PIA 3

Físico-química
Bioingeniería termodinámica de células biológicas

Andrea Varela Cruz 2123726

Melissa Romo Manzanares 1999902
Napoleón Cantú Pérez 1954389
Objetivo

Calcular los cambios de energía libre de Gibbs de las moléculas biológicas en la

interfaz aceite-agua se realiza comúnmente con simulaciones de dinámica molecular
(MD). Es un proceso que podría realizarse repetidamente con el fin de encontrar
algunas moléculas de alta estabilidad en este medio.

Introducción

Las simulaciones de Dinámica Molecular (DM) se han utilizado con éxito en los
últimos años para evaluar proteínas y péptidos como candidatos a biosurfactantes,
que han sido evaluados en procesos experimentales con resultados interesantes. Sin
embargo, MD para calcular el cambio de energía libre de Gibbs de moléculas con
tamaño de péptido o sistemas complejos compuestos por diferentes tipos de
biomoléculas se convierte en un método ineficiente cuando se necesitan resultados
rápidos.

Una forma alternativa de calcular la energía libre de las biomoléculas es mediante el

uso de métodos de contribución grupal (GCM). Los GCM se basan en datos
experimentales o en silico de algún sistema específico, y se pueden utilizar para
describir las propiedades de moléculas en condiciones similares, reduciendo el tiempo
de cálculo de las propiedades termodinámicas. Algunos GCM han sido creados para
el cálculo de la energía libre de proteínas, péptidos y otras moléculas y han sido
probados contra resultados de MD obtenidos resultados similares, pero son limitados
porque se basan en procedimientos experimentales. Utilizando estos métodos, los
valores de energía libre de las biomoléculas están determinados por la suma de las
contribuciones de cada residuo que forma parte de toda la cadena asignando un valor
energético único a cada residuo.

El objetivo de este trabajo es proponer un GCM basado en MD para estimar los

valores de cambio de energía libre de cualquier cadena de residuos sin tener que
recurrir a la simulación de todo el péptido. El GCM se desarrolla utilizando múltiples
MD de aminoácidos individuales y pares de aminoácidos ubicados en la interfaz de
las cajas de simulación de dodecano-agua. Se propone una ecuación para calcular el
valor de la energía libre de un péptido entero relacionando la presencia y ausencia de
un residuo, así como sus características hidrofóbicas. Esta ecuación tiene la
capacidad de calcular el valor de cambio de energía libre durante la inserción de
péptidos en las interfaces agua-aceite. La validación de la ecuación se realizó con
veintiún péptidos, y su capacidad para proteínas con Porina OmpA de Escherichia
coli (E. coli) que puede estabilizar mezclas de dodecano/agua 78.

Metodología

Los cálculos de energía libre de Gibbs utilizando MD se basan en el principio de que

la energía libre es una función de estado, por lo tanto, los cambios de un estado A a
un estado B solo se pueden estudiar en función de los estados de energía inicial y
final. El cambio de la energía libre de Gibbs entre A y B usando MD requiere que el
hamiltoniano cambie gradualmente de uno a otro estado y esto es posible haciendo
del hamiltoniano una función de λ (parámetro de acoplamiento) donde A corresponde
al estado λ = 0 y B al estado λ = 1. Entonces tenemos:

G(λ)=−kBTln(Q)
Dónde l=( 1,2,... ,n)l=(1,2,... ,n) y λ1=0,λn=1λ1=0,λ n=1 (ver Fig. 1). Por lo tanto, los
λ-estados seleccionados afectan al valor final de energía libre calculado. Cuanto
mayor sea el número de λ-estados, mejor convergencia para el cálculo de la energía
libre; sin embargo, se traduce en un mayor número de simulaciones, tiempo de
proceso y capacidad computacional.

Representación esquemática de MD utilizando el parámetro de acoplamiento λ. El

valor final del cambio de energía libre de Gibbs se obtiene como la suma de la energía
libre de Gibbs cambia entre el estado inicial y el estado final utilizando los estados
intermedios λ. Todas las simulaciones se llevaron a cabo utilizando esos seis estados
λ.
Se emplearon máquinas virtuales con 8 GB de RAM con 8 núcleos por máquina y 20
GB de almacenamiento. Estas máquinas virtuales se implementaron sobre la
infraestructura oportunista de Una Cloud en la Universidad de los Andes. Las
simulaciones de MD tomaron alrededor de cuatro horas por estado λ y se completaron
doscientas cuarenta simulaciones para los cuarenta sistemas (veinte aminoácidos
individuales y veinte pares).

Resultados y discusión
Simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre

El cálculo de los valores de energía libre se realizó mediante la herramienta BAR del
paquete de simulación GROMACS. Usando los seis valores de λ elegidos, fue posible
obtener una representación significativa del camino entre los estados A y B,
dondeλ1= 0λ1=0yλ6= 1. Debido a la superposición de los seis histogramas en las
cuarenta simulaciones, es posible afirmar que el camino entre el estado inicial y el
estado final es completo; por lo tanto, la suma FE de todos los estados λ representa
adecuadamente la energía libre de Gibbs total de la biomolécula.

Algunos aminoácidos como el ácido aspártico, el ácido glutámico, la arginina y la lisina

presentan valores de energía libre más elevados. Sin embargo, el histograma muestra
el mismo comportamiento para todos los aminoácidos en el primer subestado λ, con
un buen solapamiento en esta región específica. Es posible que los valores más altos
de energía libre obtenidos por estos aminoácidos sean consecuencia de una
perturbación en el cálculo hamiltoniano debido a un cambio repentino de
estado. Mediante el análisis de la energía libre del primer segmento de la vía (λ 1 =
0 a λ 2 = 0,25) es posible observar que el valor de energía libre de estos cuatro
aminoácidos individuales es mayor que los demás

Construcción de modelos

La construcción de la ecuación GCM se realizó por comparación directa entre los

valores de energía libre obtenidos en la MD de veintiún péptidos y la sumatoria de los
valores de energía libre obtenidos para todos los aminoácidos contenidos en el
péptido correspondiente. Se sumó el aporte de energía libre de cada residuo y se
comparó con los datos reportados obteniendo que las simulaciones arrojan valores
de energía libre mayores a los esperados. Los valores de energía libre de
aminoácidos individuales son de alrededor de 150 KJ/mol. Las variaciones obtenidas
podrían deberse a variables como tamaño, carga y polaridad. Luego, se necesitó un
grupo de parámetros para corregir la ecuación que calcula los valores de energía libre
más cercanos a los péptidos simulados anteriores.

Los parámetros de corrección se calcularon buscando el mejor ajuste con los datos
disponibles in silico de veintiún péptidos con un enfoque de mínimos
cuadrados. Además, estos parámetros se calcularon para dos escenarios específicos
de la configuración de la cadena de biomoléculas. Un escenario ocurre cuando el
residuo evaluado es seguido por un residuo con la misma hidrofobicidad, es decir, un
residuo hidrofóbico está al lado de otro residuo hidrofóbico o un residuo hidrofílico
está al lado de otro residuo hidrofílico; este escenario se denomina residuo clase
1 (C1). El otro escenario ocurre cuando al residuo evaluado le sigue un residuo con
diferente hidrofobicidad, es decir, un residuo hidrofóbico está al lado de un residuo
hidrofílico o un residuo hidrofílico está al lado de un residuo hidrofóbico; este
escenario se llama residuo clase 2(C2).

Se encontró que los siguientes pares: Ala-Arg, Ala-Asp, Ala-Glu, eran valores atípicos
según un diagrama de caja, lo que significa que proporcionaron valores de cambio de
energía libre que nuestro modelo no puede capturar, posiblemente debido al tamaño
del par. Usando los diecisiete valores de energía libre restantes, se seleccionaron dos
pares como la representación más cercana de la desviación de la idealidad de los
pares hidrofóbico-hidrofóbico e hidrofóbico-hidrofílico, Ala-Trp y Ala-Lys
respectivamente. El primero tiene la mayor desviación y representa las interacciones
entre dos aminoácidos con las mismas características hidrofóbicas. El segundo
muestra la más mínima desviación y representa las interacciones entre dos
aminoácidos con diferentes características hidrofóbicas. Usando esas desviaciones
representativas, se ajustó el valor α para las clasificaciones C1 y C2 y se propuso la
ecuación final del GCM como:
Donde ∆𝐺𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑒 es el Gibbs libre de la molécula en kJ/mol, i representa cada
aminoácido, C1 o C2 son la clase del residuo, n es el número de residuos clase 1 o
clase 2 según la clasificación de cada uno en la molécula y el los valores de α se

presentan en la Tabla 4.

Aunque los péptidos no se pliegan con frecuencia en estructuras secundarias típicas,

obtuvimos un efecto de desviación al comparar la ecuación de GCM y los valores
derivados de la simulación para los péptidos plegados obtenidos con el predictor de
estructura de proteínas I-TASSER, luego incorporamos un factor de corrección de
plegado. Este factor tiene en cuenta el potencial de plegamiento y se calculó
considerando la posición de los residuos y el parámetro conformacional de giro. Se
evaluó una correlación de Pearson para ambas variables, encontrando una relación
entre la correlación y la presencia de plegamiento de péptidos. Luego se agregó o
restó una corrección de plegamiento potencial para aquellos péptidos con una
correlación de Pearson mayor que 0.40. Este valor de corrección se obtuvo mediante
una ecuación lineal obtenida con la correlación de Pearson y el valor necesario para
igualar ambas energías libres obtenidas (calculadas y simuladas) cuando no se tiene
en cuenta la corrección de plegado.
Discusión

Los valores de energía libre de Gibbs de veintiún péptidos y la proteína OmpA se

calcularon usando la ecuación. y estos se compararon con los valores informados. El
error relativo de los veintiún péptidos calculado como:

Varían de 0.1 a 33.4% con un valor promedio de 17%. El error relativo de los péptidos
puede explicarse como consecuencia de las fuerzas de autointeracción debidas al
plegamiento a lo largo de la cadena residual. El péptido 5 (GKNHDTGVSPVFA) y el
péptido 10 (ALIDCLAPDRR) presentan una estructura terciaria no lineal con
secciones de pliegue específicas, obtenidas utilizando el predictor de estructura de
proteínas I-TASSER, lo que puede explicar los valores de error obtenidos. De manera
similar, la desviación del valor de energía libre de los péptidos restantes puede
explicarse por interacciones propias en las secciones plegadas. Sin embargo, el
método de simulación utilizado con aminoácidos individuales y pares de aminoácidos
no proporciona suficiente información para reducir el error relativo causado por estas
autointeracciones.

Se analizaron los problemas de superposición en los histogramas de los aminoácidos

y los pares de aminoácidos para garantizar que el error relativo calculado no
dependiera de los estados λ. El error asociado a cada estado λ y la inspección directa
de los gráficos de los histogramas muestran que Trp, Lys, Arg, Asp, Tyr y Asn como
aminoácidos individuales y Ala-Arg, Ala-Asn, Ala-Cys, Ala-Gln, Ala-Glu, Ala-His, Ala-
Lys, Ala-Met, Ala-Phe y Ala-Tyr como pares de aminoácidos tienen algunas áreas
superpuestas más pequeñas que el promedio, lo que finalmente afecta el cálculo de
los valores de energía libre Sin embargo, los péptidos con el menor error relativo
calculado, el Péptido 9 y el Péptido 18 y el mayor error relativo calculado, el Péptido
5 y el péptido 10 confirmaron que los problemas de superposición no estaban
relacionados con el error relativo obtenido. Luego, los problemas de superposición
deben ajustarse con estados λ adicionales en las áreas sin superposición para
obtener valores precisos de energía libre; sin embargo, estos problemas de
superposición juegan un papel menor en los resultados del error relativo.

Las interacciones de van der Waals y Coulomb pueden evaluarse como responsables
de la variabilidad de los valores de energía libre obtenidos. También evaluamos la
capacidad de la ecuación de predecir el cambio de energía libre durante la inserción
en la interfase de proteínas reportadas previamente con actividad de interfase como
OmpA , encontrando un error relativo de 73.1%. La evaluación de energía libre de
OmpA se llevó a cabo con una simulación desacoplada de interacciones de van der
Waals y Coulomb. Entonces, creemos que las interacciones de van the van der Waals
proporcionan mayores incertidumbres [ 7] y demostraron que esta ecuación GCM es
más adecuada para la predicción de péptidos. Las simulaciones de un solo
aminoácido y de pares de aminoácidos se evaluaron usando una simulación de
interacciones acopladas. Por tanto, las incertidumbres debidas a la interacción de van
der Waals están afectando el valor final de energía libre obtenido, sin embargo, es
necesario modificar las simulaciones desacoplando las interacciones para conocer la
magnitud de la incertidumbre provocada por cada interacción energética.

Se realizaron observaciones experimentales sobre la adición de algunos péptidos en

emulsiones de dodecano-agua y agua cruda cuya energía se calculó utilizando la
ecuación basada en GMC. Para el análisis se utilizaron medidas de calorimetría
diferencial de barrido, distribución del tamaño de las gotitas y tensión interfacial
(manuscrito en preparación). En primer lugar, encontramos que todas las secuencias
mostraron una disminución en la tensión interfacial corroborando los resultados
predichos por la ecuación GMC. En segundo lugar, encontramos que las emulsiones
de agua-dodecano se mantuvieron estables al agregar cada secuencia durante más
de 7 h, lo que indica que la disminución de la tensión superficial se reflejó en la
estabilidad de la emulsión. Finalmente, los péptidos como el 15, que alcanzan los
valores más bajos de energía libre.

Discusión individual
Andrea Varela

Hay una interacción entre los valores obtenidos de la energía con los valores que
introducción de los valores de alfa. Se demuestra el efecto que tiene la temperatura y
las concentraciones, se tuvo que hacer un experimento basado en 21 péptidos y se
permitió identificar el cambio de error entre los cambios de la energía libre de Gibbs,
este cambio de energía y variación en los resultados puede deberse a la interacción
de las moléculas de los péptidos. Se debieron de llevar acabo simulaciones para
comprobar los resultados, en base a esto los resultados nos un grado de error debido
a las diferentes experimentaciones con parámetros diferentes.

Melissa Romo

Estimar los cambios de energía fue algo que, aunque se tuviera como un objetivo, fue
difícil el poder llegar a ese resultado. Se tuvieron que analizar varias cosas, entre ellas
como explicar si había un error y el poder arreglarlo. Se tenía pensado que solo
ocurrieran 2 posibles errores en los péptidos y se confirmó después que fueron más
de lo planeado. De cualquier manera, se evaluaron todas las posibles soluciones y
explicaciones para poder resolver cuanto antes la situación. Se llevaron a cabo por
simulaciones e interacciones que se hicieron observaciones y calculando la ecuación
basada en GMC. Al final en el artículo se pudo encontrar tanto las secuencias donde
se muestra la disminución en la tensión interfacial y las emulsiones que se
mantuvieron estables en cada secuencia agregada.
Napoleón Cantú

Se sabía que encontrar un método y una ecuación alternativa a la que se utilizaba

desde un principio suponía un reto, puesto que son procesos complejos que requieren
resultados muy precisos, se demuestra en los péptidos 5 y 10 que los resultados
obtenidos con respecto al error relativo no tenían relación con los problemas de
superposición, los cuales terminan jugando un papel menor con respecto al error
relativo, a pesar de que son vitales para obtener valores precisos de energía libre.
Cada vez se formaban más preguntas que respuestas, pero al final todo tuvo solución,
aplicando diferentes métodos y también haciendo uso de la ecuación basada en
GMC, se logró demostrar lo que esta ecuación había predicho, que fue una
disminución en la tensión interfacial, sumando también una estabilidad de emulsión
como producto de esa disminución. Esto ayudó a que los resultados fueran más
precisos y que se pudieran calcular valores de energía libre incluso más bajos, como
se demostró con el péptido 15.
Conclusiones
Se desarrolló una ecuación GCM para calcular el valor de energía libre de Gibbs de
las biomoléculas ubicadas en interfaces dodecano-agua. Se realizó la DM de los
veinte aminoácidos y veinte pares y se calculó el valor de energía libre de cada uno
mediante el BAR. Esta ecuación se construyó en base a la minimización del error
absoluto entre la suma de los resultados de energía libre y los valores de energía libre
de veintiún péptidos realizados en trabajos previos por nuestro grupo. Además, la
ecuación GCM considera la hidrofobicidad de cada residuo y su contribución al valor
total de energía libre de Gibbs. Fue posible utilizar los resultados de los pares y la
diferencia de esos valores de la idealidad. Finalmente, se comprobó que la ecuación
propuesta puede ser utilizada como una primera aproximación con alta precisión al
cálculo de la energía libre de Gibbs de biomoléculas cortas.
Fuentes Bibliográficas

Osorio, M. C. A. (2016, 7 diciembre). Development of a group contribution method for

estimating free energy of peptides in a dodecane-water system via molecular dynamic

simulations - BMC Bioinformatics. BioMed Central. Recuperado 29 de mayo de 2022,

de https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-016-1399-

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