Manual Inmuno 1-5-51-71

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Práctica
Mecanismos moleculares
de inmunidad innata en el suero
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Evidenciar la actividad microbicida del suero, mediante la incubación de un cultivo
de Salmonella gallinarum con suero inactivado por calor y sin tratar, para comparar
el crecimiento de la bacteria en ambas condiciones y asociarlo con la presencia de
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

proteínas antimicrobianas termolábiles.
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)

Objetivos particulares
1. Disminuir la concentración del cultivo de salmonela mediante diluciones se-

riadas para obtener colonias aisladas.
2. Incubar el cultivo de salmonela con suero inactivado por calor y sin tratar, para
evidenciar la eficacia de los mecanismos bactericidas que posee el suero.
Introducción
Los mecanismos de defensa que intervienen inicialmente, cuando un agente pa-
tógeno (bacterias, virus, hongos y parásitos) entra en contacto con el hospedador,
son los que pertenecen a la inmunidad innata. Como características principales
de la inmunidad innata se encuentran: el no presentar memoria, el individuo la
posee desde su nacimiento y se considera la primera barrera de defensa contra
agentes extraños al organismo. Los mecanismos innatos se pueden dividir en tres
categorías:
1. Anatomo-fisiológicos. Se refieren a todos aquellos tejidos u órganos que for-

man barreras físicas, o bien que funcionalmente de manera indirecta, impiden
el establecimiento de agentes patógenos; por ejemplo, la piel, las mucosas, las
plumas, las lágrimas, los cornetes, la micción, la descamación, etcétera.
62 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
2. Moleculares. Estos mecanismos incluyen una serie de moléculas que actúan

como efectoras en la destrucción de agentes extraños, tal es el caso de enzimas
como la lisozima o las proteínas del suero, que tienen características antimi-
crobianas, como las catelicidinas, las defensinas y las generadas por el com-
plemento. En el Cuadro 1 se muestra una lista más extensa de proteínas con
propiedades antimicrobianas.
El sistema del complemento es un conjunto de más de 30 proteínas plasmáti-

cas que intervienen en procesos de destrucción de microorganismos, aunque tam-
bién se sabe que actúa de manera activa como un punto de comunicación entre
la inmunidad adaptativa y la inflamación. Su activación se puede llevar a cabo por
tres vías: a) clásica, (activada por reacciones antígeno-anticuerpo), b) de las lecti-
nas, (activadas por este grupo de proteínas con capacidad de unirse a polisacáridos
bacterianos) y c) la alterna, (activada por polisacáridos bacterianos y estabilizada
por la proteína properdina). En todos los casos, los componentes del sistema for-
man complejos de ataque de membrana con la capacidad de destruir microorganis-
mos. La primera vía de activación forma parte de la respuesta inmune adaptativa,

mientras que las dos restantes pertenecen a la innata.
3. Celulares. Como su nombre lo indica, se refiere a las células que participan

en las fases del reconocimiento antigénico e inflamación, sin inducir una me-
moria inmunológica y pueden orquestar una respuesta inmune, mediante la
secreción de mediadores químicos. Las células que los componen son neu-
trófilos, dendríticas, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células NK y células
cebadas.
Las substancias que ejercen su efecto antimicrobiano son de naturaleza protei-

ca, y dentro de sus características fisicoquímicas se encuentra la termoestabilidad;
la resistencia a la desnaturalización que tiene una proteína al aplicar calor. La des-
naturalización se produce porque el calentamiento genera un cambio en la estruc-
tura conformacional proteica, induciendo la disminución o pérdida de su efecto
biológico. En el caso particular del suero, el científico Jules Bordet descubrió que
al calentarlo a 56 °C durante 30 minutos el poder bactericida del suero disminuia.
Posteriormente se encontró, que algunas de las proteínas del complemento son
termolábiles, es decir que pierden su actividad biológica cuando son sometidas a
temperaturas arriba de los (56 °C/30 min). Esta práctica tiene como finalidad ex-
plorar las características antimicrobianas del suero inactivado por calor y el suero
sin tratamiento.
Práctica 5  Mecanismos moleculares de inmunidad innata en el suero 63
Cuadro 1.
Principales sustancias bactericidas localizadas en fluidos y tejidos del
organismo
Principal origen
Grupo Nombre Acción Cofactor
y/o localización
Gram+,
menos eficaz
Suero y en Gram−.
leucocitos Previene
Enzima Lisozima pH ácido
Secreciones fijación de
(saliva, lágrimas) virus a los
receptores
celulares.
Contra
Beta lisina
Suero Gram+
Defensinas
Neutrófilos y Gram-
Péptidos Protegrinas
Macrófagos Hongos
antimicrobianos Histatinas

Plaquetas Virus (virus
Indolicinas
envueltos)
Bactenecinas
Protozoarios
Gram+

Suero
Proteínas que fijan Transferrina Gram−
Leucocitos
al hierro Lactoferrina Secuestran
y leche
hierro
Macrófagos, Bacterias,
Componentes del hepatocitos, virus, Ca++
Complemento
complemento bazo, riñón y parásitos y y Mg++
suero. hongos.
Espermina Páncreas, riñón Gram+
Aminas básicas
Espermidina y próstata Gram-
Leche
Mecanismos de Lactoperoxidasa Neutrófilos Bacterias,
descomposición Mieloperoxidasa Macrófagos virus
del peróxido Xantinooxidasa Suero, saliva y parásitos
Tiocianato y leche
Todas las células

Virus,
IFN-α excepto los
Interferones bacterias y
IFN-β neutrófilos en
parásitos.
bovinos (*)
Saturados Glándulas Hongos
Ácidos grasos
Insaturados sebáceas Gram+
Material por alumno
]] 1 gradilla
]] 1 vial con un cultivo de Salmonella gallinarum de 18 a 24 horas
]] 3 tubos de ensayo estériles de 12 × 75 con tapón de algodón
]] 3 pipetas serológicas de 1 mL, 1/100, estériles
]] 1 pipeta serológica de 5 o 10 mL, 1/10 estéril
]] 3 cajas de Petri de 60 mm con agar triptosa envasadas estérilmente.
]] 1 frasco con 20 mL de solución salina fisiológica (SSF), estéril
]] 1 frasco con capacidad de 10 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con capacidad de 5 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con suero normal (SN)
]] 1 frasco con suero calentado (a 56 °C/30 min) (SC)
]] 1 tira de cinta adhesiva
Desarrollo de la práctica
1. Calcular una dilución en pasos 1/5000 en 5 mL. Como diluyente se utilizará la

SSF estéril y como soluto un cultivo de Salmonella gallinarum.
Dilución inicial 1/100 en 10 mL

Dilución intermedia 1/50 en 5 mL
2. Rotular los dos frascos estériles y los tubos de ensayo estériles de la siguiente
forma:
Recipientes Rótulo
Frasco con capacidad de 10 mL 1/100

Frasco con capacidad de 55 mL 1/5000
Tres tubos de ensayo estériles SC, SN y control respectivamente
SC, SN y control con el nombre del
Tres cajas de Petri
alumno
*SC: suero calentado, SN: suero normal.
Esta práctica se hace en condiciones de esterilidad, por ello se mantendrá el

mechero prendido y se trabaja en un área de 15 cm de diámetro de distancia del
mechero.
3. Con una pipeta estéril de 5 o 10 mL, añadir 9.9 mL de SSF estéril al frasco
rotulado 1/100, y 4.9 mL al frasco rotulado 1/5000.
4. Con una pipeta de 1 mL estéril, añadir 0.25 mL de SSF estéril al tubo de en-
sayo rotulado como control.
5. Con la misma pipeta añadir 0.1 mL de cultivo de S. gallinarum (cultivo de
18 horas), previamente homogeneizado, al frasco de 10 mL. Homogeneizar
perfectamente y transferir 0.1 mL de esta dilución (1/100) al frasco de 5 mL,
rotulado 1/5000. (Figura 1).

Figura 1. Proceso para la obtención de la dilución de trabajo de S. gallinarum.
6. Homogeneizar perfectamente con la pipeta y transferir 0.25 mL de esta dilu-

ción a cada uno de los tubos de ensayo estériles previamente rotulados: SN,
SC y control.
7. Con una segunda pipeta estéril añadir 0.25 mL de suero normal al tubo de
ensayo rotulado SN y con una tercera pipeta estéril añadir 0.25 mL de suero
calentado al tubo rotulado SC.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
9. Vaciar todo el contenido de los tubos rotulados SN, SC y control en las respec-
tivas cajas de Petri previamente rotuladas.
10. Incubar a 37 °C durante 24 horas y hacer la lectura.
Resultados
Los resultados esperados para cada caja de Petri son:
Control: crecimiento bacteriano abundante.

Suero normal: ausencia de crecimiento o disminución considerable del suero.
Suero calentado: crecimiento bacteriano semejante al obtenido en el control
sin suero.
Si los resultados obtenidos no concuerdan con los esperados explique las po-
sibles causas.
Preguntas
1. Esquematizar los resultados obtenidos en las mezclas S. gallinarum + SSF, S.

gallinarum + SN y S. gallinarum + SC, y discutir si lo observado en cada caso
corresponde a lo esperado.
2. Explique por qué es menos eficaz la lisozima en bacterias Gram negativas.

3. Explique por qué cuando el suero se calienta a 56 °C por 30 min, pierde su
efecto contra S. gallinarum.
Literatura de consulta
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Fudenberg, H. H. y Wells, J. V. Inmunología Básica y Clínica. Manual Moderno,
D.F, México, 5a. edición, p. 119, 1985.
3. Herbert, W. J. Inmunología Veterinaria. Acribia, Zaragoza, España Capítulo 3,
1972.
4. Werb, Z. and Goldstein, I. M. Células fagocíticas: Funciones quimiotácticas y
efectoras de los macrófagos y los granulocitos. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
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D.F, México, 5a.edición p.103, 1985.
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7. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. 6ª ed, Texas, USA, Interamericana, 2001.
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munology 11(9) 2010
9. Namekar, M. Kumar, M. O’connell, M. and Nerurkar, V. R. (2012). Effect of

serum heat-inactivation and dilution on detection of anti-WNV antibodies in mice
by West Nile virus E-protein microsphere immunoassay.
10. Callewaert, L. Aertsen, A. Deckers, D. Vanoirbeek, K. G. Vanderkelen, L. Van
Herreweghe, J. M. and Michiels, C. W. (2008). A new family of lysozyme inhibitors
contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria. PLoS Pathog, 4(3).

12
69
Práctica
Prueba de la tuberculina
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Realizar la prueba cervical doble comparativa mediante la inoculación intradérmi-
ca de derivado proteico purificado (PPD)* en vacas y analizar casos hipotéticos,
para conocer el procedimiento y la interpretación oficial empleados en el diagnós-

tico de tuberculosis bovina.

Objetivos particulares
1. Aplicar PPD en la tabla del cuello de un bovino mediante la inoculación intra-

dérmica del antígeno, de acuerdo con los lineamientos descritos en la Norma
Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995 para el diagnóstico de la tuberculosis
bovina.
2. Analizar los posibles resultados de la prueba de tuberculina con el uso de
la gráfica oficial para establecer la toma de decisiones dependiendo del esta-
do sanitario de los bovinos positivos, negativos y sospechosos a la prueba de
intradermorreacción.
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por bacterias ácido
(alcohol resistentes del género Mycobacterium. Mycobacterium bovis es la causa
principal de la tuberculosis en el ganado bovino, sin embargo, el humano, las cabras
y los cerdos también son susceptibles a esta especie. La principal vía de transmi-
sión entre animales es la aerógena, aunque la infección al hombre se da principal-
mente por vía oral, a través de la leche, así como cualquier producto lácteo crudo
o mal pasteurizado. Esta enfermedad, ocasiona grandes pérdidas económicas en la
industria pecuaria, ya que la capacidad productiva de los animales disminuye en
un 10 a 25%.El descubrimiento por Koch de la reacción de la tuberculina en 1890

aportó un instrumento útil para el diagnóstico y control epidemiológico de esta en-
fermedad. Posteriormente se pudo demostrar que esta enfermedad es una expre-
sión de la inmunidad mediada por células que desempeña el principal mecanismo
de defensa contra muchos de los microorganismos intracelulares facultativos como
lo es el Mycobacterium.
La prueba de tuberculina o de intradermorreacción (IDR) es una respuesta in-
mune mediada por células que se clasifica como hipersensibilidad tipo iv. Después
de la reacción antígeno-linfocito sensibilizado, este último produce factores bio-
lógicamente activos llamados citocinas, que inducen cambios funcionales en los
linfocitos T y en los macrófagos —células que intervienen en la respuesta celular
de tipo tuberculina—. La reacción a la tuberculina alcanza su mayor intensidad
a las 72 horas postinoculación, es cuando se observa una inflamación a nivel ma-
croscópico caracterizada por eritema y engrosamiento de la piel debido a la vasodi-
latación y al aumento en la permeabilidad vascular, pero, sobre todo, a una intensa
migración celular. Microscópicamente la población celular que infiltra el tejido
corresponde principalmente a células mononucleares (macrófagos y linfocitos).

Al antígeno que se utiliza para esta prueba, se le conoce con el nombre de tu-
berculina (de ahí su nombre). Antiguamente se utilizaron la tuberculina vieja de

Koch (TV u OT, por sus siglas en inglés Old Tuberculin) y una tuberculina con-
centrada por calor (HCSM, Heat Concentrated Synthetic Medium Tuberculin). La
primera se prepara cultivando el Mycobacterium en un medio de cultivo al que se
le añade carne. Después de que haya crecido la bacteria, el cultivo con o sin ellas,
se concentra aproximadamente 10 veces en un baño de vapor, así se eliminan los
residuos por filtración y se le añade glicerol como estabilizador. La segunda es
similar a la OT, pero el germen se cultiva en un medio sintético, así se evitan los
tejidos animales en el medio de cultivo. Para su preparación, solo se necesitan los
productos metabólicos del Mycobacterium cultivado.
Se usa el Derivado Protéico Puro (PPD, por sus siglas en inglés Purified Protein
Derivative), una tuberculina similar a la HCSM, pero con mayor grado de purifica-
ción. El PPD se prepara principalmente a partir de los productos de secreción del
Mycobacterium crecido en un medio sintético simple. Estos son precipitados varias
veces con sulfato de amonio saturado al 50 % o con ácido tricloroacético. El PPD es
el antígeno oficial de la Campaña Nacional contra la Tuberculosis Bovina (CNCTB)
y tiene las siguientes características de acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995:
a. PPD bovino: es elaborado con Mycobacterium bovis cepa AN5, para la prueba
caudal, cervical comparativa y cervical simple.
b. PPD aviar: es elaborado con Mycobacterium avium cepa D4, para la prueba
cervical comparativa. La tuberculina de PPD aviar contiene como colorante el
rojo de Ponceau, para distinguirla de la de PPD bovino que no lleva colorante.
Práctica 12  Prueba de la tuberculina 71
c. Las tuberculinas se transportan y conservan en frío a una temperatura de 4 a

8 °C, además se les protege de la luz solar directa durante el trabajo de cam-
po, se verifica el lote y la fecha de caducidad del producto. Una vez utilizado
el antígeno, se desecha el resto del contenido del envase si no se va a utilizar
el mismo día.
Puesto que, la base del esquema de erradicación de tuberculosis de la CNCTB

es la prueba de la tuberculina, es necesario un conocimiento exacto de las venta-
jas y desventajas de esta prueba de diagnóstico, así como todas sus variantes. Las
pruebas de intradermorreacción o de la tuberculina aceptadas por la CNCTB y
descritas en la NOM-031-ZOO-1995 son:
Prueba en el pliegue caudal o intradérmica única (IDU). Se aplica 0.1 mL de

PPD bovino en el pliegue anocaudal, previamente desinfectado y examinado para
detectar cualquier anormalidad que pudiera confundir la prueba. La lectura se
realiza a las 72 horas (± 6 horas) después de la inoculación y la reacción se con-

siderará positiva cuando sea visible y/o palpable cualquier engrosamiento, rubor,
calor, dolor o necrosis en el sitio de aplicación. Será negativa cuando no se observe

ni se palpe algún cambio en la piel del sitio de aplicación. En Latinoamérica, ésta
es la prueba más utilizada, en Estados Unidos, además de inocular en el pliegue
anocaudal, se aplica al mismo tiempo en el labio de la vulva, en la unión mucocu-
tánea, mientras que, en Inglaterra, se aplica en la piel del cuello.
De acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995 “es la prueba básica operativa de
rutina, cuando se desconoce la situación zoosanitaria del hato en materia de tuber-
culosis; en estos casos, deberá ser aplicada por un médico veterinario certificado o,
cuando la Sagarpa lo determine, será realizada por un médico veterinario oficial”.
Prueba cervical comparativa. En esta prueba se utilizan los dos tipos de tuber-
culina, el PPD bovino y el PPD aviar. El PPD aviar se utiliza para diferenciar la
reacción por una infección con M. bovis e infecciones por M. avium, M. paratuber-
culosis (incluyendo vacunación), Nocardia farcinicus (muermo bovino), así como
por micobacterias atípicas (fotocromógenas, ectocromógenas, no cromógenas y de
crecimiento rápido) que llegan a ser habitantes habituales del suelo y que, por su
parentesco, llegan a producir reacciones inespecíficas. En la prueba doble compa-
rativa, se inyectan simultáneamente las tuberculinas aviar y bovina en dos lugares
del mismo lado del cuello, y se realiza la lectura 72 horas (± 6 horas) después. Se
inocula comúnmente en la tabla del cuello, porque se ha observado que, en esta
parte, la piel es más sensible que la del pliegue ano-caudal.
De acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995

Esta es la única prueba autorizada para confirmar o descartar animales
reactores a la prueba de pliegue caudal. Se podrá efectuar por única vez
dentro de los 10 días naturales siguientes a la lectura de la prueba caudal; o

bien, después de transcurridos 60 días naturales, debiéndose aplicar por un
médico veterinario oficial o aprobado, se aplica en hatos o regiones con pre-
sencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y/o Mycobacterium
avium subsp. Avium.
Prueba cervical simple. En esta prueba, la inoculación también es intradérmica

en la tabla del cuello, en la región media a 10 cm de la cresta, de 0.1 mL de PPD
bovino y, mediante observación y palpación del sitio en donde se inyectó, el médico
veterinario que la aplicó, la lee a las 72 ± 6 horas después de su inoculación. Las
reacciones que se observan son:
Negativa: cuando no se observe ni se palpe ningún cambio en la piel del sitio
de aplicación.
Reactor: cuando sea visible o palpable cualquier engrosamiento, rubor, calor,
dolor o necrosis en el sitio de aplicación.
Esta prueba se emplea para inspeccionar hatos en los que se conoce la exis-
tencia de M.bovis; o bien para examinar ganado que estuvo expuesto directa o in-
directamente con hatos infectados con M. bovis. Las reacciones a las pruebas de
la tuberculina intradérmicas o no, pueden producir reacciones falsas positivas y

falsas negativas.
Las reacciones falsas negativas se observan comúnmente en:
1. Estados avanzados de la enfermedad.

2. Animales en los últimos estadios de gestación o recién paridos.
3. Animales tratados con corticoesteroides.
4. Animales que se han tuberculinizado recientemente.
5. Animales muy viejos (anergia).
Se observan reacciones falsas positivas:
1. Por el contacto de los animales con bacterias relacionadas con M. bovis como
M. avium, M. paratuberculosis, bacterias del género Nocardia, así como otras
micobacterias atípicas.
2. En animales recientemente tuberculinizados.
3. Animales que hayan adquirido inmunidad natural activa contra la tuberculosis.
Para el diagnóstico de tuberculosis, otras de las pruebas para determinar la in-

munidad celular que pueden ser utilizadas son:
a. La prueba de MIF, que es un ensayo in vitro con el que se determina la pro-

ducción o no del factor inhibidor de la migración de los macrófagos (MIF).
El MIF es una linfocina liberada por los linfocitos sensibilizados al entrar en

contacto con antígenos del Mycobacterium.
b. La prueba de interferón gama, desarrollada por Wood en 1990. También es
una prueba in vitro y tiene la ventaja de poderse realizar sin necesidad de es-
perar intervalos de 45 a 60 días entre una prueba y otra. Para la prueba, se
obtiene una muestra de sangre periférica con anticoagulante, y se cultiva en
tres formas: con PPD aviar, PPD bovino y sin PPD; de 16 a 24 horas de in-
cubación, se obtiene el sobrenadante y se determina por la técnica de ELISA
sándwich, la cantidad de interferón gama producida en cada caso. Cuando
las células cultivadas con PPD bovino producen una mayor cantidad de IFN
γ que las cultivadas con PPD aviar y el control negativo, se considera que la
prueba es positiva.
Aunque para el diagnóstico de la tuberculosis podemos utilizar estas y otras

pruebas, para dar un resultado definitivo se requiere del aislamiento del agente
etiológico, que es la prueba inequívoca de la causa de la enfermedad.

Material por animal a probar

]] 2 jeringas de 1 mL con aguja del No. 24 al 26, y de 0.5 a 1 cm de largo
]] 1 jabón
]] 1 recipiente para agua
]] 1 navaja de rasurar
]] 5 toallas de papel
]] 1 Vernier o cutímetro
]] 1 frasco con torundas de alcohol
Material por grupo
]] 4 frascos con 10 mL cada uno de PPD aviar

]] 4 frascos con 10 mL cada uno de PPD bovino
]] Toallas de papel
]] 1 Vernier grande
Desarrollo de la práctica
La prueba se realiza en el tercio medio de la tabla del cuello, a diez centímetros
por debajo de la cruz, se rasura en dos áreas, cada una de ocho centímetros de diá-
metro, aproximadamente, y trece centímetros hacia la porción ventral (Figura 1).
Figura 1. Sitios de inoculación de PPD aviar y bovino en la prueba doble comparativa.

Posteriormente, se mide el grosor de la piel de cada una de las zonas rasuradas

con un cutímetro o Vernier. A continuación, se desinfecta e inocula 0.1mL de PPD
aviar en la primer área depilada y 0.1mL de PPD bovino en la segunda, ambas por
vía intradérmica; la aguja se inserta paralelamente a la piel (la formación de una
pápula en el sitio de inoculación indica que la inyección se puso correctamente).
A las 72 horas después de la inoculación, la misma persona que hizo la lectura an-
tes de aplicar la tuberculina, medirá de nuevo el grosor de la piel en cada sitio de
inoculación.
Interpretación
Una vez obtenidas las mediciones del grosor de la piel en la lectura inicial, y a las
72 horas postinoculación, se hará lo siguiente:
1. Lectura PPD aviar: restar a la lectura postinoculación, la lectura inicial.

2. Lectura PPD bovina: restar a la lectura postinoculación, la lectura inicial.
3. Una vez obtenidas estas diferencias, comparar con la gráfica de interpretación
según sea el caso.
Por ejemplo, las siguientes son lecturas de un bovino perteneciente a un hato

afectado por tuberculosis (interpretación severa).
PPD aviar PPD bovino
Lectura inicial 4 mm 4 mm
Lectura postinoculación (72 horas) 10 mm 7 mm
Diferencia 6 mm 3 mm
Con estos dos resultados, interpretar la gráfica. Si el resultado es sospechoso,

la prueba se repetirá 60 días después.
Resultados
Con las lecturas realizadas durante la práctica, interprete la prueba y explique cuál
es el procedimiento a seguir con ese animal en caso de que perteneciera a un hato
afectado por tuberculosis.

Preguntas
1. ¿Cuáles son las pruebas in vivo e in vitro que se pueden llevar a cabo para el
diagnóstico de tuberculosis?
2. ¿Cuántos tipos de tuberculina se conocen?
3. Explique las ventajas que tiene llevar a cabo la prueba de tuberculina doble
comparativa con respecto a las demás pruebas.
4. ¿Cuál es la vía de inoculación utilizada en la prueba doble comparativa?
5. ¿Cuánto tiempo se necesita esperar después de inocular para observar una re-
acción positiva a la tuberculina?
6. De cada una de las reacciones falsas positivas y falsas negativas listadas en la
práctica, explique los mecanismos por los que se presentan.
Literatura de consulta
1. Acha, P. N. and Szifres, E. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes a

hombre y a los animales. Organización Mundial de la Salud (OMS), Publicación
Científica. No.354, 1977.

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vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of γ interferon.
Res. Vet. Sci. 49: 46-49.
3. Hagan, W. A. and Bruner, D. W. Infectious diseases of domestic animals, 7th ed.
Cornell Universitv Press, Ithaca, USA, 1981.
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Fudenberg, H. H., Stites, D. P., Cadwell, J. L. y Wells, J. V. Inmunología Clínica,
3a ed. El. Manual Moderno. México 1982.
5. Lesslie, I. W. and Hebert, C. N. Comparison of the specificity of human and
bovine tuberculin PPD for testing cattle. Vet Rec 96: 338-341, 1975.
6. Roswurm, J. D. Kantor, I. N. Marchevsky, N. Spinelli, R. and Spath, E. Sensibilidad
de las pruebas tuberculínicas en ganado bovino con Mvcobacterium bovis en
Argentina. Bol Of Sanit Pan 86(5): 420-431, 1979.
7. 7. Tizard, I. Inmunología veterinaria. 6a ed. Interamericana. McGraw Hill.
México. 2001.
8. Lee, E. and Holzman, R. S. Evolution and current use of the tuberculin test. Clin
Infect Dis. 34(3) :365-370, 2002.
9. http://www.michigan.gov/emergingdiseases/0,1607,7-186-25804_25810-74334--,00.html
10. http://www.ucd.ie/vetmed/html/research/summary/interferon.htm
11. Slovis, B. S. The case against anergy testing as a routine adjunct to tuberculin skin
testing. JAMA, 283:2003-7, 2000.
12. Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995, Campaña nacional contra la

tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis). Publicada en el Diario Oficial de la
Federación el 8 de marzo de 1996. Modificación 27 de agosto de 1998.
13. Castañeda-Ramírez, A. Heterogeneidad del derivado proteico purificado (DPP)
utilizado en la prueba de tuberculina que se emplea en la república mexicana.
Tesis de Licenciatura. UNAM, 1987.

Anexo I. Residuos peligrosos

biológico-infecciosos (rpbi’s)
De acuerdo con la NOM 087 de la Semarnat.
Sangre
La sangre y sus componentes sólo en su forma líquida, así como los derivados no
comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones
celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos

Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así
como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.
Los utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cul-
tivos de agentes biológico-infecciosos.

Patológicos
Los tejidos, órganos o partes que se extirpan o remueven durante las necropsias,
la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en
formol. Así como, las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico,
citológico e histológico, y los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados
con agentes enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.
No anatómicos
Los recipientes desechables que contengan sangre líquida. Los materiales de cu-
ración, empapados, saturados, que gotean sangre o cualquiera de los siguientes
fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido ce-
falorraquídeo o líquido peritoneal; los materiales absorbentes utilizados en las jau-
las de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatógenos.
Punzocortantes
Los utensilios que han estado en contacto con humanos o animales, o sus mues-
tras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares,
navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura,
de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material
de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectarse o esterilizarse
antes de ser dispuesto como residuo municipal.
Anexo I  Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 79
Los generadores deben cumplir con las siguientes fases de manejo: identifi-
cación, envasado, almacenamiento, recolección y transporte interno, tratamiento y
disposición final, según sea el caso.
Identificación y envasado
En las áreas de generación, (laboratorios de docencia o investigación), se deberán
separar y envasar todos los RPBI, de acuerdo con sus características físicas y bio-
lógicas infecciosas, conforme al Cuadro 2 que se presenta a continuación. Los re-
siduos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con ningún otro tipo
de residuos municipales o peligrosos.
Las bolsas se llenarán al 80 % de su capacidad y se cerrarán antes de ser
transportadas al sitio de almacenamiento temporal: no podrán ser abiertas o vacia-
das. Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes se llenarán hasta
el 80 % de su capacidad y se asegurarán los dispositivos de cierre: no se deberán
abrir o vaciar.

Identificación y envasado de los residuos peligrosos biológico-infecciosos

Tipo de Estado
Envasado Características
residuo físico
Cultivos y cepas
Polietileno traslúcido, calibre
de agentes Sólidos
300 mm, contenido de metales
infecciosos
Bolsa roja pesados de no más de una parte
por millón (ppm) y libres de cloro,
Residuos no
Sólidos marcadas con el símbolo universal de
anatómicos
riesgo biológico y la leyenda Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos.
Deberán cumplir los valores mínimos
Bolsa de los parámetros indicados en la
Patológicos Sólidos
amarilla Tabla 3 de la NOM-087.
Rígidos, de polipropileno color rojo,

contenido de metales pesados de no
más de una parte por millón (ppm)
y libres de cloro, destructibles por
métodos físicos. Deberán tener
Objetos Recipiente
Sólidos separador de agujas y abertura para
punzocortantes rojo
depósito con tapa de ensamble seguro
y cierre permanente, marcados con el
símbolo universal de riesgo biológico
y la leyenda Residuos Peligrosos
Biológico-Infecciosos
Almacenamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos envasados deberán almacenarse en
contenedores metálicos o de plástico con tapa y se rotulan con el símbolo univer-
sal de riesgo biológico, con la leyenda “Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos”.
Estos contenedores deben desinfectarse y lavarse después de cada ciclo de reco-
lección. En el caso de residuos patológicos, deberán almacenarse a 4 °C.
Recolección y transporte externo

Los residuos deben cumplir con el envasado, etiquetado o rotulado como se men-
cionó anteriormente, para poder ser recolectados. Estos residuos no deben ser
compactados durante la recolección y transporte. Si se cuenta con vehículos re-
colectores deben ser de caja cerrada y hermética, contar con sistemas de capta-
ción de escurrimientos, y operar con sistemas de enfriamiento a 4 °C. Durante su
transporte, los residuos peligrosos biológico-infecciosos sin tratamiento no debe-
rán mezclarse con ningún otro tipo de residuo municipal o de origen industrial.
Tratamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físi-
cos o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos. La

sangre y los líquidos contaminados se tratan con una solución de cloro (0.4 a 0.7 %
de concentración final) y se mantienen así durante una hora antes de desecharlos.
Disposición final
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles se dis-
pondrán como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades
competentes.
a. Residuos peligrosos radiactivos: de acuerdo con la NOM 004 NUCL de
la Secretaría de Energía, se definen como cualquier material que contenga o
esté contaminado con radionúclidos a concentraciones a las señaladas en esta
normatividad y para el cual no se prevé uso alguno. Se clasifican en nivel bajo,
medio y alto. Las fases de manejo incluyen el envasado, transporte, almacena-
miento temporal y disposición final.
b. Manejo de sustancias químicas: en los laboratorios microbiológicos, también
se manejan sustancias químicas que son potencialmente peligrosas, que consti-
tuyan un riesgo si no son identificadas y manejadas correctamente. Las NOM’s
018 y 114 de la STPS establecen los requisitos mínimos para la identificación
y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas con
respecto a sus características físicas, químicas, de toxicidad, concentración y
tiempo de exposición, que afecten la salud del personal que las maneja o que
dañe los centros de trabajo. Se debe contar con la hoja de seguridad de cada
Anexo I  Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 81
una de ellas y tenerla disponible para todos los trabajadores involucrados en

su manejo. La información estará en español y contendrá por lo menos los si-
guientes elementos: datos de la sustancia química peligrosa (nombre químico,
sinonimias, nombre comercial), identificación de los grados de riesgo (salud,
inflamabilidad, reactividad, especial), propiedades físicas y químicas, riesgos
de fuego y explosión, datos de reactividad, riesgos para la salud y primeros au-
xilios, indicaciones en caso de fuga o derrame, protección específica especial
en casos de emergencia, entre otros. Es fundamental disponer de un adecuado
almacenamiento de las sustancias químicas peligrosas de acuerdo con su grado
de compatibilidad, para proteger la salud del personal del laboratorio o centro
de trabajo donde se utilicen estos reactivos.
c. Desinfección y esterilización: para la bioseguridad en el laboratorio, la des-

infección de instrumentos y superficies del mobiliario de trabajo constituye la
forma más adecuada de evitar el posible contagio. En el manejo de los desinfec-
tantes, es muy importante conocer su espectro de actividad, los riesgos ligados
con su uso y las recomendaciones del fabricante. La limpieza previa es funda-

mental para conseguir una correcta desinfección o esterilización. Dentro de los
principales grupos de desinfectantes se encuentran los siguientes: alcoholes
(etanol al 70 %), compuestos fenólicos (triclosán y cloroxilenol), cuaternarios de

amonio (cloruro de benzalconio 0.4-1.6 %), aldehídos (formaldehído 5 %, gluta-
raldehído 2 %), cloro (hipoclorito de sodio 1 g/L), yodóforos (povidona-yodada),
oxidantes (peróxido de hidrógeno al 3 %, ácido peracético al 0.01-0.02 %).
El medio más eficaz y fiable de esterilizar material del laboratorio es la apli-

cación de vapor de agua a presión (autoclave) con un ciclo de 15 minutos a
121 °C. Estas condiciones verían dependiendo del material a esterilizar.

Manual Inmuno 1-5-51-71

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5

El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)

1. Disminuir la concentración del cultivo de salmonela mediante diluciones se-

1. Anatomo-fisiológicos. Se refieren a todos aquellos tejidos u órganos que for-

2. Moleculares. Estos mecanismos incluyen una serie de moléculas que actúan

El sistema del complemento es un conjunto de más de 30 proteínas plasmáti-

mos. La primera vía de activación forma parte de la respuesta inmune adaptativa,

3. Celulares. Como su nombre lo indica, se refiere a las células que participan

Las substancias que ejercen su efecto antimicrobiano son de naturaleza protei-

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de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)

Todas las células

Material por alumno

1. Calcular una dilución en pasos 1/5000 en 5 mL. Como diluyente se utilizará la

Dilución inicial 1/100 en 10 mL

Frasco con capacidad de 10 mL 1/100

*SC: suero calentado, SN: suero normal.

Esta práctica se hace en condiciones de esterilidad, por ello se mantendrá el

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6. Homogeneizar perfectamente con la pipeta y transferir 0.25 mL de esta dilu-

Control: crecimiento bacteriano abundante.

1. Esquematizar los resultados obtenidos en las mezclas S. gallinarum + SSF, S.

2. Explique por qué es menos eficaz la lisozima en bacterias Gram negativas.

efecto contra S. gallinarum.

9. Namekar, M. Kumar, M. O’connell, M. and Nerurkar, V. R. (2012). Effect of

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1. Aplicar PPD en la tabla del cuello de un bovino mediante la inoculación intra-

un 10 a 25%.El descubrimiento por Koch de la reacción de la tuberculina en 1890

corresponde principalmente a células mononucleares (macrófagos y linfocitos).

berculina (de ahí su nombre). Antiguamente se utilizaron la tuberculina vieja de

c. Las tuberculinas se transportan y conservan en frío a una temperatura de 4 a

Puesto que, la base del esquema de erradicación de tuberculosis de la CNCTB

Prueba en el pliegue caudal o intradérmica única (IDU). Se aplica 0.1 mL de

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De acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995

dentro de los 10 días naturales siguientes a la lectura de la prueba caudal; o

Prueba cervical simple. En esta prueba, la inoculación también es intradérmica

la tuberculina intradérmicas o no, pueden producir reacciones falsas positivas y

1. Estados avanzados de la enfermedad.

Se observan reacciones falsas positivas:

Para el diagnóstico de tuberculosis, otras de las pruebas para determinar la in-

a. La prueba de MIF, que es un ensayo in vitro con el que se determina la pro-

El MIF es una linfocina liberada por los linfocitos sensibilizados al entrar en

Aunque para el diagnóstico de la tuberculosis podemos utilizar estas y otras

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Material por grupo

]] 4 frascos con 10 mL cada uno de PPD aviar

Figura 1. Sitios de inoculación de PPD aviar y bovino en la prueba doble comparativa.

Posteriormente, se mide el grosor de la piel de cada una de las zonas rasuradas

1. Lectura PPD aviar: restar a la lectura postinoculación, la lectura inicial.

Por ejemplo, las siguientes son lecturas de un bovino perteneciente a un hato

PPD aviar PPD bovino

Lectura postinoculación (72 horas) 10 mm 7 mm

Con estos dos resultados, interpretar la gráfica. Si el resultado es sospechoso,

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1. Acha, P. N. and Szifres, E. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes a

Científica. No.354, 1977.