Departament de Química

Industrial
IES Josep Maria Llompart
Mòdul: ANIN

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CFGS Laboratorio de análisis y control de calidad

Análisis instrumental

Práctica 3: Separación de pigmentos naturales por cromatrografía en columna

Alumno: Rubén Guardia Arco

Curso: 2o CFGS

Profesor: Sabrina Clavijo Roa

Fecha: 7/12/23

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1- INTRODUCCIÓN

La Cromatografía es una técnica de separación en la que los componentes de una muestra se separan en
dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil. El objetivo de la fase
estacionaria es retrasar el paso de los componentes de la muestra.
Cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes velocidades, estos se separan en
determinados tiempos.
Cada componente tiene un tiempo de paso característico a través del sistema, llamado tiempo de
retención. La separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención del analito difiere del
resto de componentes de la muestra.
La cromatografía puede ser preparativa y analítica.
La cromatografía preparativa: se refiere a la separación de los componentes de una mezcla para su
posterior procesamiento, y se puede considerar un método de purificación.
En la cromatografía analítica: generalmente se hace con una pequeña muestra permitiendo
cuantificar la proporción relativa de los componentes en la mezcla.
La cromatografía es uno de los principales métodos analíticos y permite la separación y cuantificación
de sustancias muy similares en estructura y propiedades químicas.1
Los pigmentos son moléculas que producen color. Estos pueden ser encontrados en varios organismos
que tienen células especializadas llamadas cromatóforos.
En el caso de los vegetales, los pigmentos pueden localizarse en diferentes órganos celulares llamados
plástidos. Estas moléculas pueden absorber ciertas cantidades de onda y reflejar otras dependiendo de
su estructura química.
Existen varios tipos de pigmentos vegetales que pueden ser encontrados en la clorofila de las células de
estas. Cada una de ellas contiene un color en específico y estas también absorben cierta cantidad que
les da el color. Como en el caso de la xantofila, clorofila A, clorofila B y caroteno.
Caroteno: Es el pigmento que da la coloración amarilla clara. Estos ceden la energía captada a la
clorofila. Son moléculas de fotoprotección.
Xantofilas: Es el pigmento que da la coloración amarillenta como en el caso de las hojas secas. Estas
son compuestos que presentan características fotosintéticas y son más resistentes a la oxidación.
Clorofila-A: Es el pigmento que da la coloración verde intensa como en el caso de las plantas. Se
encuentran en los cloroplastos y estas presentan características fotosintéticas.

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Clorofila-B: Es el pigmento que da la coloración verde que caracteriza a los plastos de las algas verdes
y sus predecesores terrenales. Todos los organismos que
contienen estos plastos son verdes.2

2- OBJETIVOS

Separar los diferentes pigmentos presentes en una muestra de espinacas mediante una cromatografía
en columna.

Determinar por el espectrofotómetro si los pigmentos eluidos coinciden con los esperados según
bibliografía.

3- MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Equipos

- Balanza de precisión FS-120 +- 0,00001

- Espectrofotómetro ZUZI modelo 4211/20 +- 0,001
- Bomba de vacío

Materiales

- Soporte de vidrio para columna cromatográfica

- Vasos de precipitado de 50,100 y 250 mL
- Pipetas
- Parafilm
- Mortero
- Pistilo
- Embudo de porcelana
- Kitasato
- Manguera
- Papel de filtro
- Espinacas

Reactivos

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- Éter de petróleo 8032-32-4

- Diclorometano (CH2Cl2) 75-09-2
- Metanol (CH3OH) 67-56-1
- Etanol (C2H5OH) 64-17-5
- Cloroformo (CHCl3) 67-66-3
- Agua destilada (H2O) 7732-18-5
- Acetona (C3H6O) 67-64-1
- Sulfato de sodio (Na2SO4) 7757-82-6

4- RIESGOS

Riesgo de corte derivado del uso de material de vidrio, comprobar siempre el estado del mismo antes
de comenzar la práctica y hacer un buen uso.

Riesgo eléctrico derivado del uso de equipos electrónicos, comprobar el cableado antes de usar el equipo
y no manipular zonas que puedan conducir la corriente.

Riesgos del éter de petróleo

Inflamable

Tóxico

Mutagénico

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Peligroso para el medio ambiente

Frases HP: H225 - Líquido y vapores muy inflamables. H304 - Puede ser mortal en caso de ingestión y
penetración en las vías respiratorias. H315 - Provoca irritación cutánea. H361 - Se sospecha que puede
perjudicar la fertilidad o dañar el feto. H373 - Puede provocar daños en los órganos tras exposiciones
prolongadas o repetidas. H411 - Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.
H336 - Puede provocar somnolencia o vértigo.

P210 - Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies calientes. — No fumar.
P261 - Evitar respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los vapores/el aerosol. P273 - Evitar su
liberación al medio ambiente. P281 - Utilizar el equipo de protección individual obligatorio. P301+P310
- EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACIÓN
TOXICOLÓGICA o a un médico. P331 - NO provocar el vómito. 3

Riesgos del diclorometano

Tóxico

Mutagénico

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Frases HP: H315 - Provoca irritación cutánea. H319 - Provoca irritación ocular grave. H336 - Puede
provocar somnolencia o vértigo. H351 - Se sospecha que provoca cáncer.

P201 - Solicitar instrucciones especiales antes del uso. P202 - No manipular la sustancia antes de haber
leído y comprendido todas las instrucciones de seguridad. P261 - Evitar respirar el polvo/el humo/el
gas/la niebla/los vapores/el aerosol. P264 - Lavarse las manos, los antebrazos y la cara
concienzudamente tras la manipulación. P271 - Utilizar únicamente en exteriores o en un lugar bien
ventilado. P280 - Llevar guantes/ropa de protección/equipo de protección para los ojos/la cara/los oídos.
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Riesgos del metanol

Toxicidad aguda

Mutagénico

Inflamable

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Frases HP: H225 - Líquido y vapores muy inflamables. H331 - Tóxico en caso de inhalación. H311 -
Tóxico en contacto con la piel. H301 - Tóxico en caso de ingestión. H370 - Provoca daños en los
órganos.

P210 - Mantener alejado del calor, de superficies calientes, de chispas, de llamas abiertas y de cualquier
otra fuente de ignición. No fumar. P233 - Mantener el recipiente herméticamente cerrado. P240 - Toma
de tierra y enlace equipotencial del recipiente y del equipo receptor. P241 - Utilizar material eléctrico/de
ventilación/iluminación antideflagrante. P260 - No respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los
vapores/el aerosol. P264 - Lavarse las manos, los antebrazos y la cara concienzudamente tras la
manipulación. 5

Riesgos del etanol:

Inflamable

Tóxico

H225 - Líquido y vapores muy inflamables. H319 - Provoca irritación ocular grave.

P101 - Si se necesita consejo médico, tener a mano el envase o la etiqueta. P210 - Mantener alejado de
fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies calientes. — No fumar. P102 - Mantener fuera del

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alcance de los niños. P280 - Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P305+P351+P338 -

EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios
minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. P501 - Eliminar el
contenido/el recipiente en un centro de recogida de residuos peligrosos o especiales, con arreglo a la
normativa local, regional, nacional y/o internacional. 6

Riesgos del cloroformo

Toxicidad aguda

Mutagénico

Frases HP: H351 - Se sospecha que provoca cáncer. H361d - Se sospecha que puede dañar el feto. H331
- Tóxico en caso de inhalación. H302 - Nocivo en caso de ingestión. H372 - Provoca daños en los
órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas. H319 - Provoca irritación ocular grave. H315 -
Provoca irritación cutánea.

P271 - Utilizar únicamente en exteriores o en un lugar bien ventilado. P301+P312 - EN CASO DE

INGESTIÓN: Llamar a un CENTRO DE INFORMACIÓN TOXICOLÓGICA o a un médico si se
encuentra mal. P302+P352 - EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón
abundantes. P304+P340 - EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y
mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. P305+P351+P338 - EN CASO DE
CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las

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lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. P308+P313 - EN CASO DE exposición
manifiesta o presunta: Consultar a un médico.7

Riesgos de la acetona

Inflamable

Tóxico

Frases HP: : H225 - Líquido y vapores muy inflamables. H304 - Puede ser mortal en caso de ingestión
y penetración en las vías respiratorias. H319 - Provoca irritación ocular grave. H336 - Puede provocar
somnolencia o vértigo.

P210 - Mantener alejado del calor, de superficies calientes, de chispas, de llamas abiertas y de cualquier
otra fuente de ignición. No fumar. P233 - Mantener el recipiente herméticamente cerrado. P240 - Toma
de tierra y enlace equipotencial del recipiente y del equipo receptor. P241 - Utilizar material eléctrico/de
ventilación/iluminación antideflagrante. P261 - Evitar respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los
vapores/el aerosol. P264 - Lavarse las manos, los antebrazos y la cara concienzudamente tras la
manipulación. Frases EUH : EUH066 - La exposición repetida puede provocar sequedad o formación
de grietas en la piel. 8

Riesgos del sulfato de sodio

No presenta riesgos a considerar.

5- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparación de la muestra

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Se lavaron aproximadamente 500 gramos de espinacas y se secaron. Se llevaron a un mortero y se

machacaron hasta que se observó una buena pigmentación. Simultáneamente se preparó una disolución
50:50 de acetona y de éter de petróleo de 50 mL en la campana.

Se añadieron aproximadamente 10 mL de la disolución al mortero y se machacó unos 5’.

Se filtró al vacío el contenido del mortero en un kitasato que contenía sulfato de sodio seco.

Preparación y condicionamiento de la columna

Se pesaron 80,14g de alúmina y se introdujeron cuidadosamente en la columna cromatográfica. Una

vez se introdujo toda la alúmina se dieron golpes a la columna con una manguera con el fin de que se
ajustase bien la fase estacionaria y no hubiera espacios vacíos o grietas. Se midió el tamaño de la
columna y su diámetro con una regla. Se calculó su volumen y se introdujo la misma cantidad de la fase
móvil (etanol). Una vez el disolvente pasó a la fase estacionaria se cubrió la columna con arena y se
puso 1 cm aproximadamente de la disolución 50:50 de acetona éter y una vez que paso a la fase móvil
se puso 1 cm de la muestra filtrada.

Separación de los pigmentos

Se introdujo la fase móvil (etanol) y los pigmentos fueron separándose lentamente hasta que empezaron
a eluir, se recogieron en vasos de precipitados junto con los blancos.

Se fue variando la fase móvil para que los compuestos eluyeran, primero se usó acetona y por último
hexano.

Análisis espectrofotométrico

Se midieron las absorbancias de los blancos y de los pigmentos desde longitudes de onda de 350 nm
hasta 700 nm, en intervalos de 25 nm. Cuando se acercara la longitud de onda al pico máximo de
absorbancia la longitud de onda se cambiaba solo 5 nm entre medida.

En base a los resultados obtenidos se representó el cromatograma.

6- CÁLCULOS Y RESULTADOS

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Cálculo del volumen de la columna

Volumen del cilindro = πr2h= 154,09 cm3 = 154,09 mL

Volúmenes recogidos en cada elución

Blanco etanol: 5,5 mL

Blanco acetona hexano: 15,1 mL

Elución 1: 14,5 mL

Elución 2: 12,6 mL

Elución 3: 13,1 mL

Elución 4: 9,5 mL

Absorbancias para los blancos y las eluciones: Hoja 1

https://docs.google.com/spreadsheets/d/19sNTATEs6PbcjdqTdVPQ2ZLtVQoUxCCVyZA2sdY57VU
/edit?usp=sharing

Figura 1: Cromatograma de las eluciones 1,2 y el blanco de etanol de la muestra de espinacas.

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Figura 2: Cromatograma de las eluciones 3,4 y del blanco acetona-hexano de la muestra de espinacas.

Figura 3: Estructura de las clorofilas a y b

7- ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la figura 1 se puede observar como en los componentes que eluyeron en primer y segundo lugar los
dos picos máximos coinciden en la misma longitud de onda. El primer pico máximo de absorbancia se
produce a una longitud de onda de 435 nm y el segundo pico se produce a 675 nm.

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Si se compara con las longitudes de onda de máxima absorción según bibliografía 9 se puede ver que
coinciden los rangos máximos de absorción tanto como para la clorofila a como para la clorofila b.

En la figura 2 se puede observar cómo en los compuestos que eluyeron en tercer y cuarto lugar los picos
máximos de absorbancia coinciden en la misma longitud de onda. El primer pico máximo se produce a
una longitud de onda de 440 nm y el segundo pico se produce a 675 nm.

Se observa como la absorbancia del componente que eluyó en último lugar es menor respecto a las tres
anteriores, si se consulta la bibliografía 9 se observa como la clorofila a y la b presentan el punto máximo
de absorbancia en longitudes de onda muy similares, pero en el caso de la clorofila b la absorbancia es
menor que la de la clorofila a.

En base a los resultados y a la bibliografía se puede determinar que los tres primeros compuestos en
eluir eran los pigmentos con clorofila a y que el último componente en eluir era el pigmento con
clorofila b.

La clorofila a es menos polar que la clorofila b debido a que como se puede observar en la figura 3
presentan casi la misma estructura, pero la clorofila a tienen un radical CH 3 y la clorofila b tiene un
radical CHO que es más polar. 10

En cromatografía en fase normal el primer componente en salir es el menos polar debido a que la fase
estacionaria es polar, entonces el componente con mayor polaridad quedará retenido en la fase
estacionaria. En base a la polaridad de la clorofila a y la clorofila b y de las absorbancias obtenidas y
comparadas con las de bibliografía se puede determinar que los tres primeros eluyentes son los
pigmentos de clorofila a, ya que todos presentan unas absorbancias muy similares y al ser el compuesto
menos polar, eluye antes. De la misma manera se puede determinar que el último componente en eluir
ha sido el pigmento con clorofila b ya que este presenta una absorbancia menor que las otras tres
eluciones y al ser un compuesto más polar que la clorofila a es normal que haya quedado más retenido
en la fase estacionaria.

Al comparar la separación con los otros compañeros (hoja 2 del excel) se puede apreciar que los picos
coinciden exactamente en las mismas longitudes de onda que los analizados en este grupo, por lo que
se puede decir que este método presenta una buena reproducibilidad.

8- CONCLUSIONES

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Se han conseguido separar los diferentes pigmentos presentes en una muestra de espinacas por
cromatografía en columna.

Se ha conseguido determinar por el espectrofotómetro que las absorbancias máximas dadas a una
longitud de onda determinada coinciden con los pigmentos esperados.

9- REFERENCIA

[1] L.V, Aguas Palencia “Informe la cromatografía” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://es.slideshare.net/LesRomero/prctica-2-separacin-de-pigmentos-vegetales-mediante-
cromatografa-en-papel

[2] M.A, Moreno Vidal “Separación de pigmentos vegetales mediante cromatografía en papel”
recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://es.scribd.com/document/481034380/INFORME-LA-CROMATOGRAFIA

[3] Labbox “Ficha de seguridad éter de petróleo” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10367.pdf

[4] Labbox “Ficha de diclorometano” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10175.pdf

[5] Labbox “Ficha de metanol” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10329.pdf

[6] Labbox “Ficha de etanol” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10205.pdf

[7] Labbox “Ficha de cloroformo” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10143.pdf

[8] Labbox “Ficha de acetona” recuperado el 7 de diciembre de 2023 de:

https://esp.labbox.com/wp-content/uploads/FDS/SDS_ES_10018.pdf

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[9] D, Bastidas “Separación y espectro de absorción de pigmentos vegetales” recuperado el 7 de

diciembre de 2023 de:

https://es.slideshare.net/DiegoBastidas10/clorofilas-carotenos-xantofilas-separacin-de-pigmentos

[10] F.D, Torossi Baurino

“Una experiencia sencilla con
fundamentos complejos: la
separación de pigmentos
fotosintéticos mediante
cromatografía sobre papel”
recuperado el 7 de diciembre
de 2023 de:

https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/2510362.pdf

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