GRADO EN BIOTECNOLOGÍA

FISIOLOGÍA VEGETAL

Práctica

GERMINACIÓN DE SEMILLAS

APELLIDOS, NOMBRE

RODRÍGUEZ SERRANO, MARCOS

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 Efecto de las auxinas sobre la germinación de semillas
de Hordeum vulgare y el desarrollo del sistema radical
Marcos Rodríguez Serrano

1. Introducción

La germinación de semillas es un proceso en el que el embrión se vuelve metabólicamente

muy activo -normalmente, después de un periodo de dormición- y se producen un gran
número de reacciones químicas que permite el desarrollo radicular y caulinar. Cuando las
condiciones son favorables para romper con la dormición y dar paso a la germinación, debe
haber una hidratación del embrión y este debe ser viable, es decir, debe contar con los
mecanismos que le permitan llevar a cabo esas reacciones metabólicas (Finch-Savage &
Leubner-Metzger, 2006). No obstante, tal nivel de actividad metabólica da lugar a una
regulación equivalente, en la que los reguladores de crecimiento juegan un papel importante.
Está estudiado que los principales reguladores involucrados en la germinación son el ácido
abscísico (ABA) y su antagonista, las giberelinas (GAs) (White et al., 2000). Sin embargo, las
auxinas también podrían estar involucradas en esta fase y es que inusual es el proceso que no
esté regulado por esta hormona. En este estudio se han realizado pruebas de viabilidad y de
germinación de Hordeum vulgare y se ha determinado la longitud de sus raíces al ser tratada
con ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) con el fin de señalar los posibles efectos de las auxinas
en la germinación y desarrollo radicular.

El 2,4-D es una auxina sintética cuyos efectos son comparables a los del ácido indolacético
(IAA) -una auxina natural o fitohormona- a concentraciones muy bajas. Sin embargo, el uso
más común que se ha dado de esta auxina es como herbicida selectivo, dada su estabilidad y
relativa inefectividad contra monocotiledóneas (Pazmiño et al., 2012) (de Castro Marcato et
al., 2017). Aun así, se ha demostrado con este estudio que esta hormona -cuyo efecto es
dependiente de concentración- también tiene un efecto perjudicial en cereales cuando ciertas
cantidades son suministradas.

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 2. Material y métodos

Test de viabilidad

Se utilizaron dos lotes de semillas -A y B- de Hordeum vulgare. El lote A corresponde a semillas

recientes, mientras que las semillas del lote B fueron almacenadas durante 6-7 años. Se cortaron
las semillas –previamente sumergidas en agua destilada durante 24 horas- con bisturí
seccionando el embrión por la mitad, después se le aplicó a una de las mitades una solución de
cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 1% sobre papel de filtro en una placa Petri y se incubaron
una hora y media en oscuridad a 37ºC. La otra mitad se desechó. Se utilizaron 10 semillas de
cada lote y se realizaron 8 repeticiones.

Tratamiento 2,4-D

Las semillas utilizadas pertenecen al lote A mencionado previamente. Se prepararon 4

muestra a las que se les aplicó un tratamiento de 4 mL de ácido diclorofenoxiacético (2,4‐D)
1,2,10 y 50mg/L respectivamente a partir de una solución de stock de 50mg/L.
Adicionalmente, se preparó una quinta muestra control tratada con agua destilada. A
continuación, se sellaron las placas Petri de cada muestra con Parafilm® y se incubaron
durante 7 días en oscuridad a 25ºC. Se utilizaron 10 semillas por muestra y se realizaron 8
repeticiones.

Test de germinación y longitud

Se midió la longitud de las raíces con una regla de plástico, considerando a aquellas semillas
cuyas raíces tuvieran una longitud superior o igual a 0,2 cm como germinadas.

Análisis estadístico

Tanto para el test de germinación como de longitud se llevó a cabo un análisis de varianza
(ANOVA) y un test de mínimas diferencias significativas (MSD). Se consideraron diferencias
estadísticamente significativas si p<0,01 utilizando el software Microsoft Excel con el
complemento Herramientas para análisis.

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 3. Resultados

Viabilidad de los lotes A y B

El lote A presenta un porcentaje de viabilidad muy cercano al 100%, ya que prácticamente

todos los embriones presentaban la coloración roja debida a la reducción del cloruro de 2,3,5-
trifeniltetrazolio por la enzima succinato deshidrogenasa mientras que para el lote B, este se
reduce a la mitad (Tabla1).

Lotes % VIABILIDAD
de DESVIACIÓN
Repet. 1 Repet. 2 Repet. 3 Repet. 4 Repet. 5 Repet. 6 Repet. 7 Repet. 8 MEDIA
semillas ESTÁNDAR

A 100 100 100 90 100 100 100 100 98,8 3,5

B 50 40 60 30 40 60 50 60 48,8 11,3

Tabla 1. Porcentaje de viabilidad de dos lotes de semillas (A y B) con 8 repeticiones por cada lote.

Porcentaje de germinación

No existen diferencias significativas en el porcentaje de germinación entre los tratamientos con

2,4-D control, 1,2 y 10 mg/L mientras que sí que existen entre todos los anteriores con el
tratamiento de 50mg/l 2,4-D, siendo este hasta cinco veces menor (tabla 2, figura 1).

2,4-D % GERMINACIÓN
(mg/l) Repet. Repet. Repet. Repet. Repet. Repet. Repet. Repet. DESVIACIÓN
MEDIA
1 2 3 4 5 6 7 8 ESTÁNDAR
0 70 80 50 60 100 80 80 60 72,5 15,8
1 80 60 60 60 70 60 80 60 66,3 9,2
2 50 90 60 70 60 60 80 70 67,5 12,8
10 0 60 20 50 70 90 70 60 52,5 29,2
50 0 20 0 10 0 10 40 30 13,8 15,1
Tabla 2. Porcentaje de semillas de Hordeum vulgare germinadas tratadas con 2,4-D a diferentes
concentraciones.

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 Figura 1. Germinación de semillas de Hordeum vulgare tratadas con 2,4-D 0,1,2,10 y
50mg/L durante una semana a 25 ºC en oscuridad. Las diferencias estadísticamente
significativas están representadas con diferentes letras con un nivel de significación p
≤0,01. Los datos corresponden a medias ± DE de 8 réplicas

Longitud de raíces

Para una sola repetición, el tratamiento con 2,4-D provoca diferencias significativas con
respecto al control, reduciéndose más de la mitad en los tratamientos de 1 y 2 mg/L. Mientras
que, en el caso de mayores concentraciones de la auxina, al no haber germinación, no hay
longitud de raíz (figura 2a). En la figura 2b se observa cierto crecimiento aéreo en las semillas
tratadas con 10mg/L, mientras que en aquellas tratadas con 50mg/L no hay desarrollo de
ningún tipo.

MEDIA DESVIACIÓN
2,4-D Longitud de las raíces (L) en mm
ESTÁNDAR
(mg/l)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

0 52 121 123 130 134 134 155 L0 =121,3 32,5

1 27 29 33 33 40 45 54 71 L1 =41,5 14,89

2 29 29 30 31 42 L2 =32,2 5,54

10 L10 =0 0

50 L50 =0 0

Tabla 3. Longitud de raíces de Hordeum vulgare brotadas de semillas tratadas con 2,4-D a diferentes
concentraciones. Aquellas celdas que no recogen datos corresponden a semillas no germinadas.

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 A

b D
c c

Figura 2a. Longitud de raíces de Hordeum vulgare Figura 2b. Imagen de semillas de Hordeum vulgare
a partir de semillas tratadas con 2,4-D 0,1,2,10 y a la que se les ha aplicado un tratamiento de 2,4-D a
50mg/L durante una semana a 25 ºC. Las cinco concentraciones diferentes(A-E) al cabo de
diferencias estadísticamente significativas están una semana incubadas a 25ºC. Semilla control(A).
representadas con diferentes letras con un nivel de 1mg/L (B). 2mg/L (C). 10mg/L(D). 50mg/L(E).
significación de p ≤0,01. Los datos corresponden a
medias +-DE de 7 repeticiones para el control, 8
para el tratamiento con 1mg/L 2,4-D y 5 para el
tratamiento con 2mg/L 2,4-D.

Sin embargo, para unos resultados mas concluyentes, se deben analizar los resultados de todas
las repeticiones en conjunto. Estos se ven reflejados en la tabla 4 y figura 4. La auxina 2,4-D
tiene repercusión en el desarrollo de raíces ya que el control muestra diferencias significativas
con todos los tratamientos. Con 1mg/L la longitud se reduce a la mitad, con 2mg/L a una cuarta
parte, con 10mg/L una octava y con 50mg/L prácticamente no hay desarrollo.

Grupos de 2,4-D (mg/l)

trabajo L0 L1 L2 L10 L50
Repet. 1 121,3 41,5 32,2 0,0 0,0
Repet. 2 77,1 46,7 23,1 11,8 2,5
Repet. 3 72,8 42,5 21,7 21,0 0,0
Repet. 4 24,8 33,6 22,1 7,4 4,0
Repet. 5 86,1 51,4 26,8 13,8 0,0
Repet. 6 89,6 33,5 25,3 12,6 10,0
Repet. 7 80,1 45,7 15,8 8,7 4,0
Repet. 8 91,7 41,0 21,0 10,7 4,0
Media 80,4 42,0 23,5 10,8 3,1
Des. Est. 26,9 6,2 4,8 6,0 3,4
C.V. (%) 33,5 14,7 20,4 55,6 109,8

Tabla 4. Longitud de raíces de Hordeum vulgare brotadas de semillas tratadas con

2,4-D a diferentes concentraciones. Los datos corresponden a 8 medias de 8
repeticiones para cada tratamiento.
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 Figura 3. Longitud de raíces de Hordeum vulgare a partir de semillas tratadas con 2,4-
D 0, 1, 2, 10 y 50mg/L durante una semana a 25 ºC. Las diferencias estadís-ticamente
significativas están representadas con diferentes letras con un nivel de significación p
≤0,01. Los datos corresponden a medias +-DE de 8 réplicas.

4. Discusión

Viabilidad

Según las investigaciones de Ratajczak et al. (2015), los responsables de la pérdida de

viabilidad por el envejecimiento son los radicales libres de oxígeno (ROS) los cuales se
acumulan al no haber sistemas antioxidantes activos y causan daños en las membranas,
especialmente en la mitocondrial (Xia et al., 2015). Małecka et al. (2021) observaron que los
niveles de H2O2 -uno de los ROS más relevantes en eucariotas- y Malondialdehído (MDA)-
un indicador de daño oxidativo- aumentaban al mismo tiempo que la actividad de la enzima
catalasa disminuía en semillas envejecidas. Esto provocó cambios estructurales en las
mitocondrias resultando en la muerte de las células.

Germinación

2,4-D no puede ser degradada por plantas -a diferencia de las auxinas naturales que se degrada
cuando hay un exceso- por lo que se acumula en el embrión y es tóxico para este (Song, 2014).
Por ello no se manifiestan diferencias significativas en la germinación con 0, 1, 2 y 10, pero sí
con 50. Al tratar con 50 mg/L, el 2,.4-D no funciona como regulador de crecimiento, si no como

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herbicida. Las investigaciones sobre el efecto del 2,4-D en trigo y cebada realizadas por Azam et
al. (2005) y Hsuieh & Lou (1947) indicarían -y los resultados sobre la longitud de raíces estaría
en concordancia con sus conclusiones- que incluso todos los tratamientos aplicados de 2,4-D en
este estudio estarían actuando de manera perjudicial para el desarrollo de Hordeum vulgare .
Aunque haya estudios que apoyen que las auxinas tienen un papel en la germinación (Liu et al.,
2013), incluso siendo estas aportadas de manera exógena como se ha hecho en este estudio
(Shuai et al., 2017). Las concentraciones a las que se ha trabajado siempre han sido muy
inferiores (del orden de 1 micromolar) a las de este estudio.
En contraste con las pruebas de viabilidad realizadas, cabría esperar una germinación del 100%
en el control. Mas el tiempo transcurrido en la prueba de viabilidad fue de una hora y media
mientras que en el test de germinación transcurrió una semana. Por tanto, no se pueden
relacionar ambos datos ya que las razones por las que no se corresponden pueden ser
multifactoriales.

Longitud de raíces

Los resultados muestran que el 2,4-D tiene un efecto negativo en el desarrollo de raíces. Esto
concuerda con Özkul et al. (2016). Ellos demostraron que el número de aberraciones mitóticas
en raíces de Allium cepa aumentaba de manera significativa cuando se les aplicaron diferentes
tratamientos de 2,4-D 0.67, 1.34, 2.01, 2.68, 3.35 y 4.02 mg/L. Esto resultó en una
disminución del índice mitótico en todos los tratamientos y en una toxicidad significativa para
el desarrollo de raíces a las que se le había aplicado la mayor concentración.

5. Conclusiones

En este estudio se ha confirmado que el proceso de envejecimiento afecta a la viabilidad de las

semillas de Hordeum vulgare debido a una acumulación de estrés hídrico inducido por radicales
libres de oxígeno. Teniendo esto en cuenta para la selección de organismos en nuestro estudio, se
ha demostrado que la auxina sintética 2,4-D tiene un efecto negativo en las células
meristemáticas de las raíces a altas concentraciones -reduciendo la actividad mitótica- e inhibe la
germinación a concentraciones superiores a 50 mg/L. En cualquier caso, los mecanismos por los
cuales el 2,4-D es tóxico también para las monocotiledóneas es una línea de investigación
escasamente explorada e investigaciones futuras serán necesarias.
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 6. BIBLIOGRAFÍA.

Azam, F., Lodhi, A., Farooq, S., Harry-O’Kuru, R., & Imam, S. H. (2005). Seed treatment
with phytohormones and crop productivity. III. Physiological/biochemical changes in
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exposure to 2,4-D. Pakistan Journal of Botany, 37(4).
de Castro Marcato, A. C., de Souza, C. P., & Fontanetti, C. S. (2017). Herbicide 2,4-D: A
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Hsuieh, Y. L., & Lou, C. H. (1947). Effects of 2,4-D on seed germination and respiration.
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Liu, X., Zhang, H., Zhao, Y., Feng, Z., Li, Q., Yang, H. Q., Luan, S., Li, J., & He, Z. H.
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https://doi.org/10.1073/pnas.1304651110
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Özkul, M., Özel, Ç. A., Yüzbaşıoğlu, D., & Ünal, F. (2016). Does 2,4-dichlorophenoxyacetic
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Pazmiño, D. M., Romero-Puertas, M. C., & Sandalio, L. M. (2012). Insights into the toxicity
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Shuai, H., Meng, Y., Luo, X., Chen, F., Zhou, W., Dai, Y., Qi, Y., Du, J., Yang, F., Liu, J.,
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9
 through decreasing the gibberellin/abscisic acid (GA/ABA) ratio. Scientific Reports,
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Song, Y. (2014). Insight into the mode of action of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) as
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