una
envoltura lipídica. (Akhtar, 2019; Bamford, 2021; Wang-Shick Ryu, 2017).
2
2.3 Género Flavivirus
Los flavivirus son virus de ARN de cadena simple, sentido positivo con envoltura que
se encuentran entre los virus más diversos con más de 85 especies reconocidas, la
mayoría de importancia para la salud pública humana; por ejemplo, los virus del
dengue, la fiebre amarilla y el Zika, son transmitidos por artrópodos (arbovirus) y
tienen dos ciclos de transmisión, evolutiva y ecológicamente distintos: un ciclo de
transmisión selvático, en el que el virus circula entre el reservorio de vertebrados
zoonóticos y hospedadores de amplificación y mosquitos arbóreos; y un ciclo de
transmisión urbana, donde el virus circula entre humanos y mosquitos del
género Aedes (Vasilakis y Weaver, 2017).
Figura 1. Representación esquemática del árbol de distancias de los cuatro grupos ecológicos de
Flavivirus. Tomado de Villordo et al., (2016). RNA Structure Duplications and Flavivirus Host Adaptation.
In Trends in Microbiology (Vol. 24, Issue 4, pp. 270–283). Elsevier Ltd.
https://doi.org/10.1016/j.tim.2016.01.002
3
2.4 Ciclo de vida
Los virus del ZIKV y Dengue al pertenecer a la familia Flaviviridae, género Flavivirus
de manera similar a otros virus ARN, presentan un ciclo replicativo que ocurre en el
citoplasma y que puede ser dividido en tres fases principales: Ingreso, Traducción y
Replicación de ARN y Morfogénesis (Wang-Shick Ryu, 2017).
2.4.1 Ingreso: Los Flavivirus ingresan a una célula huésped a través de endocitosis
mediada por receptor después de que la proteína E se una a los receptores de la
superficie celular. Al momento del ingreso se produce una disminución de pH que
desencadena el cambio conformacional de la proteína E, que lleva a la fusión de la
membrana lipídica viral con la membrana endocítica y la liberación del genoma de
ARN viral en el citoplasma celular.
2.4.2 Traducción y replicación: el ARN viral que codifica un ORF único, es

traducido en una poliproteína que a su vez es escindida en diez proteínas
(estructurales y no estructurales). Después de la traducción, una polimerasa ARN
dependiente de ARN (RdRp) derivada de la proteína NS5 sintetiza una cadena
complementaria negativa del ARN de la cadena positiva que forma genoma viral.
Esta hebra negativa luego sirve como molde para la síntesis de una nueva hebra
positiva que será utilizada como genoma viral para los futuros viriones (Shaily &
Upadhya, 2019).
El ARN positivo es convertido en forma circular a través de una interacción

intramolecular de ARN-ARN entre las regiones 5´ y 3´ terminales. Este sirve como
molde para la síntesis de ARN negativo complementario, el cual es reconocido por
la polimerasa NS5 como elemento promotor (conocido como tallo-bucle A) en el
extremo 5´, y a su vez se inicia la síntesis de ARN de sentido negativo en el
extremo 3´.
4
Figura 02. ARN viral circular durante la replicación de los Flavivirus. Tomado de Yabar Carlos (2003). “Rol
de las proteínas no estructurales en los eventos de replicación del ARN del virus Dengue: Propuesta de
un modelo de replicación del ARN”. Rev Peru Med Exp Salud Pública, 20(1), 51–57.
La síntesis de ARN de sentido negativo y positivo es mediada por la actividad de la

polimerasa NS5, junto con las actividades helicasa NS3 y NTPasa que son requeridas
durante la síntesis de ARN de sentido positivo. El ARN naciente de sentido positivo
recibe el proceso de puesta de caperuza ó “capping”. El ARN cubierto 5´ luego a su
vez es metilado.
La replicación del genoma viral ocurre en el citoplasma en paquetes de vesículas, que

se forman en el retículo endoplásmico (RE), las cuales contienen la maquinaría de
replicación esencial. El ARN genómico viral (ARNg), más la cápside luego brota fuera
de RE, recubierto con una bicapa lipídica que contiene prM y proteínas E (Akhtar,
2019).
2.4.3 Morfogénesis: Los viriones inmaduros son transferidos a través de vesículas

a la red de Golgi donde las proteínas de superficie se someten a modificaciones
postraduccionales, como el procesamiento de prM a la proteína M de membrana
por una proteasa similar a la furina. Las partículas virales son liberadas de las
células al medio extracelular en vesículas exocíticas transportadas a la superficie
celular y van madurando a medida que las enzimas celulares escinden la prM, lo
que resulta en la liberación de virus maduros a la superficie celular. Los viriones
maduros son liberados de la célula infectada por exocitosis 10 a 12 h después de la
infección (Akhtar, 2020; Bamford, 2021; Shaily & Upadhya, 2019; Wang-Shick Ryu,
2017).
5
Figura 03. Ciclo de vida de los Flavivirus. De manera similar a otros virus ARN, los Flavivirus se
encuentran restringidos al citoplasma. Tomado de Wang-Shick Ryu. “Molecular virology of human
pathogenic viruses”. Chapter 12, Flaviviruses. Elsevier 2017. ISBN: 9780128009994
2.5 Tratamiento para la infección por DENV y ZIKV
No existe un tratamiento antiviral específico para las infecciones por DENV y ZIKV, por
lo que la terapia de soporte es importante para la recuperación de los pacientes y
especialmente para reducir los índices de letalidad. Esencialmente, se debe brindar
terapia con líquidos y analgésicos para reducir el dolor, incluyendo el uso de
antipiréticos. Medicamentos como el paracetamol o la dipirona son de uso común,
pero cabe destacar que debe evitarse el uso de antiinflamatorios no esteroideos
(AINES) en mujeres embarazadas, así como la administración de aspirina en el caso
del DENV (Jasamai et al., 2019).
En general, existe una gran necesidad de encontrar nuevos fármacos antivirales

adecuados tanto para la prevención y control de ZIKV como del DENV, explorando
nuevas opciones terapéuticas como citocinas, inhibidores de la ARN polimerasa,
microARN (mi-ARN), ARN pequeños de interferencia (si-ARN), anticuerpos derivados
de yema de huevo (IgY), fagos, receptores tipo toll (TLR), probióticos,
hierbas/extractos de plantas, inmunomoduladores y nano tratamientos basados en
nuevas tecnologías (Pérez-Pérez et al., 2022).
6
2.6 Vector
ZIKV y DENV son transmitidos a las personas principalmente por la picadura de los
mosquitos del género Aedes. Aedes aegypti y Aedes albopictus, son reconocidos
como los principales vectores, siendo A. aegypti, el más común en ambientes urbanos,
mientras que A. albopictus, introducido recientemente en las Américas, es más
propenso a los entornos rurales (Segura et al., 2021). La distribución global de ambos
mosquitos se extenderá bajo el escenario de cambio climático actual y venidero
(Laporta et al., 2023)
Figura 4. Mapa global de la distribución prevista de Aedes aegypti. Tomado de (Kraemer et al., 2015).
The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. ELife, 4.
https://doi.org/10.7554/eLife.08347
2.7 Virus Zika
ZIKV es un virus emergente descubierto en África en 1947, inicialmente con signos de

enfermedad leve con fiebre, sarpullido y dolor. El virus permaneció en silencio durante
casi 60 años hasta los brotes recientes del 2003 y 2013 en las islas del Pacífico, y
2015 en América, donde fue asociado a varias enfermedades neurológicas, como el
síndrome de Guillain-Barré en adultos y el desarrollo de microcefalia y otras
malformaciones en recién nacidos. (Lahon et al., 2016)
2.7.1 Estructura viral
El virión de ZIKV tiene un diámetro de 50 nm y un tamaño de genoma de 11 kb, el cual

codifica para tres proteínas estructurales: la proteína de envoltura (E), de la cápside
(C) y de premembrana/membrana (prM/M), la proteína structural M existe como prM
7
(forma inmadura) que es clivada en pr y M con la ayuda de la enzima furina; así como
para siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NSP3, NS4A, NS4B y NS5)
en un único ORF acompañado de regiones UTR en los extremos 5´ y 3´ (Bamford,
2021).
Las proteínas no estructurales de los Flavivirus realizan varias funciones que abarcan
el ensamblaje del genoma, la transcripción del genoma y la evasión inmune innata:
NS1 suele estar asociada a la membrana y tener formas variadas, siendo requerida
para la replicación de ARN, contribuyendo a la evasión inmune (siendo un blanco
inmunogénico) y suele ser utilizada también para pruebas serológicas diagnósticas.
Por su parte, NS2B, NS4A y NS4B también son requeridas para la replicación del
genoma viral y NS3 junto con el Cofactor NS2B, la ARN helicasa y la proteasa. NS5
funciona como una metiltransferasa y una polimerasa ARN dependiente de ARN
(RdRp). Muchas de las proteínas no estructurales del ZIKV tienen funciones
secundarias al antagonizar directamente la respuesta inmunitaria innata en el nivel de
señalización de interferón tipo I (IFN) (Bamford, 2021).
Figura 05. Diagrama del virus del ZIKA. Se indican la estructura del virus y su genoma. Tomado de Singh,
R. K. et al (2016). Zika virus- “Emergence, evolution, pathology, diagnosis, and control: current global
scenario and future perspectives – A comprehensive review.” Veterinary Quarterly, 36(3), 150–175.
https://doi.org/10.1080/01652176.2016.1188333
8
2.7.2 Genotipos
ZIKV es clasificado en dos genotipos, el africano y el asiático, nombrados a partir de la

región geográfica donde fue identificado por primera vez. El linaje africano, el cual fue
detectado por primera vez, ha sido aislado de varias regiones de África (Uganda,
Nigeria), y la evidencia sugiere que las infecciones por ZIKV en humanos son
frecuentes. Por su parte el linaje asiático circula por el sudeste de Asia y por el
Pacifico, denominado “PreAM-ZIKV” y se ha diferenciado en el linaje epidémico
americano conocido como “Am-ZIKV” (Faye et al., 2020; Seabra et al., 2022).
2.7.3 Tropismo ZIKV
ZIKV exhibe un amplio tropismo y persistencia en tejidos y fluidos corporales en el

huésped mamífero. Los principales tejidos donde hay persistencia y propagación viral
son el tejido nervioso, ocular, testicular y placentario. Asimismo, ZIKV puede ser
detectado en múltiples fluidos corporales, incluido lágrimas, saliva, semen,
secreciones vaginales, orina, líquido cefalorraquídeo, y líquido amniótico, células de la
placenta, (trofoblastos, células endoteliales); células neuronales (células progenitoras,
neuronas maduras y astrocitos); tejidos oculares (córnea, la retina neurosensorial,
nervio óptico y humor acuoso de la cámara anterior), células del tracto reproductivo
(espermatogonias, células de Sertoli / Leydig, esperma, epitelio vaginal y fibroblastos
uterinos); hepatocitos, células epiteliales, fibroblastos, células de tejido renal, células
mononucleares de sangre periférica, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas
(Miner & Diamond, 2017).
La gran capacidad del virus para persistir, acceder a varios órganos privilegiados es
una cuestión de preocupación ya que predispone a los individuos infectados a
enfermedades autoinmunes y dificulta el tratamiento. (Miner & Diamond, 2017; Shaily
& Upadhya, 2019).
2.7.4 Manifestaciones clínicas ZIKA
2.7.4.1 Infección aguda por ZIKV
El período de incubación del ZIKV es de 3 a 14 días y por lo general la infección suele

ser asintomática para la mayoría de las personas o ser síntomas leves: clásicamente
son erupción máculo-papular, seguido de prurito, postración, cefalea, artralgia, mialgia,
9
conjuntivitis y dolor de espalda. De manera particular, la mayoría de los pacientes con
infección aguda no presentan fiebre, la cual es observada solo en 1/3 de los pacientes
y típicamente breve, de bajo grado en comparación con aquellos pacientes con otras
infecciones como Chikunguña o dengue (Calvet et al., 2016).
Figura 06. Conjuntivitis y exantema generado por ZIKV. Tomado de Calvet, G. A., dos Santos, F. B., &
Sequeira, P. C. (2016). Zika virus infection: Epidemiology, clinical manifestations and diagnosis. In Current
Opinion in Infectious Diseases (Vol. 29, Issue 5, pp. 459–466). Lippincott Williams and Wilkins.
https://doi.org/10.1097/QCO.0000000000000301
2.7.4.2 Complicaciones de la infección aguda por ZIKV
La mayoría de las personas con infección aguda por ZIKV suelen recuperarse sin
complicaciones, sin embargo, durante la epidemia en 2015-2016 se reportaron casos
de complicaciones inusuales, que incluyeron complicaciones neurológicas graves
como microcefalia, meningoencefalitis, encefalopatía, polineuropatía sensitiva aguda,
convulsiones, Síndrome de Guillain-Barré y encefalomielitis diseminada aguda; así
como un aumento de las malformaciones congénitas diversas y trastornos oculares
como iridociclitis, uveítis, maculopatía y coriorretinitis aguda (Calvet et al., 2016).
2.7.4.3 Síndrome de Guillian-Barré
De todas las complicaciones neurológicas asociadas a la enfermedad, el Síndrome de

Guillain-Barré, ha recibido la mayor atención. Esta complicación es un proceso
inmunomediado agudo de parálisis flácida progresiva, observado por primera vez, en
la Polinesia Francesa, donde fue asociado con un riesgo 34 veces mayor de presentar
el síndrome. A su vez, observaciones en Brasil y otros países americanos (Colombia,
10
República Dominicana, El Salvador, Honduras, Surinam y Venezuela), también
documentaron un incremento de 2 a 10 veces en este diagnóstico (Calvet et al., 2016).
2.7.4.4 Infección congénita
Durante la pandemia de ZIKV del 2015-2016 se evidenció el potencial del virus para
generar efectos teratogénicos graves si la infección ocurre durante el embarazo.
Reportes de anomalías del sistema nervioso central, incluyendo microcefalia,
deficiencias neurológicas (anomalías motoras y epilepsia), anomalías oculares,
artrogriposis y déficit auditivo fueron mencionadas principalmente (Hussain et al.,
2018).
Las anomalías fetales/infantiles fueron clasificadas desde leves a graves. La CDC

creó el término “síndrome de Zika congénito” (CZS) para describir los hallazgos en
bebés gravemente afectados, incluyendo: 1. Microcefalia severa (>3 desviaciones
estándar (DE) por debajo de la media para la edad gestacional y sexo; 2.
Anormalidades cerebrales (calcificaciones subcorticales, ventriculomegalia,
adelgazamiento cortical, anomalías del patrón de giro, hipoplasia cerebelar o
anomalías del cuerpo calloso; 3. Hallazgos oculares; 4. Contracturas congénitas y 5.
Deterioro neurológico (Hussain et al., 2018).
Actualmente, se estima que hay más de 3700 infantes con CZS confirmados por
laboratorio en todo el mundo (la mayoría residentes en Brasil) y esta cifra
probablemente está siendo subestimada. Diversos reportes de infantes de Brasil con
microcefalia por ZIKV, evidencian anomalías cerebrales graves asociadas, como
calcificaciones, malformaciones corticales (lisencefalia, paquigiria, agiria y
ventriculomegalia dada por la atrofia cerebral); artrogriposis y pie zambo, tan graves
que incluso pueden resultar en luxaciones congénitas de cadera o rodilla; pérdida
auditiva neurosensorial y anomalías oculares como manchas pigmentarias retinales
focales, hormigueo, atrofia coriorretiniana, cambios en el nervio óptico, subluxación del
cristalino, pérdida del reflejo foveal, colobomas de iris, microoftalmia, cataratas,
intraocular, calcificaciones y miopía. Otros problemas crónicos descritos incluyen
epilepsia y espasmos infantiles (Calvet et al., 2016; Hussain et al., 2018; Quanquin et
al., 2019). Actualmente, ZIKV es el único virus transmitido por mosquitos asociado por
causar malformaciones fetales en humanos con una frecuencia tan alta (Lahon et al.,
2016).
11
2.7.5 Patogénesis
Dentro de las células infectadas, utilizando la maquinaria del huésped, ZIKV provoca
apoptosis/muerte celular, autofagia, desregulación del ciclo celular e inducción de
mitosis anormal (Ramos da Silva et al., 2018); y al tener ZIKV un extenso tropismo
afecta la funcionalidad de muchos órganos vitales como el cerebro, el ojo, los
testículos y la placenta. Estos órganos apoyan la infección, la amplificación viral y
pueden servir como reservorios del virus (Shaily & Upadhya, 2019).
Sin embargo, existen variaciones en la patogénesis entre los distintos genotipos de

ZIKV: las epidemias humanas por ZIKV hasta la fecha han sido causadas por cepas
pertenecientes al genotipo asiático, y solo estas han sido relacionadas con anomalías
congénitas y trastornos neurológicos. El genotipo africano tiene una mayor
transmisibilidad, pero exhibe una menor eficiencia de replicación en células de
vertebrados al compararse a linaje asiático (Theberge et al., 2022).
Asimismo, se reporta que la región de mayor variabilidad genética entre los genotipos,
ocurre en la proteína prM dentro de porción 'pr', con cambios múltiples de aminoácidos
conocidos en la posición 17. La secuencia consenso del genotipo africano muestra
una serina en la posición 17, mientras que el genotipo asiático ha modificado este a
una asparagina. Este cambio ha sido fuertemente asociado con un aumento en la
neurovirulencia y microcefalia en un modelo ratón. Por otra parte, la presencia de un
motivo de glicosilación-N (secuencia: N-X-S/T) en los codones 154–156 de la proteína
E en el genotipo asiático, ha sido asociado con cambios en la afinidad de unión y
tropismo a la célula huésped, facilitando la neuroinvasividad (Theberge et al., 2022).
Por otra parte, la proteína de unión a fosfatidilserina anexina V ha mostrado inhibe

competitivamente la infección de células Vero por el genotipo asiático PRVABC59,
pero no afecta la infección por el genotipo africano MR-766, lo que sugiere que el
linaje asiático tiene la capacidad de entrada a la célula huésped a través de adsorción
mediada por fosfatidilserina, probablemente a través de su unión a la proteína
específica de detención del crecimiento 6 (Gas6), que a su vez se une a AXL, un
receptor de tirosina quinasa. AXL regula a la baja la respuesta de señalización de IFN,
acelerando así la infección. Luego de unirse a AXL, ZIKV ingresa a la célula a través
de endocitosis mediada por clatrina, y es transferido a endosomas cerebrales
análogos a Ras para establecer la infección. Esto facilita la migración a los ganglios
linfáticos y el torrente sanguíneo. También se indica, que el genotipo asiático ZIKV
12
FSS13025 infecta las células endoteliales fetales de manera más eficiente por tener
una mayor afinidad de unión a Gas6, que a su vez ayuda en su interacción con AXL.
Todos estos hallazgos en conjunto podrían explicar las diferencias entre las
presentaciones del genotipo africano y asiático del ZIKV (Theberge et al., 2022).
2.7.6 Epidemiología
Desde que ZIKV fue descubierto en 1947, presentó poca repercusión en los sistemas
de salud pública global, hasta el 2007 donde fue detectado por primera vez fuera de
Asia y África. En octubre de 2013, ZIKV llegó a la Polinesia provocando el mayor
brote de ZIKV jamás descrito aprox. 30.000 personas donde fueron reportadas
manifestaciones neurológicas y un aumento en la presentación del síndrome de
Guillan-Barré. Luego ZIKV se propagó rápidamente a otras islas del Pacífico y en el
2014 se reportó y confirmó el primer caso sospechoso en Chile y en inicios del 2015
en Brasil. Esto proporcionó datos sobre la asociación entre microcefalia y/o trastornos
neurológicos por la infección, así que la OMS en febrero de 2016, declaró la epidemia
de ZIKV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional. Varios
casos importados de infección por ZIKV fueron reportados por viajeros de Europa,
América, Asia y el Pacífico que regresaban de áreas endémicas con la epidemia ZIKV
en curso (Calvet et al., 2016).
Los datos de la OMS mencionan que actualmente aprox. 3700 bebés tienen síndrome
de Zika congénito confirmado por laboratorio, la mayoría de los cuales están en Brasil.
En el 2016, el CDC con la creación del Registro de Embarazo ZIKV realizó
seguimiento a las mujeres embarazadas; los datos recopilados calculan que
aproximadamente del 5 al 15 % de los bebés presentaron defectos o se vieron
afectados cuando la infección materna fue adquirida durante el primer trimestre del
embarazo y se encontraron tasas mucho más altas de anormalidades en infantes de
Brasil. Asimismo, un estudio comparativo calculo en 20 veces aprox. la tasa de
incremento en presentación de defectos al nacimiento, de 2.86 nacidos vivos a 58.8
por 1000 nacidos vivos a causa de la infección por ZIKV. Dada la transmisión continua
de ZIKV en muchos países, y el riesgo que representa, particularmente para las
mujeres embarazadas, las advertencias de viaje siguen vigentes en muchas regiones
del mundo (Calvet et al., 2016; Quanquin et al., 2019).
13
2.7.7 Ciclo de transmisión
Los mosquitos del género Aedes ponen huevos en áreas de alta humedad, sufriendo
metamorfosis de larvas a pupas y finalmente a la forma adulta (duración de ciclo entre
1 semana y ½ a 3 semanas aprox.). Cuando el mosquito hembra adulto ingiere
sangre, al picar humanos y animales, puede producir en promedio de 100 a 200
huevos por lote (Hussain et al., 2018).
El virus se encuentra en primates no humanos en las selvas tropicales y ocurre allí el

ciclo selvático, cuando los mosquitos Aedes consumen sangre de chimpancés, monos
y babuinos. Otras subespecies de mosquitos Aedes, A. Africanus, A. furcifer-taylori y
A. dalzieli, pueden encontrarse en el ciclo selvático de transmisión. Asimismo, cuando
los mosquitos Aedes, toman sangre de los humanos, el ciclo selvático pasa al ciclo
urbano, y donde el virus puede también ser transmitido de forma horizontal de persona
a persona a través de relaciones sexuales, transfusiones de sangre y transmisión
vertical en el útero (Hussain et al., 2018).
2.7.8 Distribución geográfica
Las áreas con riesgo de presentar epidemias por ZIKV se encuentran ubicadas en las
regiones tropicales y subtropicales del planeta, en regiones de África, Asia, América e
Islas del Pacifico.
14
Figura 07. Países con riesgo de presentación de ZIKV, distribuidos en regiones tropicales y
subtropicales. Tomado de https://wwwnc.cdc.gov/travel/files/zika-areas-of-risk.pdf. 2022
2.7.9 Vigilancia epidemiológica
En América, desde la primera detección en marzo de 2015 en Brasil, se confirmó la

transmisión local en todos los países de las Américas, exceptuando Chile continental,
Uruguay y Canadá (OPS/OMS, 2021).
En 2016, fueron notificados 651.590 casos con una reducción significativa de la

transmisión en los años siguientes. Para el 2021, hasta la semana epidemiológica
(SE) 22, fueron notificados 6.012 casos de ZIKV, incluida una defunción. La mayor
cantidad de casos sospechosos se presentaron en Brasil con 5092 casos (85%), en
segundo lugar, Guatemala con 522 casos (9%) y tercero, Paraguay con 112 casos
(2%). La disminución en el número de casos de ZIKV notificados, a partir del 2020,
coincide con el inicio de la pandemia de COVID-19 que podría haber afectado las
capacidades de vigilancia de las arbovirosis por la saturación de los servicios de salud
(OPS/OMS, 2021).
En nuestro país desde la SE 1 hasta la 7 de 2022, se notificaron 7 casos de virus del

ZIKV y no se reportan muertes en lo que va del año. Durante el mismo periodo, en el
2018 se notificaron 209 casos; con una tasa de incidencia de 0.65 casos por cada
100.000 habitantes sin casos de defunción (MINSA, 2019, 2022).
2.7.10 Avances en terapia antiviral
Se tiene el reporte en China del uso del compuesto “Xiyanping”, un compuesto

semisintético, preparado a partir de la planta medicinal Andrographis paniculata para el
tratamiento de ZIKV, junto a la terapia de soporte brindando buenos resultados. El
componente químico presente en Xiyanping es el 9-dehidro-17-hidro-androgra-foluro y
sodio 9-dehidro-17-hidro-androgra-sulfato de foluro-19-ilo el cual posee propiedades
antiinflamatorias y actividad antiviral (Deng et al., 2016).
También están disponibles tratamientos sintomáticos de condiciones asociadas al

ZIKV, como la derivación ventriculoperitoneal (VP) en microcefalia, medicamentos para
tratar problemas del ritmo cardíaco, analgésicos para la artralgia, manejo del glaucoma
y otras opciones de tratamiento paliativo. Condiciones congénitas como la microcefalia
o lisencefalia son mucho más difíciles de tratar y pueden requerir tratamientos más
invasivos (Hussain et al., 2018).
15
2.7.11 Vacunas
La Organización Mundial de la Salud, dentro de los objetivos publicados en el 2017

para el desarrollo de una vacuna contra zika, señala principalmente que esta debe
permitir la protección en dos escenarios: El primer escenario durante un brote o
inminente brote epidémico, donde, con el fin de prevenir riesgos asociados como el
síndrome del zika congénito (CZS), la vacuna proteja sobre todo a mujeres en edad
reproductiva y mujeres gestantes. El segundo escenario se traza sobre un periodo
inter-epidémico que permita campañas de vacunación a la población en general,
desde niños hasta adultos con el fin de establecer una inmunidad comunitaria (World
Health Organization, 2017).
Para el caso de ZIKV aún no se encuentra vacuna disponible, pero la vacuna

candidata ADN VRC5283 (con codificación de prM y E) se encuentra en fase II y se
tienen otras doce opciones candidatas en pruebas de fase I. (Abbink et al., 2018;
Amorim & Birbrair, 2022; Quanquin et al., 2019; Roy & Bhattacharjee, 2021; Torres-
Flores et al., 2022a)
El National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) desarrolló la vacuna

VRC5283, consiste en un plásmido de ADN que codifica el precursor de la proteína de
transmembrana M (prM) y la proteína de envoltura E de una cepa salvaje de ZIKV
(H/PF/2013). Los resultados de la fase I de los ensayos clínicos mostraron que la
vacuna presentó alta inmunogenicidad y buena protección. En el 2017 iniciaron los
ensayos clínicos de la fase II/IIb para evaluar su seguridad, inmunogenicidad y eficacia
(Gaudinski et al., 2018; Pattnaik et al., 2020; Wilder-Smith, 2020).
16
Figura 08. Distintas plataformas de vacunas disponibles para la prevención y el control de la infección
por ZIKV en humanos. Tomado de (Singh et al., 2018). Prevention and Control Strategies to Counter
Zika Virus, a Special Focus on Intervention Approaches against Vector Mosquitoes—Current Updates.
Frontiers in Microbiology, 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00087
2.8 Virus Dengue
DENV forma un complejo de virus dentro del género Flavivirus, que consta de cuatro
serotipos antigénicamente relacionados. DENV fue aislado por primera vez en 1943
por Hotta y Kimura. En 1945 se asilaron cepas de virus de pacientes provenientes de
Nueva Guinea, India y Hawái, de las cuales un grupo era antigénicamente similar y fue
llamado serotipo 1 y otro grupo de cepas proveniente de Nueva Guinea
antigénicamente distinta al primer grupo que se denominó serotipo 2. Más delante de
aislaron los serotipos 3 y 4 durante una epidemia en Filipinas en 1956 (Murugesan &
Manoharan, 2020).
2.8.1 Serotipos virus Dengue
DENV es clasificado en 4 serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3, y DENV-4 cada uno

compartiendo aproximadamente el 60%-70% de homología en secuencias
17
aminoacídicas. Estos serotipos suelen causar presentaciones clínicas variables en el
huésped, que van desde una enfermedad leve similar a la gripe hasta síntomas graves
de fiebre hemorrágica mortal o síndrome de shock por dengue (Flipse et al., 2016).
Por su parte DENV-5 fue detectado por primera vez en Malasia en octubre 2013 en un
agricultor ingresado en un hospital local en el 2007. La evaluación filogenética viral
reveló que DENV-5 presentaba similitud genética con los otros cuatro serotipos, lo que
apunta a un origen ancestral común, sin embargo, fue clasificado en un clado diferente
(Mustafa et al., 2015).
2.8.2 Estructura Viral
El virión de DENV tiene 50 nm de diámetro y un tamaño del genoma de 11 kb. El

genoma de DENV codifica tres proteínas estructurales y siete no estructurales en un
único marco de lectura abierto (ORF), acompañado por dos regiones no traducidas
(UTR) a cada lado. Las tres proteínas estructurales incluyen la nucleocápside (C), una
proteína asociada a la membrana (M) y una glicoproteína de envoltura (E). Las siete
proteínas no estructurales son NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. Como
componentes del virión, las proteínas estructurales trabajan en la entrada, fusión y
ensamblaje viral, mientras que las proteínas no estructurales trabajan en la replicación
viral. Los dominios funcionales responsables de la neutralización del virus, la
hemaglutinación, la fusión y la interacción con los receptores del virus son asociados a
la proteína E. (Akhtar, 2020).
18
Figura 09. Diagrama del virus del Dengue (DENV) y del ARN genómico. Se indican las proteínas
estructurales (C, E y M) y no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). Tomado de
Souza, L. R., Colonna, J. G., Comodaro, J. M., & Naveca, F. G. (2022). “Using amino acids co-occurrence
matrices and explainability model to investigate patterns in dengue virus proteins”. BMC Bioinformatics,
23(1), 80. https://doi.org/10.1186/s12859-022-04597-y
2.8.3 Tropismo DENV
Una gran diferencia en la replicación de DENV entre las diferentes líneas celulares y
las células en el huésped infectado ha sido observada por este virus: DENV replica
bien en varias líneas celulares, pero in vivo solo replica en pocos tipos de células. Esto
ha sido explicado en base a la señalización del IFN que juega un papel muy
importante en el control de la permisividad de DENV en los huéspedes infectados. Las
líneas celulares inmortalizadas utilizadas para estudiar infecciones por DENV son
deficientes en la respuesta de IFN y, por lo tanto, altamente permisivas para DENV
(Begum et al., 2019).
Estudios acerca de sitios de replicación de DENV han encontrado resultados diversos,

pocas células respaldan la replicación de DENV de manera consistente, mientras que
otras muestran una susceptibilidad variable a la infección. La investigación en el tema
hasta ahora no ha logrado destacar las células específicas “absolutamente” necesarias
19
para la replicación. Se conoce que los órganos y tejidos humanos donde DENV
multiplica extensamente son sangre, piel, bazo, ganglio linfático e hígado y los
estudios realizados en otros órganos (cerebro, timo, corazón, riñón, GI tracto y médula
ósea) y han mostrado resultados contradictorios, por lo tanto, se requiere de un
conocimiento más profundo sobre las células diana y los receptores, para lograr
diseñar antivirales contra DENV, apuntando al tropismo y previniendo la progresión de
la fiebre a una infección severa o prevenir la infección extensa hacia los órganos
vitales (Begum et al., 2019).
2.8.4 Manifestaciones clínicas
Desde el 2009 la Organización Mundial de la Salud ha clasificado la infección humana

producida por DENV en 2 sistemas: Dengue que se manifiesta como una enfermedad
febril autolimitada benigna antes denominada fiebre del dengue (DF) caracterizada por
síntomas “similares a la gripe” y Dengue Grave que causa una enfermedad grave y
potencialmente mortal antes denominada Fiebre hemorrágica del Dengue (DHF) que
puede conducir a un shock hipovolémico conocido como Síndrome de Shock por
dengue (DSS) (Gubler, 2002; Roy & Bhattacharjee, 2021).
2.8.4.1 Dengue
1. Dengue sin Signos de Alarma (DSSA)
Es la forma clásica de la enfermedad, con un período de incubación entre 3-14 días

(generalmente 4 a 7) y se observa fiebre repentina acompañada de dolor de cabeza,
dolor ocular, mialgias y artralgias generalizadas, enrojecimiento de la cara, anorexia,
dolor abdominal y náuseas.
Las características clínicas manifestadas por los pacientes con DENV frecuentemente
depende de la edad del paciente: los bebés y niños pequeños pueden presentar una
enfermedad febril indiferenciada con exantema, mientras los niños mayores y adultos
pueden presentar un síndrome febril leve o una enfermedad incapacitante clásica
(OPS, 1994). Generalmente, la infección es autolimitante y el paciente se recupera
luego de 7 a 10 días de enfermedad, pero pueden presentarse convalecencias de
varias semanas (Roy & Bhattacharjee, 2021).
20
Cabe destacar que después de una infección primaria por DENV, una persona
desarrolla inmunidad de por vida al serotipo infectante pero no a los otros serotipos,
estos últimos representan un riesgo durante una posible segunda infección pudiendo
ocasionar un caso grave de fiebre hemorrágica.
2. Dengue con Signos de Alarma (DCSA)
Suele presentarse luego de la etapa Sin Signos de Alarma que indican la posible
evolución del paciente a un cuadro de dengue grave. Los signos de alarma son: dolor
abdominal intenso, los vómitos se hacen más frecuentes, acumulación de líquidos,
irritabilidad, complicaciones hemorrágicas como: hemorragias gastrointestinales,
cutáneas, de mucosas y gingival, hepatomegalia y aumento del hematocrito. Los
pacientes que lo presentan deben estar en constante vigilancia médica (Martínez
Torres, 2008; Organización Panamericana de la Salud, 2016)
2.8.4.2 Dengue Grave (DG)
Es importante diferenciar los casos de Dengue con Signos de Alarma versus casos de
Dengue Grave: los pacientes con Signos de Alarma pueden tener hemorragia severa,
pero sin la presencia de aumento de la permeabilidad vascular, lo cual es una
característica de la patogénesis de Dengue Grave. Durante el tiempo de
defervescencia, la condición del paciente se deteriora repentinamente con la
presentación de las manifestaciones hemorrágicas con o sin síntomas de hipovolemia
por pérdida de plasma. El aumento de la permeabilidad vascular permite la pérdida de
plasma hacia los espacios intersticiales resultando en derrame pleural, un hallazgo
que no siempre se acompaña de manifestaciones hemorrágicas (Andrew P. Gatto and
Benjamin S. Leon, 2012; Whitehead et al., 2007).
La Fiebre hemorrágica del Dengue (DHF) / Síndrome de Shock por dengue (DSS) son
la forma severa de la infección por DENV. Se presenta un trastorno vascular
generado por una respuesta inmunológica exacerbada, la cual produce citoquinas y
otros mediadores químicos, que conduce a un aumento de la permeabilidad vascular
conllevando a la pérdida de líquidos, hipovolemia, shock y muerte si no se recibe
tratamiento. De forma menos común pueden presentarse otras manifestaciones
graves de la enfermedad, como hemorragia masiva, insuficiencia orgánica y
21
enfermedad neurológica similar a una encefalitis viral (Andrew P. Gatto and Benjamin
S. Leon, 2012).
Las manifestaciones hemorrágicas de la DFH incluyen: fragilidad capilar; petequias,
equimosis o púrpura; hematemesis o melena y sangrado de mucosas, de tracto
gastrointestinal u otros sitios. El síndrome de shock por dengue es asociado con
manifestaciones hemorrágicas que ocurren por pérdida severa de plasma y aumentan
el riesgo de muerte. Signos de insuficiencia circulatoria, como piel fría y húmeda, pulso
rápido y débil, son observadas. Los pacientes se vuelven inquietos y luego pasan
rápidamente a una etapa crítica de conmoción (OPS, 1994; Whitehead et al., 2007).
La hipótesis comúnmente aceptada para explicar el DHF/DSS severo es conocida

como: amplificación de la infección dependiente de anticuerpos (ADE), donde los
anticuerpos heterólogos de una infección previa por DENV reconocen los virus
infectantes de una nueva infección y forman complejos antígeno-anticuerpo que son
internalizados por leucocitos, principalmente macrófagos, pero los virus no logran ser
neutralizados por los anticuerpos previos, y al ser internalizados por la célula, solo se
facilita la entrada y consecuentemente la replicación viral, resultando en una
intensificación de la infección por DENV. Aunque varios estudios correlacionan la
ocurrencia de DHF con infecciones secundarias basadas en la teoría ADE, otros
factores de riesgo para DHF/DSS han sido relacionados: tiempo entre infecciones,
edad, origen étnico, antecedentes genéticos del huésped, estado nutricional de los
pacientes infectados, secuencia de serotipos infectantes, respuesta inmune entre
otros. Sin embargo, “la infección secundaria con otro serotipo” parece ser uno de los
factores de riesgo para desarrollar DHF/DSS a través de un proceso inmunopatológico
dependiente de anticuerpos (Gatto and León, 2012; Cáceres Munar et al., 2019).
2.8.5 Patogénesis
El daño de las células endoteliales es un factor clave en la fisiopatología del dengue

grave, que aumenta la permeabilidad vascular manifestándose como fuga de plasma,
coagulación descontrolada y daño a los órganos (Cáceres Munar et al., 2019).
La patogenia de la infección por DENV es atribuida a la interacción compleja de 4

factores: factores del huésped como la amplificación dependiente de anticuerpos
(ADE), la reacción cruzada de las células T, los anticuerpos anti-DENV NS1, la
autoinmunidad, junto a las variaciones genéticas virales/huésped. Los anticuerpos
22
anti-DENV y la proteína NS1 se creen los responsables de la patogenia del dengue
grave, así como la respuesta aumentada de citoquinas de las células T CD4+
reactivas, generada por la infección secuencial con diferentes serotipos de DENV, que
conlleva a una respuesta inmunitaria perjudicial. La mejora dependiente de
anticuerpos mediada por el receptor Fcγ (ADE) resulta en la liberación exagerada de
citoquinas que conduce a la disfunción de las células endoteliales vasculares y el
aumento de la permeabilidad vascular. Asimismo, la variación genómica del DENV
altera la respuesta inmune del huésped y es determinante de la gravedad de la
enfermedad: DENV puede conducir a la generación de autoanticuerpos contra el
antígeno NS1 del DENV, prM y proteínas E, que pueden reaccionar de forma cruzada
con varios antígenos propios, como plasminógeno, integrina y plaquetas. Además, los
factores genéticos del hospedador y los polimorfismos genéticos también desempeñan
un papel en la patogénesis. (Bhatt et al., 2021).
2.8.6 Epidemiología
La incidencia del DENV ha aumentado dramáticamente en los últimos 50 años (30

veces aprox.), y DENV ha sido incluida en el listado de enfermedades
emergentes/reemergentes debido a la expansión de áreas epidémicas y la
presentación clínica de DHF/DSS. La primera epidemia registrada de DENV se
remonta a 1779 con brotes en Asia, África y América del Norte; ya para en 1953 los
dos primeros casos de dengue hemorrágico fueron reportados en Filipinas y
posteriormente, anualmente se vienen reportando epidemias de forma cíclica en
diversos países de regiones tropicales y subtropicales, notificando casos de DHF con
diferentes serotipos del DENV (Roy & Bhattacharjee, 2021).
El crecimiento demográfico descontrolado, la falta de planificación adecuada en zonas

rurales y urbanas, el control inefectivo de los mosquitos vector, sistemas de aguas
residuales y alcantarillado inadecuados y el mayor movimiento de personas dado por
la globalización, han sido los principales factores relacionados con el aumento de la
incidencia y propagación de DENV. Igualmente, factores como el clima, la densidad
poblacional y de vectores, y la presencia de reservorios también están implicados con
la emergencia del dengue en algunas áreas (Roy & Bhattacharjee, 2021).
Adicionalmente, los análisis filogenéticos sugieren que las cepas más virulentas están
reemplazando a las que menor impacto epidemiológico, y también esto puede haber
23
contribuido con el incremento global de infecciones por DENV. Con la co-circulación
de múltiples serotipos de DENV, aparece la fiebre hemorrágica del dengue (DHF) en
1954, como un problema de salud pública en Manila, Filipinas, y se extiende
gradualmente a otros países de la región del sudeste asiático. Brotes de DHF
ocurrieron en el sur de Asia en la década de 1960, y la primera gran epidemia por
DENV se presenta en Sri Lanka, en 1989. Las Américas informan casos esporádicos
sospechosos de FHD durante 1960-1970 y la primera epidemia de FHD ocurrió en
Cuba en 1981, con un total de casi 345.000 casos, de los cuales 10.000 son
clasificados como graves y se reportan 158 defunciones. Aislamientos de los serotipos
DENV-1, 2 y 4 fueron obtenidos en el brote. En los años siguientes, se notifica
DHF/DSS en otros países de las Américas, con grandes brotes epidémicos ocurridos
en Brasil, El Salvador, Puerto Rico, Colombia y Venezuela (Gatto and Leon, 2012).
Para 1995, la transmisión del dengue es mantenida en más de 100 países, con casos
de DHF/DSS en la mayor parte de las Américas y el Sudeste Asiático. Para 1998, se
notifican 1.2 millones de casos de DF y FHD/DSS en 56 países del mundo y el 2001
se establece como el año de mayor epidemia de DENV en la historia. Cabe destacar
que en las Américas, Brasil representa aproximadamente el 70% de casos notificados
de DENV durante los últimos años. La OMS ha estimado que 2500 y 3000 millones de
personas que viven en países tropicales y subtropicales están en riesgo de infección
por DENV y puede haber 50 millones de infecciones en todo el mundo cada año, de
las cuales 500.000 casos serán de FHD y al menos podría haber 22.000 muertes por
DHF/DSS (Gatto and Leon, 2012; Roy & Bhattacharjee, 2021).
2.8.7 Ciclo de transmisión
DENV presenta la particularidad de ser el “único” arbovirus adaptado completamente a

los humanos, perdiendo la necesidad de un ciclo enzoótico para su mantenimiento y
esto le da la capacidad de mantenerse en grandes áreas urbanas, presentando un
ciclo eficiente de transmisión humano-mosquito-humano independiente de los
reservorios animales. La contribución del ciclo selvático a la transmisión del dengue a
humanos es desconocida, pero parece ser mínima. Aunque, algunos estudios han
identificado que aún se mantienen reservorios en selvas de África y el sudeste de
Asia, donde el ciclo de transmisión enzoótica de DENV involucra mosquitos Aedes y
primates no humanos, como monos; a nivel general, el ciclo de transmisión más
importante es el endémico/epidémico urbano en los grandes centros, dado que, en las
24
aldeas rurales o islas, que tienen poca población humana, los virus DENV se propagan
rápidamente, y con el tiempo la población desarrolla inmunidad (Tavodova & Pgdip,
2012; Whitehead et al., 2007).
Figura 10. Transmisión de virus del dengue (DENV). Tomado de: Whitehead, S. S., Blaney, J. E., Durbin,
A. P., & Murphy, B. R. (2007). Prospects for a dengue virus vaccine. Nature Reviews Microbiology, 5(7),
518–528. https://doi.org/10.1038/nrmicro1690
DENV replica primero en el mosquito vector, donde la replicación ocurre en diferentes

tejidos y luego de replicar en las glándulas salivales, los mosquitos ya pueden
transmitir el virus a personas no infectadas. Después de un período de incubación de 3
a 14 días (promedio 4 a 7), mientras que la persona puede experimentar la aparición
de los síntomas de DENV, los virus pueden circular en la sangre periférica y cuando
los mosquitos pican a la persona enferma, los mosquitos se infectan y pueden
continuar la transmisión. Cabe destacar que los Aedes a menudo se alimentan de
varias personas durante una sola comida de sangre, y durante el día hay dos picos de
actividad de picadura de los mosquitos: en la mañana temprano, 2 a 3 horas después
del amanecer y en las tardes varias horas antes del anochecer. Asimismo, los huevos
suelen ser puestos en ambientes cálidos y húmedos en lugares cercanos a las casas y
pueden resistir más de 1 año en condiciones de desecación, lo que facilita la
supervivencia del mosquito durante condiciones climáticas adversas. (Gatto and Leon,
2012; Tavodova & Pgdip, 2012).
25
2.8.8 Distribución geográfica
DENV se encuentra presente en 128 países del mundo, localizados en las regiones
tropicales y subtropicales, dentro de zonas urbanas, periurbanas o rurales (Laporta et
al., 2023; Messina et al., 2019).
Figura 11. Países con riesgo de presentación de DENV. Riesgo frecuente o continuo: ocurren brotes
frecuentes o hay transmisión continua. Riesgo esporádico o incierto: el riesgo varía y es impredecible.
Tomado de: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Centro Nacional de Enfermedades
Infecciosas Zoonóticas y Emergentes (NCEZID) 2021.
https://www.cdc.gov/dengue/es/areaswithrisk/around-the-world.html
2.8.9 Vigilancia epidemiológica
En América, fueron notificados un total de 673.148 de casos de DENV entre la SE 1 y

la SE 22 de 2021, con una tasa de incidencia de 68 casos por cada 100.000
habitantes. La más alta proporción de casos fue en Brasil con 559.587 casos (83%),
seguido de Perú con 28.086 casos (4%) y Nicaragua 18.943 casos (3%). El número
más alto de casos de dengue grave fueron observados en Colombia 212 casos, Brasil
172 y Honduras 164 y fue notificada un total de 149 muertes en la Región (tasa de
letalidad 0.022%) (OPS/OMS, 2021).
En Perú, hasta la SE 14 del 2022 se notificaron 26.045 casos de DENV, incluido 31

fallecimientos y una incidencia de 78 casos por cada 100.00 habitantes. En el 2021
durante la misma semana fueron reportados 15.284 casos con 12 muertes y una
incidencia de 46 casos por cada 100.00 habitantes (MINSA, 2022).
26
En febrero de 2023, el Gobierno peruano declaró en emergencia sanitaria a causa del
brote de dengue por el plazo de 90 días calendario en 59 distritos de 13 regiones del
país, con el fin de fortalecer y agilizar las medidas de control poblacional en caso de
un brote de dengue, que conlleva un alto riesgo de mortalidad. Hasta la SE 05-2023 se
notificaron 9259 casos de DENV, reportando 15 fallecimientos con un incremento de
73.64% durante el mismo período en el año 2022. De los casos actuales se menciona
el 88.4% corresponde a dengue sin signos de alarma (DSSA), el 11.2% a dengue con
signos de alarma (DCSA) y el 0.4% a dengue grave (DG). Se tienen registrados 96
personas hospitalizadas a nivel nacional de las cuales 7 están en UCI. El número de
casos reportados por el Centro Nacional de Epidemiología, Prevención y Control de
Enfermedades (CDC Perú), a la semana epidemiología (SE) 6, notificó 11 585 casos
de dengue en el país y 16 defunciones (MINSA, 2023a). Hasta la semana
epidemiológica (SE) 15-2023 se notificaron 47 655 casos (confirmados y probables),
incluyendo 49 fallecidos, representando un 87,3% de incremento en los casos
respecto al mismo periodo del año 2022 y de un 146,7% en comparación al año 2017,
año donde el fenómeno natural “Niño costero” produjo la mayor epidemia de dengue
de la historia del Perú (MINSA, 2023a).
2.8.10 Avances en terapia antiviral
Varios compuestos han sido evaluados observando una buena actividad antiviral
contra DENV, tales como los extractos de varias algas marinas, ribavirina en
combinación con brequinar, glycyrrhizina, el análogo de uridina 6-azauridina, el
análogo del nucleósido adenosina, NITD008, la curcumina y sus análogos. Sin
embargo, hasta el momento no existe ningún tratamiento antiviral aprobado (Hussain
et al., 2018; Singh et al., 2016).
2.8.11 Vacunas
La vacuna tetravalente CYT-TDV (Dengvaxia ®) de Sanofi Pasteur, fue la primera

vacuna en obtener la aprobación regulatoria para su uso contra el dengue. Contiene 4
virus recombinantes diseñados a partir de los 4 serotipos de Dengue y de las proteínas
de la cápside viral de la vacuna YF-17D; sin embargo, esta vacuna presenta ciertas
limitaciones (Godói et al., 2017).
La eficacia de la vacuna está altamente correlacionada con la edad, y el estado
serológico previo (exposición a la enfermedad); es decir, que la vacuna es eficaz a un
81.9% en los individuos seropositivos proporcionando una buena y alta protección,
27
mientras que, en individuos seronegativos presenta una eficacia de 52.5%
proporcionando protección baja y no significativa, aumentando del riesgo relativo de
hospitalización por dengue (Dorigatti et al., 2018). Tomando todas las limitaciones en
cuenta, la OMS recomienda el uso de esta vacuna solo en zonas endémicas de la
enfermedad y previo a un screening que determine el estado serológico de la persona
antes de la vacunación y solo vacunar a los individuos seropositivos (World Health
Organization, 2018).
Actualmente, cuatro opciones de vacunas candidatas para DENV se encuentran en

pruebas de fase I, y dos vacunas tetravalentes a virus vivo atenuado están siendo
evaluadas en grandes ensayos clínicos en la actualidad: TAK-003 DENVax y LATV
TV003/TV005 (Torres-Flores et al., 2022b).
Figura 12. Resumen de los ensayos de eficacia de las vacunas contra DENV en niños de América Latina
y Asia. Se han realizado ensayos clínicos de fase III para Dengvaxia y DENVax con resultados mixtos.
TV003/TV005 está siendo sometida actualmente a ensayos clínicos de fase III. Tomado de (Torres-Flores
et al., 2022b). Dengue Vaccines: An Update. BioDrugs, 36(3), 325–336. https://doi.org/10.1007/s40259-
022-00531-z
28
2.9 Plantas Antivirales
2.9.1 Estudios de Principios Activos
Según la OMS, el 80% de la población de ciertos países asiáticos y africanos depende

de los medicamentos tradicionales para la atención primaria debido a limitaciones
económicas y geográficas. Similarmente, en nuestra región muchos extractos
naturales de origen natural son utilizados en el tratamiento de diversas enfermedades
y muchos de ellos aún sin información científica que valide sus propiedades.
La mayoría de las investigaciones sobre plantas antivirales se encuentran aún en

etapas iniciales y se requiere una mayor caracterización. En el caso de DENV, varios
estudios in vitro, in silico y/o de citotoxicidad han demostrado efectos antiDENV en
varios extractos de algas y plantas como Acacia catechu, Acorus calamus, Allium
sativum, Alternanthera philoxeroides, Andrographis paniculata, Arrabidaea pulchra,
Basilicum polystachyon, Boerhaavia diffusia, Carica papaya, Castanospermum
australe, Chondrus crispus, Cissampelos pareira, Glycyrrhiza glabra, Quercus
lusitánica, Myristica fatua entre otras. Otra investigación reciente reporta que los
inhibidores de la proteasa viral NS2B/NS3, podrían ser la vía para combatir los pan-
serotipos de DENV, al haber obtenido una disminución en un 80 % de la infección in
vitro en células tratadas (Astani & Schnitzler, 2014; de Castro Barbosa et al., 2022;
Ericka Vista et al., 2020).
En el caso de ZIKV, se encuentran algunos estudios donde se mencionan varios

extractos de plantas como posibles candidatos antivirales: Momordica charantia,
Psidium guajava, Vitex negundo, Blumea balsamífera, y los compuestos bioactivos
aislados de plantas como la Curcumina, Lycorina, Baicalein e Isoquertecin entre otros.
En nuestro país se ha demostrado actividad antiviral de las plantas Chondracanthus
chamissoi, Chlorella peruviana y Lippia alba contra ZIKV en la línea celular Vero-76
(Mayta-Huatuco et al., 2020; Quispe-Bravo B., 2020).
Adicionalmente, estudios in vitro realizados sobre 7000 extractos de plantas

encontraron actividad antiviral contra DENV-2 y ZIKV en 21 de los extractos obtenidos
de 15 especies de plantas, donde 4 metabolitos fueron obtenidos de especies
vegetales del género Hippeastrum (Amaryllidaceae): licorina, pretazettina, narciclasina
y narciclasina-4-O-β-D xilopiranósido (NXP) indican ser candidatos antivirales
promisorios. Otro estudio también encontró actividad inhibitoria contra DENV, ZIKV y
el Virus de la encefalitis japonesa (JEV) en los extractos de las plantas Hedyotis
29
diffusa y Artemisia capillaris sin efectos citotóxicos en cultivo celular (Haddad et al.,
2021).
Las epidemias mundiales de DENV y ZIKV han desencadenado un intenso esfuerzo

por proponer nuevos medicamentos para tratar a los pacientes, ya que actualmente no
hay disponibles fármacos aprobados para su uso (Fong & Chu, 2022; Lim et al.,
2021a, 2021b; Mao et al., 2022; Oliveira et al., 2017).
2.10 Gentianella alborosea y Gentianella nitida
Las especies Gentianella alborosea y Gentianella nitida son plantas herbáceas

originarias de Sudamérica pertenecientes a la familia Gentianaceae que en el Perú
presenta 7 géneros y 103 especies endémicas (Carbonel Villanueva et al., 2016).
Las especies más conocidas del género Gentianella son Gentianella alborosea y
Gentianella nitida que son muy utilizadas en la medicina tradicional de Perú, donde se
conocen con el nombre común de “hercampuri” ó “hercampure”. Son empleadas
principalmente como coleréticas y colagogas, contra las fiebres por el paludismo,
como cura para la hepatitis y como hepatoprotector. La diferencia en su actividad
biológica radica en los tipos de secoiridoides y/o sesterterpenos presentes en cada
especie (Rubio-Guevara et al., 2020).
Los compuestos que producen el sabor amargo de Gentianella alborosea y

Gentianella nitida son sustancias de tipo glucosídicas como amarogencita,
genciopicrina y eritaurina, lactonas insaturadas como eritrocentaurina,
genciopicrósidos, también taninos, alcaloides, saponinas, hemicelulosa, resinas y
varios minerales. También se encuentran sales de aluminio, calcio, potasio, magnesio,
sodio y cloro, azúcares, mucílagos, aceites volátiles, ácido genciánico, terpenoides y
sesterpenoides.
Cabe destacar que la familia Gentianaceae es una de las dos únicas familias fuente de
xantonas naturales, especialmente en las hojas y en la madera de estas plantas,
aunque también se pueden encontrar en la raíz. Estudios mencionan que las
xantonas, saponinas, peptinas, triterpenos secoiridoides, sesquiterpenoides, taninos,
esteroles, leucoantocianinas y aminoácidos libres, poseen propiedades antioxidantes,
antiinflamatorios, antimutagénicos y anticancerígenos, capaces de regular sistemas
enzimáticos y comportarse como prebióticos a la vez; son de especial interés las
30
xantonas, al ser fuertes inhibidores de la monoamino oxidasa (INS, 2010; Rubio-
Guevara et al., 2020; Seminario et al., 2021).
2.10.1 Gentianella alborosea
2.10.1.1 Taxonomía
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Gentianales
Familia : Gentianaceae
Género : Gentianella
Especie : Gentianella alborosea
Figura 13. Gentianella alborosea (Gentianaceae) encontrada en Cajamarca-Perú (Foto: R.W. Bussmann).
Tomado de: Rubio-Guevara, S. et al (2020).
2.10.1.2 Distribución geográfica
Gentianella alborosea ocupa la región ecológica Puna Húmeda y Seca de los Andes
del Perú entre los 2 700 y 4 500 m.s.n.m. desde Arequipa hasta La Libertad (Rubio-
Guevara et al., 2020).
31
2.10.1.3 Medicina Tradicional
Su uso principal es como tratamiento para enfermedades hepáticas, por lo que se usa
como hepatoprotector, tratamiento para la hepatitis, como depurador hepático entre
otras. También se le atribuyen propiedades diuréticas, colagogas, coléricas,
reguladoras del metabolismo de grasas, así como hipoglicemiante y reductor del
colesterol LDL. Antiguamente se usaba contra las fiebres producidas por el Paludismo
y como tratamiento para la Fiebre amarilla.
La planta entera es empleada en forma de infusión, decocción, extracto acuoso y

extractos blandos. Los preparados más sofisticados se presentan en forma de Tinturas
hechas usando alcohol etílico (INS, 2010; Rubio-Guevara et al., 2020).
2.10.1.4 Composición Química
Diversos estudios fitoquímicos determinaron la presencia de flavonoides, compuestos

fenólicos libres, Taninos, Cr (III) y Xantonas. En menor proporción se encuentran
alcaloides, saponinas y glicósidos. El característico sabor amargo se debe a la
presencia de terpenoides entre ellos los monoterpenos (secologanósido,
amarosverina); glucósidos iridoides, en particular el secoiridoide glucósido
Amargogentina, al cual se le atribuye la actividad antileishmaniásica, anticancerígena y
hepatoprotectora. amarogentina) y sesterpenoides (alborosin). El Sesterterpeno
denominado Alborosin es único en esta especie, al cual se le atribuyen propiedades
antibacterianas, antifúngicas y antivirales (Rubio-Guevara et al., 2020)
Figura 14. Estructura química del sesterterpeno Alborosin aislado de Gentianella alborosea. Tomado de:
Kawahara et al. (2000).
32
2.10.2 Gentianella nitida
2.10.2.1 Taxonomía
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Gentianales
Familia : Gentianaceae
Género : Gentianella
Especie : Gentianella nitida
Figura 15. Flores de Gentianella nitida. Tomado de: Herrera, 2016.
2.10.2.2 Distribución geográfica
Gentianella nitida ocupa los Andes Centrales del Perú dentro de la región ecológica de
Puna Húmeda y Seca entre los 3 800 y 5 100 m.s.n.m en los departamentos de Junín
Huánuco y Huancavelica. También se localiza en el departamento de La Libertad en la
misma región ecológica (Carbonel Villanueva et al., 2016; Rubio-Guevara et al., 2020).
2.10.2.3 Medicina Tradicional
Gentianella nitida es usada para tratar la hepatitis, la hipercolesterolemia, como

colagogo y contra la obesidad. También presenta propiedades hepatoprotectoras,
33
diuréticas y depurativas, hipoglucemiantes y al igual que Gentianella alborosea, es
consumida en forma infusión, decocción, extracto acuoso, extractos blandos y tinturas
(Rubio-Guevara et al., 2020).
2.10.2.4 Composición Química
No se tienen muchos estudios acerca de la composición química de Gentianella nitida,

la mayoría de estudios actuales tienen como objetivo analizar sus aplicaciones
terapéuticas. En el 2016 se realizó un análisis de extractos acuosos de la Gentianella
nitida comprobando su capacidad antioxidante in vitro y atribuyéndolo a los
metabolitos secundarios fenólicos y flavonoides (Carbonel Villanueva et al., 2016
Seminario et al., 2021).
Entre los metabolitos secundarios tenemos al grupo de los secoiridoides

(Secologanosida, Amaroswerina, Amarogentina, Amaronitidina), Sesterterpeno
(nistidasina y nitiol), xantonas en forma libre (Norswertianina, Desmetilbellidifolina,
Swertianina, Swerchirina, Gentisina, Gentiseina) y xantonas en forma de glicósido (8-
O-glicósido de desmetilbellidifolina, 1 -O-glicósido de norswertianina, 1-O-
primeverósido de swertianina, 8-O-glicósido de swertianina) (Rubio-Guevara et al.,
2020).
Figura 16. Estructura química del secoiridoide Amaronitidina. Tomado de: Kawahara et al.2001.
34
2.11 Aceites Esenciales
Los aceites esenciales (AEs) son compuestos recolectados de plantas y componentes

naturales, que han sido utilizados desde tiempos ancestrales, para el desarrollo de
diversos productos farmacéuticos, cosméticos, conservantes, repelentes entre otros.
Los AEs son sustancias químicas aromáticas sumamente volátiles constituidas por
varias moléculas orgánicas como hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, cetonas,
ésteres, éteres y fenoles, muchos de ellos en pequeñas trazas dependiendo de la
planta que se estudie (Calvache et al., 2018). Algunos estudios demostraron que los
componentes presentes en menor proporción son los responsables de las propiedades
antimicrobiana y antivirales de los aceites esenciales. Se producen naturalmente como
metabolitos secundarios como mecanismo de defensa contra bacterias, hongos, virus,
insectos y también para ayudar en la polinización y dispersión de semillas al atraer a
los insectos con sus componentes aromáticos (Sharifi-Rad et al., 2017).
Asimismo, se han documentado los efectos antimicrobianos de varios aceites

esenciales y sus componentes químicos contra variedad de patógenos bacterianos,
fúngicos y virales. Tal es el caso de los efectos antivirales de los aceites esenciales de
Lippia alba, β-cariofileno contra DENV, ZIKV y el virus de la fiebre amarilla (YFV);
Citrus reshni, Cinnamomum verum, Citrus bergamia, Cymbopogon, Thymus vulgaris,
Melaleuca alternifolia y Lavandula angustifolia contra el virus de la influenza tipo A
(IAV); Thymus vulgaris, cymbopogon citratus, Rosmarinus officinalis en el virus de VIH,
y β-cariofileno, Eucalyptus contra virus herpes simple 1-2 (HSV-1 and HSV-2) y
Coronavirus relacionado al síndrome respiratorio agudo severo-2 (SARS-CoV-2).
Recientemente, se ha reportado que el aceite esencial obtenido a partir de la fruta
Zanthoxylum acanthopodium posee actividad larivicida y antiviral para DENV, además
de sus previos efectos antifúngicos, antiinflamatorios conocidos (Astani et al., 2011; da
Silva et al., 2020; Lee, 2018; Medicinales Aromáticas, 2015; Wani et al., 2021; Yang et
al., 2022).
2.11.1 Actividad antiviral de los Aceites Esenciales
Los aceites esenciales están directamente relacionados con la defensa vegetal por lo
que poseen gran actividad biológica contra los agentes infecciosos, incluyendo a los
virus. Al obtener aceites esenciales, tales propiedades pueden sen utilizadas para
35
bloquear diferentes fases del ciclo de replicación viral, tal como han demostrado
diversos estudios in vitro (Wani et al., 2021).
Los mecanismos de acción antiviral de los aceites esenciales dependen del tipo de
aceite esencial y tipo de virus. Entre los mecanismos antivirales tenemos:
 Modificación estructural de la envoltura viral: Enmascaramiento de las

proteínas de la superficie viral impidiendo la adsorción viral y la entrada a la
célula huésped.
 Inhibición de la replicación viral: Por la alteración del pH en las diferentes
etapas de la replicación, por la inhibición de proteínas virales necesarias para
la replicación y proteínas necesarias para la entrada a la célula huésped.
 Alteración morfológica: Desintegración de la cápside resultado de la alteración
de proteínas virales (Ma & Yao, 2020).
2.12 Hidrodestilación por arrastre de vapor para la obtención de aceites

esenciales
El método de Hidrodestilación por arrastre de vapor se usa para separar sustancias

ligeramente volátiles insolubles en agua de las otras sustancias no volátiles presentes.
Estas sustancias volátiles tienen presión de vapor baja y punto de ebullición alto.
El fundamento se basa en que el agua trabajada a presión atmosférica puede separar

componentes con puntos de ebullición altos. El vapor de agua saturado a presión
atmosférica evapora las sustancias volátiles a una temperatura menor a 100 °C
evitando llegar a sus puntos altos de ebullición y descomponerlas.
El proceso consiste en someter a calor constante al material vegetal junto con agua
destilada. El vapor de agua se encarga de arrastrar el aceite esencial presente en el
material vegetal que al pasar por el condensador del equipo Clevenger estos se
enfrían y se depositan en estado líquido en dos fases inmiscibles que es posible
gracias a la diferencia de densidades. El aceite esencial se va acumulando en el
solvente orgánico mientras el agua sigue en circulación (Obregon Mariano, 2018;
Villamizar-Véliz & Aular, 2022).
36
Figura 17. Aparato tipo Clevenger modificado: Procedimiento de Hidrodestilación por arrastre de vapor.
Tomado de: Wang & Zhang, 2020.
37
2.13 Cultivo Celular
El método de detección y propagación tradicional en el campo de la virología es el

aislamiento en cultivo celular. En el caso de DENV, ZIKV y otros Flavivirus el
aislamiento puede realizarse a partir de sangre completa extraída de pacientes o a
partir de semilla viral y realizando varios pasajes consecutivos en cultivos celulares
(Ammerman et al., 2008).
Dentro de las líneas celulares de uso más común para el cultivo viral de DENV y ZIKV,
se encuentran la VERO, BHK-21, C636 y LLCMK, con sensibilidad variable para el
aislamiento y características/ particularidades propias. El presente estudio ha utilizado
la línea VERO-76. Las VERO-76 fueron derivadas en 1968 por K.M. Johnson para el
Centro de Control de Enfermedades (CDC), a partir de la línea VERO original, la cual
fue obtenida del riñón de un mono verde africano en 1960 y actualmente es una de las
líneas celulares continuas de mamíferos más utilizada en investigación. Los protocolos
utilizados para aislar DENV y ZIKV en las células VERO son diversos; asimismo los
ensayos que se realizan en placa para evaluar la presencia de anticuerpos y/o la
actividad inhibitoria de los extractos obtenidos a partir de plantas frente a los virus
cultivados (Ammerman et al., 2008; ATCC, 2022.; IPK, 2013).
2.14 Prueba de Neutralización por Reducción De Placas (PRNT)
La prueba de neutralización de reducción de placas (PRNT) es la prueba serológica

considerada “gold estándar” de diagnóstico usada para detección de anticuerpos de
DENV y ZIKV. Esta prueba es cuantitativa, sensible y muy específica para la
detección de anticuerpos neutralizantes IgG, aunque puede presentar reacción
cruzada entre los virus pertenecientes al género Flavivirus (Sulca Herencia, 2019).
Su principio se fundamenta en la unión de los anticuerpos presentes en la muestra de

una carga viral conocida, los cuales son inoculados en una línea celular con el objetivo
de formar placas líticas que luego podrán ser observadas al agregar un colorante a la
monocapa celular. Las muestras con Ac neutralizantes inhibirán la formación de cierto
número de placas producto de la infección viral (50-90% de reducción). Existen
variaciones de la prueba, de acuerdo al método utilizado (sólido o semisólido), la línea
celular (VERO o BHK-21, etc), el virus utilizado y el tiempo de incubación
postinoculación/ tamaño de placa esperado. Asimismo, cabe destacar que PRNT
puede ser utilizada para diferenciar la infección por DENV de YFV y se ha encontrado
38
que la dilución de suero más baja capaz de distinguir entre ambas infecciones es 1:5.
Por otra parte, cuando exista una infección secundaria por DENV, el PRNT puede
presentar una reacción cruzada con los otros serotipos, por lo que el título de
anticuerpos más alto corresponde a la primera infección el fenómeno del antígeno
original (OAS) o “original antigenic sin” (Sirivichayakul et al., 2014).
Para expresar los resultados el criterio establecido es el porcentaje de reducción

de placas tomando como punto de corte el 50% (PRNT50). Los sueros positivos
deben neutralizar al virus y la dilución final debe reducir del 50% a más de las
placas (Sevilla L., 2018).
PRNT, es actualmente el mejor método y el más ampliamente aceptado para medir los
anticuerpos neutralizantes, que también está siendo utilizado para evaluar la
inmunogenicidad de la vacuna contra el dengue, aunque se reporta que la correlación
entre la presencia de anticuerpos neutralizantes contra DENV y la protección adquirida
contra la infección no es 100% directa (Samuel Sulca Herencia, 2019; Ribeiro et al.,
2020; Sirivichayakul et al., 2014).
2.15 Prueba de Reducción de Placas (PRP)
Al ser la PRNT un ensayo basado en la interacción específica virus-anticuerpo, su

principio de “reducción” de placas también es utilizado en estudios de evaluación de la
actividad antiviral de extractos vegetales, conociéndose esta técnica como Prueba de
Reducción de Placas.
Esta técnica ha sido utilizada en varios estudios en el país: Quispe y col. en el 2018
determinaron la actividad inhibitoria del aceite esencial de Lippia alba contra el virus
ZIKV en las líneas celulares C6/36 y VERO-76 determinando el CC50 en 400.8 μg/ml y
167 μg/ml, respectivamente. Asimismo, en el 2019 fue evaluada la actividad antiviral
de los Chondracanthus chamissoi y Chlorella peruviana contra DENV-2 en células
Vero-76, donde ambos extractos presentaron actividad antiviral (Acuña et al., 2001;
Mayta-Huatuco et al., 2020; Quispe-Bravo B., 2020; Sulca Herencia, 2019).
39
III. HIPÓTESIS
Los aceites esenciales de Gentianella alborosea y Gentianella nitida obtenidos por

hidrodestilación tienen la capacidad de inhibir in vitro la infección por ZIKV y DENV en
la línea celular Vero-76.
IV. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antiviral in vitro de los aceites esenciales de Gentianella alborosea

y Gentianella nitida contra la infección por virus Zika y virus Dengue.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar el grado de citotoxicidad de los aceites esenciales extraídos de

Gentianella alborosea y Gentianella nitida frente a la línea celular Vero-76.
2. Evaluar los niveles de inhibición de la infección por DENV-2 in vitro de los

aceites esenciales de Gentianella alborosea y Gentianella nitida.
3. Evaluar los niveles de inhibición de la infección por ZIKV in vitro de los aceites
esenciales de Gentianella alborosea y Gentianella nitida.
40
V. MATERIALES
El presente proyecto fue realizado en el Laboratorio de Virología Clínica y Molecular

de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San
Marcos, durante los años 2019 y 2022.
Aprobación del proyecto
Este estudio fue aprobado por la Facultad de Ciencias Biológicas, Escuela Profesional
de Microbiología y Parasitología con financiamiento del Vicerrectorado de
Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
5.1 Material Biológico
 Plantas enteras de Gentianella alborosea y Gentianella nitida.

 Virus Zika y virus Dengue serotipo 2: Se trabajó a partir de semillas virales del
laboratorio de Virología Clínica y Molecular de la UNMSM.
 Línea celular Vero-76 ATTC CCL-81.
5.2 Reactivos
 Suero Bovino Fetal (SBF) (F4135 Sigma)

 Medio esencial mínimo Eagle’s EMEM (11700077 Gibco)
 Tripsina EDTA (T4049 Sigma)
 L- glutamina 100X (G7513 Sigma)
 Solución de aminoácidos no esenciales MEM (M7145 Sigma)
 Solución antibiótico-antimicótico 100X (A5955 Sigma)
 Solución bicarbonato de sodio 7.5.% (S8761 Sigma)
 Solución HEPES (H4034 Sigma)
 Solución piruvato de sodio (S8636 Sigma)
 Carboximeticelulosa (C4888 Sigma)
 Dimetilsulfóxido-DMSO (13-0091-01 LGC Biotec)
 Colorante Naftol Blue Black- NBB (N9002-100G Sigma)
 Colorante azul de tripán
41
5.3 Equipos
 Cabina de Bioseguridad BSL-2

 Refrigeradora de 4 °C
 Congeladoras de -20 °C y -80 °C
 Centrifuga (5430R Eppendorf)
 Equipo contenedor de nitrógeno líquido
 Sistema de purificación de agua
 Autoclave
 Microscopio Invertido
 Potenciómetro
 Incubadora sin CO2
 Balanza analítica
 Baño de María
 Estufa
 Micropipetas de 1-20 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl (WATTON)
 Pipeteador automático
5.4 Materiales Generales
 Pipetas serológicas estériles de 1ml, 5ml y de 10 ml

 Filtros de jeringa estériles SFCA, 0.22 µm
 Frascos de vidrio para preparación de medios de 500 ml y 1L (ISOLAB)
 Tubos Eppendorf 1 y 2 ml
 Crioviales estériles de 1ml y 2 ml
 Puntas estériles con filtro de 100-1000 µl, 20-200 µl y 1-20 µl
 Cajas de policarbonato para congelador x PS de 100 posiciones
 Cámara de Neubauer
 Jeringas de 5,10 y 20 ml
 Agujas No. 18
 Placas de cultivo celular de 24 y 96 pozos (SPL)
 Tubos cónicos estériles de 50 ml y 15 ml (ISOLAB)
 Frasco de cultivo celular de 25cm2

 Frasco de cultivo celular de 75cm2
42
VI. METODOLOGÍA
6.1 Colecta de Gentianella alborosea y Gentianella nitida
Las plantas se distribuyen de forma silvestre por toda la sierra del Perú sobre los
4000 msnm. La información recolectada nos indica que una de las zonas con más
cantidad de las plantas estudiadas se encuentra en el departamento de Junín, de
donde los comerciantes las extraen para su comercialización como medicina
natural.
 Gentianella alborosea:
Las muestras se colectaron en el camino a Sinaycocha, distrito de Comas,
provincia de Concepción, departamento de Junín; a 4002 msnm, ubicada a 11°44’
S y 75°00’ W (Anexo 1.1).
 Gentianella nitida:
Las muestras se colectaron cerca al margen izquierdo de la laguna Alcacocha, en
el punto ubicado a 11.0524° S y 75.907° W a 4422m.s.n.m. en el distrito de Junín,
provincia de Junín, departamento de Junín (Anexo 1.2).
Colecta y traslado:
Las matas de ambas especies de planta se colectaron después de su

reconocimiento, usando guantes y una espátula, para luego ser guardadas en
bolsas de polipropileno con cierre hermético y empacadas en cajas de tecnopor
con bolsas de hielo para mantener las muestras en un ambiente frío durante su
transporte a la ciudad de Lima.
Identificación de las plantas:
Las especies de plantas fueron identificadas en el Herbario del Museo de Historia

Natural de la UNMSM (Anexo 2).
43
6.2 Extracción de Aceites Esenciales
 Se utilizó el sistema de hidrodestilación por arrastre de vapor. El material

vegetal recolectado se mantuvo a 4 °C durante unas horas hasta ser
procesado. Las matas de planta a ser utilizadas fueron pesadas y lavadas para
luego ser cortadas con una tijera estéril.
 Se llenó el balón de destilación con 3 litros de agua bidestilada y se introdujo la
planta trozada y pesada, hasta un máximo de 3/4 de la capacidad del balón.
 Se instaló el aparato tipo Clevenger junto con el sistema de enfriamiento con la
ayuda de soportes universales, quedando todo el sistema en forma vertical
(Anexo 1.3).
 Se colocó el balón con la muestra en la malla eléctrica y se unió al sistema
Clevenger.
 Al empezar a hervir se cubrió el balón y la primera parte del sistema Clevenger
con papel aluminio para mantener el calor. Después de esto se colocó el éter
de petróleo (solvente) en la pera de destilación para recuperar el aceite
esencial (Chen et al., 2018).
El proceso hidrodestilación duró aproximadamente 3 horas. El aceite esencial

fue recolectado en un vaso de precipitación, luego se extrajo el agua residual
de la muestra usando sulfato de sodio anhídrido. Una vez obtenido, se dejó a
temperatura ambiente en frascos de vidrio ámbar sin tapar por 24 horas para
que el éter de petróleo por evaporación; después de este tiempo el frasco fue
almacenado a -20 °C (Duschatzky et al., 2005).
6.3 Activación de Líneas Celulares
Se usó el “Manual de Técnicas de Laboratorio para el Diagnóstico y la

Caracterización de los Virus del Dengue” del Instituto de Medicina Tropical “Pedro
Kourí” de Cuba (IPK, 2013), se realizaron algunas modificaciones y fue
estandarizado en el Laboratorio de Virología Clínica y Molecular de la UNMSM
para activar la línea celular VERO-76.
44
1. Descongelamiento de las Líneas Celulares
Los viales son colocados en baño maría a 37 °C, posteriormente transferido el

contenido a un tubo de 15 ml con 5ml de medio de mantenimiento (MM). La
eliminación del DMSO fue realizada mediante centrifugación a 1.000 X g,
eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet celular en 6 ml de medio
de crecimiento (MC). Las células resuspendidas fueron distribuidas en frascos de
cultivo de 25 cm2 e incubadas a 37 °C hasta la formación de una monocapa
confluente al 70% (aprox. 3-4 días) (Anexo 9.1).
2. Mantenimiento y Propagación de la línea celular Vero-76
Posterior a la primera incubación, la monocapa celular fue tripsinizada y

resuspendida en 12 ml de medio de crecimiento. Las células y el medio de
crecimiento se distribuyeron equitativamente en 2 frascos de cultivo celular de 25
cm2 y fueron incubados a 37 °C, a las mismas condiciones hasta la formación de
monocapa confluente al 90%. La metodología se repite una vez más para
estabilizar el crecimiento de las células.
Se utilizó la metodología de “Subcultivos Celulares” que fueron realizados para

mantener activas y realizar la propagación de las líneas celulares, generando con
el tiempo estabilidad en las mismas. La rutina de “Propagación – Subcultivo”
permitió la disponibilidad de células para los distintos protocolos realizados.
Para la línea celular Vero-76 se mezcló un inóculo de células activadas con medio
de crecimiento a un pH de 7.3 y fue incubada a 37 °C hasta la formación de
monocapa confluente al 100%.
45
6.4 Prueba de citotoxicidad de los aceites esenciales de Gentianella alborosea y
Gentianella nitida
Plaqueo: Se usó el protocolo del Laboratorio de Virología Clínica y Molecular de la

UNMSM.
Se adicionaron 100 µl de células Vero-76 mezcladas con medio de crecimiento a cada

pozo en una placa de cultivo celular fondo plano de 96 pozos a una concentración de
5
2.5 x 10 cél/mL; y se incubó a 37 °C por 24 horas hasta la formación de monocapa
confluyente al 100%.
Citotoxicidad: Se preparó una mezcla de Tween 80 y etanol absoluto a una

proporción de 2:1 (solución Tween-etanol) para usarlo de diluyente del aceite esencial
saponificándolo de manera que pueda mezclarse con los medios acuosos (Duschatzky
et al., 2005).
El aceite esencial (AE) se diluyó en Tween-etanol en proporción 1:5. Luego se hicieron

diluciones seriadas en MM y se incubó a 37 °C por 1 hora. Cada dilución fue inoculada
en los pozos con monocapa por triplicado (120 µl cada pozo) e incubada a 37 °C
durante 7 días.
De igual manera se inocularon 2 controles por dilución que se hicieron a partir de la

mezcla de Tween-etanol con medio de mantenimiento (representando al AE). Se
incluyeron controles celulares (monocapa cubierta por 125 µl de MM).
Los pozos fueron coloreados con 100 µl de colorante Naphthol Blue Black para el
respectivo análisis de placas. De esta prueba se obtuvo la concentración máxima no
citotóxica (MNCC) para cada aceite esencial, con las que se realizaron pruebas de
inhibición más adelante.
AE: Aceite esencial; CT-E: Control Tween 80- etanol; CC: Control de células
Figura 18. Distribución de las diluciones de los aceites esenciales, los controles de
Tween–etanol y control celular.
46
6.5 Propagación de semillas virales de ZIKV Y DENV-2 en la línea celular Vero-76
 Previamente se prepararon dos frascos de cultivo celular de 75 cm2 de línea

celular Vero-76 hasta una confluencia del 100%, la cual será infectada con el
virus.
 El virus fue diluido en MM frío a una proporción (1:20) y homogeneizado con
vórtex.
 El sobrenadante del frasco con células se descartó para luego inocular 500 µl
de la dilución viral e incubar el frasco infectado a 37 °C por 1 hora. Luego de
este tiempo se añadió 12 ml de medio de mantenimiento y se volvió a incubar a
37 °C hasta la cosecha viral.
 Se preparó el frasco control añadiendo 500 µl MM en lugar del virus a uno de
los frascos con monocapa confluente.
 Se revisó diariamente el efecto citopático (desprendimiento celular) cada día,
comparándolo con el frasco control para diferenciar el desprendimiento natural
del efecto citopático (Anexo 9.2) (Sevilla L., 2018; Vásquez Cajachahua, 2018).
- ZIKV: La incubación duró un aproximado de entre 6 y 7 días.

- DENV-2: La incubación duró un aproximado de 11 y 12 días
6.6 Cosecha Viral
 Las células del frasco infectado con un 75% de efecto citopático ECP (3+) fueron
comparadas con las células del frasco control y posteriormente cosechadas.
 El contenido del frasco infectado fue centrifugado a 3000 RPMI a 4 °C por 10
minutos.
 El sobrenadante viral fue alicuotado en crioviales correctamente etiquetados que
luego fueron guardados a -80 °C (Anexo 9.2).
47
6.7 Titulación de la Semilla Viral
6.7.1 Prueba de plaqueo para titulación de ZIKV en la línea celular VERO-76
Plaqueo: Para esta prueba fue utilizada una placa de 24 pozos donde se
adicionaron 500 µl de células cultivadas contenidas en medio de crecimiento a
cada pozo a una concentración de 2.5 x 105 cel/mL; luego, para luego ser
incubadas a 37 °C por 24 horas hasta la formación de monocapa.
Infección viral: Una dilución viral seriada de ZIKV desde 10 -1 hasta 10-7 fue
preparada utilizando medio de mantenimiento frío. El sobrenadante en la placa de
cultivo fue descartado y sobre la monocapa celular se dispensaron 50 µl de las
diluciones virales previamente preparadas (cada dilución por triplicado) junto con
los respectivos controles celulares (50 µl de MM). La placa inoculada fue sellada y
llevada a incubación durante 3 horas a 37 °C, con homogeneización cada hora. Al
finalizar las 3 horas, se añadió medio de recubrimiento a cada pozo y se selló la
placa herméticamente incubándola a 37 °C durante 7 días.
Coloración: Luego de los 7 días de incubación, el medio de recubrimiento fue

descartado y cada pozo fue teñido con 500 µL de colorante Naphthol Blue Black,
para luego dejar reposando 12 horas. Posteriormente el colorante fue descartado,
y se procedió a contabilizar las placas virales en cada dilución para obtener el
título viral de ZIKV del ensayo de placa (Anexo 9.3).
6.7.2 Prueba de plaqueo para titulación de DENV-2 en la línea celular VERO-76
Plaqueo: Para esta prueba fue utilizada una placa de 24 pozos, preparando una
suspensión celular a 2.5 x 105 cel/mL de concentración en MC; e inoculado 500
µl/pozo. Fueron preparadas 3 placas y llevadas a incubación por 1 hora y 30
minutos a 37 °C.
Infección viral: Fueron preparadas diluciones seriadas de DENV-2 desde 10-1

hasta 10-7 usando medio de mantenimiento frío. Se dispensaron 50 µl de las
diluciones virales previamente preparadas (cada dilución por triplicado) junto con
sus controles celulares respectivos (50 µl de MM). La placa inoculada fue sellada
y llevada a incubación por 4 horas a 37 °C, luego se añadió el medio de
recubrimiento a cada pozo, se selló la placa herméticamente y fue incubada a 37
°C durante 9 días.
48
Coloración: El medio de recubrimiento fue descartado y se adicionó 500 µL de
colorante Naphthol Blue Black en cada pozo, para luego dejar reposando 12
horas. El colorante fue descartado, y las placas virales en cada dilución fueron
contadas para proceder al análisis y la obtención del título viral de DENV-2 (Anexo
9.3).
1. Prueba de Ajuste de cálculo de título viral para DENV-2

Se realizó un Ensayo de Titulación adicional tomando en cuenta el rango máximo
y mínimo de los resultados obtenidos en la prueba de titulación anterior. Se diluye
la semilla viral para obtener de 15 a 20 UFP/pozo (Working Solution Viral (WSV))
según el Título Viral a evaluar. Se eligió el Título Viral en el cual se obtuvieron de
15 a 20 UFP/pozo.
6.7.3 Cálculo de título viral
Para el cálculo del título viral se escoge la dilución que presente entre 15 a 20
UFP y se aplicó la siguiente fórmula:
UFP/mL = P x 20 x 10x
P: Promedio del número de placas obtenido del conteo (15-20 UFP)
20: factor de conversión de µl a ml
10x: factor de dilución viral
49
6.8 Prueba de Reducción De Placas (PRP)
Working Solution Viral (WSV): Se preparó esta solución viral de trabajo calculada a
partir del título viral obtenido. Se calculó la dilución de la semilla viral a la cual se
obtendrían de entre 15 a 20 UFP por pozo después de mezclarse en proporción 1:1
con las diluciones del AE.
6.8.1 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV
Plaqueo: Para esta prueba se utilizará una placa de 24 pozos con monocapa
confluente al 100%, preparada siguiendo el método utilizado en prueba de plaqueo
para titulación de ZIKV.
Se diluyó el aceite esencial con la mezcla Tween 80 – etanol en la misma proporción

usada para la prueba de citotoxicidad (Duschatzky, 2005). Se prepararon diluciones
seriadas de AE en MM desde 1/1000 a 1/8000. Además, se prepararon las mismas
diluciones para el control Tween–etanol (C-TE) de la misma manera que se hizo para
la prueba de citotoxicidad (sustituyendo AE por MM). Por otro lado, se diluyó la
semilla viral de ZIKV en MM frío, para obtener la solución de trabajo viral (Working
solution viral ― WSV).
Se prepararon controles virales (CV) con WSV y MM en proporción 1:1 y como

demás controles se incluyeron el control WSV-1 y control WSV-2.
Se mezcló cada dilución preparada del AE con la WSV en proporción 1:1, lo mismo
para las diluciones del C-TE, y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Luego se
inocularon 50 μl/pozo de la mezcla AE y WSV por duplicado para cada dilución, con
sus correspondientes C-TE por diluciones y se incubó la placa durante 3 horas, con
homogenización cada hora. Todos los demás controles también siguieron el mismo
procedimiento. Se incluyeron controles celulares (CC) añadiendo 50 μl/pozo de MM
sobre la monocapa. Finalmente se añadió el medio de recubrimiento, se selló
herméticamente y se incubó a 37 °C durante 7 días la placa, revisando diariamente.
Coloración: El medio de recubrimiento fue descartado y cada pozo fue teñido con
500 µL de colorante Naphthol Blue Black, para luego dejar reposando 12 horas.
Posteriormente el colorante fue descartado, y las placas virales en cada pozo fueron
contabilizadas.
50
6.8.2 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2
Plaqueo: Para esta prueba fue utilizado el método de suspensión celular en placa de
5
24 pozos, preparando una a 2.5 x 10 cel/mL de concentración en MC siguiendo el
método utilizado en la Prueba de plaqueo para titulación de DENV-2.
El aceite esencial fue diluido con la mezcla Tween 80 – etanol, en la misma

proporción usada para la prueba de citotoxicidad. Se prepararon diluciones seriadas
en MM desde 1/1000 a 1/800. Se prepararon las diluciones para el control Tween–
etanol (C-TE) de la misma manera que se hizo para la prueba de citotoxicidad,
sustituyendo el AE por MM. Por otro lado, la semilla viral de DENV-2 fue diluida en
MM frío, para obtener la solución de trabajo viral (WSV).
Se prepararon controles virales (CV) con WSV y MM en proporción 1:1 y como

demás controles se incluyeron el control WSV-1 y control WSV-2.
Cada dilución del AE fue mezclada con la WSV en proporción 1:1, lo mismo para las
diluciones del C-TE, y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de la
incubación de la placa de 24 pozos con la suspensión celular se inocularon 50
μl/pozo de la mezcla AE y WSV por duplicado para cada dilución, con sus
correspondientes C-TE por diluciones y se llevó a incubar la placa durante 4 horas a
37 °C. Todos los demás controles también siguieron el mismo procedimiento. Se
incluyeron controles celulares (CC) añadiendo 50 μl/pozo de MM sobre la suspensión
celular. Finalmente se añadió el medio de recubrimiento, se selló herméticamente y
se incubó la placa durante 9 días, revisando diariamente.
Coloración: El medio de recubrimiento fue descartado y cada pozo fue teñido con
500 µL de colorante Naphthol Blue Black, para luego dejar reposando 12 horas.
Posteriormente el colorante fue descartado, y las placas virales en cada pozo fueron
contabilizadas.
6.9 Análisis Estadísticos
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante el programa IBMM SPSS 25.
51
VII. RESULTADOS
7.1 Extracción de los aceites esenciales
7.1.1 Extracción del aceite esencial de Gentianella alborosea
Se obtuvieron en total 3.69 ml de aceite esencial de 1211.7 g de la planta

procesada Gentianella alborosea en los 4 procesos de extracción (Tabla 1).
Tabla 1. Relación peso de Gentianella alborosea procesada (g) y cantidad de aceite esencial
obtenido en peso (g) y volumen (ml).
Gentianella alborosea
Peso de la planta Peso del AE obtenido Volumen de AE
procesada (g) (g) obtenido (ml)
208.20 0.5011 0.7133
187.00 0.088 0.125
396.54 1.002 1.424
419.96 1.001 1.424
7.1.2 Extracción del aceite esencial de Gentianella nitida
Se obtuvieron 3.57 ml de aceite esencial de 968.26 g de planta procesada de

Gentianella nitida en 3 procesos de extracción (Tabla 2).
Tabla 2. Relación peso de Gentianella nitida procesada (g) y cantidad de aceite esencial
obtenido en peso (g) y volumen (ml).
Gentianella nitida
Peso de la planta Peso del AE obtenido Volumen de AE
procesada (g) (g) obtenido (ml)
439.56 1.205 1.834
139.0 0.09 0.137
389.70 1.05 1.598
52
7.2 Prueba de Citotoxicidad de los aceites esenciales:
7.2.1 Prueba de Citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella alborosea en

línea celular VERO-76.
La máxima concentración no citotóxica (MNCC) para el aceite esencial de

Gentianella alborosea fue de 140.5 µg/ml (dilución 1/1000) (Tabla 3). Se muestra
una de las placas reveladas en el Anexo 5.1.
Tabla 3. Resultados de la prueba de citotoxicidad de diluciones del aceite esencial

de Gentianella alborosea sobre la línea celular Vero-76.
Dilución Concentración (µg/ml) Monocapa

1/500 281.00 -
1/600 234.17 -
1/800 175.63 -
1/1000 140.50 +
1/1200 117.08 +
1/1500 93.67 +
1/2000 70.25 +
1/2500 56.20 +
1/3000 46.83 +
1/5000 28.10 +
-: Desprendimiento en la monocapa celular; +: Monocapa celular completa.
7.2.2 Citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella nitida en línea celular

VERO-76.
La máxima concentración no citotóxica (MNCC) para el aceite esencial de

Gentianella nitida se encontró a la concentración de 131.4 µg/ml (dilución 1/1000)
(Tabla 3). Se muestra una de las placas reveladas en el Anexo 5.2.
Tabla 4. Resultados de la prueba de citotoxicidad de diluciones del aceite esencial

de Gentianella nitida sobre la línea celular Vero-76.
Dilución Concentración (µg/ml) Monocapa

1/500 262.80 -
1/600 219.00 -
1/800 164.25 -
1/1000 131.40 +
1/1200 109.50 +
1/1500 87.60 +
1/2000 65.70 +
1/2500 52.56 +
1/3000 43.80 +
1/5000 26.28 +
-: Desprendimiento en la monocapa celular; +: Monocapa celular completa.
53
7.3 Titulación Viral:
7.3.1 Ensayo de Placa para titulación de ZIKV en la línea celular VERO-76
La semilla viral de ZIKV titulada fue la cosechada del pasaje 3, que mostró efecto
citopático en el día 6 post infección (Anexo 6.1).
El título viral de la semilla de ZIKV fue en promedio 7.4x10 5 UFP/ml que se calculó al
promediar el número de UFP de las diluciones 10-3 y 10-4 de las pruebas de plaqueo
(Tabla 5). Se muestra una de las placas de titulación reveladas en el Anexo 7.1.
El día óptimo para revelar la placa de titulación es el día 7 post infección donde se
observaron placas bien definidas (Anexo 6.2).
Tabla 5. Titulación de semilla viral de ZIKV pasaje 3 en línea celular Vero – 76.
Diluciones Virales 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
UFP Promedio NC NC 31 4.3 0.3 0 0
Coef. Variación - - 0.09 0.13 0.58 - -

Desviación estándar - - 2.65 0.58 0.60 - -
Título Viral - - 6.2x105 8.7x105 - - -
Log10 Título Viral
5.79 ± 0.04 5.94 ± 0.06
IC 95%
Título Viral promedio 7.4x105
Log10 Título Viral
5.87 ± 0.14
promedio IC 95%
NC: No contable; IC 95%: Intervalo de confianza al 95%
54
7.3.2 Ensayo de placa para titulación de DENV-2 en la línea celular VERO-76
Se tituló la semilla viral de DENV-2 obtenida del pasaje 3 que mostró efecto
citopático en el día 11 post infección (Anexo 6.3).
El título de la semilla viral de DENV-2 fue de 2.6x105 UFP/ml, obtenido del promedio
de UFP de las diluciones 10-3 y 10-4 de las pruebas de plaqueo (Tabla 6). Se muestra
una de las placas de titulación reveladas en el Anexo 7.2.
Se encontró que el día óptimo para revelar la placa de titulación es el día 9 post
infección donde se observaron placas bien definidas (Anexo 6.4).
Tabla 6. Titulación de semilla viral de DENV-2 en línea celular Vero – 76
Dilución del Virus 10-1 10 -2 10-3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7
UFP Promedio NC NC 12.7 1.3 0 0 0

Coef. Variación - - 0.12 0.43 - - -
Desviación
- - 1.53 0.58 0 - -
estándar
Título Viral - - 2.53 x105 2.67 x105 0 0 0
Log10 Título Viral
5.40 ± 0.06 5.43 ± 0.20
IC 95%
Título Viral
2.6x105
Promedio
Log10 Título Viral
5.41 ± 0.02
promedio IC 95%
NC: No contable; IC 95%: Intervalo de confianza al 95%
1. Ajuste de Cálculo de Título Viral para la semilla de DENV-2:

Para tener un cálculo más exacto del título viral de la semilla de DENV-2 se realizó
una prueba de ajuste viral donde el título obtenido fue de 2.5 x 105 UFP/ml (Tabla
7). Se escogió la titulación que presentó entre 15 a 20 UFP (Anexo 7.3).
Tabla 7. Ajuste de Cálculo de Título Viral para la semilla viral de DENV-2.
Título viral 2.5 x 105 3 x 105 3.5 x 105
UFP Promedio 19 11 4.2
Coef. Variación 0.098 0.14 0.45
Desviación estándar 1.87 1.58 1.92
55
7.4 Prueba de Reducción De Placas (PRP)
7.4.1 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV

El aceite esencial de Gentianella alborosea presentó efecto inhibidor contra ZIKV a la

concentración 46.83 µg/ml con un porcentaje de reducción del 54.30 %. Las
concentraciones superiores a la inhibitoria no fueron consideradas debido a la propia
inhibición que presenta el Control Tween- etanol (Tabla 8). El efecto inhibidor contra
ZIKV se establece a partir de la dilución 1:300 ya que a partir de la misma dilución en
el Control Tween- etanol la inhibición es de 0% (Figura 20).
En el efecto de aceite esencial se visualiza que la cantidad de UFP/pozo va en
aumento gradual desde la dilución 1:1000 hasta la dilución 1:4000 y en las siguientes
diluciones alcanza el máximo de UFP/pozo; mientras que en el efecto del control
tween -etanol se alcanza el máximo de UFP/pozo desde la dilución 1:3000 (Figura 19).
Tabla 8. Resultados de la prueba de reducción de placas utilizando el aceite esencial de

Gentianella alborosea: Porcentaje de Reducción de Placas del aceite esencial y Control
Tween-Etanol.
Dilución Concentración ACEITE ESENCIAL + TWEEN

CONTROL TWEEN ETANOL
(µg/ml) ETANOL
Promedio Porcentaje Promedio Porcentaje
UFP/pozo AE de UFP/pozo C-TE de
IC (95%) Reducción IC (95%) Reducción
1/1000 140.50 0.0 100% 0.0 100%
1/1500 93.67 0.17 ± 0.43 99.30% 1.17 ± 1.03 94.93%
1/2000 70.25 0.75 ± 0.80 96.50% 2.75± 3.01 87.8%
1/2500 56.20 5.67 ± 3.09 75.40% 10.67 ± 3.23 53.5%
1/3000 46.83 10.50 ± 2.33 54.30% 23.00 ± 1.51 0.0%
1/4000 35.13 19.30 ± 1.52 16.30% 23.00 ± 0.77 0.0%
1/5000 28.10 23.00 ± 1.38 0.0% 23.00 ± 2.04 0.0%
1/6000 23.42 23.00 ± 1.48 0.0% 23.00 ± 0.77 0.0%
1/7000 20.07 23.00 ± 1.10 0.0% 23.00 ± 0.10 0.0%
1/8000 17.56 23.00 ± 2.20 0.0% 23.00 ± 2.54 0.0%
AE: Aceite esencial, C-TE: Control Tween 80- Etanol; IC 95%: Intervalo de confianza al 95%;
UFP: Unidad formadora de placa.
56
Figura 19. Diagrama de cajas de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el ZIKV
utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea: Distribución de UFP/pozo en cada
dilución del aceite esencial de comparado con las UFP/pozo del Control Tween etanol (C-TE).
esencial (AE) de Gentianella alborosea comparado con el porcentaje de Inhibición obtenido
en las diluciones del Control Tween- Etanol (C-TE): Se obtuvo un 54.3% de Inhibición.
57
Gentianella nitida
El aceite esencial de Gentianella nitida presentó efecto inhibidor contra ZIKV a la

ZIKV se establece a partir de la dilución 1:300 ya que a partir de la misma dilución en
el Control Tween- etanol la inhibición es de 0% (Figura 21).
aumento gradual hasta la dilución 1:4000 y en las siguientes diluciones alcanza el
máximo de UFP/pozo; mientras que en el efecto del control tween -etanol se alcanza
el máximo de UFP/pozo desde la dilución 1:3000 (Figura 22).
Tabla 9: Resultados de la prueba de reducción de placas utilizando el aceite esencial de

Gentianella nitida: Porcentaje de Reducción de Placas del aceite esencial y del Control Tween-
Etanol.

(µg/ml) ETANOL
IC 95% Reducción IC 95% Reducción
1/1000 131.4 0 100.0% 0 100.0%
1/1500 87.6 0 100.0% 0.7 ± 1.34 97.2%
1/2000 65.7 2.75 ± 3.28 89.0% 6.8 ± 8.5 72.8%
1/3000 43.8 14.7 ± 1.88 41.2% 25 ± 2.91 0.0%
1/4000 32.85 20.25 ± 2.91 19.0% 25 ± 2.25 0.0%
1/5000 26.28 25 ± 2.43 0.0% 25 ± 0.95 0.0%
1/6000 21.9 25 ± 0.77 0.0% 25 ± 1.1 0.0%
1/7000 18.77 25 ± 1.10 0.0% 25 ± 0 0.0%
1/8000 16.43 25 ± 1.77 0.0% 25 ± 0.77 0.0%
58
Figura 21. Diagrama de cajas de la Prueba Reducción de Placas (PRP) para el ZIKV
utilizando el aceite esencial de Gentianella nitida. Distribución de UFP/pozo en cada dilución
del Aceite esencial (AE) comparado con las UFP/pozo del Control Tween- Etanol (C-TE).
esencial (AE) de Gentianella nitida: En comparación con el porcentaje de inhibición obtenido
con las diluciones del Control Tween- Etanol (C-TE). Se obtuvo una Inhibición del 41.2%.
59
7.4.1.3 Control viral (CV) para ZIKV
En la tabla 10 se observan las UFP/pozo en los controles virales obtenidos en todas

las pruebas de inhibición realizadas para ZIKV y para analizarlos se construyó una
gráfica de Levey-Jennings (Figura 23); donde, analizando las reglas de Westgard, se
puede observar que ningún control viral se encuentra fuera de los intervalos ±2SD y
±3SD, lo que indica poca variabilidad.
Tabla 10: Controles Virales obtenidos en las pruebas de reducción de placas (PRP) contra
ZIKV
CONTROLES VIRALES (UFP/pozo)
19 18 15 21 18 Promedio 18.72
16 18 16 22 21 (IC 95%) ± 0.99
21 20 15 21 19
Desviación
19 17 20 22 19 2.39
23 15 17 16 20 Estándar
IC 95%: Intervalo de confianza al 95%; UFP: Unidad formadora de placa.
Distribución de Controles Virales para ZIKV

Gráfica de Levey-Jennings
26
24
22
UFP/pozo
20
18
16
14
12
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Cantidad de Controles Virales
Figura 23. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en las
Pruebas de Reducción de Placas (PRP) contra ZIKV.
60
7.4.2 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2

El aceite esencial de Gentianella alborosea presentó efecto inhibidor contra DENV-2 a

la concentración 28.10 µg/ml con un porcentaje de reducción del 51.7 %. Las
DENV-2 se establece a partir de la dilución 1:500 ya que a partir de la misma dilución
en el Control Tween- etanol la inhibición es de 0%; también se visualiza que los
intervalos de confianza del promedio de UFP/pozo de Control Tween- etanol hasta la
dilución 1:3000 son muy amplios (Figura 24).
aumento gradual hasta la dilución 1:6000 a partir de la cual se alcanzó el máximo de
UFP/pozo; mientras que en el efecto del Control Tween -etanol se alcanza el máximo
de UFP/pozo desde la dilución 1:5000 (Figura 25).
Tabla 11: Resultados de la prueba de reducción de placas para DENV-2 utilizando el aceite
esencial de Gentianella alborosea: Porcentaje de Reducción de Placas del aceite esencial y
del Control Tween-Etanol.
Dilución Concentración ACEITE ESENCIAL + TWEEN CONTROL TWEEN ETANOL

(µg/ml) ETANOL
UFP/pozo AE de UFP/pozo C T-E de
1/1000 140.5 0 100% 1.75 ± 3.28 91.67%
1/1500 93.67 0 100.00% 7 ± 7.9 66.67%
1/2000 70.25 0.5 ± 1.59 97.62% 9 ± 10.15 55.14%
1/2500 56.20 1.5 ± 0.92 92.86% 14 ± 13.12 33.33%
1/3000 46.83 4.5 ± 2.91 77.83% 16.5 ± 7.4 21.43%
1/5000 28.10 10.5 ± 4.0 51.70% 21 ± 2.55 0%

1/6000 23.42 21 ± 3.80 0% 21 ± 2.48 0%
1/7000 20.07 21 ± 1.44 0% 21 ± 2.87 0%
1/8000 17.56 21 ± 2.48 0% 21 ± 1.47 0%
61
Figura 24. Diagrama de cajas de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el DENV-2
utilizando el aceite esencial de Gentianella alborosea: Distribución de UFP/pozo en cada dilución
del aceite esencial (AE) comparado con las UFP/pozo del Control Tween-Etanol (C-TE).
Figura 25. Porcentaje de Inhibición obtenido sobre el DENV-2 en cada dilución del aceite
esencial (AE) de Gentianella alborosea: Comparado con el porcentaje de inhibición obtenido en
el Control Tween- Etanol (C-TE). Se obtuvo un 51.7% de inhibición.
62
Gentianella nitida
El aceite esencial de Gentianella nitida presentó efecto inhibidor contra DENV-2 a la

inhibición que presenta el Control Tween 80- etanol (Tabla 12). El efecto inhibidor
contra ZIKV se establece a partir de la dilución 1:500 ya que a partir de la misma
dilución en el Control Tween- etanol la inhibición es de 0% (Figura 26).
aumento gradual hasta la dilución 1:6000 a partir de la cual se alcanzó el máximo de
UFP/pozo; mientras que en el efecto del control tween -etanol se alcanza el máximo
de UFP/pozo desde la dilución 1:5000 (Figura 27).
Tabla 12: Resultados de la prueba de reducción de placas para DENV-2 utilizando el aceite
esencial de Gentianella nitida: Porcentaje de Reducción de Placas del aceite esencial de
Gentianella nitida y del Control Tween-Etanol.

(µg/ml) ETANOL
1/1000 131.4 0 100% 0.25 ± 0.80 98.68%
1/1500 87.60 0 100.00% 0.75 ± 0.80 96.05%
1/2000 65.70 0.5 ± 1.59 97.37% 1.75 ± 1.52 90.79%
1/2500 52.56 2 ± 1.30 89.47% 5.5 ± 2.76 71.05%
1/3000 43.80 7 ± 2.91 63.16% 10 ± 2.60 47.37%
1/5000 26.28 11 ± 2.25 42.11% 19 ± 2.91 0.0%
1/6000 21.90 19 ± 0.00 0.0% 19 ± 1.44 0.0%
1/7000 18.77 19 ± 1.43 0.0% 19 ± 2.98 0.0%
1/8000 16.43 19 ± 2.48 0.0% 19 ± 2.87 0.0%
63
Figura 26. Diagrama de cajas de la Prueba de Reducción de Placas (PRP) para el DENV-2
usando el aceite esencial de Gentianella nitida: Distribución de UFP/pozo en cada dilución del
aceite esencial (AE) comparado con las UFP/pozo del Control Tween- Etanol (C-TE).
Figura 27. Porcentaje de Inhibición obtenido sobre el DENV-2 en cada dilución del aceite
esencial (AE) de Gentianella nitida: En comparación con el porcentaje de inhibición obtenido
en el Control Tween- Etanol (C-TE). Se obtuvo una inhibición del 42.11%.
64
7.4.2.3 Control viral (CV) para DENV-2
En la tabla 13 se observan las UFP/pozo en los controles virales obtenidos en todas

las pruebas de inhibición realizadas para DENV-2 y para analizarlos se construyó una
gráfica de Levey-Jennings (Figura 28); donde, analizando las reglas de Westgard, se
puede observar que ningún control viral se encuentra fuera de los intervalos ±2SD y
±3SD, lo que indica poca variabilidad.
Tabla 13: Controles virales obtenidos en las pruebas de reducción de placas (PRP) contra
DENV-2.
CONTROLES VIRALES (UFP/pozo)
23 17 20 Promedio 18.07
21 15 14 (IC 95%) ± 1.61
22 18 17
Desviación
15 14 15 3.17
22 21 17 Estándar
IC 95%: Intervalo de confianza al 95%; UFP: Unidad formadora de placa.
Distribución de Controles Virales para DENV-2

Gráfica de Levey-Jennings
27
22
UFP/pozo
17
12
7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Cantidad de Controles Virales
Figura 28. Gráfica de Levey- Jennings de los controles virales (CV) obtenidos en la prueba
de reducción de placas (PRP) contra DENV-2.
65
VIII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Gentianella alborosea y Gentianella nitida fueron seleccionadas para el presente

estudio debido a que en la medicina tradicional son utilizadas para tratar múltiples
enfermedades entre las cuales están las virales en regiones de la selva para combatir
la fiebre amarilla, asimismo por la variedad de metabolitos secundarios presentes en la
familia Gentianaceae.
La línea celular Vero-76, fue elegida para esta investigación por ser una de las líneas
celulares de mamíferos más usadas en investigación, posee protocolos establecidos
que son reproducibles para su propagación en laboratorio, han sido autorizadas para
la producción de vacunas virales vivas e inactivadas, para la producción de virus y
para ensayos de citotoxicidad (Almeida et al., 2011; Ammerman et al., 2008).
Vero-76 es también usada para la propagación de ZIKV, siendo demostrada su

susceptibilidad a la infección por el virus. Por otra parte, Vero-76 es altamente
susceptible a la infección por DENV y produce un alto rendimiento infeccioso en
pruebas in vitro. Al mostrar alta susceptibilidad a la infección de estos dos virus, se
eligió la línea celular VERO-76 para este estudio (Barreto-Vieira et al., 2017;
Yamanaka et al., 2020).
La evaluación in vitro de la concentración más alta no citotóxica de los aceites

esenciales de las plantas en estudio es crucial antes de las pruebas de inhibición
viral. En el presente estudio se observó la citotoxicidad de los aceites esenciales en la
línea celular Vero-76 en términos de efecto citopático, la cual nos muestra que la
concentración más alta no citotóxica (MNCC) para Gentianella alborosea fue de 140.5
µg/ml. Si bien no hay estudios sobre la citotoxicidad de los aceites esenciales de
Gentianella alborosea existen algunos reportes sobre la citotoxicidad de sus extractos
acuosos como la de Aranda Ventura et al., 2018 que evaluó la citotoxicidad in vitro del
extracto acuoso liofilizado de Gentianella alborosea sobre larvas de Artemia salina,
que no mostró ninguna toxicidad en las concentraciones realizadas y su Concentración
letal media (CC50) fue > 1000 µg/ml También se llevó a cabo un estudio de Pinedo
Torres, 2010 sobre la genotoxicidad del extracto acuoso liofilizado de Gentianella
alborosea sobre linfocitos de ratas albinas (cepa Holtzmann), donde se analizaron
dosis de 1000 y 2000 mg/Kg durante 5 días y se midió el daño al ADN. Los resultados
mostraron que no hubo diferencia significativa entre el pequeño daño medido entre el
grupo de dosis de 2000 mg/Kg y el control negativo (peróxido de hidrógeno y
ciclofosfamida), por lo que se concluyó que el extracto tenía baja genotoxicidad sobre
66
linfocitos de ratas albinas (cepa Holtzmann) y se presume que la presencia de
polifenoles capta los radicales libres y protege al ADN.
Para el aceite esencial de Gentianella nitida la concentración más alta no citotóxica

(MNCC) fue de 131.4 µg/ml e igual que en la otra especie, no hay estudios sobre la
citotoxicidad de los aceites esenciales, pero si algunos sobre la citotoxicidad de
extractos acuosos, como el realizado por Quiñones et al., 2022 ,donde el extracto
acuoso de Gentianella nitida en concentraciones de 20 gr a 40 gr no mostró efecto
citotóxico ni genotóxico de más de 0.010% ±0.05 (interpretado nulo efecto citotóxico ni
genotóxico) sobre tejido meristemático radicular de Allium cepa, , donde analizaron los
índices mitóticos, índice de fases y anomalías del material hereditario. Se puede
observar que los extractos acuosos poseen casi nula citotoxicidad a diferencia de los
aceites esenciales y esto se debe principalmente a que los extractos acuosos y los
aceites esenciales tienen diferencias en la composición y diferencias en la
concentración de compuestos, por lo que los estudios no son comparables. A pesar de
que las plantas evaluadas pueden ser bien toleradas por los sistemas biológicos en los
trabajos mencionados, se necesita constatar con mayor precisión el potencial
toxicológico de los aceites esenciales, lo que implica la necesidad de más estudios,
como pruebas in vivo, para aclarar los aspectos relacionados con la citotoxicidad. Otro
punto a considerar es que la presencia de citotoxicidad, por más pequeñas que sea,
implica la necesidad de seguir estudiando todos los componentes de las plantas para
garantizar la seguridad en su uso como tratamiento farmacológico en el futuro. Un
punto importante es que no se puede concluir el efecto o ausencia de citotoxicidad de
estas plantas en base a tan pocos estudios; sin embargo, estos resultados pueden
servir como modelo para otros estudios in vitro o servir de base para futuras
investigaciones más amplias como pruebas in vivo.
Las pruebas de inhibición siguientes se realizaron con valores menores a la

concentración más alta no citotóxica y los resultados garantizan que el aceite esencial
no genere citotoxicidad sobre la línea celular VERO-76, de lo contrario se generarían
unas falsas Unidades Formadoras de Placas (UFP) o desprendería grandes secciones
de la monocapa celular impidiendo la visualización de los resultados.
Los métodos utilizados en el presente estudio ya han sido comprobados bajo otras
condiciones mostrando efectividad en estudios previos de otros extractos vegetales en
actividad antiviral en DENV-2 y ZIKV (Mayta-Huatuco et al., 2020).
Durante la determinación de la Titulación Viral se encontró que el día óptimo para

revelar la placa de titulación para DENV-2 fue los 9 días y ZIKV a los 7 días, donde
67
pueden verse placas bien definidas, así que se revelaron las pruebas de reducción de
placas (PRP) también en esos días. Esto puede explicarse según el ciclo de
crecimiento viral observado en la monocapa celular en ambos casos durante la
propagación de las semillas virales, donde el virus se ha adaptado bien a las
condiciones estandarizadas del laboratorio y a mayor número de pasajes del virus, el
efecto citopático aparece en menor número de días post-infección, el crecimiento se
extrapola de manera similar al crecimiento en placas (Sevilla L., 2018).
La prueba de reducción de placas para ZIKV con el aceite esencial de Gentianella

alborosea demostró una inhibición del 54.3% a la concentración de 46.83 µg/ml del
aceite lo que demuestra una alta acción antiviral que podría ser evaluada en estudios
posteriores. El aceite esencial de Gentianella nitida logró inhibir el ZIKV en un 41.2% a
una concentración de 43.8 µg/ml. Se eligió el método semisólido en monocapa celular
para la infección con ZIKV teniendo en cuenta los trabajos de Roehrig et al., 2008,
quién usó el método semisólido con medio de recubrimiento (overlayer) determinando
que son aceptables carboximetilcelulosa (CMC), metilcelulosa (MC) y agarosa;
condicionado a la ausencia de inhibidores ya que pueden inhibir la formación de
placas (UFP). El medio de recubrimiento usado en este estudio fue el semisólido con
CMC al 3% que Quispe-Bravo B., 2020 usó como medio de recubrimiento para su
prueba de reducción de placas y titulación de ZIKV.
Al analizar los efectos de estos aceites esenciales sobre el DENV-2 se obtuvo que el
aceite esencial de Gentianella alborosea inhibió en un 51.7% a una concentración de
28.10 µg/ml y Gentianella nitida pudo inhibirlo en un 42.11% a una concentración de
26.28 µg/ml. Para el virus DENV-2 se utilizó el método semisólido con células Vero en
suspensión celular. Se describen varios estudios del uso de este método para DENV-2
para obtener placas más definidas. El método de suspensión celular es más largo,
pero más eficaz para obtener placas definidas, a diferencia del método semisólido en
monocapa recomendado por la OMS (Álvarez Vera et al., 2010; Sevilla L., 2018).
La actividad antiviral que se muestran en los resultados de este estudio se encuentra

relacionado a los componentes de los aceites esenciales, ya que Guo et al., 2021,
reporta que los sesterpenos que se encuentran presentes en la Gentianella nitida y
Gentianella alborosea son compuestos bioquímicamente activos con gran potencial
antimicrobiano. El aceite esencial de Gentianella alborosea contiene terpenoides, de
los cuales destacan los monoterpenos del pentano-secoiridoides (secologanósido,
amarosverina, amarogentina) (INS, 2010) y en general los monoterpenos has sido
reportados como buenos antivirales en varios estudios sobre la actividad antiviral de
68
aceites esenciales contra virus que poseen envoltura, un ejemplo es el limonelo;
compuesto que fue encontrado en el aceite esencial de 8 especies vegetales con alta
actividad antiviral en diferentes trabajos que al ser aislado mostró una efectividad
antiviral contra el virus del herpes del 99 % y su IC50 del 5.9 ± 5.3 µg/ml (Astani &
Schnitzler, 2014).
El aceite esencial de Gentianella nitida también contienen terpenos y terpenoides entre

los que destacan los sesterterpeno nistidasina y nitiol y los secoiridoides (monotrpenos
C10) ecologanosida, amaroswerina, amarogentina y amaronitidina (Rubio-Guevara et
al., 2020). El sesquiterpeno β-cariofileno demostró alta capacidad antiviral en un
estudio realizado por Nogueira Sobrinho et al., 2021 al aceite esencial de Lippia alba
con un IC50 de 32.2 μg/ml contra el ZIKV.
En el caso de inhibición de Flavivirus, los monoterpenos geraniol, citronelol, pineno y

mirceno (provenientes del cedrón, citronela y cúrcuma) presentaron una alta
capacidad de inhibición del virus del dengue con un IC50 fue de 17,91 µg/ml para el
caso de cúrcuma y la citronela presentó un porcentaje de inhibición de 100% contra
DENV y un 83% de inhibición contra el al virus de la Fiebre Amarilla y las plantas laurel
y verbena (ricas en los monoterpenos eugeniol y geraniol respectivamente) inhiben en
un 100% las placas del virus de la Fiebre Amarilla al probar su capacidad antiviral de
(Ichsyani et al., 2017; Meneses et al., 2009b).Los aceites esenciales de ajenjo y el
orégano (monoterpenos linalool, pineno, sabineno y mirceno) inhiben casi en su
totalidad al virus de la Fiebre Amarilla al probar su capacidad antiviral a una
concentración de 100 µg/ml (Jalal, 2022; Meneses et al., 2009a; Teixeira et al., 2013).
Todos los estudios mencionados nos muestran a los terpenos y terpenoides en sus
diferentes formas (monoterpenos, sesterterpeno, secoiridoides) como excelentes
antivirales. Este estudio propone que los terpenos y terpenoides en general poseen
alta actividad antiviral y que los presentes en los aceites esenciales de Gentianella
alborosea y Gentianella nitida pueden ser los responsables de la actividad antiviral
mostrada frente a ZIKV y DENV-2.
Los resultados también muestran que el aceite esencial de Gentianella alborosea

presenta mayor actividad antiviral que el aceite esencial de Gentianella nitida; ya que
el porcentaje de inhibición supera el 50%; sin embargo, el estudio de Barona Endara,
2022, clasifica la efectividad antiviral de los aceites esenciales según la siguiente
escala: alta total (inhibición total: 100%), alta (50 – 99%), moderada (20 – 49%), baja
(1 – 20%) y sin efectividad (0%); según la cual el aceite esencial de Gentianella
69
alborosea demostró una alta actividad antiviral sobre ZIKV y DENV-2; mientras que, el
aceite esencial de Gentianella nitida presentó moderada actividad antiviral sobre
ambos virus. Esta diferencia puede deberse a que, si bien ambas plantas pertenecen
al mismo género, y poseen muchos compuestos en común, estos no se encuentran en
las mismas cantidades en ambas plantas y cada uno también posee compuestos
únicos como el sesterterpeno alborosin en Gentianella alborosea y el sesterterpeno
nitiol presente en Gentianella nitida (Rubio-Guevara et al., 2020).
Han sido estudiado ampliamente variaciones del efecto inhibitorio de aceites

esenciales tomando en cuenta varios factores, como el tiempo y temperatura de
hidrodestilación en el proceso de extracción, también con respecto a la parte de la
planta utilizada (Meneses, Torres, et al., 2009a) y de igual manera se han reportado
variaciones en la actividad antiviral de plantas de la misma especie colectadas en
diferentes lugares (Quispe-Bravo B., 2020).
La amplia biodiversidad con la que cuenta nuestro país es literalmente una farmacia
natural aún por explorar e investigar, esto particularmente de gran importancia en el
caso de la búsqueda de fármacos antivirales en países tropicales con serias
problemáticas con Flavivirus entre otros agentes infecciosos.
70
IX. CONCLUSIONES
 En la Prueba de Citotoxicidad el aceite esencial de Gentianella alborosea

presenta citotoxicidad sobre la línea celular Vero-76 en concentraciones
superiores a 0.1405 ug/ml.
 En la Prueba de Citotoxicidad realizada al aceite esencial de Gentianella nitida

se demostró que las concentraciones superiores a 0.1314 ug/ml son citotóxicas
para la línea celular Vero-76.
 El aceite esencial de Gentianella alborosea posee una alta actividad antiviral in

vitro contra el ZIKV y el DENV-2 mostrando un 54.3% y 51.7% de inhibición
respectivamente en la Prueba de Reducción de Placas.
 Se mostró mediante la Prueba de Reducción de Placas, que el aceite esencial

de Gentianella nitida posee una moderada actividad antiviral in vitro contra el
ZIKV y DENV-2 con un 41.2% y 42.11% de inhibición respectivamente.
71
X. RECOMENDACIONES
 Realizar estudios de los componentes presentes en los aceites esenciales, en

particular se deben hacer estudios individuales de los monoterpenos y xantonas,
para determinar cuáles son los responsables de la actividad antiviral y de la
misma manera estudiar sus efectos citotóxicos para verificar las dosis antivirales
no citotóxicas.
 Realizar estudios de caracterización bioquímica del aceite esencial de cada
especie para hallar la cantidad presente de cada componente y determinar los
parámetros fisicoquímicos que proveerá información base al momento de realizar
estudios más profundos sobre la actividad biológica de los componentes
 Realizar un análisis del perfil bioquímico de la planta, tanto en la temporada de
floración como en la temporada vegetativa, para poder dilucidar las diferencias de
componentes entre los estadíos de las plantas.
 Realizar pruebas de docking molecular para complementar los hallazgos in vitro
obtenidos, así como validar otras propiedades que pudiesen ser descritas
aprovechadas a nivel farmacológico.
 De igual manera al ser este el primer trabajo sobre la capacidad antiviral de estos
aceites esenciales, se deben hacer más estudios in vitro en diferentes líneas
celulares para recolectar información que sirva de base para estudios in vivo y
como candidato a fármaco antiviral.
72
XI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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85
XII. ANEXOS
ANEXO 1: Colecta de Gentianella alborosea y Gentianella nitida
A. Ubicación: Departamento de Junín. Círculo amarillo: Zona de crecimiento de

Gentianella alborosea. Círculo verde: zona de crecimiento de Gentianella nitida.
86
1. Colecta de Gentianella alborosea
A. Identificación y colecta de Gentianella alborosea en el distrito de Comas,

provincia de Concepción, departamento de Junín; a 4002 msnm.
87
B. Ruta hacia el punto de colecta de Gentianella alborosea. Coordenadas 11°44’
S y 75°00’ W.
2. Colecta de Gentianella nitida
88
A. Identificación y colecta de Gentianella nitida en el margen izquierdo de la
laguna Alcacocha, distrito de Junín, provincia de Junín, departamento de
Junín; a 4422msnm.
B. Ruta hacia el punto de colecta de Gentianella nitida. Coordenadas 11.0524° S

y 75.907° W.
89
3. Extracción de aceites esenciales
Aparato Clevengere modificado: Extracción del aceite esencial de Gentianella

alborosea y Gentianella nitida mediante Hidrodestilación por arrastre de Vapor.
90
ANEXO 2: Constancias de Identificación
91
92
ANEXO 3: Composición de Medios de Cultivo Celular
1. Medio de crecimiento (MC):
Medio Minimo Esencial con sales de Earle (E-MEM) (GIBCO) 0.939 g

Aminoacidos no esenciales 100x (SIGMA) 1%
Piruvato de sodio 100mM (SIGMA) 1%
L-glutamina 200mM (SIGMA) 1%
Antibiotico y antimicotico 100x (SIGMA) 1%
Suero Bovino Fetal (SBF) (SIGMA) 10%
Bicarbonato de sodio 7.5% (SIGMA)* *
Buffer Hepes (CDH) 24 mM* *
Agua bidestilada estéril Completar a 1 L
 Adicionar bicarbonato de sodio hasta ajustar el pH a 7,3.

 Adicionar 25 mM de Hepes.
 Esterilizar por filtración con membrana de 0,22 μm y almacenar a 4 °C
2. Medio de Mantenimiento (MM):


 Adicionar 25 mM de Hepes.
93
3. Medio de Recubrimiento:
CMC al 6%:
Carboximetilcelulosa
6g
(SIGMA)
Agua bidestilada 100 mL
 Esterilizar por calor húmedo y almacenar a 4 °C.
Medio E-MEM a doble concentración (2X):


 Se mezcla el medio E-MEM 2 X ajustado a pH: 7,3 con CMC al 6% en
la relación 11: 5, luego adicionar 25 mM de Hepes.
 Dejar incubar el medio de recubrimiento a 37 °C durante 24 horas.
4. Colorante Naftol Blue Black (NBB):
Naftol Blue Black (SIGMA) 2g

Acetato de sodio 13,6 g
Ácido acético glacial 60 mL
Agua destilada Completar a 1 L
 No requiere de esterilización.
 Almacenar a temperatura ambiente en frascos oscuros.
94
ANEXO 4: Cálculos Numéricos de los Procedimientos
1. Conteo de Células:
 Se realiza el desprendimiento de la monocapa celular con tripsina.

 Mezclar 50 μl de suspensión celular y 50 μl de colorante de azul de tripán.
 Dispensar 10 μl de la mezcla en los compartimientos de la Cámara de
Neubauer.
 Realizar el conteo de células de cada uno de los cuatro cuadrantes de la
cámara de Neubauer.
 Calcular el promedio de células de los cuatro cuadrantes.
Concentración Promedio Factor de Factor de conversión de la

= x x
de células de células Dilución Cámara de Neubauer
Factor de dilución: 2
Factor de conversión de la Cámara de Neubauer: 104.
2. Ajuste de Concentraciones:
C1 x V1 = C2 x V2
C1: Concentración inicial de células.

V1: Volumen inicial.
C2: Concentración celular requerida.
V2: Volumen final requerido.
3. Cálculo del Título Viral:
95
ANEXO 5: Prueba de Citotoxicidad de los aceites esenciales sobre la Línea
celular Vero-76
1. Placa de citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella alborosea en línea

celular VERO-76.
2. Placa de citotoxicidad del aceite esencial de Gentianella nitida en línea celular

VERO-76.
96
ANEXO 6: Efecto Citopático (ECP) del ZIKV y DENV-2 sobre la línea celular Vero-
76
1. Efecto Citopático del ZIKV sobre la monocapa de células Vero-76 visto al

microscopio. (A): Frasco de Control Celular inoculado con MM 6 días post
inoculación. (B): Efecto citopático de 3+ de la semilla viral de ZIKV (pasaje 3) 6
días post infección. Se cosechó el ZIKV de este frasco infectado.
2. Placa de lisis celular producto de la infección de ZIKV sobre la línea celular Vero-
76 vista al microscopio como resultado de una Prueba de plaqueo viral revelada.
(A): Placa de lisis celular vista a un aumento de 20X en el microscopio invertido.
(B): Placa de lisis celular vista a un aumento de 40X en el microscopio invertido.
97
3. Efecto Citopático de DENV-2 sobre la monocapa de células Vero-76 visto al
microscopio. (A): Frasco de Control Celular inoculado con MM 6 días post
inoculación. (B): Efecto citopático de 3+ de la semilla viral de DENV-2 (pasaje 3)
11 días post infección. Se cosechó el DENV-2 de este frasco infectado.
4. Placa de lisis celular producto de la infección de DENV-2 sobre la línea celular

Vero-76 vista al microscopio como resultado de una Prueba de plaqueo viral
revelada.
(A): Placa de lisis celular vista a un aumento de 20X en el microscopio invertido.
(B): Placa de lisis celular vista a un aumento de 40X en el microscopio invertido.
98
ANEXO 7: Placas de los Ensayos de Titulación de ZIKV y DENV-2
1. Placa del Ensayo de Titulación de ZIKV
2. Placa del Ensayo de Titulación de DENV-2
99
3. Placa de Prueba de Ajuste de Título Viral de DENV-2
100
ANEXO 8: Prueba de Reducción de Placa (PRP)
1. Prueba de Reducción de Placas para ZIKV
1.1 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV usando el aceite esencial de

101
1.2 Prueba de Reducción de Placas para ZIKV usando el aceite esencial de
Gentianella nitida
102
1.3 Placa de Controles virales para ZIKV
2. Prueba de Reducción de Placas para DENV-2
2.1 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2 usando el aceite esencial de

103
2.2 Prueba de Reducción de Placas para DENV-2 usando el aceite esencial de
Gentianella nitida
104
2.3 Placa de Controles virales para ZIKV
105
ANEXO 9: Flujogramas
1. Descongelamiento y Propagación de Línea Celular VERO-76:
2. Protocolo de Producción de Semillas Virales:
106
3. Titulación de semilla viral ZIKV:
107

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América

Evaluación de la actividad inhibitoria de Gentianella

Dra. Egma Marcelina MAYTA HUATUCO

Chávez, A. (2023). Evaluación de la actividad inhibitoria de Gentianella alborosea

Nombres y apellidos Alys Mercedes Chávez Alvarado

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 47290522

URL de ORCID https://orcid.org/0000-0002-1982-9762

Nombres y apellidos Egma Marcelina Mayta Huatuco

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 06175080

URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-8471-1675

Datos del jurado

Presidente del jurado

Nombres y apellidos Enrique Walter Mamani Zapana

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 02414092

Miembro del jurado 1

Nombres y apellidos Miguel Angel Francisco Talledo Rivera

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 25625144

Miembro del jurado 2

Nombres y apellidos Domingo Iparraguirre Leon

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 08609804

Virología Clínica Molecular

Perú. Universidad Nacional Mayor de San

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Año o rango de años en que se

Ciencias de las plantas, Botánica

A Dorian y Churrita por llenarme la vida de amor, alegría y pelitos.

A mis amadas mascotas, que me enseñaron lo que significa amar incondicionalmente,

A los miembros y amigos del Laboratorio de Virología Clínica y Molecular: Dilan

Y finalmente pero no menos importante le agradezco al señor Armandito Alvarado,

TABLA DE CONTENIDO ............................................................................................ iv

LISTADO DE TABLAS Y FIGURAS.......................................................................... xiii

II. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 2

2.2 Clasificación ZIKV Y DENV ................................................................................. 2

2.3 Género Flavivirus ................................................................................................ 3

2.4 Ciclo de vida ........................................................................................................ 4

2.5 Tratamiento para la infección por DENV y ZIKV .................................................. 6

2.7 Virus Zika ............................................................................................................ 7

2.7.1 Estructura viral .......................................................................................... 7

2.7.2 Genotipos ................................................................................................. 9

2.7.3 Tropismo ZIKV .......................................................................................... 9

2.7.4 Manifestaciones clínicas ZIKA.............................................................. 9

2.7.4.1 Infección aguda por ZIKV .................................................................... 9

2.7.4.2 Complicaciones de la infección aguda por ZIKV ............................. 10

2.7.4.3 Síndrome de Guillian-Barré ............................................................ 10

2.7.4.4 Infección congénita ......................................................................... 11

2.7.5 Patogénesis ............................................................................................ 12

2.7.6 Epidemiología ......................................................................................... 13

2.7.7 Ciclo de transmisión ............................................................................... 14

2.7.8 Distribución geográfica ........................................................................... 14

2.7.9 Vigilancia epidemiológica ........................................................................ 15

2.8 Virus Dengue..................................................................................................... 17

2.8.1 Serotipos virus Dengue........................................................................... 17

2.8.2 Estructura Viral ....................................................................................... 18

2.8.3 Tropismo DENV ...................................................................................... 19

2.8.4 Manifestaciones clínicas ......................................................................... 20

2.8.4.1 Dengue ........................................................................................... 20

2.8.4.2 Dengue Grave (DG)........................................................................ 21