UD2 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN y PRECIPITACIÓN

UD2
TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES AG-AC

SECUNDARIAS
LAS TÉCNICAS SECUNDARIAS

Las técnicas basadas en reacciones Ag-Ac secundarias son:
Reacciones de aglutinación: el Ag es una partícula grande y

se encuentra en suspensión. La unión Ag-Ac forma una red que
provoca una aglutinación visible en el medio.
Reacciones de precipitación: los Ag y Ac son solubles. El Ag

No es una partícula grande. La unión Ag-Ac forma complejos
insolubles y precipitan en el medio.
Fijación del complemento: técnica en la que interviene el

sistema de complemento y como sistema revelador se utilizan
hematíes (para ver si se hemolizan o no por el complemento).
UD2
TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES AG-AC
SECUNDARIAS
2. GENERALIDADES TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Y

PRECIPITACIÓN
3. AGLUTINACIÓN
3.1.- Generalidades técnicas de aglutinación
3.2.- Aglutinación Directa
3.3.- Aglutinación Indirecta
3.4.- Inhibición de la aglutinación
4. PRECIPITACIÓN
4.1.- Generalidades técnicas de precipitación
4.2.- Precipitación en gel
5. TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
6. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO
2.GENERALIDADES TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN
La aglutinación y precipitación ocurren cuando las
concentraciones de Ag y Ac están en una proporción adecuada
(zona de equivalencia), de forma que cada Ac se une al menos
a dos Ag y cada Ag se une al menos a dos Ac. Si hay exceso de
Ag o de Ac, se produce el fenómeno de zona, y se
proporcionará un resultado falso negativo.
Exceso de Ac (prozona): cada Ac se une a un solo antígeno.
No se forma una red y no hay aglutinación. Se debe diluir el
suero.
Exceso de Ag
(postzona): el mismo
Ag no se une a dos o Reacción
positiva
más Ac. No se forma Reacción Reacción
una red y no hay negativa negativa
aglutinación. Prozona Postzona

Las técnicas de aglutinación y precipitación sirven para
identificar tanto Ag como Ac:
Queremos saber si en la muestra problema está el Ac
específico y tenemos el Ag en un reactivo. Ejemplo: queremos
saber si el paciente tiene Ac anti-Brucella en suero y tenemos un
reactivo con Brucella (bacteria).
Queremos averiguar si en la muestra problema está el Ag
complementario y tenemos el Ac en un reactivo. Ejemplo:
queremos saber si el paciente tiene en la superficie de sus
hematies el Ag B y tenemos un reactivo con Ac anti-B.
Las reacciones de aglutinación tienen un alto grado de

sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica es la cantidad
mínima de sustancia problema (analito) que es capaz de detectar
la técnica. Cuanto menor sea la cantidad de analito detectado,
mayor será la sensibilidad analítica de la técnica.
APARTADO 3
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN
APARTADO 3
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN
3.1.- GENERALIDADES TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN
3. 2.- AGLUTINACIÓN DIRECTA

3.2.1.- Aglutinación Directa
3.2.2.- Hemaglutinación Directa
3. 3.- AGLUTINACIÓN INDIRECTA

3.3.1.- Aglutinación indirecta
3.3.2.- Hemaglutinación indirecta
3.3.3.- Pruebas de Coombs
Prueba de Coombs directa
Prueba de Coombs indirecta
3.4. INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN

3.4.1.- Inhibición de la aglutinación directa
3.4.2.- Inhibición de la aglutinación indirecta
La aglutinación ocurre entre partículas en suspensión. Cada

aglutinógeno (Ag) puede unirse a dos o más unidades de su Ac
específico (aglutinina), y cada Ac a más de dos o más unidades
de Ag. Así se forma una red de Ag-Ac que provoca una
aglutinación visible en el medio.
¿El suero
problema
tiene Ac?
Valencia: significa lugar de unión.
Ag multivalente: tiene varios

epítopos, es decir, puntos de unión
al Ac.
Inmunoglogulinas (aglutininas)
La IgM es una aglutinina completa:
siempre produce aglutinación. Su
estructura es pentamérica (5 “Y”). Tiene 10
valencias (puntos de unión al Ag). IgM
La IgG es una aglutinina incompleta. A IgG

pesar de reaccionar con el Ag, no siempre
producen aglutinación. Su estructura es
monomérica (una “Y”) y, por tanto, bivalente.
En el caso de utilizar Ac incompletos para aglutinar hematies,
deberemos facilitar el fenómeno de la aglutinación. Esto se puede
hacer:
 Aumentando la viscosidad del medio añadiendo albúmina

bovina al 30 %, dextrano o polivinil pirrolidina.
 Eliminando los residuos negativos de ácido siálico de la

membrana del eritrocito exponiéndolo a la acción de enzimas
como la tripsina, papaína, bromelina o ficina.
 Disminuyendo la fuerza iónica del medio trabajando con LISS

(low ionic strength solution).
La visualización del resultado en las técnicas de aglutinación
depende del soporte con el que se realiza la reacción:
Soporte plano (portaobjetos, tarjeta): la aglutinación implica
la formación de «grumos». En las tarjetas hay unos círculos que
serán negros si la partícula a aglutinar es blanca y viceversa.
Placa de microtitulación o tubos de ensayo:
Aglutinación: se observa un velo en el pocillo.
 NO hay aglutinación: los Ag particulados sedimentan en
forma de botón en el fondo de los pocillos o tubo de ensayo.
Aglutinación
NO aglutinación
Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o
cuantitativas.
 Cualitativas: la aglutinación se produce o no se produce. Si se

produce, se asignan más o menos cruces en función del número
de agregados que se observan y el tamaño de éstos.
Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o
cuantitativas.
 Cuantitativas: se deben efectuar diluciones seriadas del

suero para determinar el título de Ac. Después se añadirá Ag
en todos los tubos. Cuando la dilución es baja habrá
aglutinación, pero a medida que aumenta el grado de dilución,
llegará un momento en el que ya no aparecerá aglutinación.
TÍTULO: inversa de la máxima dilución de Ac que aún

presenta una reacción positiva.
Concentración o tasa del Ac =

título x sensibilidad de la técnica
NOTA PARA LA REALIZACIÓN DE LAS PRÁCTICAS
Obligatorio trabajar con bata, guantes, pelo recogido y uñas cortas.
 Todo material reutilizable que se quiera recuperar y que haya estado
en contacto con muestras potencialmente infecciosas, se sumergirá en
lejía diluida al 1% para su descontaminación. P. ej. tarjetas de reacción o
portaobjetos. Por tanto, se prepararán bateas y vasos de precipitados
con lejía diluida para este fin. Después el material se lavará con agua y
jabón (último enjuague con agua destilada).
Se homogeneizarán (suavemente) antes de ser utilizados:
• Todos los tubos con sangre, suero o plasma
• Los frasquitos con reactivos
 La punta del cuentagotas con reactivo jamás debe contactar con otros
líquidos.
 Se eliminarán en el recipiente de objetos cortantes y punzantes: palillos
utilizados, portaobjetos (si no se quieren recuperar), cubreobjetos…
 Las puntas de micropipetas y las pipetas pasteur de plástico se
eliminarán al contenedor con una bolsa de autoclave para autoclavar.
El determinante antigénico forma parte (de forma natural) de una

célula o partícula lo suficientemente grande.
Se trata de bacterias, protozoos, esporas o hematíes que

expresan en su superficie sus propios determinantes antigénicos
o epítopos (lugar de unión del Ag al Ac).
En el caso de hematies se llama hemaglutinación directa.
EJEMPLO TIPO DE TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN DIRECTA
R1: suspensión del Ag
Homogeneizar los reactivos antes
R2: líquido con Ac frente al Ag (control +)
de su uso (R1, R2, R3)
R3: líquido sin Ac frente al Ag (control -)
M: suero problema ¿tiene Ac frente al Ag?
1º) 1 gota R1 Tarjeta de reacción
5º) Resultados:
• El C(+) debe aglutinar siempre
2º) 1 gota 1 gota 1 gota • El C(-) NO debe aglutinar nunca
R2 (C+) R3 (C-) M • La muestra aglutinará si tiene Ac frente
al Ag estudiado
3º) Homogeneizar las dos
gotas de cada circulo con un NOTA: si se aplica
palillo (utilizad un palillo como método
distinto para cada círculo) cuantitativo, se
efectuarán diluciones
4º) Realizar oscilaciones con dobles de la muestra
la tarjeta el tiempo indicado y se determinará el
en el protocolo título.
3. 2.- AGLUTINACIÓN DIRECTA: EJEMPLO
Aglutinación directa de Brucella
(Rosa de Bengala):
Se utiliza como prueba de screenning para descarte de brucelosis
R1
R2
R3
M
(debe aglutinar siempre)

Hemaglutinación directa
Se aplica para el tipaje de la

sangre. Tipar la sangre es
averiguar, respecto de un sistema
sanguíneo (sistema AB0, sistema
Rh…), qué determinante antigénico
expresa el eritrocito en su
membrana.
¿Qué tiene en su sangre
la persona del grupo?
Los Ac del sistema AB0 son

Ac regulares. Esto significa
que una persona siempre
tendrá Ac frente al Ag que NO
tiene en sus eritrocitos.
Determinación del determinante antigénico del sistema AB0.

Procedimiento:
 Reactivo anti-A (Ac anti-A) Homogeneizar los
 Reactivo anti-B (Ac anti-B) reactivos antes de su uso
 Muestra: sangre del paciente
1º) 1 gota 1 gota
anti-A anti-B
Portaobjetos
A B
2º) 1 gota sangre homogeneizada. La punta de la pipeta con la que

cogemos la sangre no debe tocar la gota con anticuerpos anti-A ni anti-B.
3º) Mezclar con un palillo las dos gotas de la parte A y con otro palillo las dos gotas de
la parte B.
4º) Oscilar el porta 2 min y observar si se produce aglutinación.
Procedimiento (continuación):
No aglutina ni
en A ni en B
A B
No aglutina: es grupo 0
Aglutina en B
A B
La sangre es grupo B
1º) 1 gota anti-A1 Aglutina: es grupo A1
Aglutina en A homogeneizado
Homogeneizar
A B con palillo y
No aglutina: es grupo A2
oscilar 2 min
2º) Otra gota de sangre
homogeneizada
La sangre del grupo A puede ser A1 ó A2. Existen reactivos con

anticuerpos anti-A1, pero no existen reactivos con anticuerpos anti-A2.
Aglutina en A y 1º) 1 gota anti-A1 Aglutina: es grupo A1B
en B homogeneizado
Homogeneizar
A B con palillo y
No aglutina: es grupo
oscilar 2 min
A2B
La sangre es 2º) Otra gota de sangre
AB homogeneizada
La sangre del grupo A puede ser A1 ó A2. Existen reactivos con

anticuerpos anti-A1, pero no existen reactivos con anticuerpos anti-A2.
Determinación del determinante antigénico (Ag D) del

sistema Rh.
Antígeno en Anticuerpo en plasma
el hematie
Persona Rh (+) Ag D NO tiene anticuerpos Anti-D
Persona Rh (-) NO tiene Ag D Tendrá anticuerpos anti-D si ha

sufrido una exposición previa al
Ag D, si no, no los tendrá.
Los Ac del sistema Rh y del resto de sistemas sanguíneos (a

excepción del AB0), son Ac irregulares. Para tener Ac
irregulares, la persona debe haber tenido una exposición previa al
Ag correspondiente. Existen más de 30 sistemas sanguíneos
distintos (Kell, Duffy, Lutheran, Lewis, MNSs, Ii…)
Determinación del determinante antigénico (Ag D) del sistema Rh.
Procedimiento:
Homogeneizar los reactivos antes de su uso
 Reactivo anti-D (Ac anti-D)
 Reactivo albúmina al 30% (control -)
 Muestra: sangre del paciente D
1º) 1 gota 1 gota albúmina 30%
anti-D Control (-)
D A 3º) Mezclar con palillos distintos las dos

Portaobjetos gotas de la parte D y las dos gotas
de la parte A. Oscilar el porta sobre
un visualizador al menos 2 minutos.
2º) 1 gota sangre homogeneizada. La punta de la pipeta con que ponemos la

sangre no debe tocar la gota de anticuerpos anti-D ni la albúmina.
Resultados
La albúmina nunca debe aglutinar. Si lo hace, la prueba no vale.
D A
Aglutina en D: Rh (+). Los eritrocitos tienen el Ag D.
D A NO aglutina en D: debemos realizar otra prueba para
saber si el paciente es Rh (+) ó Rh (-).
El determinante antigénico o bien anticuerpos se han fijado a la
superficie de una partícula. El determinante antigénico (o los
anticuerpos) y la partícula a la que se han fijado son de
procedencia distinta. Los tipos de partículas pueden ser:
Suspensión de bolitas de látex, bentonita o carbón activo.
Suspensión de hematíes (en este caso se llama
hemaglutinación indirecta).
Así se conforma una partícula sensibilizada con el determinante
antigénico o con anticuerpos con un tamaño suficiente como para
hacer visible la reacción. Partícula
Sensibilización: cuando la superficie

de una partícula o célula se recubre de
determinantes antigénicos, anticuerpos Determinante
u otra sustancia. antigénico
Toxoplasma
EJEMPLO TIPO DE TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN INDIRECTA
R1: partícula recubierta con determinante antigénico Homogeneizar los
R2: suero con Ac frente al determinante antigénico (C+) reactivos antes de
R3: suero sin Ac frente al determinante antigénico (C-) su uso (R1, R2, R3)
M: Suero problema ¿tiene Ac frente al determinante antigénico?
1º) 1 gota R1 Tarjeta de reacción
1 gota 1 gota 1 gota Método cualitativo

2º) R2 (C+) R3 (C-) M
3º) Homogeneizar las dos gotas de cada circulo con un NOTA: si se aplica
palillo (utilizad un palillo distinto para cada círculo) como método
4º) Realizar oscilaciones con la tarjeta el tiempo cuantitativo, se
indicado en el protocolo efectuarán diluciones
de la muestra y se
5º) Resultados:
determinará el título.
• El C(+) debe aglutinar siempre
• El C(-) NO debe aglutinar nunca
• La muestra aglutinará si tiene Ac frente al determinante antigénico
3. 3.- AGLUTINACIÓN INDIRECTA: EJEMPLO
Aglutinación de látex en placa
Determinación de Ac antiestreptolisina O (ASO) en suero del
paciente. Se aplica en el diagnóstico de fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y otras
infecciones estreptocócicas.
R1
R2
R3
M
La estreptolisina O es una
enzima producida por
estreptococos hemolíticos
de los grupos A, C y G.
3. 3.- AGLUTINACIÓN INDIRECTA INVERSA: EJEMPLO
Determinación de Factor Reumatòide (Ag) en suero del
paciente
R1: Reactivo de látex: suspensión de partículas de poliestireno sensibilizadas con gamma-Globulina humana.
R2: suero humano con Factor Reumatoide El Ag está libre en la muestra biológica
R3: suero sin Factor Reumatoide y el Ac está fijado a la partícula.
M: suero del paciente
Hemaglutinación indirecta (HAI)
TPHA. Determinación de Ac
anti-Treponema pallidum.
Hemaglutinación en microplaca
R1: hematies sensibilizados con determinante antigénico (T. pallidum)
R2: hematies NO sensibilizados. NO tienen determinante antigénico. (C-)
R3: diluyente (buffer o suero fisiológico) Homogeneizar
M: suero problema. ¿Tiene Ac frente al determinante antigènico? los reactivos
2n) Dispensar 10 μl de 1º) Dispensar 190 μl de diluyente antes de su
suero problema en el en el primer pocillo uso (R1, R2)
primer pocillo i
homogeneizar 4t) Añadir 75 μl de R2 (hematies sin
Ag) al segundo pocillo
Muestra: suero
problema
5è) Añadir 75 μl de R1 (hematies
3r) Trasvasar 25 μl del primer con Ag) al tercer pocillo
Placa de microtitulación pocillo al segundo i otros 25 μl
de fondo redondo del primer pocillo al tercero. 6è) Golpear suavemente la placa
hasta homogeneización completa.
• Primer pocillo: dilución suero 1/20 Cubrir la placa e incubar a
• Segundo pocillo: NO debe aglutinar. Dilución 1/80 = (1/20)*(25/100) temperatura ambiente 45-60 min.
• Tercer pocillo: ensayo del paciente. Aglutinarà si el paciente tiene Ac
anti- T. pallidum en su suero. Dilución 1/80 = (1/20)*(25/100) Prof: Jose Manuel Nicolau
Prof: Jose Manuel Nicolau
Lectura e interpretación
•Primer pocillo: dilució suero 1/20.
•Segundo pocillo: NO debe aglutinar. Control aglutinación inespecífica.

Hematies sin Ag + suero pacient. Dilución suero 1/80 = (1/20)*(25/100).
•Tercer pocillo: ensayo del paciente. Aglutinarà si el paciente téiene Ac anti- T.

pallidum en su suero. Hematies con Ag + suero pacient. Dilución suero 1/80 =
(1/20)*(25/100).
Determinación cuantitativa (si hemos obtenido un resultado positivo en la
R3: diluyente (buffer o suero fisiológico) prueba cualitativa)
R1: hematies sensibilizados con determinante antigénico (T. pallidum)
R2: hematies NO sensibilizados. NO tienen determinante antigénico. (C-)
M: suero problema. ¿Tiene Ac frente al determinante antigènico?
1) Poner 25 μl de diluyente
2) Dispensar 25 μl de
la dilución 1/20 de
suero problema del
primer pocillo de la
prueba cualitativa
3) Trasvasar 25 μl del
5) Dispensar 75 μl de R1 pocillo anterior al posterior.
(hematies sensibilizados) Homogeneizar
4) Descartar 25 μl
6) Golpear suavemente la placa hasta homogeneización (després de
completa. mezclar)
Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente 45-60 min y
realizar la lectura Prof: Jose Manuel Nicolau
Pruebas de Coombs o de la antiglobulina humana
Existen dos variantes de la prueba:
 Prueba de Coombs DIRECTA: detecta Ac ya unidos “in vivo” a
la superficie de los eritrocitos.
 Prueba de Coombs INDIRECTA: detecta Ac que nosotros
debemos unir a la superficie de los eritrocitos en el laboratorio.
Estas pruebas usan el reactivo de Coombs (Ac frente a las Ig

humanas).
Pruebas de Coombs o de Aplicaciones Coombs directa:
la antiglobulina humana  Diagnóstico de anemias
autoinmunes
 Diagnóstico de EHRN en la
La sangre del paciente tiene ya sangre del recién nacido Rh(+)
los Ac pegados en su superficie hijo de una madre Rh(-).
Suero Eritrocitos
con Ac tipados Aplicaciones Coombs indirecta:
 Detectar el Ag Du después de la NO aglutinación en la
prueba del Rh (si estuviese, el paciente seria Rh (+)).
 Detectar Ig anti-D en el suero de una madre Rh (-)
Incubamos en el laboratorio para para evitar EHRN del hijo Rh (+).
que los Ac del suero se peguen a  Detectar Ac irregulares en el suero del receptor de una
la superficie de los hematies transfusión para evitar reacciones transfusionales.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA
Sirve para detectar Ac ya unidos a la superficie de los hematíes, por ejemplo en
anemias autoinmunes o cuando los Ac de la madre han atravesado la placenta y
se han pegado a los eritrocitos del feto.
Muestra: sangre paciente ¿tiene Ac autoinmunes pegados sobre los eritrocitos?

Sangre feto o bebé ¿tiene sobre sus eritrocitos Ac anti-D procedentes de la madre?
1. Preparar una suspensión de hematíes lavados al 3-5% en suero fisiológico. Pasos:
a) Poned aprox 1 ml de sangre en un tubo de centrífuga y completad con suero
fisiológico hasta aprox 5 ml. Homogeneizad suavemente el contenido tapando el
tubo con parafilm. Centrifugar 2 min a 2000 rpm. Quitad con una pipeta Pasteur el
sobrenadante y echadlo a un vaso de precipitados con lejía diluida.
b) Añadid suero fisiológico al tubo hasta la marca de 5 ml y repetid el proceso.
c) Añadid suero fisiológico hasta la marca de 5 ml y repetid el proceso por 3ª vez.
d) Preparamos la suspensión de hematies al 5%. P.ej. 1 ml de suspensión al 5%.
Vi x Ci = Vf x Cf Vi x 100% = 1ml x 5% Vi = 0,05 ml (50 μl)
• Ponemos en un eppendorf 1 ml de suero fisiológico con micropipeta.
• Quitamos 50 μl de SF del eppendorf y los descartamos.
• Cogemos 50 μl del concentrado de hematies y los añadimos al eppendorf.
• Homogeneizamos expulsando y aspirando varias veces el contenido de la
micropipeta. Con el contenido expulsado, sacamos la micropipeta.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (continuación)
2. Poner una gota de la suspensión de hematies en tubo de hemólisis y añadir

una gota de suero de Coombs (anti-Ig humana). Este suero tiene
inmunoglobulinas tipo M que se unirán a los anticuerpos que están pegados a
la superficie del eritrocito, produciendo aglutinación.
4.- Centrifugar el tubo 1 minuto a 2000 rpm.
5.- Golpear suavemente el fondo del tubo para desprender el sedimento y

observad la presencia o ausencia de aglutinación. Si hay aglutinación, la
reacción es positiva.
6.- Todos los tubos negativos se someten a un control de Coombs, que

consiste en añadirles una gota de hematíes sensibilizados con
inmunoglobulina humana (reactivo comercial), y volver a centrifugarlos, con lo
que se producirá aglutinación. Esto indica que el suero de Coombs funciona
bien. Si no se produce aglutinación, se invalida la prueba.
PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA
Sirve para
 Detectar el Ag Du (y por tanto, conocer que el paciente es Rh (+)).
 Detectar Ig anti-D en el suero materno para evitar EHRN del hijo Rh (-).
 Detectar Ac irregulares en el suero de un paciente para evitar reacciones
transfusionales.
Aquí explicaremos la determinación del antígeno Du

En la determinación del Rh sanguíneo, la detección del antígeno Du debe
realizarse siempre que se obtenga una aglutinación negativa con el reactivo
anti-D, ya que la unión del Ac anti-D al antígeno Du de la superficie del eritrocito
NO produce aglutinación.
Muestra
Suspensión al 5% de hematíes lavados del paciente (sangre que NO ha aglutinado
al enfrentarla al Ac anti-D).
Reactivos
-Suero anti-D
-Albúmina bovina al 30% (control -)
-Suero de Coombs (antiglobulina humana)
Determinación del antígeno Du (continuación)
Técnica
a.- Rotulad un tubo con la letra D y otro tubo con las letras CN (control negativo).
b.- Poned en el tubo rotulado como D una gota de suero anti-D. En el otro tubo rotulado
como CN poned una gota de albúmina bovina al 30% (control negativo).
c.- Añadid a cada tubo una gota de suspensión de hematies lavados al 5% (en la
prueba de Coombs directa se explica como se hace esta suspensión).
d.- Homogeneizad e incubad los tubos a 37ºC durante 30 min (en la incubación, el Ac
anti-D se unirá al Ag Du de la membrana del eritrocito).
e.- Centrifugad los dos tubos 1 minuto a 2000 rpm.
f.- Observad si hay aglutinación en alguno de los tubos. Para ello, golpead suavemente
la base del tubo y observad si se resuspende el botón celular. Si NO hay
aglutinación continuaremos con los siguientes pasos.
g.- Lavad los hematíes tres veces con suero fisiológico. Cada lavado consiste en añadir
suero fisiológico, homogeneizar, centrifugar 1 minuto a 2000 rpm y descartar el
sobrenadante (especialmente en el último lavado) en lejía diluida. Esta operación la
realizamos en los dos tubos: en el problema y en el control negativo
Determinación del antígeno Du (continuación)
Técnica
h.- Añadid a cada tubo una gota de antiglobulina humana (suero de Coombs) y
mezclad.
i.- Centrifugad 1 minuto a 2000 rpm.
j.- Resuspended suavemente el botón celular mediante golpecitos suaves en la
base de los tubos para observar si existe aglutinación o no.
Interpretación de resultados
 Si aparece aglutinación en el tubo rotulado D y NO hay aglutinación en el
control negativo: los hematies tienen el Ag Du. El paciente es Rh (+) a todos
los efectos.
 Si el tubo D NO aglutina en ningún paso, significa que es Du negativo. Es
sangre Rh negativa (NO tiene Ag D).
 Si el tubo control aglutina en cualquier paso, la prueba NO es válida.
Existen dos variantes de técnicas de inhibición de la aglutinación:
 Cuando buscamos Ac en la muestra del paciente.
 Cuando buscamos Ag en la muestra del paciente.
Ambas técnicas se componen de 2 pasos:
1º) Una incubación previa del antígeno NO particulado con su
anticuerpo correspondiente. Al reaccionar entre sí, se bloquean
mutuamente y ya no podrán aglutinar con un tercer componente que
hará visible la aglutinación y que se añadirá a continuación.
2º) Añadir partículas que hacen visible la aglutinación y aglutinan con el
Ag o bien con el Ac.
Si se ha producido la reacción en el primer paso, NO se producirá
aglutinación en el segundo.
La inhibición de la aglutinación puede ser una técnica cuantitativa si
se realizan diluciones seriadas.
Si la técnica emplea hematíes como partículas aglutinantes, se
denominará inhibición de la hemaglutinación.
Cuando buscamos Ac en la muestra del paciente
Algunas bacterias y algunos virus (rubeola, gripe…) pueden
aglutinar los hematies. Si el suero del paciente tiene Ac frente a
esas bacterias o virus, los Ac rodearán a esas bacterias o virus
impidiendo que puedan aglutinar los hematies.
Velo en el pocillo.
El paciente no tiene
Muestra
Ac. Resultado (-)
+ + =
Reactivo Suero 2º paso: adición de (-)
sin Ac
hematies (reactivo
1er paso: incubación revelador de la
aglutinación)
Botón en el pocillo.
+ + = El paciente tiene
Ac. Resultado (+)
Reactivo Suero
con Ac
Muestra
Resultado: al revés que la hemaglutinación. (+)

Ejemplo de cuando buscamos Ac en la muestra del paciente
Diagnóstico de la rubéola (virus)
Se realiza en placa de microtitulación con diluciones seriadas del suero
del paciente. Por tanto, es una técnica cuantitativa.
Primer paso: en los pocillos de una fila se realiza una dilución seriada
del suero del paciente y se les añade suspensión de virus de rubéola.
Se incuba.
Segundo paso: a todos los pocillos se añade una suspensión de
eritrocitos (reactivo revelador de la aglutinación).
 Formación de velo: resultado negativo. El virus aglutina los
eritrocitos (no hay Ac anti-rubeola en el suero problema).
 Formación de botón: resultado positivo. Hay Ac anti-rubeola en el
suero problema que rodean a los virus (los virus no podrán aglutinar
los hematíes).
1/2 1/4 1/8
Cuando buscamos Ag en la muestra del paciente
Primer paso: incubación de la muestra con el Ac (reactivo)

Muestra
Reactivo
¿Hay determinante
¿antigénico en la?
muestra problema?
Segundo paso: adición de un reactivo particulado sensibilizado con el

mismo determinante antigénico que se busca en la muestra del paciente
Cuando buscamos Ag en la muestra del paciente
Ejemplo: test de embarazo
Muestra 1er paso:

Muestra
incubación del
antígeno no
Reactivo particulado con Reactivo
su anticuerpo
2º paso: añadir el
2º reactivo Ag particulado 2º reactivo
que aglutina y
hace visible la
aglutinación
APARTADO 4.- TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN
Técnicas en gel:
Doble difusión (Ouchterlony)
Contrainmunoelectroforesis
Inmunodifusión radial (Mancini)
Electroinmunodifusión
Inmunoelectroforesis
En las reacciones de inmunoprecipitación, un Ag soluble (Ag

que NO es particulado) multivalente se une con su Ac específico
(que también es soluble), dando lugar a inmunocomplejos que
precipitan en el medio de la reacción.
4.1- GENERALIDADES TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN
Las técnicas de precipitación se utilizan para determinar

proteinas en el suero o plasma del paciente (Ac, fracciones
del complemento, proteinas de fase aguda u otras proteínas).
Estas proteínas actúan como antígenos. Deberemos tener

como reactivo de laboratorio el Ac específico para cada uno de
esos antígenos.
4. 2.- TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN GEL
El soporte de reacción es un gel de agarosa en el cual hay
excavados unos pocillos.
Los componentes de la reacción (Ag y Ac) se depositarán en los

pocillos, difundirán a través del gel y, en la zona donde se alcance
el punto de equivalencia (concentraciones equiparables de Ag y
Ac), se formarán los inmunocomplejos (que aparecerán como
líneas, arcos o bandas de precipitación).
Ac Ag
Existen diferentes modalidades de precipitación en gel en función
de:
 Si por el gel difunde uno o los dos componentes de la reacción.
 Si la difusión es espontánea o forzada (se aplica un campo
eléctrico).
Técnicas de difusión - Doble difusión

espontánea - Inmunodifusión radial
Técnicas de difusión -Contrainmunoelectroforesis
forzada en campo - Electroinmunodifusión
eléctrico - Inmunoelectroforesis
Doble difusión o reacción de Ouchterlony
Se dispone agarosa al 1% sobre una placa de Petri.
Se excava un pocillo central y varios periféricos.
Normalmente en el pocillo central se sitúa el Ac y en los pocillos
periféricos el Ag (pero también puede ser al revés).
El Ag y el Ac difunden a través del

gel de manera radial. Entre los dos
pocillos (el del Ag y el del Ac) habrá
una zona donde los Ag y los Ac se
encontrarán en su punto de
equivalencia: allí se formará un
precipitado que se verá como una
banda blanca.
Cuanto mayor sea la
concentración de la sustancia
introducida en el pocillo o menor
sea el tamaño molecular del
componente introducido, más lejos
de dicho pocillo se formará la
banda.
Si enfrentamos el Ac (pocillo central) a una
dilución seriada del Ag (dispuesta en los
pocillos periféricos), la distancia a la que se
forman las bandas de precipitación variará en
función de la concentración (dilución) del Ag.
Esto se realiza cuando se quiere cuantificar la
cantidad de Ag; para ello, los resultados
obtenidos con la muestra problema se
comparan con los obtenidos en otra placa con
un patrón de Ag de concentración conocida.
Otra aplicación de la doble difusión en gel es realizar estudios

de identidad entre Ag, es decir, la existencia (o no) de
determinantes antigénicos iguales en Ag distintos.
Para ello pondremos los distintos Ag en los pocillos de la periferia

y, en el pocillo central, un antisuero que pueda reaccionar con
más de un determinante antigénico distinto. Las distintas
posibilidades que se pueden dar son:
 Patrón de identidad total: los Ag

comparten todos los determinantes
antigénicos. Las bandas de
precipitación se fusionan dando una
única línea contínua.
 Patrón de NO identidad: los Ag

situados en pocillos distintos NO
tienen ningún determinante
antigénico común. Las líneas de
precipitación se cruzan.
 Patrón de identidad parcial: los Ag

de pocillos distintos tienen algunos
determinantes iguales y otros
diferentes. En la zona de intersección
de las bandas, aparece un espolón que
siempre se dirige hacia el pocillo que
tiene el Ag con menos epítopos que
reaccionan con los Ac.
Contrainmunoelectroforesis
Es una doble difusión forzada porque se aplica un campo
eléctrico. Es una técnica cualitativa.
El campo eléctrico disminuye el tiempo de incubación y aumenta

la sensibilidad: todos los componentes de un pocillo migran hacia
el pocillo donde está el componente complementario.
carga (+) carga (-)
El gel debe tener un pH tal que el Ac
adquiera carga (+) y el Ag carga (-).
Al aplicar un voltaje a través del gel,
el Ac (carga (+)) se moverá hacia el
cátodo y el Ag hacia el ánodo (carga
(-)).
En el punto de equivalencia se
forman los inmunocomplejos y las
líneas de precipitación. Ánodo Cátodo
Inmunodifusión radial o técnica de Mancini
El suero o plasma con el Ag a determinar se introduce en los
pocillos y difundirá por el gel que lleva incorporado e inmovilizado
el Ac frente a este antígeno.
La difusión del Ag ocurre desde el pocillo en todas direcciones,

encontrándose con su Ac complementario incorporado al gel
formándose, por tanto, complejos Ag-Ac que originarán un anillo
de precipitación alrededor del pocillo.
El diámetro del anillo
de precipitación es
proporcional a la
concentración del Ac en
el gel
componente que
Anillo de
difunde por el gel.
precipitación Ag
incorporado
Técnica cuantitativa. al pocillo
Esta técnica es muy útil para cuantificar fracciones plasmáticas de
proteínas (p. ej. inmunoglobulinas, factores de coagulación,
componentes del complemento, proteinas plasmáticas...). Por tanto, la
muestra biológica que introducimos en el pocillo es plasma o suero.
P. ej. queremos determinar la concentración de fibrinógeno en un suero.

El kit comercial incluye:
Una placa de agar con el Ac anti-fibrinógeno incorporado al gel.
 Una tabla que informa de la concentración del Ag en la muestra
problema en función del diámetro del precipitado obtenido.
Se dispensan las muestras problema en los pocillos. Para ello se pone la

pipeta totalmente en vertical y, tocando el fondo del pocillo, se descarga
su contenido apretando hasta el primer tope. Transcurrido el tiempo
de incubación, se miden los diámetros obtenidos.
Observar en la tabla, en función del diámetro obtenido, qué

concentración de Ag tiene la muestra problema.
También hay tablas para IgG, IgA, IgM, C3c, C4, Transferrina,
Albumina, ApoA1, Cadena k, Cadena λ...
6. Si el diámetro del anillo es mayor que el recogido en las tablas, se

deberá diluir la muestra (y tener en cuenta la dilución para calcular
la concentración de plasmaproteina en el paciente).
También existen placas divididas en

secciones que permiten realizar
determinaciones diferentes en la misma
placa (por ejemplo de IgG, IgA e IgM).
Electroinmunodifusión o electroforesis en cohete (rocket)
Inmunodifusión radial forzada por aplicación de corriente
eléctrica. Técnica cuantitativa más rápida y sensible que la IDR.
Ag: se introduce en los pocillos (muestra).
Ac: está incorporado al gel.
pH del gel: punto isoeléctrico de los Ac (tendrán carga neta 0).
Al realizar la electroforesis los Ac no migran, pero sí los Ag.

Se forman precipitados en forma de cohete, cuya altura será
proporcional a la concentración de Ag en el pocillo.
Los valores problema se determinan por interpolación en una
curva patrón.
Inmunoelectroforesis
Las distintas proteinas (Ag) presentes en una muestra (generalmente
suero) se separan mediante electroforesis (aplicando una corriente
eléctrica). En este caso las proteinas buscadas son la IgM, IgG y la IgA.
Luego se realiza una difusión libre en gel tanto de las fracciones
antigénicas obtenidas como de una mezcla de Ac frente a los Ag
buscados situada en un surco lateral.
Agarosa en
Resultado: bandas de precipitación en soporte de
cristal o de
pocillo
forma de arco. Cada banda es plástico
específica para cada una de las Punto isoeléctrico de los distintos Ag

proteinas (fracciones antigénicas Medio pH
determinado
obtenidas).
Antisuero con anti-IgA, anti-IgM y anti IgG
El resultado obtenido se compara con Surco lateral

unas bandas patrón para identificar las
Antisuero con anti-IgA, anti-IgM y anti IgG
bandas problema.
Patrón
Una variante de la inmunoelectroforesis es la inmunofijación. Se utiliza para
gammapatias monoclonales (p.ej. mieloma múltiple, que es la producción
excesiva de una Ig con un tipo concreto de cadena pesada y de cadena ligera.
Ponemos suero problema en tantos carriles como tipos de cadenas distintas
queremos investigar, y los sometemos a electroforesis.
A continuación, cada carril se recubre con el Ac específico de un tipo de
cadena concreta. P. ej. si investigamos las cadenas pesadas γ, α y μ (IgG, IgA
e IgM) y las cadenas ligeras κ y λ; recubriremos con anti-IgG, anti-IgA, anti-
IgM, anti- κ y anti- λ, cada carril respectivamente.
Si el Ac reconoce a su cadena correspondiente, se formará un precipitado.

Lavaremos para eliminar las cadenas y Ac que no han formado el
inmunocomplejo (precipitado) y teñiremos para visualizar las cadenas que sí
han formado el inmunocomplejo (precipitado).
En el dibujo, el paciente
produce en exceso IgA λ.
Estas técnicas miden la cantidad de inmunocomplejos que han
aglutinado o bien han precipitado en un medio líquido mediante:
Inmunoturbidimetría
Compara la intensidad del rayo de luz
monocromática emergente con la del
rayo incidente. Existe una relación
proporcional entre la concentración del
inmunocomplejo formado y la
absorbancia medida por el
espectrofotómetro a una λ determinada.
Inmunonefelometría
Esta técnica es más recomendable cuando la muestra contiene
pequeñas concentraciones de partículas solubles. Esta técnica
utiliza un láser (luz monocromática) y en la solución se añade
polietilenglicol para aumentar el tamaño del agregado.
Los complejos Ag-Ac formados se cuantifican midiendo la cantidad
de luz dispersada que producen.
Tipos de determinaciones:
Determinaciones a punto final
Antes de medir la cantidad de luz absorbida (turbidimetria) o
dispersada (nefelometria) por la muestra, se deja transcurrir el
tiempo necesario para que se formen los inmunocomplejos. Para la
medición se debe restar el valor obtenido de un blanco preparado
solamente a base de reactivos.
La concentración del Ag presente en la muestra se determina

interpolando el valor obtenido en el espectrofotómetro o nefelómetro
en una curva de calibrado que ha sido trazada a partir de varias
diluciones de un patrón del Ag cuya concentración es conocida.
Determinaciones cinéticas
Calcula la velocidad con la que se forman los inmunocomplejos.
A mayor velocidad, mayor cantidad de Ag presente en la muestra.
Estas determinaciones no necesitan blanco de reactivos ni patrones.

UD2 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN y PRECIPITACIÓN

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TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES AG-AC

LAS TÉCNICAS SECUNDARIAS

Reacciones de aglutinación: el Ag es una partícula grande y

Reacciones de precipitación: los Ag y Ac son solubles. El Ag

Fijación del complemento: técnica en la que interviene el

2. GENERALIDADES TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Y

aglutinación. Prozona Postzona

Las reacciones de aglutinación tienen un alto grado de

3.1.- GENERALIDADES TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN

3. 2.- AGLUTINACIÓN DIRECTA

3. 3.- AGLUTINACIÓN INDIRECTA

3.4. INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN

La aglutinación ocurre entre partículas en suspensión. Cada

Ag multivalente: tiene varios

La IgG es una aglutinina incompleta. A IgG

 Aumentando la viscosidad del medio añadiendo albúmina

 Eliminando los residuos negativos de ácido siálico de la

 Disminuyendo la fuerza iónica del medio trabajando con LISS

 Cualitativas: la aglutinación se produce o no se produce. Si se

 Cuantitativas: se deben efectuar diluciones seriadas del

TÍTULO: inversa de la máxima dilución de Ac que aún

Concentración o tasa del Ac =

El determinante antigénico forma parte (de forma natural) de una

Se trata de bacterias, protozoos, esporas o hematíes que

(debe aglutinar siempre)

Se aplica para el tipaje de la

Los Ac del sistema AB0 son

Determinación del determinante antigénico del sistema AB0.

2º) 1 gota sangre homogeneizada. La punta de la pipeta con la que

La sangre del grupo A puede ser A1 ó A2. Existen reactivos con

La sangre del grupo A puede ser A1 ó A2. Existen reactivos con

Determinación del determinante antigénico (Ag D) del

Persona Rh (-) NO tiene Ag D Tendrá anticuerpos anti-D si ha

Los Ac del sistema Rh y del resto de sistemas sanguíneos (a

D A 3º) Mezclar con palillos distintos las dos

2º) 1 gota sangre homogeneizada. La punta de la pipeta con que ponemos la

Sensibilización: cuando la superficie

1 gota 1 gota 1 gota Método cualitativo

•Primer pocillo: dilució suero 1/20.

•Segundo pocillo: NO debe aglutinar. Control aglutinación inespecífica.

•Tercer pocillo: ensayo del paciente. Aglutinarà si el paciente téiene Ac anti- T.

Estas pruebas usan el reactivo de Coombs (Ac frente a las Ig

Muestra: sangre paciente ¿tiene Ac autoinmunes pegados sobre los eritrocitos?

2. Poner una gota de la suspensión de hematies en tubo de hemólisis y añadir

4.- Centrifugar el tubo 1 minuto a 2000 rpm.

5.- Golpear suavemente el fondo del tubo para desprender el sedimento y

6.- Todos los tubos negativos se someten a un control de Coombs, que

Aquí explicaremos la determinación del antígeno Du

Resultado: al revés que la hemaglutinación. (+)

Primer paso: incubación de la muestra con el Ac (reactivo)

Segundo paso: adición de un reactivo particulado sensibilizado con el

Muestra 1er paso:

En las reacciones de inmunoprecipitación, un Ag soluble (Ag

Las técnicas de precipitación se utilizan para determinar

Estas proteínas actúan como antígenos. Deberemos tener

Los componentes de la reacción (Ag y Ac) se depositarán en los

Técnicas de difusión - Doble difusión

El Ag y el Ac difunden a través del

Otra aplicación de la doble difusión en gel es realizar estudios

Para ello pondremos los distintos Ag en los pocillos de la periferia

 Patrón de identidad total: los Ag

 Patrón de NO identidad: los Ag