T.3.

ESPECTOFOTOMETRÍA
Los colores son el resultado de la capacidad de algunas moléculas de absorber la luz en algunas
longitudes de onda (l.o) del espectro visible, cuando la luz blanca incide sobre una molécula
coloreada, esta absorbe a ciertas l.o del espectro, permitiendo que el ojo capte solo las no
absorbidas, determinando así el color de la molécula.
El espectro de absorción de una molécula es la longitud de onda a la que absorbe. Cada
molécula tiene un espectro de absorción distinto (ya que no todas absorben a la misma l.o ni
tienen la misma absorbancia).
Coeficiente de extinción molar: es la absorbancia de una molécula a una longitud de onda
determinada, con una concentración de 1M y un paso óptico de 1 cm. (a misma l.o mismo
c.e.m).
Si existe una relación lineal entre absorbancia y [ ], se usa Y = m * X Y=abs//X=[ ]//m=c.e.m.
El espectrofotómetro mide la absorbancia de una molécula a determinada longitud de onda =
identificación y cuantificación. (gráfica).
La absorbancia de una muestra es mayor (depende de) cuanto mayor sea la distancia que
atraviesa la luz, y directamente proporcional a la concentración de moléculas en la muestra. A
mayor absorbancia, mayor facilidad para detectar una molécula.
Abs = c.e.m * [ ] * l. Ley de Lambert-Beer
Sirve para determinar la [ ] de una molécula en disolución, midiendo su abs y conociendo c.e.m
(L /M^1 *cm^1) para la l.o en la que se trabaja.
La luz en zona UV y visible que una molécula es capaz de absorber depende del número de
dobles enlaces conjugados (a mayor número, mayor absorbancia) que posee, característica
que se observa en su c.e.m (depende de la absorbancia, que a su vez depende del número de
dobles enlaces conjugados de la molécula.
Una molécula de pigmento debe absorber luz y presentar un color.
Una molécula con dobles enlaces conjugados nos permite identificar que tiene color.

CROMÓFOROS DE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS.

Las proteínas absorben a una l.o de 280 nm (aprox), mientras que los ácidos nucleicos lo hacen
a 260 nm (máximo pico al que absorben sus bases nitrogenadas).
Las proteínas absorben diferente según los aa de su composición. Si teñimos la proteína entera
y medimos ese color, detectaremos todos los aa por igual. Así se cuantifican las proteínas en
un extracto.
Los ácidos nucleicos no se miden en M, por lo que no se utiliza c.e.m, pero se usan 3
constantes, en función del tipo de ácido nucleico.
Aplicación directa ley Lambert-Beer a los ácidos nucleicos.
Cuando se utilizan cubetas de 1 cm.

Estimación de la pureza: mediante relación Abs 260nm/Abs 280nm

Solución ADN doble hebra puro, relación 1,8.
Solución ARN puro, relación 2. Abs a 260nm es el doble.
(y2-y1)=m*(x2-x1)