UNIVERSIDAD SAN LORENZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD Y EL DEPORTE

CARRERA BIOQUIMICA

FRECUENCIA DE VIRUS CAUSANTES DE INFECCIÓN

RESPIRATORIA AGUDAS (IRAs) DETECTADOS POR MÈTODOS
MOLECULARES. EXPERIENCIA EN UN LABORATORIO
PRIVADO DE ASUNCIÒN EN EL AÑO 2017.

AUTORA

ZORAIDA ARRÚA

TUTORA

B.C. Fátima Rodríguez, MSc

SAN LORENZO-PARAGUAY

2019
 UNIVERSIDAD SAN LORENZO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD Y EL DEPORTE

TESIS DE GRADO PRESENTADA COMO REQUISITO PARA

CULMINAR LA CARRERA DE BIOQUIMICA

AUTORA

ZORAIDA MABEL ARRUA ORUE

SAN LORENZO - PARAGUAY

2019
 HOJA DE RESPONSABILIDAD

Declaro mi responsabilidad absoluta sobre el contenido, datos,

expresiones que consten en este trabajo, eximiendo a la Universidad San
Lorenzo de responsabilidad sobre el contenido del mismo. En caso que el
mismo sea publicado la Universidad deberá indicar que la autoría o creación
del presente trabajo de investigación corresponden a mi persona.

Zoraida Mabel Arrúa Orué

C.I: 4.870.364

II
 DEDICATORIA

En primer lugar, dedico este trabajo a Dios por permitirme llegar a este
momento tan importante en mi formación profesional, por la fortaleza que me
ha brindado en los momentos difíciles, por iluminar mi camino y poder culminar
este trabajo de investigación.
De todo corazón agradezco a mi padre Ignacio Arrúa, a mis hermanos:
Damián, Edgar, Gloria y Raquel por haberme dado todo el amor de mundo,
cariño, compresión y consejos en los momentos difíciles y el apoyo
incondicional durante en toda mi vida, por eso este logro también es de
ustedes.
A mi madre Sixta Orué que, aunque ya no esté físicamente me bendice y
me protege desde el cielo.
A mis sobrinos Martina y William por darme la alegría e inocencia que
solo ustedes saben brindar.

III
 AGRADECIMIENTO

En primer lugar, quiero agradecer a la Universidad por permitir formarme

en ella, a mis maestros por las enseñanzas que me otorgaron durante varios
años, fueron ustedes los responsables de realizar gran aporte que hoy se vería
reflejado en la culminación de mi paso por la universidad, a todo el plantel que
fueron participes de este proceso ya sea de forma directa o indirectamente,
gracias de corazón.
Gracias a mi familia que fueron mis mayores promotores de mis sueños,
gracias a cada uno de ellos por confiar y creer en mi durante este proceso,
gracias a Dios que fue mi principal apoyo y motivador día tras día.
Gracias a mis compañeros de trabajo del Laboratorio San Roque por el
apoyo constante, en especial a mis compañeras de guardia Miriam Ruiz Diaz
por el aliento de siempre y por acompañarme en las agotadoras noches de
guardia, a la dra. Liza Ramírez por la ayuda incondicional, al coordinador del
laboratorio el Dr. Raúl Ferreira por guiar y orientarme profesionalmente siempre
con mucha sabiduría, al Dr. Ramon Fernández, Dr. William Figueredo, a la dra.
Juliana Penayo por la paciencia y por despejar cada duda que se me
presentaba.
Gracias a mis amigos Ángel Lezcano y a Del Rosario Bogado, por no
dejarme sola en los momentos difíciles y por cada palabra de aliento.
A mi tutora Dra. Fátima Rodríguez por mostrarme siempre el valor del
aprendizaje, por su paciencia, dedicación, motivación y esfuerzo constante, por
haberme brindado la oportunidad de recurrir a su capacidad y conocimiento
científico, por la confianza cuando más lo necesité, y por creer siempre en mí
durante el desarrollo de la tesis.
Gracias a la vida por este nuevo logro, gracias a todas las personas que
me apoyaron y creyeron en la realización de esta tesis.

IV
 RESUMEN
Las infecciones respiratorias agudas siguen siendo una de las causas
más frecuentes de morbimortalidad en todo el mundo, de ahí el diagnóstico
precoz es fundamental. Tradicionalmente las pruebas diagnósticas para este
tipo de infecciones se han basado en métodos convencionales que incluyen
cultivos en medios artificiales para el aislamiento de virus, bacterias, o la
detección antigénica o de anticuerpos mediante inmunofluorescencias, y
técnicas inmunocromatográficas (1,2).
El principal inconveniente de las técnicas metodológicas anteriormente
citadas es el tiempo necesario para obtener el diagnóstico de la infección
causadas por distintos tipos de agentes etiológicos. Las técnicas basadas en
biología molecular han irrumpido con fuerza en las últimas décadas como
herramienta de diagnóstico rápido de infecciones respiratorias agudas(1–3)
El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de virus
causantes de IRA detectados por métodos moleculares. Se realizó un estudio
descriptivo, de corte transversal donde se analizaron las muestras por
Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real.
Se analizaron 405 muestras del 1 de enero al 31 de diciembre del 2017
a pacientes de 0 a 99 años, identificándose uno o más agente viral en 187
casos (46 %), las distintas muestras biológicas estudiados consistieron en
hisopados nasofaríngeos, conjuntival, secreciones traqueales, liquido
cefalorraquídeos, pleural, heces y sangre.
Los virus respiratorios detectados fueron Rhinovirus (HRV) 31%,
Influenza (Flu A) 20%, Influenza B (Flu B) y Virus Sincitial Respiratorio (VRS)
11% y Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza (PIV) 10%, Adenovirus (ADV)
y Coronavirus (HCoV) fueron detectados en frecuencia menores (7%), en este
estudio no se detectó Bocavirus humano (HBoV). El Rhinovirus se identificó
con mayor frecuencia en pacientes con edades comprendidas de 19 -60 años
(42%), el Virus Respiratorio Sincitial en niños menores de 5 años (61%) y la
influenza A en adultos mayores de 61 a 99 años (60%), en referencia a la
circulación viral durante las estaciones del año, la influenza A alcanzo un pico
V
mayor en otoño e invierno, sin embargo, el Rhinovirus estuvo en circulación
durante todo el periodo del año estudiado. Con la implementación de técnicas
moleculares para un diagnóstico rápido y útil en las infecciones respiratorias
agudas se dispuso de datos sobre la epidemiologia de afecciones de probable
etiología viral similar a lo observado en otros países.
Palabras claves: Infecciones Respiratorias Agudas, Métodos
Moleculares Reacción en cadena de la polimerasa, virus respiratorios.

VI
ÍNDICE DE CONTENIDOS
HOJA DE RESPONSABILIDAD............................................................................................... II

DEDICATORIA .......................................................................................................................... III

AGRADECIMIENTO ................................................................................................................. IV

RESUMEN ................................................................................................................................... V

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................... XI

INTRODUCCION........................................................................................................................ 9

CAPITULO I: MARCO INTRODUCTORIO........................................................................... 11

1.1 Descripción del problema: ............................................................................................ 11

1.2 Preguntas de investigación .......................................................................................... 12

1.2.1 Pregunta General ................................................................................................. 12

1.2.2 Preguntas Específicas ......................................................................................... 12

1.3. Objetivos de Investigación ...................................................................................... 13

1.3.1 Objetivo General ................................................................................................... 13

1.3.2 Objetivos Específicos........................................................................................... 13

1.4 Justificación .................................................................................................................... 13

CAPÍTULO II: MARCO TEORICO ......................................................................................... 15

2.1. Infecciones respiratorias agudas: .............................................................................. 15

2.1.1 Historia: .................................................................................................................. 15

2.1.2 Generalidades:...................................................................................................... 17

2.1.3 Antecedentes: ....................................................................................................... 17

2.1.4 Etiología: ................................................................................................................ 19

2.1.5 Virus causales de IRAs - Generalidades .......................................................... 19

2.1.5.1 Virus de la Influenza......................................................................................... 19

2.1.5.2 Virus Parainfluenza .......................................................................................... 21

2.1.5.3 Virus Respiratorio Sincitial .............................................................................. 22

VII
2.1.5.4 Rhinovirus Humano.......................................................................................... 22

2.1.5.5 Bocavirus humano............................................................................................ 22

2.1.5.6 Coronavirus ....................................................................................................... 23

2.1.5.7 Adenovirus ......................................................................................................... 24

2.1.5.8 Metapneumovirus ............................................................................................. 24

2.1.4 Distribución de las IRAs ...................................................................................... 25

2.1.4.1 Geográfica - Poblacional ................................................................................. 25

2.1.5 Métodos de diagnóstico IRAs virales: ............................................................... 25

2.1.5.1 Aislamiento del virus en cultivo: ..................................................................... 25

2.1.5.1.1 Ventajas del Aislamiento del virus en cultivo: .............................................. 26

2.1.5.1.2 Desventajas del Aislamiento del virus en ..................................................... 26

2.1.5.2 Técnicas inmunocromatográficas: ................................................................. 26

2.1.5.2.1 Ventajas de las técnicas Inmunocromatográficas: ......................................... 26

2.1.5.2.2 Desventajas de las Técnicas Inmunocromatográficas: .............................. 27

2.1.5.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa – Generalidades .......................... 27

2.1.5.3.1 Tipos de PCR, características y aplicaciones ................................................. 27

2.1.5.3.2 PCR Tiempo Real – Concepto y generalidades ............................................. 28

2.1.5.3.3 Sistemas de detección utilizados en PCR en tiempo real. ............................ 29

2.1.5.3.4 Análisis de la curva de fusión: ........................................................................... 30

2.1.5.3.5 Umbral y valores del ciclo................................................................................... 31

2.1.5.3.6 Estrategias para la cuantificación por qPCR ................................................... 31

2.1.5.3.6.1 Cuantificación absoluta: .................................................................................. 32

2.1.5.3.6.2 Cuantificación relativa:..................................................................................... 32

2.1.5.3.7 Ventajas de la PCR en tiempo real: .................................................................. 32

3.1. Nivel de Investigación: Descriptivo ............................................................................ 33

3.2. Enfoque de la investigación: Cuantitativo ................................................................. 33

VIII
 3.3. Diseño de estudio: No experimental de corte transverso ...................................... 33

3.4. Lugar de investigación: Laboratorio privado de Asunción ..................................... 33

3.5. Población ....................................................................................................................... 33

3.6. Muestra .......................................................................................................................... 33

3.7. Tipos de muestras ........................................................................................................ 34

3.8. Muestreo ........................................................................................................................ 34

3.9. Criterios de Inclusión.................................................................................................... 34

3.10. Criterios de exclusión ................................................................................................ 34

3.11. Consideraciones éticas ............................................................................................. 35

3.12 Definición de Variables ............................................................................................... 35

3.13 Operacionalización de variables ............................................................................... 36

CAPITULO IV ............................................................................................................................ 37

MARCO ANALITICO................................................................................................................ 37

4.1 PRESENTACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS ........................................ 37

Discusiones ........................................................................................................................... 40

Recomendaciones: .................................................................................................................. 43

Conclusión ................................................................................................................................. 43

Bibliografía................................................................................................................................. 45

Anexos ....................................................................................................................................... 52

IX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Página 29
Figura 2 Página 30
Figura 3 Página 31
Figura 4 Página 37
Figura 5 Página 38
Figura 6 Página 39
Figura 7 Página 40

X
 LISTA DE ABREVIATURAS

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ARN: Ácido ribonucleico
ADV: Adenovirus
CDC: Centros para el control y Prevención de las enfermedades
ENO: Enfermedad de notificación obligatoria
Flu A: Influenza A
Flu B: Influenza B
HBoV: Bocavirus Humano
HCoV: Coronavirus Humano
HRV: Rinovirus humano
HMPV: Metapneumovirus humano
IRAs: Infecciones Respiratorias Agudas
IFD: Inmunofluorescencia directa
IFI: Inmunofluorescencia indirecta
OPS: Organización Panamericana de la Salud
OMS: Organización Mundial de la Salud
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa tiempo real
PCR- RFLP: Reacción en cadena de la polimerasa polimorfismo de longitud del
fragmento de restricción
PCR- RT: Reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa
PIV 1,2,3,4: Parainfluenza 1,2,3,4
VRS: Virus Respiratorio Sincitial

XI
 INTRODUCCION
Las Infecciones Respiratorias Agudas (IRAs) se refieren a un conjunto
de infecciones que afectan el aparato respiratorio, causadas por virus,
bacterias o combinación de ambas. Las manifestaciones clínicas son muy
variables, desde infecciones leves a crónicas, y constituyen una de las
principales causas de ingreso hospitalario de pacientes pediátricos, adultos
mayores e inmunocomprometidos, siendo responsable de la morbimortalidad
de los mismos. Es considerada como una de las enfermedades transmisibles
más frecuentes en el ser humano(1–3).
Los virus son los principales agentes causales de las IRAs la dificultad
en el diagnóstico de los mismos por los métodos convencionales como la
Inmunofluorescencia (IFI), cultivos y la identificación de antígenos o
anticuerpos virales por inmunocromatografía; están limitados por su alto costo,
baja sensibilidad, dependencia del estado inmunológico del paciente y la
prórroga de resultados, estos factores impulsaron el avance de la ciencia en el
área de la Biología Molecular permitiendo ampliar el conocimiento y la
utilización de diversas herramientas para la detección e identificación de
distintos patógenos que afectan el tracto respiratorio. Las técnicas moleculares
se caracterizan por su alta sensibilidad y especificidad, como la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR), que permite la detección de ácidos nucleicos
en la búsqueda y reconocimiento de parte del genoma viral de los agentes
causales de manera rápida y con alto grado de confiabilidad. Es por ello que la
utilización de métodos moleculares para la identificación de los patógenos
respiratorios virales en pacientes conducirá a un mejor diagnóstico de la
enfermedad desde el punto de vista clínico, epidemiológico, y del
tratamiento(4,5).
La introducción de métodos de diagnóstico molecular ha mejorado
significativamente la investigación epidemiológica de las IRAs con alto
potencial para la detección de una amplia gama de virus. La frecuencia de
aparición de las infecciones virales es muy similar en países en desarrollo y en
vías de desarrollo, los agentes etiológicos asociados frecuentemente en niños y
adultos de la tercera edad son Virus Respiratorio Sincitial (VRS), los 4 tipos de
9
Parainfluenza (PIV 1,2,3,4), Influenza (FLU A, FLU B), Adenovirus (ADV),
Rinovirus humano (HRV). A nivel mundial los virus de influenza (FLU A – FLU
B) y VRS figuran como los responsables de un tercio de las infecciones
respiratorias agudas. En EEUU se estima que el número de niños fallecidos por
VSR se cifra entre 70 y 250 al año, seguidas por infecciones causadas por
Rinovirus, Bocavirus, Parainfluenza 1,2,3,4, Methapneumovirus.
A nivel nacional, los Sistema de Vigilancia del Ministerio de Salud y de
la Organización Panamericana de la Salud (OPS) han identificado la circulación
simultánea de varios virus respiratorios como: VRS, Influenza A/H3, Influenza
B, Parainfluenza y Metapneumovirus humano, Rinovirus humano con
predominio del virus de la influenza B en los últimos años (2014-2017) (6–8).
En la actualidad a nivel mundial, las infecciones respiratorias agudas
son un problema de salud pública por lo que es importante considerar los
mecanismos de patogénesis, conocer el agente etiológico y los avances que se
han logrado en el diagnóstico éstos, de esta manera continuar fortaleciendo los
esfuerzos que se han realizado para la disminución y prevención de las
infecciones respiratorias.

10
 CAPITULO I: MARCO INTRODUCTORIO
1.1 Descripción del problema:
Las infecciones respiratorias agudas constituyen las enfermedades
más frecuentes a lo largo de la vida del ser humano, son de rápida propagación
y se presentan especialmente en pacientes con factores de riesgos como
recién nacidos, inmunodeprimidos o portadores de enfermedades crónicas,
siendo la causa más común de morbilidad y mortalidad en el periodo invernal
(9).
Los principales agentes causales de las IRAS son los virus, donde la
dificultad en el diagnóstico de los mismos por los métodos clásicos, entre los
que se incluye el cultivo o la identificación de antígenos virales por métodos
inmunológicos tales como inmunofluorescencia directa e indirecta (IFD, IFI),
inmunocromatografía entre otros; están limitados por su alto costo, metodología
engorrosa, tiempo prolongado de respuesta y dependencia del estado
inmunológico del paciente; todos estos factores han impulsado el avance de la
ciencia en el área de la biología molecular que posibilitan la utilización de
herramientas y técnicas de alta sensibilidad y especificidad, como la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR) que permite la detección de los agentes
causales de manera rápida y con alto grado de confiabilidad (5).
La epidemiologia de las infecciones virales es similar en los países
desarrollados y en vías de desarrollo afectando generalmente a niños menores
y a adultos de la tercera edad. Los agentes etiológicos asociados
frecuentemente a infecciones de las vías respiratorias altas en el niño son:
Virus Respiratorio Sincitial (VRS A-B), Rinovirus Humano (HRV), los 4 tipos de
Parainfluenza (PIV 1,2,3,4), Influenza (FLU A- FLU B). A nivel mundial se
estima que el VRS es el responsable de casi 7% de las muertes de niños de
entre un mes y 1 año, otras personas en riesgo de enfermedades graves tras la
infección de VRS son los adultos mayores de 65 años y personas
inmunocomprometidas. En EEUU se estima que el número de niños fallecidos
por VSR se cifra entre 70 y 250 al año, seguidas por infecciones causadas por
Rinovirus, Bocavirus, Parainfluenza 1,2,3,4 y Metapneumovirus(3,5,10,11).

11
 A nivel de salud pública, los Sistema de Vigilancia del Ministerio de
Salud y de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) han identificado la
circulación simultánea de varios virus respiratorios como: VRS, Influenza A/H3,
Influenza B, Parainfluenza y Metapneumovirus humano, con predominio del
virus de la influenza B en los últimos años (2014-2017) (6–8).
En el sector privado no se cuenta con referencia al respecto, debido a
que las IRAS no se encuentran en la lista de Enfermedad de Notificación
Obligatoria (ENO) en nuestro sistema de salud pública, es por ello que este
trabajo pretende determinar la frecuencia de virus respiratorios causantes de
Infección Respiratoria Aguda por métodos moleculares en pacientes que
acudieron a un laboratorio privado en Asunción en el año 2017.

1.2 Preguntas de investigación

1.2.1 Pregunta General
¿Cuál es la frecuencia de los virus causantes de infecciones
respiratorias agudas (IRAs) detectados por métodos moleculares?

1.2.2 Preguntas Específicas

¿Cuáles son los agentes causantes de Infecciones Respiratoria Aguda
(IRA) detectados por métodos moleculares, en pacientes que acuden a un
laboratorio privado de Asunción, de enero a diciembre del 2017?
¿Cómo es la distribución y frecuencia de los principales virus
causantes de Infecciones Respiratoria Aguda (IRA), teniendo en cuenta
variables como: edad y sexo del paciente, tipo de material y servicio del cual
provenía, fecha de aislamiento?
¿Qué correlación existe ente los hallazgos obtenidos y la información
bibliográfica disponible?

12
1.3. Objetivos de Investigación
1.3.1 Objetivo General
Determinar la frecuencia de virus causantes de infecciones
respiratorias agudas (IRAs) detectados por métodos moleculares.

1.3.2 Objetivos Específicos

Identificar los agentes causantes de Infección Respiratoria Aguda (IRA)
de pacientes que acuden a un laboratorio privado de Asunción, de enero a
diciembre del 2017.
Establecer la distribución y frecuencia de los principales virus
causantes de Infección Respiratoria Aguda (IRA), teniendo en cuenta variables
como: edad y sexo del paciente, tipo de material y servicio del cual provenía,
fecha de aislamiento.
Establecer la correlación existente entre los hallazgos obtenidos y la
información bibliográfica disponible.

1.4 Justificación
El diagnóstico molecular comprende un área de la ciencia dinámica y
en constante desarrollo, que ha revolucionado la evaluación clínica de los
pacientes, donde el avance rápido y preciso de las tecnologías lo ha
transformado en una herramienta clave para el diagnóstico clínico en beneficio
directo de la salud del paciente. La principal explicación del avance molecular
es debido a las dificultades que se presentan cuando se hacen uso de las
técnicas clásicas de diagnóstico clínico, donde podemos mencionar a las
técnicas inmunológicas tales como las inmunofluorescencias (IFI),
inmunocromatografía, o inclusive el requerimiento de cultivos virales, que
conllevan largos periodos de tiempo que son necesarios para el crecimiento y
la obtención adecuada de muestras, todos estos factores inciden en la correcta
identificación del agente causante del proceso infeccioso(5,11,12).
Las técnicas basadas en la detección del ADN (ácido
desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico), no requieren la presencia de
un microorganismo viable en la muestra, sino que solo la existencia del material
genético del mismo, permitiendo estudiarlo sin necesidad de realizar
aislamientos (5).

13
 Es así que las técnicas moleculares proponen altos estándares de
calidad que ofrecen al equipo médico información crítica para el cuidado del
paciente, debido a los elevados valores de sensibilidad y especificidad de las
mismas, junto con la rapidez con la que se pueden obtener los resultados, las
han convertido en técnicas de elección para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas, sobre todo ante la sospecha de infecciones virales, desplazando a
otros de métodos de elección (1,11–15).
Paraguay junto a otros países de la región como Argentina, Brasil y
Uruguay realizan un proceso de fortalecimiento sobre la vigilancia
epidemiológica de los virus respiratorios de tal manera que otorgue información
sobre la enfermedad, su estacionalidad, el tipo de virus circulante, efectividad
de la vacuna y su impacto en beneficio de la población. La vacunación sigue
siendo una de las mejores medidas de prevención contra las enfermedades
respiratorias, por lo que el conocimiento de los tipos de virus respiratorios
circulantes permite conocer la efectividad de las vacunas aplicadas a la
población. Es así que la aparición de sistemas de diagnóstico molecular
oportuno tanto en el sector público como en el privado, permiten la
identificación rápida y precisa de agentes causales (principalmente virus) de
infecciones respiratorias agudas (IRAs), útiles para el sistema de vigilancia
sanitaria del país (OPS/OMS Paraguay, 2017).

14
CAPÍTULO II: MARCO TEORICO
2.1. Infecciones respiratorias agudas:
2.1.1 Historia:
La gripe española de 1918 fue una de las pandemias más letales de la
humanidad del siglo XX, causado por un brote de virus de la Influenza A del
subtipo H1N1, se estima que alrededor de 500 millones de personas o un tercio
de la población se infectaron por este virus, y el número de muertes en todo el
mundo osciló entre 50 a 100 millones en los años 1918-1919. La mayoría de
las víctimas de esta pandemia fueron jóvenes y adultos sanos de 20 a 40 años
de edad a diferencia de otras epidemias de gripe que afectaron a niños,
personas adultas e inmunodeprimidas. El origen de esta enfermedad no fue
español, se observó por primera vez en Fort Riley un cuartel militar del estado
de Kansas (Estados Unidos), pero los aliados de la Primera Guerra Mundial la
llamaron Gripe Española porque la pandemia recibió una mayor atención de la
prensa española que el resto del mundo, ya que España no se involucró en la
Guerra por eso no censuró ninguna información respecto a la enfermedad. El
primer brote, la ola de primavera de la epidemia, se originó al parecer en los
cuarteles militares estadounidenses en marzo de 1918. El segundo brote, la ola
principal de la pandemia global tuvo lugar en setiembre a noviembre de 1918.
Hubo en numerosas zonas una tercera ola, muy grave a comienzos de 1919
(16,17).
Esta pandemia habría matado más personas que las dos guerras
juntas. En total murieron 2,5% de la población mundial y un 20% sufrió este
subtipo de virus de la gripe H1N1, con un elevado índice de contagio del 50%,
síntomas capaces de debilitar y consecuentemente facilitar la muerte, la
enfermedad se extendió por todo el mundo en cuestión de semanas. En
Estados Unidos fallecieron más de 300 mil personas en 1918 a causa de esta
gripe, las tasas de mortalidad en España fueron de 260.000 personas, la
pandemia de la influenza finalmente disminuyó en verano de 1919(Centers for
Diseases, Control and Prevention, 2018).

15
 El ingreso de la gripe española en América del Sur fue silenciosamente
dado, ya que los medios de comunicación la trataban básicamente como una
enfermedad europea. La epidemia se inició en Argentina en 1917 y su puerta
de ingreso fue el puerto de Buenos Aires, el impacto se desarrolló en 2 etapas:
la primera leve (1918) con una tasa de mortalidad de 2.237 personas. La
segunda oleada (1919) con una alta tasa de mortalidad, provocó 14.997
muertes de personas infectadas por este virus. En Brasil, llegó la epidemia en
setiembre de 1918 su puerta de ingreso se dio mediante el puerto de Recife a
través de marineros militares que prestaron servicio en Dakar en un
procedimiento de desembarque de personas infectadas por este virus. Entre de
Rio de Janeiro y Sao Paulo se registraron 16.348 muertes a causa del virus. La
llegada de la epidemia en Paraguay fue en setiembre 1918 y conllevó a la
muerte de 2.016 personas (entre 0.2%-0.4% del total de la población)(18–20).
El virus de la influenza A (H1N1) es el primer virus pandémico del siglo
XXI (pdm09) con un genoma constituido por un triple reordenamiento entre el
virus de la influenza de origen aviar, humano y porcino. Pocas personas
jóvenes tenían algún grado de inmunidad existente al virus, pero alrededor de
un tercio de las personas mayores de 60 años si tenían anticuerpos contra este
virus probablemente debido a una exposición anterior al mismo. El virus (H1N1)
pdm09 era muy diferente de los virus H1N1 que circulaban a inicios del siglo
XX. Se identificó por primera vez en Estados Unidos y México en abril del 2009,
luego se diseminó en todos los continentes. Desde el 12 de abril del 2009 al 10
de abril del 2010 los CDC calcularon que hubo 60.8 millones de casos, 274.304
hospitalizaciones, y 12.469 muertes en los Estados Unidos. A nivel mundial, los
CDC calcularon que el 80% de los casos de muertes asociados a virus (H1N1)
pdm09 se dio en personas menores de 65 años de edad. La prevalencia
mundial del virus H1N1 pdm09 fue de 13,9 casos por millón de habitantes. Los
países más afectados de mortalidad por el virus de (H1N1) pdm09 fueron:
Argentina 2,41%, Uruguay: 2,05%, Republica Dominicana: 1,85%, Colombia:
1,69%, México: 1,16%, Paraguay: 0,94%, Estado Unidos: 0,50%, Chile: 0,19%
y Brasil: 0,14 %. Investigaciones llevadas a cabo luego de esta pandemia
concluyeron que el virus produce la muerte del ser humano a causa de una

16
hipercitoquinemia o tormenta de Citocinas, una reacción del sistema
inmunitario potencialmente mortal, muy común en la infección del virus
H1N1(21–25)

2.1.2 Generalidades:
Las infecciones respiratorias agudas constituyen las enfermedades
infecciosas más frecuentes en el ser humano, son causadas por diferentes
microorganismos como virus, bacterias, entre otros y afectan al aparato
respiratorio (vías aéreas superiores y/o inferiores), con una evolución menor de
15 días: pudiendo causar desde un resfrío común hasta complicaciones más
severas como la neumonía, e incluso la muerte. El grupo poblacional con
mayor riesgo de IRAs son los niños menores de 5 años, así como personas
con enfermedad crónica de base, especialmente aquellas que reciben
tratamiento con inmunosupresores, otros grupos altamente vulnerables son las
personas mayores de 60 años. Las IRAs se clasifican según el sitio anatómico
afectando las vías respiratorias altas o bajas siendo la epiglotis el punto de
separación de los dos tipos de patologías. Entre las afecciones de vías
respiratorias altas se encuentran: rinofaringitis, faringoamigdalitis, sinusitis,
otitis media aguda, y entre las infecciones de vías respiratorias bajas se
incluyen las epiglotis, laringitis, laringotraqueobronquitis, bronquitis,
bronquiolitis, neumonía. Las IRAs tanto virales como bacterianas constituyen
las causas más frecuente de morbimortalidad en el mundo (3,15,26).

2.1.3 Antecedentes:
Las infecciones respiratorias agudas se ubican entre las diez
principales causas de defunción en la población general y dentro de las tres
primeras en niños menores de 5 años. La incidencia global de las IRAs es
similar para los países desarrollados y en vías de desarrollo, se presenta entre
30 - 60% en niños y estimándose 7 a 10 episodios de IRAs anualmente, que
son en su mayoría leves y autolimitados, implicando hospitalizaciones y una
elevada carga a la atención médica primaria. Por esto en la actualidad a nivel
mundial las IRAs son consideradas un problema de salud pública(26–28).

17
 Cada año en todo el mundo aparecen brotes de IRAs de extensión e
intensidad variables; ocasionando tasas importantes de morbilidad en la
población en general y mayores tasas de mortalidad principalmente en
pacientes de alto riesgo. Las infecciones respiratorias agudas en los EE.UU
son consideradas la sexta causa de muerte en adultos mayores, en el año
2017 la mayoría de los casos de IRAs que se registraron corresponden a los
distintos virus de la influenza(29).
Las IRAs en Argentina son la tercera causa de muerte (neumonía,
bronquiolitis, neumonitis) en menores de un año y la segunda en menores de 5
años. En el 2017 predominó el virus de la influenza A subtipo (H2N3) con
ciertos reportes de la infección por el virus FLU B. En el Brasil, 2017, los
niveles de influenza disminuyeron ligeramente a niveles estacionales con
mayor predominio el virus de la influenza A (H1N1)(30)(31,32).
En nuestro país en el año 2016, la Dirección General de Vigilancia
emitió alerta por enfermedades de tipo Influenza e infecciones respiratorias
agudas debido al incremento de consultas por cuadros respiratorios registrado
en un periodo desde el 03 de enero al 23 de abril 134.958 consultas situándose
en la franja de alerta del corredor endémico, según el monitoreo de circulación
viral se ha detectado un incremento importante de infecciones por el Virus
Sincitial Respiratorio y casos esporádicos de influenza. Inicios del mes de
enero hasta 31 de mayo del 2017 se registraron 1875 pacientes hospitalizados
por IRAs de los cuales 335 requirieron terapia intensiva, se reportaron 100
muertes de los cuales 13 fallecimientos estuvieron asociados a los siguientes
virus: Influenza A (H3N2), Influenza B, Virus Respiratorio Sincitial,
Metapneumovirus humano, Parainfluenza B. Según la OMS cada año en todo
el mundo aparecen brotes por infecciones respiratorias agudas de extensión e
intensidad variables, ocasionan tasas importantes de morbilidad en la población
en general y mayores tasas de mortalidad en pacientes con altos riesgos.(33)
En la actualidad como problema de salud pública, es importante
considerar los mecanismos de patogénesis de las IRAs, los agentes etiológicos
y avances que se han logrado en el diagnóstico de las mismas.

18
2.1.4 Etiología:
Las infecciones respiratorias pueden ser ocasionadas por una
diversidad de agentes infecciosos, como bacterias y virus, siendo los más
importantes estos últimos. Existe una gran variedad de niveles de gravedad
desde un resfrío común hasta procesos con afectación de vías respiratorias
bajas, como la bronquiolitis y la neumonía. Los agentes etiológicos asociados a
las infecciones virales son: el Virus Respiratorio Sincitial (VRS), Influenza A y B
( Flu A- Flu B), Rhinovirus humano (HRV), Parainfluenza 1,2,3,4 (PIV 1,2,3,4),
Adenovirus (ADV) y los nuevos virus identificados por primera vez en el año
2001 el Metapneumovirus humano (HMPV), en el año 2005 el Bocavirus
(HBoV), y entre los años 2004 y 2006 los nuevos Coronavirus (HCoV). En las
infecciones bacterianas los agentes responsables de las infecciones son
Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, y Mycoplasma
pneumoniae, Streptococcus pneumoniae (26).
Enfocaremos este estudio en los agentes etiológicos virales.

2.1.5 Virus causales de IRAs - Generalidades

2.1.5.1 Virus de la Influenza
El término de ―influenza‖ surgió en Italia en el siglo XV por una
epidemia de enfermedad respiratoria que se le atribuía a las ―influencias de las
estrellas‖, fue adoptado por los ingleses en el siglo XVIII, mientras los
franceses lo llamaban gripe. El virus de influenza pertenece a la familia
Orthomyxoviridae, con genoma ARN de sentido negativo segmentado, se
caracteriza por poseer variabilidad genética, una gran capacidad de mutación
con lo cual cambia algunas de sus características de tal manera que la cepa
del virus circulante de una temporada puede ser diferente a la temporada
anterior, esta capacidad es muy difícil de controlar. Es una infección viral aguda
que afecta las vías respiratorias, altamente contagiosa, es causada por el virus
de la influenza A, B, C, D, que pueden dividirse en cepas. Está infección puede
tener un comportamiento endémico, epidémico o pandémico, los síntomas son
similares a un resfriado común sin embargo pueden presentar ciertas
complicaciones: pudiendo presentarse como un cuadro febril agudo leve hasta

19
una infección pulmonar y alcanzar complicaciones graves incluyendo la
muerte.(23).
El virus de la influenza A (FLUA) se vuelve a clasificar en subtipos
según las proteínas de la superficie del virus: la hemaglutinina (H) y la
neurominidasa (N), ambos antígenos están agregados a la cubierta lipídica por
cortas secuencias de aminoácidos hidrofóbicos, son virus esféricos o
pleomórficos de 80 hasta 120 nm de diámetro; presentan una envoltura
derivada de la célula huésped precisamente esta envoltura la que alberga la
hemaglutinina, la neuromidasa y la proteína M (matriz o membrana) que da
forma y estabilidad a la envoltura, la hemaglutinina es considerada el antígeno
mayor para la cual está dirigida la producción de anticuerpos neutralizantes
cuya función es la adhesión del virus mediante residuos de ácidos siálicos en la
superficie del epitelio respiratorio humano, la neurominidasa es menos
abundante en la superficie viral, su papel en facilitar la liberación de viriones de
células infectadas del hospedero, hay 18 subtipos de diferentes hemaglutinina
y 11 subtipos diferentes de neuromidasas (H1 hasta H18 y N1 hasta N11), El
genoma de la influenza A está compuesto por 8 segmentos de ARN lineal de
una sola cadena de sentido negativo. Los subtipos H1N1 y H3N2 son los
causantes de enfermedades en humanos, los demás han sido detectados en
animales como: murciélagos, aves, perros y caballos. (34) (35) (36).
El Virus de la influenza B (Flu B) proviene del género de
Orthomyxoviridae, no se dividen en subtipos, pero pueden dividirse en líneas y
cepas. Los virus de la influenza B a diferencia de la influenza A causan
enfermedades principalmente en humanos, los síntomas y la duración de la
enfermedad son similares, los cambios evolutivos en el gen de la hemaglutinina
por deriva antigénica separaron los virus de la influenza B en dos linajes
antigénicamente distintos representados por B/Yamagata 16/88 y B/Victoria
2/87. La carga de la enfermedad es mayor en niños de 0 a 17 años, y en
adultos de 25 a 44 años de edad, la enfermedad es de evolución lenta en
comparación a la influenza A (37).
El virus de la Influenza C contienen los linajes antigénicos y genéticos
del gen hemaglutinina-esterasa y los genes internos PB2, PB1, P3, NP, M y NS

20
que se dividen en seis linajes C/ Taylor, C/ Mississippi, C/ Aichi, C/ Yamagata,
C/ Kanagawa y C/ San Paulo, de los cuales son principales linajes las
relacionadas con C/ Mississippi / 80 y C/ Yamagata / 81,varios brotes de la
enfermedad en los años 1990 y 2014 en Japón consistieron en virus
reorientados lo que sugiere que constelación genómica está relacionada con
las epidemias de la influenza C. Es un patógeno que causa una infección leve
de las vías respiratorias superiores especialmente en niños y resalta la
hospitalización de bebés menores de 2 años (38).

2.1.5.2 Virus Parainfluenza

El virus de la Parainfluenza (PIV) pertenece a la familia de
Paramyxoviridae, ARN de hebras simples, polaridad negativa, contienen
aproximadamente más de 15.000 nucleótidos, en la actualidad se han descritos
4 tipos de Parainfluenza: Parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3,
parainfluenza 4, constituyendo los serotipos 1,2 y 3 los más importantes desde
el punto de vista médico, las manifestaciones clínicas dependen
específicamente del serotipo de Parainfluenza siendo importante la edad del
paciente, el estado inmunológico y variaciones estacionales. Las infecciones
por los serotipos 1 y 2 causan enfermedades del tracto respiratorio superior e
inferior, como resfriado y gripe siendo el serotipo 1 más frecuentemente
identificado en niños, se presentan con más frecuencia en primavera y verano,
infectando a niños en edades de 4 a 5 años. El serotipo 3 se asocia
principalmente con enfermedades de tracto respiratorio inferior, produciendo
brotes epidémicos en invierno, afectando a pacientes de todas las edades sin
preferencia, niños y adultos, pudiendo causar formas graves de
laringotraqueobronquitis y ciertas complicaciones críticas a pacientes
inmunocomprometidos, sus brotes son comunes en escuelas y en unidades de
trasplantes de precursores hematopoyéticos. El serotipo 4 se reconoce con
menor frecuencia, puede causar infecciones respiratorios leves y graves; en
adultos sanos no presentan complicaciones, sin embargo puede ser
potencialmente mortales en bebés y pacientes inmunodeprimidos (39–41).

21
2.1.5.3 Virus Respiratorio Sincitial
Virus Respiratorio Sincitial (VRS) es un virus de cadena simple de
ARN, de sentido negativo con un diámetro de 150 a 200 nm de la familia de los
paramyxovirus (Paramyxoviridae). El genoma es de 15.000 nucleótidos y se
componen de 10 genes que codifican 11 proteínas. Es el principal agente
etiológico de infecciones del tracto respiratorio en niños menores de 2 años,
uno de los agentes causales de ciertas enfermedades como: bronquiolitis,
neumonías, traqueobronquitis y otitis medias dando lugar a importantes brotes
epidémicos en población lactante durante el invierno, infecta al 70 % de los
niños en su primer año de vida y casi al 100% en su tercer año de vida (15,42).

2.1.5.4 Rhinovirus Humano

Los Rhinovirus Humanos (HRV) pertenecen al género de Enterovirus
de la familia Picornaviridae, poseen un genoma de ARN de cadena simple, de
polaridad positiva con un único marco de lectura, existen más de 100 serotipos.
Son los agentes etiológicos causales de aproximadamente 40% de los casos
del resfrío común, afectando las vías respiratorias altas; en algunas ocasiones
asociados a otitis media y/o sinusitis. Las infecciones por Rhinovirus son más
frecuentes en niños destacando que más del 75% de ellos han tenido contacto
con este virus antes de los dos primeros años de vida (43).

2.1.5.5 Bocavirus humano

El Bocavirus humano (HBoV) es un virus de la familia Parvoviridae del
género Bocavirus. Son virus pequeños, de simetría icosaédrica y no poseen
manto, su genoma está formado por ADN de simple hebra, y es dependiente
de células en división para la replicación viral. Sus secuencias genéticas y
análisis filogenético muestran una estrecha relación del Bocavirus humano con
dos miembros de la familia de Parvoviridae: parvovirus bovino (BPV) y virus
minute canino (CMnv) por lo que recibió el nombre provisorio de Bocavirus
humano ―bo‖ de bovino y ―ca‖ canino, el primer Bocavirus descubierto fue en
Suecia en el año 2005, posteriormente en el 2010 se descubrieron HBoV2,
HBoV3, HBoV4. El HBoV1 causa entre 2-19% infecciones respiratorias, su
ADN ha sido detectado en muestras respiratorias, en materia fecal, suero,
amígdalas, saliva y orina. El HBoV2 es el único Bocavirus entérico que se ha

22
aislado en aspirados nasofaríngeos y se le considera responsable de las
enfermedades respiratorias causadas por este virus, los demás Bocavirus se
han encontrado en el tracto gastrointestinal. La mayor incidencia se reporta
durante las estaciones: invierno y primavera (clima templado). Presenta una
población pediátrica más vulnerable entre los 6 meses y 3 años de edad
(9,44,45).

2.1.5.6 Coronavirus
Coronavirus (HCoV) pertenecen a la familia de Coronaviridae, son
virus de ARN cuya envoltura está cubierta de una glicoproteína de superficie
que le da a su característica apariencia de corona. Se conoce 4 tipos de
Coronavirus que se asocian con enfermedades respiratorias leves y
autolimitadas en el hombre: HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-
KHU1, estos tipos de CoVh no severos, son endémicos en el mundo, su
prevalencia, distribución regional y patogenicidad no son tan claras y afectan a
todos los grupos etarios pero presentan más complicaciones en adultos e
inmunocomprometidos; también se han detectados 2 tipos de Coronavirus que
causan síndromes respiratorios severos con alta tasas de mortalidad: SARS-
CoV y MERS-CoV4, se ha planteado una transmisión zoonótica para ellos, se
cree que el virus se originó en murciélagos luego se transmitió a camellos y
posteriormente por contacto directo o por consumo de leche no pasteurizada se
transmitió al hombre. Hubo brotes SARS-CoV entre los años 2002 y 2003 que
infectó a un total de 8.098 personas en 25 países, produciendo 774 muertes,
durante este brote el cuadro clínico fue menos severo en lactantes, siendo el
sector más vulnerable las personas mayores de 65 años de edad. MERS-CoV4
se detectó por primera vez en junio del 2012 mediante un aislamiento de una
muestra de esputo de un hombre de 60 años que falleció a causa de una
neumonía grave asociada a una falla renal en Arabia Saudita, los primeros
casos se presentaron en los países del Medio Oriente y luego se extendieron a
Reino Unido, Francia, Italia, Alemania, Egipto y Estados Unidos. La tasa de
mortalidad por este virus es del 30%, pero es más significativa en paciente con
comorbilidades e inmunosuprimidos (Maestre Naranjo et al., 2017; D. C. M.
Sánchez, Domínguez, & Ira, 2017)(44).

23
2.1.5.7 Adenovirus
Los Adenovirus (ADV) presentan simetría icosaédrica, isométrica, con
genoma ADN bicatenario lineal, diámetro de 70 a 80 nm, presentan fibras que
contienen las proteínas de adherencia viral y pueden actuar con la
hemaglutinina, la cápside está formada por 252 capsómeros de los cuales 240
son hexones y 12 pentones; pertenecen a la familia Adenoviridae y se conocen
55 serotipos de Adenovirus que se clasifican en seis especies: A, B, C, D, E, F.
La especie B ha sido subdivida en dos subespecies: B1 y B2 entre las
subespecies de B1 especialmente los serotipos Ad3, Ad7, Ad21 se asocian a
infecciones respiratorias agudas bajas que presentan manifestaciones clínicas
con mayor severidad, mientras que las especies C y D se relacionan con
cuadros leves de bronquitis y catarro de vías aéreas superiores. Los
Adenovirus son importantes causantes de infecciones respiratorias agudas
especialmente en niños y en pacientes inmunocomprometidos; pueden causar
enfermedades respiratorias moderadas como también infecciones graves o
fatales principalmente en niños de 2 a 8 años de edad(3,46,47).

2.1.5.8 Metapneumovirus
Metapneumovirus humano (HMPV) es un virus ARN de 150 a 600 nm
de tamaño pertenece a la familia Paramyxoviridae, subfamilia de
Pneumovirinae, del género Metapneumovirus, posee una envoltura lipoproteica
similar al VRS. Existen 2 genotipos: A y B con varios subgrupos: A1, A2, B1,
B2. El subgrupo A2 se vuelve a subdividir en A2a y A2b, mediante esta
clasificación se obtienen variantes de dos glicoproteínas, una es la responsable
de la adherencia (G) y la otra en la fusión (F), la infección por un genotipo no
confiere inmunidad protectora cruzada ya que las cepas circulantes varían año
tras año. El HMPV puede ocasionar patologías de las vías superiores e
inferiores. Desde el punto de vista epidemiológico tiene una distribución
geografía mundial y afecta a todos los grupos etarios, pero con mayor
frecuencia aparece en niños menores de 5 años especialmente en los primeros
12 meses de vida, las reinfecciones pueden presentarse en adultos, los brotes
ocurren principalmente en primavera e invierno, el mecanismo de transmisión
es por gotitas, y contacto directo con secreciones(44,48).

24
2.1.4 Distribución de las IRAs
2.1.4.1 Geográfica - Poblacional
Las IRAs son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad
infantil mundialmente. La mortalidad en niños menores de 5 años de edad y en
pacientes de tercera edad en países en vías de desarrollo es de 30 a 70%
superior a los países desarrollados, el número de defunciones relacionadas con
IRAs está en el orden de 4 millones por año. La incidencia anual de infecciones
moderadas y graves de las vías respiratorias inferiores representan la mayoría
de las defunciones por IRAs. La magnitud del problema es evidente a partir de
las estadísticas mundiales del servicio de salud que señalan a las IRAs como la
razón principal de consulta en un 30 a 60% de las visitas pediátricas en países
externos. Asimismo, las IRAs representan entre el 20 a 40% de los ingresos
pediátricos al hospital(49).
Por lo tanto, está claro que las IRAs ejercen una presión considerable
en los servicios de salud mundialmente. Mientras los sistemas sanitarios de
países desarrollados bien pueden ser capaces de responder a la necesidad del
problema, la situación en los países en vías de desarrollo está lejos de ser
satisfactoria.

2.1.5 Métodos de diagnóstico IRAs virales:

El diagnóstico precoz de las IRAs virales es fundamental para el
tratamiento oportuno. Tradicionalmente el diagnóstico de este tipo de
infecciones se ha basado en métodos convencionales como los cultivos virales
en medios artificiales, técnicas inmunológicas como la Inmunofluorescencia
directa (IFI), inmunocromatográficas, pruebas serológicas y por último las
técnicas de biología molecular para detectar el genoma del virus,
específicamente la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). Es importante
recalcar que las técnicas de diagnóstico directas (cultivo viral y PCR) siempre
son preferibles a las indirectas, por presentar mayor especificidad.

2.1.5.1 Aislamiento del virus en cultivo:

La base del diagnóstico viral es la detección del virus o de sus
componentes. Es por eso que el aislamiento del virus mediante su cultivo es la
técnica standard de oro sobre la cual se evalúan todas las otras pruebas de

25
diagnóstico viral, por tratarse de una técnica directa y específica. La adecuada
selección de varias líneas celulares utilizadas individualmente o combinadas,
permite abarcar el cultivo de un amplio espectro del virus, la inoculación debe
ser inmediata después de tomarse la muestra para que los virus no pierdan su
capacidad infectiva. Los cultivos inoculados se incuban a 33-35 grados
centígrados, y el crecimiento del virus se identifica por observación de su efecto
citopático (CPE), consistente a la aparición de células alteradas en la
monocapa celular, a veces es difícil diferenciar el CPE, por lo tanto, se deben
de utilizar otras pruebas de identificación especifica(13).

2.1.5.1.1 Ventajas del Aislamiento del virus en cultivo:

Esta técnica es la única que permite disponer del virus para efectuar
análisis posteriores, esenciales para obtener información antigénica como
genética del virus. En el caso de los virus de la gripe, la disponibilidad de los
virus vivos es esencial para realizar el diseño de vacunas para siguientes
temporadas. La técnica del cultivo viral se caracteriza por tener alta
sensibilidad y especificidad.
2.1.5.1.2 Desventajas del Aislamiento del virus en
cultivo:
 Requiere de aparatos costosos y personal altamente capacitado.
 Demora de resultados: 6 o 7 días hasta 14 días o más.
 Requiere confirmación por otros métodos.
 Existen virus difíciles de aislar o de crecimiento lento.

2.1.5.2 Técnicas inmunocromatográficas:

La inmunocromatografía es una técnica de inmunodiagnóstico que se
basa en la migración de una muestra a través de una membrana de
nitrocelulosa a la que se unen anticuerpos específicos contra el antígeno que
se quiere detectar(50).

2.1.5.2.1 Ventajas de las técnicas

Inmunocromatográficas:
Sensibilidad, rapidez y economía en el procedimiento.

26
2.1.5.2.2 Desventajas de las Técnicas
Inmunocromatográficas:
Baja especificidad y generalmente necesita de otras pruebas
complementarias para corroborar el resultado obtenido.

2.1.5.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa –

Generalidades
La técnica de Reacción en cadena de Polimerasa (PCR), creada y
desarrollada en 1985 por Karry B. Mullis, se ha convertido en una poderosa
herramienta que cumple con los requisitos de especificidad y sensibilidad que
exige la caracterización de ácidos nucleicos, pudiendo detectarlos de forma
fácil y rápida en una muestra. Es un método enzimático in vitro que permite la
amplificación de una secuencia específica del ADN, basada en el uso de
oligonucleótidos que luego de reconocer la secuencia complementaria en la
molécula de ADN, son elongados cíclicamente mediante la acción de una
enzima: Taq polimerasa. Cada ciclo de reacción se repite 30 a 40 veces, lo que
implica la desnaturalización del ADN polimerasa, el apareamiento de los
oligonucleótidos y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir del
oligonucleótido, resultando en un crecimiento exponencial de millones de
copias del fragmento seleccionado(« (Reacción en cadena de la polimerasa)»,
2014; Pedrosa Amado, 1999; Rabagliati B, Serri V, Montecinos P, Azocar A, &
Ferrés G, 2007).
Dependiendo del objetivo y las utilidades que se le quiera dar a la PCR,
existen diferentes tipos:

2.1.5.3.1 Tipos de PCR, características y aplicaciones

Tipos de PCR Características Aplicaciones
Amplificación de un Detección cualitativa de un
PCR estándar segmento de ADN (utilizando segmento de ADN.
un par de oligonucleótidos) y
detección mediante geles de
agarosa.
PCR Múltiple Amplificación de dos o más Detección cualitativa de
segmentos de ADN utilizando varios segmentos de ADN en
varios oligonucleótidos en una sola reacción de PCR.
una sola reacción de
amplificación. Detección
mediante geles de agarosa.
PCR – RFLP PCR estándar con paso Detección de polimorfismo
(Polimorfismo de longitud del posterior de digestión con genéticos (SNPs).
fragmento de restricción) enzimas de restricción.

27
PCR-RT Síntesis de cADN partir de Expresión de genes
(Transcriptasa inversa) ARN mediante transcripción Detección de virus ARN.
reversa seguida de una PCR
estándar.
PCR-TR (Tiempo real) o PCR cuantitativa que Cuantificación de ADN en la
qPCR mediante la utilización de muestra (cargas) o expresión
tinciones o sondas con de genes.
fluorofóros permite la
detección y cuantificación de
los fragmentos amplificados.
Los diferentes tipos de reacciones de PCR pueden ser utilizados sólos o
combinados. Ejemplo: Se podría combinar la qPCR, PCR múltiple y PCR-RT
para cuantificar la carga viral de varios retrovirus presentes en una muestra
biológica.

2.1.5.3.2 PCR Tiempo Real – Concepto y generalidades

La PCR en tiempo real es una técnica que permite determinar cantidades de
ADN y ARN en una gran variedad de ensayos que involucran la expresión de
genes, la detección de patógenos, la genotipificación, la determinación de la
carga viral. Combina la amplificación y la detección en un mismo paso, al
correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de
intensidad de florescencia. Posee características importantes como alta
especificidad, amplio rango de detección, los ensayos de la PCR en tiempo real
son entre 10.000 y 100.000 veces más sensibles que otras pruebas
moleculares. Los procesos de amplificación y detección se producen de
manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción
posterior. Además, mediante la detección por fluorescencia se puede medirla
cantidad de ADN amplificado en cada momento ya que la emisión de
fluorescencia producida por la reacción es proporcional a la cantidad de ADN
formado, esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la
reacción de amplificación (Costa, 2004; Guerrero Gámez et al., 2013; «PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa)», 2014).

28
2.1.5.3.3 Sistemas de detección utilizados en PCR en tiempo
real.
Los fluoróforos utilizados para seguir la amplificación del ADN durante la PCR
en tiempo real pueden ser de dos tipos: Específicos e inespecíficos (Fig.1)
Tipos Descripción Ventajas Desventajas
Fluorocromos con Son capaces de unirse a No requiere de Pueden generar
afinidad por el ADN las moléculas de ADN sondas. falsos positivos.
(Bromuro de etidio, de cadena doble para Relativamente No agrega
SYBR Green) detectar un producto de económico. especificidad a la
PCR que se acumula Fácil optimización reacción.
Son ensayos de las condiciones No permite
cuantitativos e de reacción. realizar pruebas
inespecíficos. multiples.
Sondas especificas para Son ensayos Hibridación Una sonda es
fragmentos de ADN específicos, especifica entre capaz de
(Sondas de hidrolisis, cuantitativos, multiplex. sonda y secuencia detectar solo una
hibridación, horquilla) Emiten fluorescencia Reduce el ruido de secuencia
cuando se han fondo
amplificado a un Reacciones
fragmento de ADN de Multiplex.
interés.

Figura 1. Fluoróforos con afinidad por el ADN: SyBR Green. A) Mecanismo de incorporación
del SyBR Green. Durante la alineación del iniciador, el SyBR Green se incorpora en la doble
cadena. La señal de fluorescencia incrementa de manera proporcional a las moléculas de
doble cadena producidas en la amplificación(54).

29
2.1.5.3.4 Análisis de la curva de fusión:
El análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo en la mayoría de las
plataformas disponibles en la qPCR, por lo general al final de la reacción de la
amplificación. La medida de la fluorescencia dependiente de la temperatura se
realiza mientras la temperatura en el termociclador aumenta de 50°C a 95 °C,
siendo la fluorescencia detectada dependiente de la presencia de secuencia
de doble cadena de ADN. Cuando las dobles cadenas de ADN se separan por
efecto de la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el colorante deja
de estar unido al producto de la PCR.
La mayoría de los instrumentos proporcionan un análisis de estos datos
teniendo en cuenta el punto en donde aparece el primer diferencial negativo de
la fluorescencia con respecto a la temperatura de fusión (Figura 2). Este punto
aparece como uno o más picos que representan las temperaturas a las que los
máximos niveles de cambio de la fluorescencia se producen, lo cual es
necesario conocer para discriminar los productos específicos de la PCR (los
que se disocian a una temperatura más alta) de los artefactos como dímeros
de oligonucleótidos(12,55).

Figura 2: Análisis de la curva de fusión. Los picos de las curvas muestran que los productos
específicos de la PCR en tiempo real tienen una temperatura de fusión mayor a la de
productos inespecíficos. Figura generada con Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0.

30
2.1.5.3.5 Umbral y valores del ciclo
Los resultados de PCR en tiempo real se basan en la detección y cuantificación
de los marcadores fluorescentes a lo largo de la reacción de la PCR, esto
permite conocer la cantidad de fluorescencia emitida durante la fase
exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del producto de
PCR se correlaciona con la cantidad inicial de ADN en estudio, anteriormente
un umbral adecuado debía ser fijado por el operador en un punto
significativamente por encima de la línea de base.
Los valores de Ct son determinados por la identificación del ciclo en el cual la
emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del
ruido de fondo en la fase exponencial de la reacción de la PCR. Es importante
considerar que un valor Ct superior a 40 ciclos indica que no hay amplificación
y por consiguiente no debe incluirse en los cálculos. En la actualidad hay
software que pueden determinar el Ct mediante un análisis matemático de la
curva de crecimiento pudiendo tener así una mejor reproducibilidad en las
pruebas de PCR en tiempo real (55,56).

Figura 3: A) Curva de amplificación de qPCR (puntos negros) y segunda derivada

correspondientes (líneas rojas). Los números de ciclos en los cuales la curva de fluorescencia
atraviesa el umbral establecido corresponden a los valores Ct que se utilizaran para cálculos
posteriores B) Grafico de Cp respecto al cDNA. Extraído de Aguayo y Rueda, 2013(56).

2.1.5.3.6 Estrategias para la cuantificación por qPCR

Existen dos tipos de estrategias para llevar a cabo la cuantificación por qPCR:
Cuantificación absoluta y cuantificación relativa

31
2.1.5.3.6.1 Cuantificación absoluta:
La cuantificación absoluta asume todos los estándares y las muestras tienen la
misma eficiencia de amplificación, utiliza diluciones seriadas de estándares de
concentraciones conocidas para construir una curva de estándar a partir de la
curva se establece una relación lineal entre el Ct y la cantidad inicial de
templado de ADN. (52,55,57).

2.1.5.3.6.2 Cuantificación relativa:

No requiere estándares con concentraciones determinadas, se utiliza para
obtener la magnitud de cambios fisiológicos en los niveles de expresión
genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de
referencia. Hay que tener en cuenta que la expresión de los genes de
referencia debe ser constante. Generalmente se utilizan genes ¨housekeeping¨.
Los cálculos se basan en compararlos valores de Ct utilizando la eficiencia de
la reacción de la PCR como factor de corrección. (55,58)

2.1.5.3.7 Ventajas de la PCR en tiempo real:

La primera ventaja de la PCR en tiempo real es su rapidez, puesto que no es
necesario ningún proceso adicional de detección, así como la utilización de
sistemas cerrados, lo que disminuye el riesgo de contaminación de forma
importante. Los sistemas en tiempo real permiten cuantificar la concentración
inicial del ácido nucleico presente en la muestra de manera mucho más
sencilla, precisa y sobre todo con mayor rango que los procedimientos
convencionales. Otras de las ventajas es la capacidad de determinación de
mutaciones puntuales que pueden estar relacionados con resistencias a
medicamentos antimicrobianos o con factores de virulencia. Los equipos para
PCR en tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya que en los mismos
instrumentos se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos, cuantitativos,
determinaciones de mutaciones, PCR múltiple, etc. Mientras que para los
procedimientos convencionales se requieren de multiples equipos. La PCR en
tiempo real gracias a sus innumerables ventajas y la sencillez de su empleo
vaya reemplazando a la clásica(12,53,57)

32
3.1. Nivel de Investigación: Descriptivo
Según Hernández (2014): es un estudio descriptivo cuyo objetivo es
medir o recoger información de manera independiente o conjunta sobre los
conceptos o las variables (59).

3.2. Enfoque de la investigación: Cuantitativo

Según Hernández (2014) para probar hipótesis con la base en la
medición numérica y el análisis estadístico (59).

3.3. Diseño de estudio: No experimental de corte transverso

Según Hernández (2014): Consiste en observar fenómenos tal y como
se dan en su contexto natural, con el propósito de describir variables y analizar
su incidencia e interrelación en un momento dado (59).

3.4. Lugar de investigación: Laboratorio privado de Asunción

Es uno de los pocos laboratorios privados que cuenta con herramientas
tecnológicas de última generación y personal altamente capacitado en el área
de Biología Molecular con el fin de diagnosticar enfermedades infecciosas.

3.5. Población
Planilla electrónica de resultados moleculares de pacientes con
sospecha de IRAs que acudieron a un Laboratorio Privado de Asunción durante
el año 2017.

3.6. Muestra
La planilla electrónica correspondiente al año 2017 (del 01 de enero al
31 de diciembre) contiene 405 pedidos médicos de Panel Respiratorio (virus y
bacterias) y Panel Respiratorio Viral de pacientes que acudieron al laboratorio
privado de Asunción y también se recibieron muestras de otros laboratorios
externos que son consideradas como muestras remitidas. Este estudio sólo se
enfocó en el análisis de la frecuencia de virus causantes de IRA detectados por
qPCR, no se tuvo en cuenta a las bacterias.

33
 Los distintos tipos de muestras colectados para el diagnóstico
molecular fueron: hisopados nasofaríngeos, esputo lavado bronco-alveolar,
líquido cefalorraquídeo y líquido pleural.

3.7. Tipos de muestras

Planilla electrónica con referencia al pedido médico: Panel Respiratorio
que incluyen virus y bacterias: Influenza A (Flu A), influenza B (Flu B),
Parainfluenza 1,2,3,4 (PIV 1,2,3,4) Coronavirus (HCoV), Adenovirus (Adv),
Bocavirus (HBoV), Rhinovirus (HRV), Virus Respiratorio Sincitial (VRS),
Metapneumovirus (HMPV), Chlamydophila pneumoniae, Legionella
pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae y el Panel
Respiratorio Viral incluye solamente virus: Influenza A (Flu A), influenza B (Flu
B), Parainfluenza 1,2,3,4 (PIV 1,2,3,4) Coronavirus (HCoV), Adenovirus (ADV),
Bocavirus (HBoV), Rhinovirus (HRV), Virus Respiratorio Sincitial (VRS),
Metapneumovirus (HMPV). Para los efectos de este estudio sólo se tuvo en
cuenta a los virus causantes de IRA detectados por qPCR, no a las bacterias.
Para los cálculos estadísticos se utilizó el software EpiInfo.exe Versión
V.7.2.2.6.

3.8. Muestreo
No probabilístico de casos consecutivos
Los datos empleados en este estudio provinieron del sistema informático de un
laboratorio privado de Asunción, el cual se utilizó con el permiso
correspondiente (Anexo 1).

3.9. Criterios de Inclusión

Todas aquellas determinaciones que tengan pedido médico ya sea
panel respiratorio o panel viral respiratorio detectados por Biología Molecular,
provenientes de pacientes de 0 a 99 años de edad, de ambos sexos,
internados o pacientes ambulatorios.

3.10. Criterios de exclusión

Muestras sanguíneas.

34
3.11. Consideraciones éticas
En este trabajo se tuvieron en cuenta los principios básicos de la ética
en las investigaciones clínicas; el principio del respeto por las personas, el
principio de beneficencia y el principio de justicia.
a. Principio del respeto por las personas: Restricción al acceso de la
identidad de los pacientes, todos los datos obtenidos fueron manejados de
manera estricta bajo códigos, salvaguardando la integridad de los mismos.
b. Principio de beneficencia: Asegurar y mantener altos estándares
de competencia en el trabajo del profesional de manera a garantizar que sus
intervenciones ofrezcan el mayor beneficio y el mínimo riesgo al paciente o a
sus resultados, teniendo en cuenta que para la realización del presente estudio,
no se requiere toma de muestra adicional al paciente. En el presente estudio se
emplearán los resultados de muestras colectadas en el laboratorio en
respuesta a una solicitud del médico tratante, por tanto, el presente protocolo
no conllevará a la extracción de muestras adicionales al paciente, ni riesgo
alguno para su salud, además los resultados originados por el mismo no
influirán en el tipo de tratamiento que recibirá el paciente en su momento, ya
que serán administrados empleando el criterio médico basado en el resultado
emitido por el laboratorio.

c. Principio de justicia: Los resultados epidemiológicos obtenidos del

presente estudio serán reportados o presentados en un evento científico, de
forma a divulgar a la comunidad científica los conocimientos generados a
través del presente estudio.

3.12 Definición de Variables

Variable Dependiente: Agente etiológico detectado por qPCR en la muestra
biológica analizada.
Variables Independientes:
Edad
Sexo
Procedencia
Fecha de recolección de muestras

35
Tipo de Pedido Médico

3.13 Operacionalización de variables

VARIABLE TIPO ESCALA DESCRIPCIÓN
EDAD Cualitativa Numérica expresada Edades de los
Continua en meses pacientes de los
cuales provienen los
resultados en estudio
SEXO Cualitativa Femenino Biológico reconocido
Dicotómica Masculino
Nominal
Servicio Médico Cualitativa Ambulatorio Servicio médico en el
Nominal Urgencias cual es atendido el
Politómica Recuperación paciente cuya
Internados muestra biológica se
Unidad de cuidados encuentra en estudio
intensivos
Fecha de Cualitativa Enero- Marzo Fecha
recolección de Abril- Junio correspondiente a los
muestras Julio- Setiembre días de recolección
Octubre- Diciembre del material en
estudio, agrupada en
trimestres
Pedido médico Cualitativa Panel Respiratorio Determinación
Nominal (PR) solicitada por el
Politómica Panel Virus médico para el
Respiratorio (PVR) procesamiento de la
muestra
Agente etiológico Cualitativa Influenza A Identificación del
detectado por qPCR Nominal Influenza B virus detectado por la
Parainfluenza técnica qPCR en la
Virus Sincitial muestra biológica
Respiratorio analizada, expresada
Adenovirus en lenguaje científico
Coronavirus o su ausencia.
Rinovirus Humano
Bocavirus
Metapneumovirus
No detectable
El instrumento de colección de datos es una ficha elaborada para este
estudio conteniendo las variables de interés para la investigación.

36
CAPITULO IV

MARCO ANALITICO
4.1 PRESENTACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS

En el presente estudio se colectaron 405 muestras biológicas de pacientes con

sospecha de IRA en un laboratorio privado de la ciudad de Asunción; durante el
año 2017, del 1 de enero al 31 de diciembre (figura 4). Las mismas consistieron
en: hisopado nasofaríngeo (95%, 386/405), esputo (1%, 5/405), BAL (1%,
4/405) entre otros (sangre, líquido cefalorraquídeo, pleural, secreción traqueal,
heces, hisopado conjuntival: 3%, 10/405).

Figura 4. Muestras colectadas vs. Meses del año. En la ordenada está representado el
número de muestras colectadas por meses del año 2017 (abscisas), en el mes de mayo se
registró la mayor frecuencia de recolección (62/405, 15%).

Los pacientes de los cuáles provenían las muestras biológicas tenían edades
comprendidas entre 0 y 96 años, con una media de edad de 43 años
(mediana= 42, moda=1).

El mayor porcentaje (47%) de las muestras fueron colectadas en laboratorios

externos pertenecientes al mismo seguro privado del laboratorio en cuestión,
por lo tanto, se denominan como ―remitidas‖; esta situación forma parte del
procedimiento habitual del sistema de trabajo de dicho lugar, por consiguiente,
no es una modificación sujeta al presente estudio.

37
Las demás muestras biológicas analizadas provenían de los siguientes
servicios: Internación (23%), Ambulatorios (21%), Urgencias (6%) y Unidad de
Terapia Intensiva (3%).
Del total de muestras biológicas analizadas (N=405), el 54% (n=218) de las
mismas no portó agente etiológico alguno analizado y el 46% (n=187) portó
uno o más. En la figura 5 se observan los agentes etiológicos detectados en las
muestras biológicas analizadas mensualmente, siendo los más frecuentes en
todo el periodo de estudio: el Rhinovirus (HRV) 31%, Influenza A (Flu A) 20%,
Influenza B (Flu B) y Virus Sincitial Respiratorio (VSR) 11% y Metapneumovirus
(HMPV) 10%. Parainfluenza (PIV), Adenovirus (ADV) y Coronavirus (HCoV)
fueron detectados en frecuencias menores (9%, 7% y 1% respectivamente). No
se detectó Bocavirus en las muestras estudiadas.
El mayor porcentaje (97%) de los virus detectados provenían de muestras de
hisopados nasofaríngeos, a excepción del 3% que fueron distribuidos de la
siguiente manera: 2% Esputo (Rhinovirus e Influenza A), 0,5% Lavado Bronco-
alveolar (Influenza A) y 0,5% en Secreción traqueal (Metapneumovirus).
En el mes de mayo se observó un aumento del número de muestras colectadas
(62/405, 15%), así como también el mes con la mayor frecuencia de muestras
positivas (28/187, 15%), siendo el agente etiológico más frecuente, el virus de
la Influenza A (35% del total detectado en todo el año). No se observó
diferencia estadísticamente significativa entre la portación del virus de la
influenza A y el mes de detección del virus (p≥0,05 según Test de Chi-
Cuadrado o Exacto de Fischer según correspondía).

38
Figura 5: Agentes etiológicos de IRAs vs meses del año. En las barras horizontales están
representados los agentes etiológicos (por color, pie de figura) detectados por qPCR en las
muestras biológicas por mes del año. El ítem ¨otros¨ incluye las bacterias: Chlamydophila
pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Streptococcus pneumoniae.
No se detectó bocavirus en ninguna de las muestras analizadas.
La distribución de los distintos agentes causales de IRA en función del servicio
médico en el cual se encontraba el paciente en el momento de la toma de
muestra se observa en la figura 6. En UTI sólo se registraron pacientes
portadores del virus de la influenza A y metapneumovirus, a diferencia de los
demás servicios, donde se observó alta variabilidad de los agentes etiológicos
detectados. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre la
portación de agente etiológico y el tipo de servicio en el cual se encontraba el
paciente al momento de la toma de muestra (p≥0,05 según Test de Chi-
Cuadrado o Exacto de Fischer según correspondía).

Figura 6: Tipo de servicio médico vs. Agente etiológico de IRA. En el gráfico de columnas
apiladas al 100% se pueden observar los agentes etiológicos causantes de IRA en porcentaje,
respecto al servicio médico en el cual se encontraba el paciente al momento de la toma de
muestra remitida al laboratorio.

En el presente estudio se observó que la edad más vulnerable de contraer IRA

fue la de adultos mayores de 61-99 años de edad (35%), seguidos por mínima
diferencia de las personas con edades comprendidas entre 19-60 años (33%).

39
En tercer lugar, se registró a niños menos de 0 a 5 años de edad (25%) y por
último a niños de 6-18 años de edad (7%) (Figura 7).

Figura 7. Rango etario vs agente etiológico. El rango etario de los pacientes de los cuales
provenían las muestras analizadas (en abscisas) vs agente etiológico detectado en las mismas
(en ordenadas).

Con respecto a la frecuencia de los agentes etiológicos por rango etario: el

HRV se detectó con mayor frecuencia en pacientes con edades comprendidas
entre 19-60 años (42%), el VRS en niños menores de 5 años (61%) y la
influenza A en adultos mayores (61-90 años, 60%). En los niños menores de 5
años portadores de agentes etiológicos causantes de IRA, el virus más
frecuente fue el HRV (31%), seguido de VRS (24%), PIV (18%) y ADV (18%).

Discusiones
En este estudio, el rinovirus resultó ser el agente etiológico más
frecuentemente detectado (31%) en muestras biológicas (de pacientes con
sospecha de IRA y en un segundo lugar el virus de la influenza A (20%).
Estudios similares en la región y en el viejo continente, que emplearon técnicas
moleculares, también encontraron al rinovirus como el principal agente
detectado en pacientes con sospecha de IRA (15,60,61), seguidos
generalmente de VRS, PIV y ADV. A diferencia de nuestro estudio, en el que el
segundo virus circulante en el año 2017 fue la influenza A, seguido de influenza
B, VRS y Metapneumovirus, los demás virus (parainfluenza, adenovirus y
coronavirus) fueron detectados en porcentajes menores al 10%. Estos
40
resultados coinciden con la alerta epidemiológica emitida por el Ministerio de
Salud Pública y Bienestar Social (MSP y BS) entre los meses de abril y mayo
del año en estudio (2017), tras el incremento inusitado de casos de IRAs en
nuestro país, ya que en el documento se mencionan que los virus en
circulación simultánea fueron: influenza A, influenza B, parainfluenza 2,
Metapneumovirus y VRS(«Alerta ante el incremento de cuadros respiratorios»,
2017; «Notificación de enfermedades respiratorias», 2017).
Se observó circulación viral durante todo el año 2017, principalmente en los
meses correspondientes a las estaciones de otoño e invierno del hemisferio
sur. El invierno en nuestro país se caracteriza por las bajas temperaturas
sumadas a la escasa ventilación de hogares (por ausencia de sistemas de
calefacción eficientes), que desencadenan en un alto nivel de circulación de
distintos tipos de virus respiratorios. La mayor propagación de los virus
respiratorios afectó principalmente a niños de 0 a 5 años y adultos de 61 a 99
años (coincidente con las etapas de la vida más vulnerables a contraer cuadros
respiratorios), por lo que todos los años junto al plan de vacunación se
despliega una campaña de invierno en consultorios y hospitales para esta
población vulnerable. En adultos mayores la infección por virus respiratorios
como la influenza A se asocia a mayor riesgo de muerte por las complicaciones
que puedan presentar durante la enfermedad(Riquelme et al., 2014).
Respecto al lugar en el que se realizó la investigación, cabe destacar que la
atención médica es preferentemente de pacientes adultos y adultos mayores
(tanto ambulatorios, internados y UTI), es así que se registró un alto de
porcentaje (35%) de resultados positivos en pacientes de 61 a 99 años,
coincidente con una de las etapas más vulnerable a contraer infecciones
respiratorias (adultos mayores), expuesto anteriormente No obstante, el
laboratorio en cuestión también recibe muestras remitidas de otros centros
hospitalarios de niños y pacientes mayores por lo que se pudo analizar y
registrar casos de IRA.
La mayoría de los niños de 0 a 5 niños han tenido contacto con el virus sincitial
respiratorio al menos una vez en su corta vida y las reinfecciones son

41
frecuentes, por lo que el pico de incidencia y gravedad ocurre generalmente
entre las 6 semanas a 6 meses de edad (10,34,42).
Según los datos generados por este estudio, el VRS a nivel general presentó
una frecuencia del 11%, pero si analizamos con respecto a la edad de los
pacientes afectados, la mayor frecuencia de su portación se dio en niños
menores de 5 años, 61% del total de VRS reportado, coincidente con lo
reportado en la literatura.
Numerosos estudios demuestran que las infecciones virales por Influenza,
Rhinovirus, y Virus Respiratorio Sincitial representan los principales
desencadenantes de exacerbaciones de cuadros respiratorios en niños y en
adultos mayores. Los Rhinovirus no son estudiados de rutina ya que no existen
métodos rápidos para la detección. Sin embargo, con el uso de métodos
moleculares, el diagnóstico de HRV se ha expandido y se los asocia también
con infecciones respiratorias bajas. (43,66).
En este trabajo se estudió la presencia de virus respiratorios utilizando un
método molecular sensible, altamente específico y rápido en cuanto a su
realización: la qPCR. los Rhinovirus fueron los más frecuentemente detectados
(31%) de la población, se identificaron principalmente en pacientes de 19 – 60
años (42%), la frecuencia obtenida para Flu A en la población estudiada fue de
20% con mayor reincidencia en adultos mayores (61 a 99 años) 60%, según el
estudio la Flu A presentó un mayor pico de circulación en estaciones de otoño
e invierno, no obstante el Rhinovirus tuvo una circulación en todo el periodo
del año estudiado. Según la experiencia, los resultados obtenidos sugieren que
el Rhinovirus tiene un papel importante en las infecciones respiratorias en
todas las edades, Rhinovirus, tras el VRS fue el segundo agente viral más
frecuentemente detectado en pacientes menores de 0 a 5 años.
La identificación viral demostró que solo 2 virus; la influenza A y el
Metapneumovirus fueron los agentes responsables de IRA para el ingreso en
unidades intensivas (UTI), indicando probablemente que la coexistencia de
ambos virus fue el agravante de los cuadros que conllevó a la necesidad de un
monitoreo más exigente en terapia intensiva.

42
En conclusión, la introducción de los métodos moleculares para el diagnóstico
viral (en especial qPCR), para la detección de virus respiratorios en la medicina
ha revolucionado para el rápido diagnóstico y eficaz tratamiento ante las
infecciones respiratorias (55), así como ha permitido ampliar el conocimiento
sobre la prevalencia epidemiológica de ciertos virus dada la dificultad de la
detección de los mismos por métodos clásicos (43,49).

Recomendaciones:
La utilización de métodos moleculares proporciona un diagnóstico rápido y
preciso, ya que estas pruebas poseen alta sensibilidad y especificidad, por eso
la implementación de métodos moleculares en el área laboratorial es acertada
para fundamentar o confirmar el diagnóstico cuando existe un cuadro clínico
sospechoso.
Llevar un control adecuado de casos de Infecciones Respiratorias Agudas,
tomando en cuenta que la necesidad de cada edad y/o problema de salud son
diferentes, por cuanto la detección temprana del agente etiológico que puedan
causar infecciones leves o graves es primordial para el tratamiento.
Conviene realizar especial énfasis en la importancia de estudios
epidemiológicos. Varios trabajos han demostrado que la vigilancia
epidemiológica de las infecciones respiratorias agudas permiten conocer las
vías de transmisión, y los factores de riesgos, así como la detección de
distintas cepas y su prevalencia.

Conclusión
En la actualidad la introducción de técnicas moleculares como una nueva
tecnología ha revolucionado el avance de conocimiento científico en los últimos
años especialmente en el área de medicina permitiendo notables avances
investigativos y de diagnóstico especialmente de enfermedades respiratorias, la
Reacción en cadena de polimerasa (PCR) es considerada una técnica de
elección para la detección y tratamientos de infecciones virales por su alto
grado de especificidad y sensibilidad.

43
El presente estudio, aporta información acerca de los resultados de la
frecuencia de virus causantes de infecciones respiratorias agudas detectadas
por métodos moleculares (qPCR), en el periodo comprendido de 1 de enero al
31 de diciembre, experiencia en un laboratorio privado de Asunción, los datos
obtenidos son los siguiente:
Referente al rango etario los pacientes más vulnerables de contraer infecciones
respiratorias fueron los adultos mayores de 61 a 99 años de edad.
El agente etiológico detectado con mayor frecuencia fue el Rhinovirus
considerado como uno los virus responsables de las infecciones respiratorias
bajas y con una circulación viral durante todo el año estudiado, es
imprescindible utilizar una técnica molecular para su diagnóstico.
Los agentes responsables de IRAs para el ingreso en la Unidad de Terapia
Intensiva solo fueron 2 virus: Influenza A y Metapneumovirus.
Cabe destacar que la mayoría de los niños menores de 5 años tuvieron
contacto con el virus sincitial respiratorio al menos una vez en su corta etapa
de vida y que las reinfecciones con frecuentes.
Con este presente estudio se confirma que la utilización del método molecular
qPCR es el mas efectivo para la detección de multiples agentes y de
diagnóstico en pacientes con sospecha de IRAs. Sin embargo, por el momento,
su alto costo hace difícil su incorporación en la rutina diaria.

44
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51
Anexos

Ambulatorio vs Agente Etiológico

Urgencias vs Agente etiologico

52
Internado vs Agente etiológico

53
Remitidos vs agente etiológico

54
UTI vs agente etiologico

55
56