Evaluación comparativa de la actividad enzimática de hidrolasas lisosomales en diferentes tipos

celulares humanos: Fibroblastos, leucocitos, monocitos y macrófagos

Laura Camila Sáenz Díaz ¹

¹ Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana,
Bogotá, Colombia.

1. Resumen:

Las enzimas β-galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa, son proteínas que cumplen una
función hidrolítica para la degradación de macromoléculas como glicosoaminoglicanos, gangliósidos,
entre otros. La disminución de estas enzimas conlleva al acúmulo de estas moléculas no degradadas,
indicando una baja actividad enzimática y del mismo modo, podría evidenciar una posible enfermedad
de depósito lisosomal (LSD, por sus siglas en inglés).

En este estudio, se optimizaron protocolos de cuantificación fluorimétrica para evaluar la actividad

enzimática en fibroblastos wild type. Posteriormente, se replicaron dichos ensayos en leucocitos,
monocitos y macrófagos de individuos sanos.

Los resultados demostraron que los métodos seleccionados son eficientes para la medición de actividades
enzimáticas de hidrolasas lisosomales, mostrando diferencias significativas entre las fluorescencias de
las muestras y sus blancos de reacción, y obteniendo valores altos de actividad enzimática.
Adicionalmente, se evidencia que los macrófagos y los fibroblastos son modelos idóneos para estudios
de LSD, ya que cuentan con actividades cuantificables de enzimas hidrolíticas y aportan una base para
investigaciones futuras sobre la función lisosomal y degradación de macromoléculas en diferentes tipos
celulares.

2. Palabras clave:

Lisosoma, fibroblastos, leucocitos, monocitos, macrófagos, actividad enzimática, β-galactosidasa, β-

glucuronidasa, β-hexosaminidasa, enfermedades de depósito lisosomal, protocolos.

1
 Key words:

Lysosome, fibroblasts, leukocytes, monocytes, macrophages, enzyme activity, β-galactosidase, β-

glucuronidase, β-hexosaminidase, lysosomal storage diseases, protocols.

3. Introducción:

3.1 Justificación y planteamiento del problema:

El lisosoma es un organelo celular encargado de diversas funciones fundamentales en el metabolismo

celular, entre ellas, la degradación de algunas biomoléculas, detección y transporte de nutrientes,
señalización celular, regulación de genes, entre otras. (Pu, 2022).

Para llevar a cabo este rol en la célula, el lisosoma participa en un proceso más amplio conocido como
autofagia (Jaishy & Abel, 2016), el cual es una vía catabólica de control intracelular que conlleva a la
degradación y reciclaje de compuestos de desecho (Vargas, et al 2023), generando simultáneamente ATP
lo que representa gran beneficio a nivel celular (Costas & Rubio., 2017).

Esta dinámica metabólica implica la fusión de un organelo llamado fagóforo junto con el lisosoma, que
contiene las proteínas encargadas de la degradación hidrolítica de sustancias de desecho formando lo que
se conoce como autofagosoma (Peña, et al. 2013); una alteración o deficiencia de dichas enzimas
conllevaría al acúmulo de ciertas sustancias que previamente estarían destinadas al proceso de
degradación lisosomal, lo cual, en errores innatos del metabolismo (EIM), recibe el nombre de
enfermedades de depósito lisosomal (LSD, por sus siglas en inglés) (Ferreira & Gahl., 2017) y provocaría
a su vez una disfunción del funcionamiento general del lisosoma (Platt et al., 2018).

Es importante destacar que este grupo de patologías afecta diversas rutas metabólicas, razón por la cual,
la medición de la actividad enzimática es una herramienta útil para la exploración de las enfermedades
de depósito lisosomal en diferentes tipos celulares como leucocitos y fibroblastos (Srovel et al., 2022).

En el instituto de errores innatos del metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad Javeriana se ha

empleado el cultivo celular de fibroblastos en el contexto de las LSD con fines investigativos para el
campo de la biología y la salud, mediante estudios enfocados a posibles terapias (Guerrero Vargas, 2022),
evaluaciones de polímeros en EIM (López Rojas, 2022) y otros trabajos relacionados con evaluaciones
enzimáticas (Duarte Villanueva, 2022) y autofagia (Ríos Mora, 2022). Estas células permiten realizar la
recopilación de datos relacionados con las LSD, dado que presentan características patológicas distintivas
2
de dichas enfermedades, lo cual a su vez facilita la evaluación del funcionamiento del lisosoma, con
relación a procesos como la autofagia y el reciclaje de sustancias de desecho (Yim & Mizushima, 2020).

Los leucocitos, constituyen células fundamentales del sistema inmunológico, e incluyen subpoblaciones
como los linfocitos y los monocitos (que se diferencian en macrófagos). Así como los monocitos y
macrófagos cumplen un papel crucial en la regulación homeostática y en procesos patológicos (Ginhoux
& Jung, 2014), también se ha implementado el uso exitoso de leucocitos para el análisis de enzimas
lisosomales mediante ensayos fluorométricos (Camelier et al., 2014). Una forma de evaluar la función
lisosomal es la medición de la actividad biológica de las proteínas que participan en la degradación,
mediante la hidrólisis de macromoléculas (Puentes Téllez et al., 2020), para lo cual, en el área de
diagnóstico del IEIM priman las evaluaciones de actividades enzimáticas (AE) en sangre seca y
leucocitos, debido a la facilidad en el proceso de obtención de las muestras.

Aunque los fibroblastos, leucocitos y monocitos no son las células directamente afectadas por
enfermedades de depósito lisosomal, representan poblaciones accesibles para investigaciones. Los
leucocitos, en particular, son células de aislamiento sencillo y los fibroblastos, monocitos y macrófagos
pueden cultivarse in vitro fácilmente. La disponibilidad de estas células es un factor importante para
evaluar si son un buen modelo de estudio para las LSD, así como para llevar a cabo la medición de
actividades enzimáticas para la comparación de su actividad lisosomal.

En consecuencia, se propone ejecutar ensayos que impliquen una modificación gradual en los métodos
previamente establecidos, con el objetivo adaptarlos a cultivos a baja escala, como es el caso de los
fibroblastos, monocitos y macrófagos. Estos cambios comprenderán ajustes en la concentración de
reactivos y tiempos de incubación de las reacciones, para evaluar las respuestas del comportamiento
celular y la actividad enzimática, ante la variación de estas condiciones, de manera que los protocolos
adaptados podrán ser aplicados en el ámbito de investigación del IEIM.

En el marco de este proyecto, se realizó un estudio específico de las actividades enzimáticas de tres
hidrolasas lisosomales: β-galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa en fibroblastos, leucocitos,
monocitos y macrófagos de individuos sanos. Este enfoque permitió comparar las actividades
enzimáticas en diferentes tipos celulares, proporcionando una visión integral de la función lisosomal y
permitió evaluar la capacidad de respuesta de estas células como modelo de estudio para las LSD.

3
3.2 Objetivos de investigación

3.2.1 Objetivo general:

Analizar la función lisosomal en modelos celulares de fibroblastos, leucocitos, monocitos y macrófagos

humanos sanos, mediante la medición de actividades enzimáticas de tres enzimas lisosomales (β-
galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa)

3.2.2 Objetivos específicos:

• Establecer las condiciones para la medición de actividades enzimáticas de las enzimas β-

galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa, en modelos celulares de fibroblastos,
leucocitos, monocitos y macrófagos humanos.
• Cuantificar la actividad enzimática de las enzimas lisosomales β-galactosidasa, β-glucuronidasa
y β-hexosaminidasa, en líneas sanas de fibroblastos, leucocitos, monocitos y macrófagos
humanos sanos.

4. Materiales y Métodos:
4.1 Búsqueda de literatura

Inicialmente, se realizó una búsqueda de literatura científica para identificar protocolos relacionados con
las técnicas implementadas en el laboratorio de diagnóstico del IEIM. Para este fin fueron consultadas
las siguientes bases de datos: PubMed, NCBI, Scopus, Web of science, Google schoolar, proQuest,
Elsevier y Wiley Online Library. Adicionalmente se consultaron los repositorios institucionales
específicos de la Pontificia Universidad Javeriana y de la Universidad de Chile.

Los términos de búsqueda específicos se nombran a continuación: β-galactosidase activity”, “β-

glucuronidase activity”, “hexosaminidase activity” “4-methylumbeliferone” “enzimatic activity”
“lisosomal storage diseases” “actividad enzimática” “β-galactosidasa” “β-glucuronidasa” “β-
hexosaminidasa” “4-metilumbeliferona” “4-MU”.

A partir de los artículos seleccionados que proporcionaban información pertinente a la búsqueda de

antecedentes, protocolos y referentes bibliográficos, se procedió a la elaboración de una base de datos
estructurada para la clasificación de estas publicaciones, haciendo uso del programa Microsoft Excel,
con el objetivo de estructurar y facilitar el acceso a la información recolectada de manera eficiente y
organizada bajo criterios como sustrato, buffer en que está disuelto, reactivo de parada de la reacción,

4
volúmenes utilizados de cada reactivo, tiempo y temperatura de incubación de las muestras, métodos de
lisis, entre otros. (Tabla suplementaria 1).

4.2 Obtención y conservación de muestras

4.2.1 Fibroblastos

Las muestras del cultivo celular manejadas en el IEIM fueron obtenidas a partir de un modelo in vitro de
fibroblastos de un individuo sano, y fueron incubadas a una temperatura de 37°C en una atmósfera de
CO₂ al 5%, empleando medios de cultivo Dulbecco’s modified Eagle’s médium (DMEM) con
suplementación de suero fetal bovino al 10 y 15% y antibiótico penicilina-estreptomicina al 1%. Los
cambios de medio se llevaron a cabo aproximadamente cada 48 horas. Finalmente, las muestras ya
procesadas fueron conservadas en congelación (-20°C) hasta su procesamiento.

4.2.2 Monocitos y macrófagos

A partir de una muestra de 20mL de sangre heparinizada, obtenida en el laboratorio con previo
consentimiento de los participantes, se llevó a cabo el aislamiento de monocitos. Este proceso implicó la
centrifugación a 2200 rpm durante 10 minutos para extraer el “buffy coat”, que es la capa fina compuesta
principalmente por glóbulos blancos (leucocitos), que se encuentra entre los glóbulos rojos y el plasma.
Se procuró descartar la mayor cantidad posible de plasma, y la capa leucocitaria resultante, se mantuvo
en medio DMEM sin suplementar, hasta completar aproximadamente 20mL de la mezcla.
Posteriormente, el contenido de los tubos se dispensó en 10mL de ficol histopaque 1077 (sigma), con el
propósito de realizar una segunda centrifugación de 30 minutos a 20°C. El sobrenadante resultante fue
adicionado a 10mL de medio DMEM sin suplementar y se llevó a cabo una última centrifugación de 10
minutos, nuevamente a 20°C y 2200 rpm. Al obtener el pellet final, se retira el medio, dejando
aproximadamente 5mL y se resuspenden las células en 10mL de medio DMEM suplementado al 10% de
Suero Fetal Bovino (SFB) y 1% del antibiótico penicilina-estreptomicina (Biowest)

Del pellet obtenido de los monocitos, una fracción fue resuspendida en 300μL de PBS para cuantificación
de la actividad enzimática (AE) y almacenada en congelación (-20°C) hasta su procesamiento. La porción
restante fue cultivada bajo las mismas condiciones previamente descritas para los fibroblastos.

Posteriormente, se promovió la diferenciación de los monocitos en monocapa durante un tiempo

estimado de una semana, en donde, de acuerdo con la literatura, se presentan una serie de cambios
morfológicos y funcionales como lo son el aumento de tamaño, desarrollo de organelos especializados
5
como los lisosomas, el aumento de la capacidad de fagocitosis, etc. (Sutton & Weiss, 1996). Una vez
obtenidos los macrófagos, también se tomó una muestra para la recopilación de datos de las actividades
enzimáticas de la β-galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa.

4.2.3 Leucocitos

Los leucocitos fueron obtenidos a partir de muestras de aproximadamente 4mL de sangre de tres
individuos sanos, cuya participación en el estudio fue voluntaria, para lo cual, a cada muestra de
aproximadamente 4mL, fueron adicionados 1600µL de dextrán heparina al 3%. Al cabo de una hora, se
evidencian las fases de plasma y glóbulos blancos separadas de la fase de glóbulos rojos. Posteriormente,
los leucocitos fueron recuperados por medio de la centrifugación de esta primera capa a 3500 rpm durante
3 minutos, en donde se realizan alrededor de tres lavados con agua destilada y centrifugación. Finalmente,
el botón resultante fue resuspendido en 400µL de agua destilada y fue conservado en congelación (-20°C)
hasta su procesamiento.

4.3 Preparación de lisados celulares

Una vez que los fibroblastos utilizados en los ensayos preliminares alcanzaron una confluencia de
alrededor del 80%, se transfirieron a placas de cultivo de 24 pozos. 12 pozos, fueron sometidos a
tripsinización y posteriormente se realizaron tres ciclos de sonicación por ultrasonido, con una duración
de 20 segundos cada uno. Los otros 12 pozos fueron tratados mediante lisis química, utilizando 350 µL
por pocillo de una solución (Vf= 8000 µL) compuesta por Buffer acético-acetato (800µL), Tritón X-100
(800 µL), PMSF (800 µL) y agua destilada (5600 µL).

En cuanto a los monocitos, macrófagos y leucocitos empleados, cada muestra fue sometida en frío a tres
ciclos de sonicación por ultrasonido, cada uno con una duración de 20 segundos y a una amplitud del
20%.

4.4 Medición de actividad enzimática

4.4.1 Cuantificación de proteínas

Para la estimación de la cantidad de proteína contenida en cada muestra se siguió el método de Folin-
Lowry (1951), empleando una curva de albúmina sérica bovina con un rango de concentraciones desde
0,093 hasta 3mg/mL.

6
4.4.2 Medición actividad enzimática

Los ensayos de actividad enzimática se realizaron considerando los valores obtenidos en la cuantificación
de proteínas. Inicialmente se utilizaron los protocolos disponibles en el área de diagnóstico del instituto:
Shapira et al. (1989) y Civallero et al. (2006), señalados en la tabla suplementaria 1, los cuales estaban
estandarizados para leucocitos; razón por la cual se decide realizar una prueba inicial en fibroblastos,
considerando que es una muestra con menor número de células y menor cantidad de proteína total por
muestra, con el fin de determinar cuál es el protocolo óptimo para aplicar a los demás tipos celulares.

Una vez los protocolos fueron seleccionados, estos se aplicaron a la medición de actividades enzimáticas
en una mayor cantidad de tipos celulares como los monocitos, macrófagos y leucocitos, procurando que
los ensayos fueran replicables y reproducibles.

La lectura de la fluorescencia se realizó en un fluorómetro de microplacas Twinkle marca Berthold con

una longitud de onda específica de excitación de 360nm y de emisión de 415nm.

Una vez realizado el respectivo procedimiento, se calcula la actividad enzimática específica (AE) por
medio de la siguiente fórmula, obteniendo resultados expresados en unidades de nmol/h/mg:

Donde:
AE: Actividad Enzimática en nmol/h/mg
FSU neta es la diferencia de fluorescencia entre la muestra y el blanco
3331,3 corresponde al intercepto de la recta calculado en la curva de 4-metil-umbeliferona
406809 es la pendiente de la recta obtenida en la curva de 4-metil-umbeliferona

5. Resultados

5.1 Búsqueda de literatura

Durante el proceso se obtuvo un total de 10 artículos sometidos a revisión, de los cuales, tres artículos
abordaban la actividad enzimática de la β-galactosidasa, tres se centraban en la β-glucuronidasa, tres en
la β-hexosaminidasa y un artículo abordaba simultáneamente las tres enzimas. (Tabla suplementaria 1).

7
5.2 Modificación y comparación de protocolos

Inicialmente, se procedió a la adaptación y optimización de los protocolos establecidos por Shapira et al.
(1989) y Civallero et al. (2006) para aplicarlos a muestras de fibroblastos. Este proceso implicó la
modificación gradual de los tiempos de incubación y los volúmenes de los reactivos empleados, con el
fin de obtener una diferencia significativamente mayor entre las fluorescencias registradas en la muestra
y su correspondiente blanco de reacción. Además, se buscaba obtener valores bajos de coeficientes de
variación en la actividad enzimática entre las diferentes muestras de fibroblastos.

Cabe destacar que, durante este proceso, se optó por emplear exclusivamente las muestras lisadas por
sonicación, dado que no se obtuvo lisis celular con la solución de buffer acético-acetato. Esto se evidenció
al cuantificar la proteína total según el protocolo mencionado en el numeral 4.4.1, obteniéndose un valor
negativo, lo cual indica la ausencia de proteína en la muestra y sugiere que no hubo rompimiento de
membranas lisosomales mediante la lisis química.

5.2.1 Ajuste protocolo actividad enzimática β-galactosidasa

Para la evaluación preliminar de la actividad enzimática de la β-galactosidasa, se llevaron a cabo seis

ensayos, de los cuales tres se basaron en el protocolo de Shapira et al. (1989) y tres en el protocolo de
Civallero et al. (2006). Respecto al protocolo de Shapira et al. (1989), los valores de fluorescencia neta
(FSU muestra – FSU blanco) presentan un valor medio de 4915.53 (Figura 1a), dando como resultado
actividades enzimáticas (AE) que oscilan entre 1.25 y 8.89, con un promedio de 4.62 nmol/h/mg (Figura
1b).

Por otra parte, a pesar de que respecto al protocolo de Civallero et al. (2006) el valor promedio del ΔFSU
es de 34646.67, indicando una mayor diferencia, y el promedio de la actividad enzimática es de 1,72, el
coeficiente de variación es menor respecto al de Shapira et al. (1989) (Tabla suplementaria 3A), razón

8
por la cual se optó por utilizar el protocolo sin modificaciones de Civallero y colaboradores (2006), para
llevar a cabo la medición de la actividad enzimática de la β-galactosidasa en los diferentes tipos celulares.

ΔFSU: Fluorescencia neta (fluorescencia muestra – fluorescencia blanco)

UAF: Unidades Arbitrarias de Fluorescencia
AE: Actividad Enzimática
Figura 1. Resultados de la medición de actividad enzimática de β-galactosidasa obtenidos de los métodos de
Shapira et al. (1989) y Civallero et al. (2006): A) Promedios de los deltas de fluorescencia obtenidos a partir de
la diferencia entre la fluorescencia de la muestra y la fluorescencia de su respectivo blanco de reacción. B)
Promedio de actividades enzimáticas presentados en unidades de nmol/h/mg. A partir de una muestra de
fibroblastos sanos con siete réplicas experimentales para el protocolo de Shapira et al., (1989) y seis réplicas
experimentales para el método de Civallero et al., (2006).

5.2.2 Ajuste protocolo actividad enzimática β-glucuronidasa

Para la medición de la actividad de la enzima β-glucuronidasa se realizaron cambios en el protocolo de

Shapira et al., (1989), en términos de volumen de muestra y de sustrato, así como una prolongación en
el tiempo de incubación a 24 horas en una temperatura de 37°C (Tabla suplementaria 3B).
Dicha modificación, permitió alcanzar fluorescencias netas (ΔFSU) significativamente mayores respecto
a las obtenidas en los demás ensayos, de alrededor de 155395, como se puede evidenciar en la figura 2a,
sin embargo, en términos de actividad enzimática (AE) promedio, los valores son relativamente similares
respecto a las demás modificaciones realizadas para el mismo protocolo de Shapira et al. (1989), así
como el ensayo realizado por el método de Civallero et al. (2006) (Figura 2b).
Una vez finalizadas las pruebas, se designa la modificación 6 del método de Shapira para las mediciones
de actividades enzimáticas de la β-glucuronidasa, debido principalmente a que es el método con la mayor
diferencia de fluorescencia presentada entre muestra y blanco (ΔFSU), y teniendo en cuenta que los
coeficientes de variación tanto del ΔFSU, como de la actividad enzimática (AE) son de 36,3%, lo cual
significa que hay una dispersión de datos igualmente significativa (Tabla suplementaria 3B).

9
ΔFSU: Fluorescencia neta (fluorescencia muestra – fluorescencia blanco)
UAF: Unidades Arbitrarias de Fluorescencia
AE: Actividad Enzimática

Figura 2. Resultados obtenidos para la medición de la actividad enzimática de β-glucuronidasa, mediante los
métodos de Shapira et al. (1989) y Civallero et al. (2006) y las 6 respectivas modificaciones aplicadas al método
de Shapira: A) Promedios de los deltas de fluorescencia obtenidos a partir de la diferencia entre la fluorescencia
de la muestra y la fluorescencia de su respectivo blanco de reacción. B) Promedio de actividades enzimáticas
presentados en unidades de nmol/h/mg. A partir de una muestra sana de fibroblastos, cada protocolo se realizó por
duplicado.

5.2.3 Ajuste protocolo actividad enzimática β-hexosaminidasa

Finalmente, para la cuantificación de la actividad enzimática de la β-hexosaminidasa, se realizaron cuatro

ensayos, dos con el protocolo de Shapira et al. (1989) y dos con el protocolo de Civallero et al. (2006),
este último con una ligera modificación en cuanto al tiempo de incubación, que originalmente era de dos
horas a 37℃, y se redujo a sólo una manteniendo la misma temperatura (Tabla suplementaria 3C).
En la figura 3a, se observa que la diferencia de fluorescencias entre la muestra y el blanco fue
ampliamente mayor al utilizar el protocolo de Civallero et al. (2006). Por otra parte, la actividad
enzimática mostrada en la figura 3b, es más alta al medirla con el método de Shapira et al (1989). Sin
embargo, los valores de coeficientes de variación tanto de la fluorescencia neta (ΔFSU), como de la
actividad enzimática (AE), son significativamente menores con la modificación 1 del método de
Civallero (Tabla suplementaria 3C), lo cual sugiere que la dispersión de datos es menor con esta
modificación, se designa este método como el más adecuado para la medición de actividad enzimática
de la enzima β-hexosaminidasa.

ΔFSU: Fluorescencia neta (fluorescencia muestra – fluorescencia blanco)

UAF: Unidades Arbitrarias de Fluorescencia
AE: Actividad Enzimática

Figura 3. Resultados obtenidos para la medición de la actividad enzimática de la β-hexosaminidasa mediante los
métodos de Shapira et al. (1989) y Civallero et al. (2006), contando con una única modificación en el protocolo
de Civallero (mod1): A) Promedios de los deltas de fluorescencia obtenidos a partir de la diferencia entre la FSU
10
de la muestra y la FSU de su respectivo blanco de reacción. B) Promedio de actividades enzimáticas presentados
en unidades de nmol/h/mg, a partir de una muestra de fibroblastos sanos con cinco réplicas experimentales para el
método de Shapira et al. (1989) y dos replicas para cada ensayo con el método de Civallero et al. (2006).

5.3 Aplicación de métodos seleccionados en diferentes tipos celulares

AE: Actividad Enzimática

Figura 4. Resultados obtenidos en los ensayos finales de actividades enzimáticas en fibroblastos, leucocitos,
monocitos y macrófagos. A) Promedios de actividades enzimáticas de la β-galactosidasa, aplicando el método de
Civallero et al., (2006), en diferentes tipos celulares expresados en nmol/h/mg, a partir de una muestra de
fibroblastos sin réplicas experimentales; tres muestras de leucocitos de individuos diferentes, con dos replicas
experimentales por cada uno; dos muestras biológicas de monocitos con dos réplicas por cada una y una muestra
de macrófagos con 4 réplicas experimentales. B) Promedios de actividades enzimáticas de la β-glucuronidasa,
aplicando el método de Shapira et al., (1989) (Modificación 6), expresadas en nmol/h/mg, a partir de una muestra
de fibroblastos sanos con dos réplicas experimentales; tres muestras de leucocitos de individuos diferentes, con
dos replicas experimentales por cada uno; dos muestras biológicas de monocitos con dos réplicas por cada una y
una muestra de macrófagos con 4 réplicas experimentales. C) Promedios de actividades enzimáticas de la β-
hexosaminidasa, aplicando la modificación 1 del método de Civallero et al., (2006), para los cuatro tipos celulares,
expresados en nmol/h/mg, a partir de una muestra de fibroblastos sanos con dos réplicas experimentales; tres
muestras de leucocitos de individuos diferentes, con dos replicas experimentales por cada uno; dos muestras
biológicas de monocitos con dos réplicas por cada una y una muestra de macrófagos con 4 réplicas experimentales

11
5.3.1 Actividades enzimáticas β-galactosidasa

Al comparar las mediciones enzimáticas de la β-galactosidasa en los distintos tipos celulares, se puede
observar que los macrófagos presentan la mayor actividad enzimática (Tabla suplementaria 4A). Por
otra parte, los fibroblastos alcanzaron los mayores promedios de fluorescencia neta y una actividad
enzimática mayor de 50 nmol/h/mg (Figura 4a). En cuanto a los leucocitos, se observaron actividades
enzimáticas bajas; finalmente los monocitos tuvieron actividades enzimáticas casi nulas y del mismo
modo, registraron las menores diferencias de fluorescencia de la totalidad tipos celulares.

5.3.2 Actividades enzimáticas β-glucuronidasa

A partir de los resultados obtenidos en la tabla suplementaria 4B, se pueden evidenciar los promedios
de la medición de actividades enzimáticas en los diferentes tipos celulares estudiados, en donde según se
observa que los deltas de fluorescencia presentan valores relativamente homogéneos y por encima de
1400000 en unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF). Por otra parte, las actividades enzimáticas que
se muestran en la figura 4b presentan un rango de valores qué van desde 12,56 hasta 81,67, siendo este
último valor alcanzado únicamente por los macrófagos. En cuanto a los demás tipos celulares, sus valores
de actividad enzimática presentan valores de menos de la mitad de las obtenidas por los macrófagos.

5.3.3 Actividades enzimáticas β-hexosaminidasa

Para el caso de la β-hexosaminidasa, nuevamente los macrófagos presentan actividades enzimáticas más
altas en promedio con los demás tipos celulares (Figura 4c), teniendo en cuenta que es la muestra con
menor cantidad de proteína utilizada por cada ensayo (Tabla suplementaria 4C) y que los valores de
AE obtenidos son muy superiores a los alcanzados por los demás tipos celulares.

6. Discusión:

La hipótesis inicial sugeriría que, los macrófagos y monocitos, debido a su función en la homeóstasis
celular, presentarían las actividades enzimáticas más altas ya que son el tipo celular con mayor cantidad
de enzimas lisosomales en su interior. Del mismo modo, se esperaba que los leucocitos, al ser
ampliamente utilizados en el área clínica para el diagnóstico de enfermedades de depósito lisosomal
(LSD), mostrarían actividades enzimáticas mayores, suponiendo una dispersión mínima en dichos

12
resultados. En contraste, se esperaba que los fibroblastos presentarían el menor contenido de enzimas
hidrolasas lisosomales, viéndose reflejado en actividades enzimáticas reducidas.

Los hallazgos de este estudio sugieren que los macrófagos tienen una función lisosomal más activa que
los demás tipos celulares (fibroblastos, monocitos y leucocitos) ya que presentaron actividades
enzimáticas mayores respecto a las demás muestras. Esta mayor actividad era esperada, puesto que los
macrófagos desempeñan un papel importante en la respuesta inmune, por medio de la descomposición
de productos de desecho celular (Hirayama et al., 2017), a través de la hidrólisis enzimática de las
macromoléculas incorporadas por procesos de fagocitosis (Echeverri et al., 2004).

En contraste con lo esperado, los fibroblastos, también mostraron actividades enzimáticas considerables,
siendo las segundas más altas para las tres enzimas estudiadas (Figura 4 A, B y C). Cabe resaltar, que
para la actividad enzimática de la β-galactosidasa, la muestra de fibroblastos fue muy limitada, ya que
sólo se contó con una muestra sin posibilidad de hacer réplicas y por este motivo no fue posible calcular
los valores de desviación estándar y coeficientes de variación para las variables de interés (Tabla
suplementaria 4A). Sin embargo, es probable que presenten actividades enzimáticas menores respecto
a los macrófagos puesto que no tienen funciones de degradación. La evidencia que respalda estos
resultados proviene de la investigación de Yatziv et al, 1978, donde los autores encontraron que los
macrófagos presentaban actividades lisosomales mayores que los fibroblastos, debido a su fagocitosis
activa.

Los leucocitos, pese a ser considerados células prometedoras en el diagnóstico de LSD, con numerosos
protocolos estandarizados para medir sus actividades enzimáticas, en este estudio demostraron que no
son el tipo celular con el contenido más alto de hidrolasas lisosomales debido a los bajos valores
obtenidos en las mediciones de sus actividades enzimáticas. De hecho, presentan actividades enzimáticas
inferiores a los fibroblastos, indicando un nivel moderado de enzimas lisosomales en comparación con
los demás tipos celulares. Esto es comparable con los resultados obtenidas por Sopelsa et al., (2000) en
donde consistentemente los fibroblastos wild type tienen valores de actividad enzimática mayores que
los leucocitos, a pesar de tener niveles similares de confiabilidad en sus resultados.

Específicamente para la enzima β-glucuronidasa, los leucocitos demostraron los valores más bajos entre
todas las células analizadas. Del mismo modo, fue la célula con mayor número de muestras y replicas
analizadas en la investigación (Tabla suplementaria 4B), razón por la cual se infiere que la AE obtenida
es confiable. Sin embargo, la disponibilidad inmediata y la facilidad de obtención y manipulación de las

13
muestras, sin necesidad de condiciones específicas de esterilidad, posibilita un aislamiento rápido, lo cual
hace que los leucocitos sean muestras frecuentemente utilizadas en el área clínica.

En última instancia, los monocitos evidenciaron las actividades enzimáticas y los ΔFSU más bajos entre
todas las muestras evaluadas, equiparables a los valores obtenidos en leucocitos. La enzima β-
galactosidasa destacó por ser la que presenta la menor actividad en este modelo analizado (Figura 4A).
Estos valores no concuerdan con las expectativas ya que, en primer lugar, la proteína total de la muestra,
así como la proteína utilizada por cada ensayo se encontraba en un rango similar a las de las demás
células estudiadas. Del mismo modo, estudios anteriores revelan que los monocitos suelen tener
actividades enzimáticas entre 2,31 y 4,57 veces mayores a las de los leucocitos y sus subpoblaciones
(Strobel et al., 2020). Sin embargo, es importante señalar que el número limitado de muestras pudo haber
introducido un sesgo experimental, ya que la experimentación fue realizada a partir de un solo individuo
sano, representando una limitante para el estudio, ya que, por una parte, no se tiene certeza absoluta de
que porción del aislamiento corresponde a monocitos o a macrófagos, y, por otro lado, se presenta una
dificultad a la hora de obtener muestras lo suficientemente grandes (Cohn Z.A. (1968).

Dicho lo anterior, los resultados de las mediciones de actividades enzimáticas revelan variabilidad entre
muestras, y tipos de células, sin embargo, pese a la cantidad limitada de muestras en la investigación, los
hallazgos de este estudio revelan que aunque los macrófagos son el tipo celular ideal para medición de
actividad enzimática, son células cuya obtención y cultivo es más complejo respecto a los demás tipos
celulares evaluados, además de que presentan una gran problemática y es que los macrófagos son células
que no se dividen y no se pueden expandir en cultivo, razón por la cual la cantidad de muestra es muy
limitada (Cohn Z.A. (1968).

Por otra parte, los leucocitos, son la muestra cuyo manejo es más sencillo ya que no es necesario realizar
una preparación previa que requiera cultivo celular, no obstante, según la evidencia proporcionada, no
son el tipo celular con mayor contenido de hidrolasas lisosomales, lo cual se ve reflejado en sus bajas
actividades enzimáticas (Figura 4A, B y C), y a pesar de que si puede llegar a ser útil en los casos de
diagnóstico, también puede reflejar algunos falsos positivos (Sozmen et al., 2018).

Sin embargo, en la elección de un tipo celular como modelo de estudio para las enfermedades de depósito
lisosomal (LSD), los fibroblastos emergen como un modelo de investigación sólido, ya que muestran
tener un alto contenido de enzimas hidrolíticas, reflejado en sus altas tasas de actividad enzimática, a
pesar de no ser esencial para su función (Hultberg & Sjöblad, 1977). Adicionalmente, los fibroblastos
son células cuyo cultivo es relativamente sencillo, con un periodo de una o dos semanas en las cuales se
14
dividen y crecen, mejorando la disponibilidad de muestras para realizar diferentes tipos de ensayos, y si
bien, la extracción de fibroblastos puede ser un poco más demandante que la de los leucocitos, representa
un punto medio también entre los macrófagos, y leucocitos.

Una evidencia de que los fibroblastos representan un buen modelo celular para investigación en LSD se
puede encontrar en la investigación de Wang et al., (2011) en donde buscan el diagnóstico y manejo de
pacientes afectados por LSD haciendo uso de controles de fibroblastos o en la investigación de Hultberg
& Sjöblad, (1977) en donde se busca cuantificar actividad específica de hidrolasas lisosomales en
cultivos de fibroblastos de piel.

Finalmente se sugiere realizar ensayos con una población mayor de individuos sanos, cuyas muestras
sean suficientes para poder replicarlas en los estudios de las tres enzimas lisosomales y de esta manera
comprobar experimentalmente los resultados obtenidos en la presente investigación, haciendo uso de los
protocolos adaptados, los cuales demuestran ser fiables según los resultados obtenidos en las actividades
enzimáticas, con coeficientes de variación en la mayoría de los casos menores al 30% (Tabla
suplementaria 4 A, B y C).

7. Conclusiones:

Los modelos celulares analizados en esta investigación presentan una variabilidad entre muestras, debido
a diversos factores como la diferenciación de funciones celulares, errores experimentales en la toma de
datos, etc. El hallazgo principal de la investigación sugiere que, a pesar de que los macrófagos son el tipo
celular idóneo para medir la actividad enzimática, su procesamiento es dispendioso y con baja
reproducibilidad. Sorprendentemente, los fibroblastos, a pesar de no ser células directamente afectadas
por las LSD, exhiben altas tasas de actividad enzimática, sugiriendo que tienen un contenido significativo
de enzimas hidrolasas lisosomales, destacándose como buenos modelos de estudio debido a sus buenos
resultados experimentales de actividad enzimática, llegando a superar a los leucocitos que son el modelo
más utilizado en la actualidad en diagnóstico e investigación. En consecuencia, se propone que los
fibroblastos sean utilizados como modelo principal para investigaciones de LSD, debido a su capacidad
para proporcionar datos consistentes de actividad enzimática.

15
8. Bibliografía:

• Betta Morales, K. A. (2014). Evaluación de la actividad de la enzima lisosomal beta-galactosidasa

en muestras de fibroblastos lisados dispuestos sobre papel filtro [Tesis de maestría en Bioquímica
área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular]. Universidad de Chile.
• Camelier M, Civallero G, De Mari J, Burin M, Giugliani R. (2015) Galactocerebrosidase assay
on dried-leukocytes impregnated in filter paper for the detection of Krabbe disease. Clin Chim
Acta. 1;438:178-80. Doi: 10.1016/j.cca.2014.08.029. Epub 2014 Sep 3. PMID: 25193740.
• Civallero, G., Michelin, K., De Mari, J., Viapiana, M., Burin, M. G., Coelho, J. C., & Giugliani,
R. (2006). Twelve different enzyme assays on dried-blood filter paper samples for detection of
patients with selected inherited lysosomal storage diseases. Clinica Chimica Acta, 372(1-2), 98-
102. Https://doi.org/10.1016/j.cca.2006.03.029
• Cohn Z. A. (1968). The structure and function of monocytes and macrophages. Advances in
immunology, 9, 163–214. https://doi.org/10.1016/s0065-2776(08)60443-5
• Costas, M. A., & Rubio, M. F. (2017). Autofagia, una estrategia de supervivencia
celular. Medicina (Buenos Aires), 77(4), 314–320.
Http://www.scielo.org.ar/scielo.php?Script=sci_arttext&pid=S0025-
76802017000400011&lng=es&tlng=es
• Duarte Villanueva, M. C. (2022). Evaluación de la enzima Iduronato 2-sulfato sulfatasa humana
recombinante producida en Komagataella phaffii GS115 en un modelo in vitro de fibroblastos de
pacientes con Mucopolisacaridosis tipo II (Síndrome de Hunter). Javeriana.edu.co.
Http://hdl.handle.net/10554/60527
• Echeverri, D., Fontanilla, M., & Buitrago, L. (2004). El macrófago en enfermedad vascular ¿El
enemigo oculto? Rev. Colomb. Cardiol, 164–173.
Https://pesquisa.bvsalud.org/portal/resource/pt/lil-438400?Lang=en
• Ferreira, C., & Gahl, W. A. (2017). Lysosomal storage diseases. 2(1-2), 1–71.
Https://doi.org/10.3233/trd-160005
• Ginhoux, F., Jung, S. (2014) Monocitos y macrófagos: vías de desarrollo y homeostasis
tisular. Nat Rev Immunol 14 , 392–404 . Https://doi.org/10.1038/nri3671
• Guerrero Vargas, J. M. (2022). CRISPR-ncas9 como posible terapia génica para la enfermedad
de Tay-Sachs mediante el uso del polímero PP6D5 como sistema de entrega. Javeriana.edu.co.
Http://hdl.handle.net/10554/63289

16
• Hirayama, D., Iida, T., & Nakase, H. (2017). The Phagocytic Function of Macrophage-Enforcing
Innate Immunity and Tissue Homeostasis. International journal of molecular sciences, 19(1), 92.
Https://doi.org/10.3390/ijms19010092
• Hultberg, B., & Sjöblad, S. (1977). Lysosomal enzymes in medium from cultured skin fibroblasts
from normal individuals and patients with lysosomal diseases. Clinica Chimica Acta, 80(1), 79-
86. Https://doi.org/10.1016/0009-8981(77)90266-2
• Jaishy, B. P., & E. Dale Abel. (2016). Lipids, lysosomes, and autophagy. 57(9), 1619–1635.
Https://doi.org/10.1194/jlr.r067520
• López Rojas, E. N. (2022). Evaluación de polímero anfifílico como agente de transfección no
viral en fibroblastos de pacientes con Mucopolisacaridosis IIIB en un sistema de terapia génica
empleado la herramienta CRISPR/Cas9. Javeriana.edu.co. Http://hdl.handle.net/10554/64193
• Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J Biol Chem. Nov;193(1):265-75. PMID: 14907713.
• Norberto, J., Hamasaki, M., Kawabata, T., Youle, R. J., & Tamotsu Yoshimori. (2022). The
mechanisms and roles of selective autophagy in mammals. 24(3), 167–185.
Https://doi.org/10.1038/s41580-022-00542-2
• Olsen, I., Dean, M. F., Muir, H., & Harris, G. (1982). Acquisition of β-glucuronidase activity by
deficient fibroblasts during direct contact with lymphoid cells. 55(1), 211–231.
Https://doi.org/10.1242/jcs.55.1.211
• Peña-Sanoja, María Johanna, & De Sanctis, Juan Bautista. (2013). Autofagia y respuesta
inmunitaria. Investigación Clínica, 54(3), 325-337. Recuperado en 05 de enero de 2024, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0535-
51332013000300009&lng=es&tlng=es.
• Platt, F., d’Azzo, A., Davidson, B., Neufeld, E., & Tifft, C. (2018). Lysosomal storage
diseases. Nature Reviews Disease Primers, 4(1). Doi: 10.1038/s41572-018-0025-4
• Pu, J. (2022). Targeting the lysosome: Mechanisms and treatments for nonalcoholic fatty liver
disease. 123(10), 1624–1633. Https://doi.org/10.1002/jcb.30274
• Puentes-Tellez, M. A., Lerma-Barbosa, P. A., Garzón-Jaramillo, R. G., Suarez, D. A., Espejo-
Mojica, Á. J., Guevara, J. M., Echeverri, O. Y., Solano-Galarza, D., Uribe-Ardila, A., &
Alméciga-Díaz, C. J. (2020). A perspective on research, diagnosis, and management of lysosomal
storage disorders in Colombia. Heliyon, 6(3), e03635–e03635.
Https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e03635
17
• Ríos Mora, J. (2022). Análisis del efecto de los niveles de aminoácidos sobre la autofagia en la
fisiopatología de las aminoacidopatías. Repositorio Institucional Javeriana.
Http://hdl.handle.net/10554/62585
• Salminen, A. (2023). The plasticity of fibroblasts: A forgotten player in the aging process. 89,
101995–101995. Https://doi.org/10.1016/j.arr.2023.101995
• Shapira, E., Blitzer, M. G., & Miller, J. B. (1989). Biochemical Genetics: A Laboratory Manual.
Oxford University Press, USA.
• Sopelsa, A. M., Severini, M. H., Da Silva, C. M., Tobo, P. R., Giugliani, R., & Coelho, J. C.
(2000). Characterization of beta-galactosidase in leukocytes and fibroblasts of GM1
gangliosidosis heterozygotes compared to normal subjects. Clinical biochemistry, 33(2), 125–
129. https://doi.org/10.1016/s0009-9120(00)00049-7
• Sozmen, Eser & Dondurmacı, Meral & Ucar, Sema & Coker, Mahmut. (2018). False Positive
Diagnosis of Lysosomal Storage Disease with Dried Blood Spot Sample; Leucocyte Number As
A Challenging Factor. The Journal of Pediatric Research. 5. 10.4274/jpr.33042.
• Strobel, S., Hesse, N., Santhanakumaran, V., Groeschel, S., Bruchelt, G., Krägeloh-Mann, I., &
Böhringer, J. (2020). Optimization of Enzyme Essays to Enhance Reliability of Activity
Measurements in Leukocyte Lysates for the Diagnosis of Metachromatic Leukodystrophy and
Gangliosidoses. Cells, 9(12), 2553. https://doi.org/10.3390/cells9122553
• Strovel, E. T., Cusmano-Ozog, K., Wood, T., & Yu, C. (2022). Measurement of lysosomal
enzyme activities: A technical standard of the American College of Medical Genetics and
Genomics (ACMG). 24(4), 769–783. Https://doi.org/10.1016/j.gim.2021.12.013
• Sutton, J. S., & Weiss, L. (1966). Transformation of monocytes in tissue culture into
macrophages, epithelioid cells, and multinucleated giant cells. Journal of Cell Biology, 28(2),
303–332. Https://doi.org/10.1083/jcb.28.2.303
• Tropak, M. B., Reid, S. P., Guiral, M., Withers, S. G., & Mahuran, D. J. (2004). Pharmacological
Enhancement of β-Hexosaminidase Activity in Fibroblasts from Adult Tay-Sachs and Sandhoff
Patients. 279(14), 13478–13487. Https://doi.org/10.1074/jbc.m308523200
• Wang, R., Bodamer, O., Watson, M. et al. (2011). Lysosomal storage diseases: Diagnostic
confirmation and management of presymptomatic individuals. Genet Med 13, 457–484 .
https://doi.org/10.1097/GIM.0b013e318211a7e1

18
 • Yatziv, S., Epstein, L. & Epstein, C. (1978). Monocyte-derived Macrophages: An in
Vitro System for Studying Hereditary Lysosomal Storage Diseases. Pediatr Res 12, 939–944
Https://doi.org/10.1203/00006450-197809000-00011
• Yim, W.WY., Mizushima, N. (2020). Lysosome biology in autophagy. Cell Discov 6, 6
Https://doi.org/10.1038/s41421-020-0141-7
9. Material suplementario

9.1 Tabla suplementaria 1.

Base de datos con artículos clasificados en el programa Microsoft Excel

9.2 Tabla suplementaria 2.

Descripción de protocolos de actividad enzimática en las tres enzimas estudiadas

Protocolo de actividad enzimática Shapira et al., (1989) y Civallero et al. (2006), para las enzimas β-galactosidasa,
β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa, en donde se señalan los volúmenes específicos de cada uno de los reactivos
de ambos métodos, así como los tiempos y temperatura de incubación.
mg de Volumen
Volumen Volumen Tiempo de
Buffer en que está disuelto proteína R. de
Enzima Protocolo Sustrato y concentración muestra sustrato incubación a
el sustrato en la parada*
(μL) (μL) 37°C
muestra (μL)

4-MU-β-galactopiranósido Acetato de sodio - ácido 100 (diluida 0,010-

Shapira 100 20 minutos 1300
[0,5mM] acético [0,1M] pH: 4,0 en agua) 0,020
β-galactosidasa
4-MU-β-galactopiranósido Acetato de sodio - ácido
Civallero 30 NA 30 3 horas 150
[0,5mMol/L] acético [0,1M] pH: 4,0

4-MU-β-D-glucorónido Acetato de sodio - ácido 100 (diluida 0,020-

Shapira 100 30 minutos 1300
[10mM] acético [0,1M] pH: 4,8 en agua) 0,030
β-glucuronidasa
4-MU-β-D-glucorónido Acetato de sodio - ácido
Civallero 25 NA 25 2 horas 150
[10mM] acético [1M] pH: 4,8

4-MU-2-acetamido-2- 50 (diluida
Citrato-fosfato [0,01M] pH: 0,004-
Shapira deoxy-β-D- en buffer 200 20 minutos 1250
4,4 0,010
glucopiranósido [2,5mM] HSA*)
β-h exosaminidasa
4-MU-N-acetyl-β-D-
Citrato-fosfato [22mmol/L]
Civallero glucosaminidae 25 NA 50 2 horas 150
pH: 4,4
[22mMol/L]
4-MU: 4-metilumbeliferil
*R. de parada: Buffer glicina-carbonato [0.17M] pH 9.8
**NA: No aplica
***Buffer HSA: Solución de albúmina sérica humana al 0,6% en buffer citrato-fosfato [0,01M] pH 4,4

Nota: Para el caso de los protocolos realizados mediante el método de Civallero y colaboradores (2006), no se tiene en cuenta el criterio de
la concentración de proteína en la muestra puesto que este es un método volumétrico.

19
9.3 Tabla suplementaria 3.

Protocolos y promedios de los ensayos de medición de actividad enzimática para la β-galactosidasa,

β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa.

Se proporciona una descripción de los métodos de Shapira et al. (1989) y Civallero et al. (2006),
incluyendo información sobre los volúmenes y los tiempos de incubación empleados en los
procedimientos. 3A) Se presentan en color verde los promedios derivados de los 6 ensayos realizados
para la enzima β-galactosidasa (3 de cada protocolo) y no se realizan modificaciones frente a las
metodologías originales. 3B) Se presentan los ensayos correspondientes de las AE de la enzima β-
glucuronidasa, los cuales estaban principalmente enfocados en las modificaciones del protocolo de
Shapira, et al. (1989), evidenciando cambios graduales a lo largo de la experimentación, señalados en
color naranja en la tabla, y dejando como metodología óptima modificación 6. 3C) Se llevaron a 4
ensayos, aplicando las dos metodologías propuestas en la investigación; en donde el resultado más
favorable en términos de tiempo y valores de AE, se obtuvo en el último ensayo, en el cual se realizó una
pequeña modificación en cuanto al tiempo de incubación, como se señala en color azul.

Promedio Δ
Tiempo de Volumen Promedio Promedio Coeficiente Coeficiente
Volumen Volumen Promedio FSU (FSU
Protocolo incubación a Reactivo de FSU valor AE de variación de variación
muestra (μL) sustrato (μL ) FSU blanco mx - FSU
37°C parada* (μL) muestras (nmol/h/mg) AE Δ FSU
blanco)
Shapira 100 (diluida) 100 20 minutos 1300 2523,23 7418,04 4915,53 4,62 66,93 58,58
A β-Galactosidasa
Civallero 30 (pura) 30 3 horas 150 3480 38126,66 34646,67 1,72 53,76 56,70
Shapira 100 (diluida) 100 30 minutos 1300 8682,09 14194,78 5512,14 2,35 66,24 63,01
Shapira mod 1 100 (diluida) 100 2 horas 400 5618,96 14271,35 8652,39 1,00 23,76 18,23
Shapira mod 2 50 (diluida) 100 2 horas 400 20805 25430 4625 1,02 73,23 76,99
Shapira mod 3 50 (diluida) 50 1 hora 400 25880 30285 4405 1,93 63,09 67,21
B β-Glucuronidasa
Shapira mod 4 50 (pura) 50 1 hora 400 27750 33125 5375 1,36 25,39 25,39
Shapira mod 5 50 (pura) 50 6 horas 200 33645 81230 47585 2,01 25,04 25,04
Shapira mod 6 50 (pura) 50 24 horas 200 33480 188875 155395 1,64 36,3 36,3
Civallero 25 (pura) 25 2 horas 150 3000 48985 45985 2,30 57,92 41,2
50 (diluida en
Shapira 200 20 minutos 1250 1263035,25 1432455,02 178215 364,69 45,15 44,11
buffer HSA)
C β-Hexosaminidasa Civallero 25 (pura) 50 2 horas 150 24730 801840 777110 79,45 16,39 8,15
Civallero mod 1 25 (pura) 50 1 hora 150 612900 859900 247000 50,56 5,31 5,98

*Reactivo de parada: Buffer glicina- carbonato [0.17M] pH 9.8

***Buffer HSA: Solución de albúmina sérica humana al 0,6% en buffer citrato-fosfato [0,01M] pH 4,4
FSU: Fluorescencia
ΔFSU: (fluorescencia de la muestra - fluorescencia del blanco)
UAF: Unidades arbitrarias de fluorescencia
AE: Actividad enzimática
Mx: muestra

20
9.4 Tabla suplementaria 4.

Resultados Actividades enzimáticas β-galactosidasa, β-glucuronidasa y β-hexosaminidasa en

diferentes tipos celulares:

4A) Promedios de valores obtenidos en los 4 tipos celulares para la enzima β-galactosidasa (señalados
en color verde), en donde para el caso de los fibroblastos solo se contaba con una muestra y por lo tanto,
no existen valores de desviación estándar ni coeficientes de variación. 4B) resultados promedio obtenidos
en la actividad enzimática de la β-glucuronidasa (señalados en color naranja) 4C) Resultados de las
actividades enzimáticas β-hexosaminidasa en diferentes tipos celulares (señaladas en color azul)

Promedio
Promedio Promedio Desviación Coeficiente Coeficiente
proteína Promedio Promedio Promedio AE Desviación
Tipo de célula Proteina total FSU NETA (Δ estándar de variación de variación
utilizada por FSU Blanco FSU Mx (nmol/h/mg) estándar AE
(mg/mL) FSU) ΔFSU Δ FSU AE
ensayo (mg)
Fibroblastos 0,28 0,01 15940 557320 541380 52,48
Leucocitos 2,24 0,03 14766,67 379643,33 364878,33 10,15 39011,08 11,69 1,20 11,89
A β-Galactosidasa
Monocitos 1,75 0,05 15135 73560 58425 0,91 12932,99 19,80 0,20 22,30
Macrófagos 0,12 0,003 16250 339330 323080 79,74 20668,73 6,40 5,33 6,46
Fibroblastos 0,28 0,01 40440 1505110 1464670 25,19 24310,33 1,66 0,42 1,66
Leucocitos 2,24 0,04 27047 2112845 2085798 12,56 11089,79 0,54 0,09 0,54
B β-Glucuronidasa
Monocitos 1,75 0,09 31655 1548640 1516985 12,70 589126,01 44,73 1,32 44,73
Macrófagos 0,12 0,01 34675 1878385 1843710 81,67 19657,57 1,06 0,94 1,06
Fibroblastos 0,28 0,01 501750,00 1401710 899960 314,86 32823,90 3,65 11,53 3,66

β- Leucocitos 2,24 0,02 527448,33 1566430 1038982 123,97 74300,42 7,62 10,97 7,65
C
Hexosaminidasa Monocitos 1,75 0,04 452175,00 1410960 958785 107,37 24593,17 3,02 4,29 3,04
Macrófagos 0,12 0,001 322425,00 892309 569884 1138,98 45270,39 7,92 238,86 22,21
FSU: Fluorescencia
ΔFSU: (fluorescencia de la muestra - fluorescencia del blanco)
UAF: Unidades arbitrarias de fluorescencia
AE: Actividad enzimática
Mx: muestra

21