INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

AGUASCALIENTES
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

Docente:
Dra. Florianne Castillo Borja

Alumnos:
Paulina Cruz Ferreira / 21150051
Adriana Lizbeth De león Ruvalcaba / 21150524
José Luis López Martínez / 21150476
Angélica Teresa Rivera Vega / 20150675
Luis Manuel Martínez Cazares / 21150619

Materia:
Taller de investigación II

Proyecto:
“Aumento de la producción de maíz utilizando
Bacillus Subtilis como biofertilizante”

Actividad:
Nueva revisión del protocolo

Grupo: IQ2

Fecha de entrega: 12/02/2024

I.- Objetivos Generales

El objetivo principal de este proyecto es investigar y desarrollar estrategias efectivas

para aumentar la producción de maíz utilizando el Bacillus Subtilis como
biofertilizante, con el fin de mejorar la productividad agrícola de manera sostenible y
respetuosa con el medio ambiente.

II.- Objetivos Específicos

 Evaluar el efecto del Bacillus Subtilis en la germinación y el crecimiento inicial

de las plántulas de maíz en condiciones de laboratorio y vivero.
 Determinar el impacto del Bacillus Subtilis en la salud y desarrollo de las raíces
del maíz, así como en la absorción de nutrientes esenciales del suelo.
 Investigar la capacidad del Bacillus Subtilis para promover la resistencia de las
plantas de maíz a enfermedades comunes y a factores de estrés abiótico,
como la sequía y salinidad.
 Optimizar las condiciones de aplicación del Bacillus Subtilis, incluyendo dosis,
momento y métodos de aplicación, para maximizar su eficacia en la promoción
del crecimiento y rendimiento del maíz.
 Evaluar el impacto ambiental de la aplicación del Bacillus Subtilis en términos
de su persistencia en el suelo, potencial de lixiviación y efectos sobre la
microbiota del suelo.
 Realizar análisis económicos para determinar la viabilidad y rentabilidad de la
aplicación de Bacillus Subtilis como biofertilizante en sistemas de producción
de maíz a gran escala.
 Diseñar recomendaciones prácticas y guías para agricultores sobre el uso
óptimo de Bacillus Subtilis como parte de un enfoque integrado para aumentar
la producción de maíz de manera sostenible y rentable.
III.- Justificación

La producción de alimentos en los últimos años se ha visto afectada de una forma

abismal, pues se pretende en la industria ganadera agrandar la producción de
alimentos a precio accesible al público es por eso que nuestro proyecto es ayudar al
crecimiento de cultivos de una forma orgánica y sin dañar a la madre naturaleza. Las
bacterias que promueven el crecimiento de los vegetales de los cultivos son varios
microorganismos que ayudan al favorecimiento de las plantas, en los últimos años se
está utilizando fertilizantes más amigables con el medio ambiente la fuente de
obtención de algunas de estas bacterias es el suelo, en la rizosfera, evaluaremos la
respuesta de la aplicación de esta bacteria en el cultivo de maíz, pues las especies
del género Bacillus poseen características especiales que los hacen buenos
candidatos como agentes de control biológico. Su utilización para el biocontrol de las
enfermedades de las plantas es de gran interés, debido a la capacidad que presentan
estas bacterias para producir sustancias con capacidad antibacteriana y antifúngica
impidiendo el establecimiento de patógenos vegetales. Entre las especies más
utilizadas con este propósito se encuentran B. subtilis, B. cereus, B. pumillas y B.
polymyxa.

Por lo tanto, este proyecto se justifica por los siguientes motivos:

1. Contribución a la seguridad alimentaria: Aumentar la producción de maíz

mediante el uso de Bacillus Subtilis puede ayudar a garantizar un suministro
suficiente de alimentos para una población en constante crecimiento.

2. Sostenibilidad agrícola: El uso de biofertilizantes como el Bacillus Subtilis

puede reducir la dependencia de los fertilizantes químicos y pesticidas,
minimizando así el impacto negativo sobre el suelo, el agua y la biodiversidad.

3. Resiliencia de los cultivos: Fortalecer la resistencia de las plantas de maíz

frente a enfermedades y condiciones ambientales adversas puede ayudar a
mitigar los riesgos asociados con el cambio climático y otros factores de estrés.

4. Reducción de costos para los agricultores: La implementación de prácticas

agrícolas más eficientes y sostenibles puede contribuir a reducir los costos de
producción y mejorar la rentabilidad de los agricultores.
IV.- Planteamiento

Los fertilizantes son sustancias ricas en nutrientes que se utilizan para mejorar las
características del suelo para un mayor desarrollo de los cultivos agrícolas.
Debido a la globalización y al aumento de la población global, el uso de fertilizantes
ha ido en aumento lo cual ha causado el aumento de compuestos nitrogenados
artificiales en el agua, suelo y el aire causando problemas de salud y contribuyendo
al cambio climático ya que muchos de estos liberan óxido nitroso el cual es un potente
gas de efecto invernadero.
A su vez, la UNEP señala que la sobreabundancia de nitrógeno en el medio ambiente
es uno de los problemas medioambientales más graves a los que nos enfrentamos
en la actualidad.
En toda la cadena de valor, 80% del nitrógeno se desperdicia y se pierde en el medio
ambiente, según un estudio del Centro de Ecología e Hidrología del Reino Unido.
Los biofertilizantes son fertilizantes orgánicos que proporcionan a las plantas los
nutrientes necesarios para su desarrollo, al mismo tiempo mejoran la calidad del suelo
y ayudan a conseguir un entorno microbiológico óptimo y natural.
El maíz es uno de los cultivos más importantes desde todos los puntos de vista ya
sea económico y productivo en los últimos años hemos podido ver qué es uno de los
más importante a experimentar para incorporar tecnología en su producción.
La fuente de obtención de estas bacterias es el suelo y, específicamente, la rizosfera;
pero pueden tener otros orígenes.
En la producción del maíz se requieren varios fertilizantes químicos, es importante
que destaquemos que se utilizan cantidades grandes para que los productos tenga
una forma más grande y vendible pero en este procesos de agradación, una de las
enfermedades que resalta es el marchitamiento vascular causado por Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici, este marchitamiento vascular es en gran medida una
potencial amenaza para las industrias ganaderas, bacillus subtilis, es un potencial
benefactor como un inoculante microbiano para la detención del marchitamiento por
eso se en este trabajo se planteó como objetivos principal determinar la capacidad
promotora de crecimiento vegetal de B. subtilis cepas Mza01 y cepas Lvpa en el
cultivo de tomate variedad Floradade, separar y evaluar fracciones peptídicas de
extractos libres de células (ELC) de B. subtilis cepa Mza01 sobre la germinación de
esporas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
El interés creciente de generar alimentos de buena calidad para satisfacer las
necesidades de los seres vivos y responder de manera eficiente al objetivo número
dos planteado por las Naciones Unidas, para este milenio “poner fin al hambre, lograr
la seguridad alimentaria y la mejora de la nutrición y promover la agricultura
sostenible”, genera la necesidad de aplicar estrategias amigables y sostenibles que
mejoren la productividad del suelo y la obtención de productos en óptimas
condiciones.
La importancia de los biofertilizantes en la industria agrícola se sustenta también en
que son una opción amigable para el suelo, ya que el uso excesivo de las tierras
fértiles para cultivo y el manejo indiscriminado de fertilizantes químicos desgasta este
recurso, y en este caso, los biofertilizantes contribuyen a mitigar el problema de
deterioro y/o contaminación ambiental.
En este proyecto se busca aprovechar este organismo para la producción de un
sustrato el cual favorezca el crecimiento de los cultivos de maíz.
V.- Antecedentes

En la siguiente tabla se muestran los antecedentes encontrados:

Título Autor Resumen Año

Bacillus subtilis: María Magdalena En esta tesis se

Producción de Ramos evaluó el potencial
fracciones Hernández. efecto promotor
pépticas de crecimiento de 2011
antimicrobianas y la bacteria B.
promoción de subtilis cepa
crecimiento PLV01 Y Mza01
vegetal de tomate. en la planta del
tomate.

Potencial Ángel Mena En esta tesis se

biotecnológico de García evaluó el potencial
bacterias de la biotecnológico de
rizosfera de maíz las bacterias
y asociadas a presentes en la 2020
Melipona rizosfera del maíz
beecheii. y en las abejas sin
aguijón (Melipona
beecheii) en la
formulación de un
fertilizante natural.

Bacillus spp: una

alternativa para la María Angélica En esta
promoción vegetal Gómez Méndez, investigación se
por dos caminos Sonia Julieth evaluó el uso de
enzimáticos Ramos Rojas, la bacteria
Jessica Natalia Bacillus spp para 2017
Rodríguez Torres promover el
crecimiento
vegetal a través
de la
solubilización de
fosforo.
VI.- Marco teórico

Un biofertilizante o inoculante bacteriano es un concentrado de bacterias benéficas

para las plantas, constituido de uno, dos o más organismos (de una sola cepa, especie
o multiespecífico), con facilidad de uso, indicado para aplicar durante la siembra o el
trasplante, dosificado en un soporte económico (orgánico, inorgánico o sintético), que
se aplica directamente al suelo o a la semilla, y mejora el desarrollo del cultivo. Se
entiende por rizósfera el volumen de suelo influenciado por la presencia de raíces de
una planta viva, cuya extensión puede variar de acuerdo al tipo de suelo, la especie
de planta, su edad y otros factores. Se denominan rizobacterias a aquellas cepas
bacterianas del suelo capaces de colonizar las raíces y entorno rizosférico y
constituyen por ello, uno de los grupos microbianos más importantes de los suelos.
Estas bacterias forman relaciones simbióticas o beneficiosas con las plantas,
ayudando en su crecimiento y salud. Hay varios tipos de rizobacterias, y algunas de
ellas pueden fijar nitrógeno atmosférico, lo que significa que convierten el nitrógeno
del aire en una forma que las plantas pueden utilizar para su crecimiento. Además de
la fijación de nitrógeno, las rizobacterias pueden también ayudar en la solubilización
de nutrientes del suelo y en la protección de las plantas contra patógenos. Estas
bacterias son de gran importancia en la agricultura sostenible, ya que pueden reducir
la necesidad de fertilizantes químicos y pesticidas. Se atribuye a estas rizobacterias
muchos procesos importantes de los ecosistemas, como control biológico de
patógenos de plantas, ciclos de nutrientes y establecimiento de semillas.

Se pueden definir dos posibles mecanismos de estimulación del crecimiento de las

PGPRs:

 Mecanismos de acción directa:

Totalmente independientes de la población microbiana edáfica y del soporte
edáfico; A este grupo pertenecen aquellos metabolitos producidos por la
bacteria capaces de estimular el crecimiento vegetal.
 Mecanismos indirectos:
Cuando la estimulación del crecimiento es indirecta, la bacteria libera algún
metabolito, que, a su vez, afecta a otros factores rizosféricos que revierten en
una mejora o estimulación del crecimiento de la planta.

El maíz, científicamente conocido como Zea mays, es una planta herbácea anual de
la familia de las gramíneas (Poaceae). Es una de las plantas cultivadas más
importantes y ampliamente distribuidas en el mundo, Es considerado el cereal y la
planta más distribuida en el mundo, posee la facilidad de encontrarse en varios
ambientes por la capacidad de adaptación adquirida durante su evolución y en el
proceso de domesticación. Las regiones geográficas que abarca su presencia alcanza
altitudes de 3800 metros y zonas donde la precipitación anual es de 400 mm hasta
1500 mm. El maíz es una planta herbácea que puede alcanzar alturas que oscilan
entre 1 y 3 metros, aunque hay variedades que pueden ser más altas. Tiene un tallo
erecto, cilíndrico y hueco, con nudos en intervalos regulares donde se unen las hojas.
Las hojas del maíz son alternas, lanceoladas y largas, con una vaina que envuelve
parcialmente el tallo. Tienen una venación paralela y un margen aserrado. La
inflorescencia del maíz se denomina espiga. Esta se encuentra en la parte superior
de la planta y está rodeada por varias hojas modificadas conocidas como brácteas.
La espiga está compuesta por muchas flores, cada una de las cuales dará lugar a un
grano de maíz. Las flores del maíz son diminutas y están dispuestas en grupos
llamados inflorescencias. Cada flor consta de una espiguilla que contiene estambres
y estigmas, siendo esta estructura la que eventualmente se convierte en un grano de
maíz. Los granos de maíz, también conocidos como semillas o mazorcas, son el
producto más valioso de la planta. Cada mazorca puede contener entre 200 y 600
granos dispuestos en hileras sobre una espiga central. Los granos de maíz son ricos
en almidón, proteínas, lípidos y otros nutrientes.
El sistema de raíces del maíz es fibroso y se extiende ampliamente en el suelo, lo que
le permite absorber agua y nutrientes de manera eficiente. Además, algunas
variedades de maíz pueden formar una asociación simbiótica con hongos micorrízicos
que aumentan la absorción de nutrientes.
Existen muchas variedades de maíz adaptadas a diferentes condiciones climáticas y
de suelo. Estas variedades pueden clasificarse según su uso principal, como maíz
dulce (consumo humano), maíz para forraje (alimentación animal), maíz para harina
(producción de harina y productos derivados) y maíz de tipo popcorn (para hacer
palomitas).
VII.- Metodología

Bacterias con ACC desaminasa.

 Se utilizará la metodología descrita por Penrose y Glick (2003), la cual tiene

como objetivo aislar bacterias capaces de utilizar el ACC como fuente de
nitrógeno.
 Para el crecimiento de las bacterias se utilizarán frascos de vidrio de 250 mL.
Se agrega 1 g de suelo rizosférico en frascos con 50 mL de medio de cultivo
líquido Pseudomonas Agar F (PAF) y se incuban a 28°C durante 24 h a 200
rpm. Transcurrido el tiempo de incubación, se toma una alícuota de 1 mL y se
adiciona a 50 mL de medio PAF líquido, se incubará a las mismas
condiciones que el primero.
 Del crecimiento obtenido se transfiere 1 mL a 50 mL de medio de cultivo
líquido mínimo y se incuba de la misma forma. Posterior a las 24 h, 1 mL se
transfiere a 50 mL de medio mínimo líquido que contenía 3.0 mM de ACC en
lugar de (NH4)2SO4 como suministro de nitrógeno y se mantendrá a 28°C
durante 24 h a 200 rpm (el ACC se esteriliza por filtración y se adiciona una
vez tibio el medio de cultivo).
 Las cepas crecidas en esta última incubación a medio líquido se considerarán
como ACC positivas.
 Para conseguir colonias aisladas se realizan diluciones seriadas y extensión
en placa. 100 µL de la dilución 10-4 a 10-6 se siembran en placas con medio
mínimo con 3 mM de ACC solidificado con agar.
 Se incubarán durante 4 d a 28 °C y se purificarán las colonias. Las cepas
ACC positivas se someterán a las pruebas de solubilización de fosfatos,
producción de indoles y sideróforos.

Bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

 El aislamiento se realiza por el método de diluciones seriadas y extensión en

placa. La dilución 10-2 a 10-4 se sembraron por triplicado en medio de cultivo
“nitrogen fixing bacteria” (NFB) con rojo congo y se incuban durante 4 días a
28°C.
 Las cepas que absorbieron el colorante se purificaron y se someten a la
prueba de solubilización de fosfatos, producción de indoles y sideróforos.

Bacterias productoras de índoles (ensayo cualitativo)

  Se sembrará 100 µL de la dilución 10-3 a 10-5 en placas Petri con medio de
cultivo Luria- Bentanni (LB) sólido y se incubarán a 28°C durante 3 d. Las
cepas se purifican en medio de cultivo LB sólido. Para determinar las
bacterias que producen índoles (AIA), las cepas se siembran en tubos de
polipropileno de 15 mL con 10 mL medio de cultivo LB líquido suplementado
con 1 g L- 1 de triptófano, se incuban por 48 h a 28 °C a 160 rpm.
 Después del periodo de incubación los tubos se centrifugan a 7000 rpm por
10 minutos y una alícuota de 200 µL se colocan en pozos de microplaca y se
les adiciona 100 µL de reactivo de Salkowski (2% 0.5 M FeCl3 en 35% de
ácido perclórico).
 Las muestras con coloración rosa se determinaron como positivas para la
producción de AIA y se evalúan para su cuantificación y para ensayar su
capacidad de solubilizar fosfatos y producir sideróforos.

Aislamiento por extensión en placa

 100 µL de la dilución 10-3 a 10-5 se siembran en medio de cultivo Pikovskaya

(Pikovskaya, 1948) e incuban por 7 d a 28°C. Las bacterias que formaron
halo alrededor de la colonia se seleccionan y purifican por su capacidad de
solubilización de fosfato, además, se someten al ensayo de producción de
índoles y sideróforos.

Ensayo cualitativo de producción de sideróforos

 Se utiliza el medio cromo azurol S (CAS) descrito por Louden et al. (2011).
Las bacterias se siembran en tubos cónicos de polipropileno de 50 mL, con
25 mL caldo nutritivo y se incuban a 28°C por 24 h. Los tubos se
centrifugaron a 7,000 rpm durante 15 min. Se desecha el sobrenadante y se
adiciona agua bidestilada estéril, se agita en vórtex y se centrifuga a 7000
rpm por 15 min. Este procedimiento se repite 3 veces para eliminar residuos
de elementos del medio de cultivo. Ya realizados los lavados, se siembra una
alícuota de 6 µL en medio CAS. La formación de un halo amarillo alrededor
de la colonia indica la captura de hierro como consecuente de la presencia de
los quelantes.
VIII.- Bibliografía

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