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MORFU - MLB
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE VERSION: 1
BIOLOGIA MOLECULAR FECHA: ENERO 2021
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
BIOLOGIA MOLECULAR
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PROCEDIMIENTO PRUEBA COVID-19 Real Time PCR

1. EXTRACCION
VERI-Q PREP - M16
EQUIPO Veri – Q – (16 TU – CV 19)
La extracción de ácidos nucleicos por un soporte de fase solida fase solida por un proceso de cuatro
pasos
- LISIS
- UNION
- LAVADO
- ELUCION
Para disolver los componentes celulares y la mezcla de proteínas en la muestra
A) Preparación de la muestra: (Hisopado, saliva, esputo, lavado broncoalveolar)

VOLUMEN NB NPK NCM IPA

DE LA (Buffer de (Proteinasa K (Carrier (Alcohol
MUESTRA unión) ) Molecular) isopropilico)
200 uL 200 uL 20 uL 10 uL 200 uL
500 uL 500 uL 20 uL 10 uL 500 uL
Principio del procedimiento
BUFFER DE LISIS Guanidina y sales
cautropicas
MEMBRANA DE SILICA Puentes de sal con el material
genético
SOLUCION DE WASH En base a alcohol desihidrata
el material gentico
SOLUCION DE ELUCION Hidrata el material genético

B) Preparación del Equipo de extracción Veri – Q M 16TU – CV 19

1. Encender el equipo (Turn on parte trasera inferior derecha del equipo)
2. Verificar que las botellas de los reactivos esten llenas
NOMBRE DE LA BOTELLA BUFFER
WASHING BUFFER 1 NW1 BUFFER
WASSHING BUFFER 2 ENTANOL
ABSOLUTO
ELUTION BUFFER NE

3. PRE RUNNING- Colocar el Catridge en el carril superior

4. Cuando ha finalizado el Pre –run Retirar el catridge y vaciar el contenido
5. Insertar el rotor con los mini tubos de eluccion previamente irradiados
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6. Defina los siguientes ajustes:

Volumen de la Reacción 50 µL
INIT Boton SET
Inserter columas con el volume final
de la muestra
pretratada (1530 uL)
7. Presionar el Boton START
8. Cuando se ha completado la extracción (Sample Preparation Complete)
9. Del carril superior descartar las columnas
10. Del carril inferior los tubos con la elución
11. Descartar los residuos del rotor
2. AMPLIFICACION
A) Preparación de la Reacción master mix
VERI-Q ncOv-QM-N
Kit de detección multiplex COVID
1. Cada preparación de reacción debe incluir suficientes espacios de reacción para el número de
muestras y al menos un control positivo , un control negativo mas uno
(# de muestras + 3 = total de espacios de reacción necesarios).
2. En un Tubo previamente irradiado mezclar
N NOMBRE DE LOS NOMBRE CANTIDAD EJEMPLO
COMPONENTES DEL
(14MUESTRAS+3)
MODELO
1 One – step RT – PCR nCoV- 3uL 51 uL
Master Mix MMNH33
2 Primer / Probe nCoV-M - 1uL 17 uL
Mixture PPM
3 Internal Positive nCOV - 1uL 17 uL
Control IPC

3. Selle con tapas adecuadas.

B) PREPARACION DEL LAB CHIP
1. Colocar en el lab chip case las gomitas negras y acomodar el lab chip de forma adecuada
2. Alicuotar en cada posillo del trail 5 uL de la muestra
3. Cargar al lab chip 8uL en el orificio mas externo
4. Cerrar el Lab case
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C) Preparación del Equipo para a amplificación

1. Defina los siguientes ajustes:

Etapa Ciclos Etapa Ciclos Etapa Ciclos Etapa Ciclos

Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura
Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo
Transcripción
1 50˚C 10
Reversa
Minutos
Desnaturalización
Inicial 1 95˚C 3 Minutos

95˚C 9
Amplificación 45 segundos
58˚C 30
segundos
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Cuando se haya compIletado la prueba, asegúrese que el archivo de la prueba se haya guardado con los
siguientes datos
- Fecha
- Rangos de muestras

D) ANÁLISIS DE DATOS

Los estudios de verificación y validación realizados para el Logix Smart de Enfermedad del Coronavirus del 2019
(COVID-19) fueron conducidos siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio para ensayos de Biología
Molecular (Viana & Wallis, 2011). Si estas condiciones no se cumplieron, el desempeño mostrará mayor
variabilidad debido a errores de usuario cuando se conduce el experimento.

1. FLUORESCENCIA Y PUNTO DE CORTE

TARGET FLUOROFORO THRESHOLD PUNTO DE CORTE
DEL VALOR DE ct
ORF 3a FAM 1000 <40
N Cy5 1500 <40
IPC Texas red 500 <40

2. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

3. Un resultado Positivo mostrará una curva de amplificación o un valor de umbral del ciclo para el COVID-19
en o menor a 45 ciclos. Las curvas de amplificación mayores a 45 ciclos para el COVID-19 están en una
zona de incertidumbre. La presencia de una curva con un Cq en o debajo de 45 ciclos para una muestra de
COVID-19, indica un resultado positivo. La amplificación del canal de la RNasaP (IPC) muestra que la
extracción fue exitosa.
4. Un resultado Negativo no mostrará ninguna amplificación para el coronavirus COVID-19, sin embargo,
ocasionalmente ocurren amplificaciones mayores a 45 ciclos que pueden ocurrir en el canal COVID-19 o
del RNasaP. Cualquier amplificación mayor a 45 ciclos es una zona de incertidumbre y posiblemente
debajo del límite de detección. Una nueva corrida de la misma muestra o una corrida de otra muestra del
paciente en los siguientes días debe considerarse. La ausencia de una curva del COVID-19 indica un
resultado negativo ÚNICAMENTE cuando el marcador RNasaP (IPC) es positivo.
5. Un resultado Inválido ocurrirá si cualquiera de los controles falla. Vea la resolución de
problemas. La interpretación de los resultados con valores Ct puede traducirse según la
siguiente tabla:

MUESTRA ORF3a N IPC RESULTADO

Control negativo - - + VALIDO
Uno positivo +/- INVALIDO
Control positivo + + + VALIDO
Uno negativo +/- INVALIDO
CASO 1 - -/+ + NEGATIVO
CASO 2 + + +/- COVID-19
CASO 3 + - +/- COVID – 19
CASO 4 - - - INVALIDO
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E) CONTROLES
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