Como biblioteca, NLM proporciona acceso a la literatura científica.

La inclusión en
una base de datos de NLM no implica el respaldo o el acuerdo con el contenido por
parte de NLM o los Institutos Nacionales de Salud.
Más información: Descargo de responsabilidad de PMC | Aviso de derechos de autor
de PMC

Sci Rep. 2019; 9: 2704. PMCID: PMC6390103PMID

Publicado en línea el 25 de febrero de 2019. doi: 10.1038/s41598-019- : 30804376
39128-y

Filogeografía del pez tetraploide amenazado, Schizothorax waltoni, en el río

Yarlung Tsangpo en la meseta sur de Qinghai-Tíbet: implicaciones para la
conservación
Xiang-Zhao Guo,1,2,5 Gui-Rong Zhang,1,2Kai-Jian Wei, 1,2 Wei Ji,1,2 Ruo-Jin Yan,1,2,3Qi-Wei Wei,4 y
Jonathan P. A. Gardner1,2,3

Abstracto

La filogeografía de Schizothorax waltoni, un pez esquizothoracina tetraploide endémico y en

peligro de extinción en el río Yarlung Tsangpo (YLTR) en el margen sur de la meseta de
Qinghai-Tibet (QTP), se investigó utilizando dos regiones de ADN mitocondrial y once loci de
microsatélites. Los análisis de las secuencias concatenadas del citocromo b (1141 pb) y la región
de control (712 pb) revelaron una alta diversidad de haplotipos y una diversidad moderada de
nucleótidos. Se observó una alta diversidad genética basada en la variación de los microsatélites.
Tanto el ADNmt como los análisis de microsatélites revelaron una diferenciación genética
significativa entre la población oriental (Mainling) y las otras cuatro poblaciones del oeste, y una
diferenciación genética no significativa entre las tres poblaciones centrales del oeste. Se observó
una diferenciación genética significativa entre la población occidental (Shigatse) y las tres
poblaciones centrales basándose solo en análisis de microsatélites. Los análisis de la trama del
:
 horizonte bayesiano mostraron que S. waltoni experimentó una pronunciada expansión de la
población de 0,05 a 0,10 Ma. Los análisis de la estructura jerárquica de los datos de
microsatélites indicaron que S. waltoni podría dividirse en tres grupos (YLTR occidental, central
y oriental). Los resultados indican que se deben considerar tres unidades de gestión para S.
waltoni. Nuestros hallazgos destacan la necesidad de la conservación y el manejo efectivo de S.
waltoni, que es un miembro clave de los peces endémicos y altamente amenazados del QTP.

Introducción

Los peces son el grupo más abundante de vertebrados, y casi la mitad de su número se encuentra
1
en sistemas de agua dulce que constituyen < 0,01 % del agua de la tierra . La mayoría de los
sistemas de agua dulce ahora se enfrentan a múltiples amenazas, todas relacionadas con la
actividad antropogénica, de modo que las poblaciones de peces de agua dulce en muchas
2 4
regiones están en peligro de extinción – . De hecho, los efectos antropogénicos están bien
documentados en términos de extinciones localizadas y globales de peces de agua dulce en
4 6
todos los continentes habitados por el ser humano – , lo que lleva a la sugerencia de que el
7
mundo ya ha entrado en un sexto evento de extinción masiva .

Los peces esquizoracinas (tráceta de nieve o minnows de nieve) consisten en 15 géneros y más
8
de 100 especies que se distribuyen principalmente en Asia . De estos, ~76 especies y
subespecies pertenecientes a 11 géneros se encuentran en la meseta de Qinghai-Tíbet (QTP) y su
9
área adyacente . Los análisis del cariotipo y el contenido de ADN indican que estos peces
10 12
pueden ser tetraploides, hexaploides u octoploides – . El género Schizothorax incluye 63
13 9 14
especies válidas , de las cuales ~40 especies y subespecies se encuentran en China , .

La esquizothoracina Lhasa, Schizothorax waltoni Regan 1905 (Cyprinidae: Schizothoracinae),

es un pez tetraploide endémico en el río Yarlung Tsangpo (YLTR) en el margen sur del
12 14 15
QTP , , . Debido a que hay información limitada disponible sobre las tendencias de la
población de esta especie, S. waltoni es evaluado como de menor preocupación en la Lista Roja
16
de Especies Amenazadas de la UICN . Sin embargo, en la nueva Lista Roja de los Vertebrados
17
de China , S. waltoni es evaluado como Vulnerable. Es uno de los peces comerciales más
importantes de esta región y se pesca principalmente con redes de enmalle y electropesca. Es de
larga duración, se adapta al frío, tiene una tasa de crecimiento lenta, madurez sexual tardía y
9 18
baja fecundidad , , y por lo tanto es especialmente vulnerable a las actividades humanas como
la sobrepesca, la invasión biológica por peces exóticos y la construcción de presas
18 20
hidroeléctricas – .
:
 Antes de la década de 1950, los peces esquizoracinas en el Tíbet estaban protegidos
indirectamente debido a la creencia religiosa tibetana, con restricciones a la pesca y el consumo
21
de pescado impuestas por la autoridad religiosa tibetana suprema . Sin embargo, con el
aumento de inmigrantes y turistas de las zonas interiores y la creciente demanda de pescado y
productos pesqueros, la sobreexplotación y la pesca ilegal son ahora graves amenazas para la
18 19
supervivencia a largo plazo de los peces esquizorácico en el Tíbet. , . Al mismo tiempo,
muchas especies no nativas (por ejemplo, el pez dorado (Carassius auratus) y el gudgeon de
boca superior (Pseudorasbora parva)) se han introducido en el YLTR y ahora están
19 20
compitiendo y desplazando a los peces esquizothoracinas endémicos , . Además, la
construcción en curso de presas hidroeléctricas ha contribuido sustancialmente a la degradación
del hábitat de los peces endémicos. Como consecuencia, S. waltoni ahora está amenazado por
19
fuertes disminuciones en el tamaño de la población . La conservación de las poblaciones
naturales de S. waltoni es ahora de principal preocupación, en particular dada la limitada
distribución geográfica de esta especie.

A pesar de la importancia ecológica y pesquera de S. waltoni, se sabe poco sobre la diversidad

genética y la estructura genética de sus poblaciones, y la información que existe se deriva
indirectamente de los análisis filogenéticos en lugar de de los análisis genéticos de la población.
Comprender el nivel de diversidad genética y la estructura genética de la población de S. waltoni
es importante para la conservación efectiva (por ejemplo, la producción en incubación de
jóvenes a partir de poblaciones apropiadas) y la gestión (por ejemplo, restricciones a las
actividades pesqueras) de la especie.

En el presente estudio, utilizamos la secuenciación del gen del citocromo b de ADN

mitocondrial (ADNmt) (Cyt b) y la secuenciación de la región de control (CR) y una evaluación
de once loci de microsatélites polimórficos para evaluar la diversidad genética y la
diferenciación genética dentro y entre las poblaciones, y para explorar estrategias de gestión de
la conservación de esta especie. El desafío que enfrenta un estudio como este cuando se trabaja
en una especie amenazada con una distribución geográfica limitada es tomar muestras de
individuos de poblaciones suficientes y a través de un rango geográfico lo más amplio posible.
Los resultados de este estudio proporcionan nuevas ideas sobre la estructura genética de la
población de este pez amenazado que pueden contribuir a la conservación, el manejo y la
utilización sostenible de esta importante especie, y que también pueden ayudar a proporcionar
contexto para otras especies de peces endémicas amenazadas en los mismos sistemas fluviales o
similares.

Resultados
:
 Diversidad genética y estructura genética de cinco poblaciones - datos de secuencia de
ADNmt

Tanto el ADN mt Cyt b como el CR se amplificaron y secuenciaron a partir de 114 muestras de

S. waltoni. Las secuencias completas de Cyt b 1141 bp exhibieron 21 sitios variables, 17 de los
cuales fueron informativos sobre la parsimonia. Las secuencias CR parciales (712 bp) tenían 28
sitios variables, 22 de los cuales eran de parsimonia informativa, sin indels. Se definieron 17
haplotipos de Cyt b y 28 haplotipos de CR, y sus secuencias se enviaron a GenBank (números
de adhesión MK243405-MK243421 para Cyt b yMK243422-MK243449 para CR). Las
secuencias de Cyt b y CR de cada muestra se concatenaron en una secuencia de 1853 bp (5′-Cyt
b + CR-3′) para el análisis filogenético, para dar un total de 37 haplotipos de ADNmt en el
conjunto de datos concatenados. Se compartieron tres haplotipos (H03, H05 y H06) entre las
cinco poblaciones (Fig.1; Tabla S1); cada población se caracterizó por uno o más haplotipos
privados. Las cinco poblaciones se caracterizaron por valores de alta diversidad de haplotipo
(Hd = 0,941) y diversidad de nucleótidos moderada (π = 0,0052), respectivamente (Tabla1).

Figura 1

Ubicaciones de muestreo y distribución geográfica de 37 haplotipos de Cyt b + CR identificados en

Schizothorax waltoni en la meseta de Qinghai-Tíbet. YLTR, río Yarlung Tsangpo; PLTR, río Parlung
Tsangpo; YGTR, río Yigong Tsangpo; NCR, río Nianchu; LSR, río Lhasa; NYR, río Nyang; NW, cascada
de Nierikar. SG - Shigatse; MG - Maldrogongkar; QX - Quxu; SN - Shannan; ML - Mainling. El mapa se
dibujó utilizando ArcGIS 10.2 (ESRI, CA, EE. UU.) y Adobe Photoshop CS5.1 (Adobe Systems Inc., CA,
EE. UU.).
:
 Tabla 1

Índices de diversidad genética para cinco poblaciones de esquizothorax waltoni basados en el conjunto de
datos de secuencia de Cyt b, CR y Cyt b + CR concatenado.

secuencia Población N S h Hd K π

Cyt b SG 23 12 7 0,877 3.478 0,0031

miligramo 20 15 10 0,900 3.579 0,0031

QX 23 14 8 0,818 3.360 0.0029

SN 24 14 10 0,891 4,072 0,0036

ML 24 13 7 0,819 4.058 0,0036

Total 114 21 17 0,877 3.937 0,0035

CR SG 23 19 10 0,897 5.190 0,0073

miligramo 20 22 14 0,947 5.284 0,0074

QX 23 17 12 0,937 5.289 0,0074

SN 24 21 10 0.880 5.493 0,0077

ML 24 20 10 0.895 5.594 0,0079

Total 114 28 28 0,918 5,597 0,0079

Cyt b + CR SG 23 31 11 0,910 8.668 0,0047

miligramo 20 37 15 0,968 8.863 0,0048

QX 23 31 14 0,949 8,648 0,0047

SN 24 35 15 0,953 9,565 0,0052

ML 24 33 11 0,909 9,652 0,0052

Total 114 49 37 0,941 9.534 0,0052

n, número de muestras, h, número de haplotipos; S, número de sitios de separación; Hd, diversidad de

haplotipos; π, diversidad de nucleótidos; K, número de diferencias de nucleótidos.

Todos los valores de ΦST por pares entre ML (región oriental) y las otras poblaciones (SG, MG,
QX, SN, región occidental) fueron significativamente diferentes de cero después de la
corrección FDR (Tabla2).
:
 Tabla 2

Por pares ΦST (debajo de la diagonal), valores promedio de distancia genética de Kimura de 2 parámetros
(K2P) entre pares de poblaciones (por encima de la diagonal) basados en el conjunto de datos de secuencia
Cyt b, CR y Cyt b + CR concatenado.

secuencia Población SG miligramo QX SN ML

Cyt b SG — 0.003 0.003 0.003 0.004

miligramo −0,038 — 0.003 0.003 0.004

QX −0, 0,012 −0,33 — 0.003 0.004

SN −0,17 -0,029 −0,023 — 0.004

ML 0.179 0,160 0.195 0,139 —

CR SG — 0,007 0,007 0,007 0,009

miligramo −0,035 — 0,007 0,007 0,009

QX −0,26 −0,031 — 0,007 0,009

SN −0,26 −0,32 −0,023 — 0,009

ML 0,154 0.134 0,156 0.104 —

Cyt b + CR SG — 0,005 0,005 0,005 0,006

miligramo −0,036 — 0,005 0,005 0,006

QX −0,324 −0,32 — 0,005 0,006

SN −0,22 −0,30 −0,023 — 0,006

ML 0,164 0.145 0,172 0,119 —

Los valores significativos de ΦST están en negrita después de la prueba FDR (P < 0,05).

Para las secuencias concatenadas de ADNmt Cyt b + CR, AMOVA indicó que existía una
diferencia significativa entre las poblaciones (P < 0,01), pero no entre las regiones (Tabla3). Las
distancias genéticas K2P y los valores ΦST por pares entre las poblaciones oscilaron entre 0,005
y entre 0,006 y entre 0,03 y 0,172, respectivamente (Tabla2). Las distancias genéticas K2P entre
los grupos (occidental (SG) vs central (QX, MG, SN); occidental versus oriental (ML); central
versus oriental) fueron de 0,005, 0,006 y 0,006, respectivamente. Sobre la base de las secuencias
Cyt b o solo de las secuencias CR, se observaron resultados similares para el análisis AMOVA,
las distancias K2P y los valores ΦST por pares (Tablas2Y).
:
 Tabla 3

Análisis de la varianza molecular (AMOVA) de la variación genética de la población de esquizothorax

waltoni basada en Cyt b, CR y el conjunto de datos de secuencia de Cyt b + CR concatenado, así como en la
variación de microsatélites de ADN nuclear (basada en 266 bandas de microsatélites).

Fuente de variación df Componente de Porcentaje de Índice de

variación variación fijación

Cyt b
Entre las poblaciones 4 0.135 6.76 ΦST =
0,676***

Dentro de las poblaciones 109 1.860 93,24 —

Entre regiones (oeste/este) 1 0,439 19,52 ΦCT = 0,195

Entre las poblaciones dentro de las 3 −0,048 −2,13 ΦSC = −0,26

regiones

Dentro de las poblaciones 109 1.860 82,61 ΦST =

0.174***

CR

Entre las poblaciones 4 0.138 4,87 ΦST =

0,049**

Dentro de las poblaciones 109 2.688 95,13 —

Entre regiones (oeste/este) 1 0,511 16,35 ΦCT = 0,164

Entre las poblaciones dentro de las 3 −0,75 −2,40 ΦSC = 0,029

regiones

Dentro de las poblaciones 109 2.688 86,05 ΦST =

0,140**

Cyt b + CR

Entre las poblaciones 4 0,272 5,65 ΦST =

0,057**

Dentro de las poblaciones 109 4.548 94,35 —

Entre regiones (oeste/este) 1 0,950 17,68 ΦCT = 0,177
**P < 0,01, ***P < 0,001.
:
 Los dos métodos filogenéticos (NJ y ML) produjeron árboles con topologías muy similares
basadas en ADNmt concatenado (solo se muestra el árbol de NJ con valores de arranque de los
árboles de NJ y ML - Fig.2). Los 37 haplotipos formaron dos clados distintos que estaban bien
respaldados por los valores de arranque. Sin embargo, no se identificó un patrón claro de
estructura geográfica, consistente con los resultados de AMOVA (Tabla3). Los análisis
filogenéticos de NJ y ML mostraron resultados similares basados en Cyt b o CR solo (Figs S1 y
S2).
Al igual que los resultados de NJ y ML, las redes de ión de la mediana mostraron que todos
los haplotipos de las cinco poblaciones no revelaron una estructura geográfica distinta. No se
observó ninguna estructura topológica obvia en forma de explosión estelar o distribución
haplotípica central en los mapas de la red (Fig.3). El tiempo de divergencia entre los clados
principales estimados sobre la base del ADNmt combinado Cyt b + CR y en los conjuntos de
datos Cyt b fueron de 0,26 Ma a 0,39 Ma y 0,33 Ma a 0,44 Ma, respectivamente (Figs4, S3).

Figura 2

El árbol filogenético de Schizothorax waltoni que se une al vecino, basado en haplotipos de secuencia de
Cyt b + CR concatenados (1853 bp). Los haplotipos proporcionados en cada ramita y sus ubicaciones
geográficas se muestran en la Tabla S3 y la Fig.1. Los números por encima de las ramas corresponden a
valores de soporte de arranque > 50% obtenidos en los análisis de NJ/ML, respectivamente.

Figura 3

Red de conexión mediana de ADNmt (a) haplotipos de cito b, (b) haplotipos de CR y haplotipos de
secuencia de cito b + CR concatenados de cinco poblaciones de esquizothorax waltoni. El tamaño de cada
círculo haplotipo denota el número de individuos observados. Los colores corresponden a diferentes
regiones. Los círculos blancos representan haplotipos intermedios no observados. Las barras pequeñas a
través de las líneas representan pasos de pares base entre los haplotipos adyacentes.
:
 Figura 4

Árbol filogenético bayesiano para Schizothorax waltoni, basado en haplotipos de secuencias concatenadas
de ADNmt (Cyt b + CR). Los números por encima de las ramas son las estimaciones de los tiempos de
divergencia (millones de años, Ma) dentro de Schizothorax waltoni para los nodos principales según el
análisis de BEAST. Las barras sombreadas azules indican la densidad posterior (HPD) más alta del 95 %
para las edades de los nodos y la barra de escala representa el tiempo en millones de años desde el día de
hoy.

Las distribuciones de desajuste multimodal y los valores no significativos de D de Tajima y Fs

de Fu indicaron que S. waltoni se ha mantenido relativamente estable a lo largo del tiempo en
las cinco poblaciones (Fig.5a,d,g; Tabla S2). Sin embargo, se encontraron distribuciones de
desajuste unimodales, valores negativos significativos de D de Tajima, F de Fu, SSD y r no
significativos en el clade de haplotipo A de tres árboles de NJ (Fig.5b,e,h; Tabla S2). Todos estos
resultados apoyaron un modelo de expansión repentina de la población para el clado A en cada
árbol de Nueva Jersey.

Figura 5

Distribuciones de desajuste observadas y esperadas para Schizothorax waltoni en las cinco poblaciones.
Secuencias de citos: (a) haplotipos totales, (b) clado A, (c) clade C; secuencias CR: (d) haplotipos totales,
(e) clade A, (f) clade B; secuencias de cito b + CR: (g) haplotipos totales, (h) clade A, (i) clade B; línea
discontinua, distribución observada; línea sólida, distribución teórica esperada bajo un modelo de tamaño de
población constante.

Los análisis del gráfico del horizonte bayesiano (BSP) apoyaron la hipótesis de una expansión
de la población relativamente reciente del clado A (Figs6a–cy S4a-d). BSP reveló que el tamaño
de la población no tuvo cambios demográficos pronunciados durante mucho tiempo, antes de
que experimentara una pronunciada expansión de la población de ~0,05 Ma-10,10 Ma (Figs6a–c
,S4a–d).
:
 Figura 6

Trazos del horizonte bayesiano (BSP) de Schizothorax waltoni. (a) Cyt b; (b) CR; (c) Cyt b + CR; El eje X
muestra el tiempo en millones de años antes del presente. El eje Y (escala logarítmica) indica estimaciones
efectivas del tamaño de la población de mujeres (Ne) multiplicadas por el tiempo de generación (Tgen). La
línea continua indica la mediana del tamaño de la población, y el intervalo de densidad posterior más alta
(HPD) del 95 % se muestra en azul.

Diversidad genética y estructura genética de cinco poblaciones - datos de microsatélites

Como se esperaba para un tetraploide, cada locus de microsatélite tenía hasta 4 bandas
amplificadas por individuo (Tabla S3), y los 11 loci de microsatélites eran altamente
polimórficos. En total, se amplificaron 266 bandas de 11 loci de microsatélites en 221 peces
(Tabla4). El número de bandas por locus varió de 5 (loci LLK28 y Scho23) a 62 (locus Scho24)
(Tabla S3). Los valores del índice de diversidad genética fueron consistentes en el patrón en las
cinco poblaciones (Tabla4). El número total de bandas para cada población osCría entre 135
(ML) y 180 (MG). El análisis de los supuestos loci de FST atípico mostró que 11 bandas
(BayesScan), 11 bandas (Arlequin) y 15 bandas (Mcheza) se detectaron como candidatos a
atípicos para estar bajo selección (Fig. S5; Tabla S4). Sin embargo, solo nueve bandas comunes
fueron identificadas como loci atípicos por cualquiera de los tres métodos (Tabla S4). Se
eliminaron las nueve bandas atípicas y los análisis adicionales se basaron en los 257 loci
suportivamente neutros. Todos los resultados que se describen a continuación provienen de
análisis tanto del conjunto de datos completo (las 266 bandas) como del conjunto de datos
reducido (257 bandas putatively neutral). De las 266 bandas, 199 bandas (74%) fueron
compartidas por las cinco poblaciones, y las otras 67 bandas eran específicas de la población, es
decir, alelos privados (Tabla4). La población ML tenía una menor diversidad genética, según lo
que se revela por el porcentaje de loci polimórficos (PPL), la diversidad génica de Nei (H) y el
índice de información de Shannon (I) en comparación con las otras cuatro poblaciones (Tabla4).
Se observaron resultados similares para el conjunto de datos de banda 257 (Tabla S5).
:
 Tabla 4

Índices de diversidad de ADN nuclear para cinco poblaciones de Schizothorax waltoni basados en el
análisis de 266 bandas de microsatélites.

Población Bandas totales Bandas privadas PPL (%) h yo

SG 173 24 64,29 0.080 0.143

miligramo 180 15 66,54 0,082 0.147

QX 163 5 60,53 0.080 0,142

SN 167 10 62,03 0,079 0.141

ML 135 13 49,62 0,073 0,128

Medio 163,6 13.4 60,60 0,079 0.140

Total 266 67 — — —

PPL, porcentaje de loci polimórficos; H, índice de diversidad génica de Nei; I, índice de información de
Shannon.

Sobre la base del conjunto completo de datos de la banda 266, todos los valores de FST por
pares fueron significativamente diferentes de cero después de la corrección FDR, excepto las
comparaciones entre las tres poblaciones geográficamente centrales (MG, QX y SN) (Tabla5).
Los resultados de AMOVA indicaron que existían diferencias significativas entre las poblaciones
y entre las poblaciones dentro de las regiones (P < 0,01), pero no entre las regiones (Tabla3).
Los valores imparciales de distancia genética por pares y los valores de FST por pares oscilaron
entre 0 y 0,013 y entre 0,001 y 0,163, respectivamente (Tabla5). Los análisis de ESTRUCTURA
y BAPS indicaron que las estadísticas ΔK y Log(ML) alcanzaron su mayor valor en K = 2,
respectivamente, lo que sugiere que había dos subgrupos en las cinco poblaciones de S. waltoni
(Fig.7a–d). Estos estaban compuestos por peces de SG en el extremo aguas arriba (occidental)
del YLTR y peces de ML en el extremo aguas abajo (este) del río. Los peces de las tres
poblaciones geográficamente centrales cayeron en una posición intermedia entre estos dos
grupos. El árbol de agrupación de NJ basado en las distancias genéticas imparciales de Nei entre
las poblaciones (Fig.8a) y las parcelas de PCoA de las relaciones entre los individuos (Fig.8b) y
entre las poblaciones (Fig.8c) fueron consistentes con el patrón de los resultados de los análisis
de STRUCTURE y BAPS, y sugirieron que la población de ML era la más diferenciada
genéticamente y, por lo tanto, más distinta. Los resultados basados en el conjunto de datos

S6 S7 S6a S7a,c
:
 reducido fueron todos similares a los descritos anteriormente (Tablas S6 y S7; Figs S6a,c; S7a,c),
excepto que no se encontró una estructura genética de población clara basada en BAPS (Fig.
S6b,d) y análisis de PCoA entre individuos (Fig. S7b).

Tabla 5

Matriz de valores de FST por pares (por debajo de la diagonal) y las distancias genéticas imparciales de Nei
(por encima de la diagonal) entre cinco poblaciones de Schizothorax waltoni basadas en la variación en 266
bandas de microsatélites.

Población SG miligramo QX SN ML

SG — 0.004 0.003 0.004 0.013

miligramo 0.055 — 0.001 0,000 0,006

QX 0,042 0.004 — 0.001 0,007

SN 0,060 0.001 0,006 — 0,006

ML 0,163 0,092 0,102 0,097 —

Los valores significativos de FST están en negrita después de la prueba FDR (P < 0,05).

Figura 7

Análisis de grupos de poblaciones de Schizothirax waltoni basados en las 266 bandas amplificadas en 11
loci de microsatélites. (a) Inferencia del mejor K en la ESTRUCTURA 2.3; (b) Inferencia del mejor K en
BAPS 6.0; (c) Histograma de la prueba de asignación usando la ESTRUCTURA 2.3 (K = 2); (d)
Histograma de la prueba de asignación usando BAPS 6.0 (K = 2); Cada individuo está representado por una
línea de color vertical, y cada color corresponde a un grupo genético.
:
 Figura 8

Relación genética entre cinco poblaciones de Schizothorax waltoni basada en las 266 bandas amplificadas
en 11 loci de microsatélites. (a) Árbol de agrupación de NJ basado en las distancias genéticas imparciales de
Nei entre las poblaciones; (b) Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en las distancias
genéticas por pares entre los individuos; (c) PCoA basado en las distancias genéticas por pares entre las
poblaciones.

Aislamiento por distancia (IBD)

Las pruebas de Mantel no revelaron una correlación significativa entre ΦST/(1 − ΦST) y Ln(d)
para la variación de la secuencia de ADNmt (R2 = 0,59, P = 0,097, Fig. S8a). Sin embargo, se
observó una correlación significativa entre FST/(1 − FST) y Ln(d) basada en la variación de los
microsatélites (R2 = 0,74, P = 0,043, Fig. S8b). Los resultados confirmaron la aparición de un
modelo de flujo genético de EII, consistente con los resultados del análisis de ESTRUCTURA.
Cuando se realizó el análisis de IBD en el conjunto de datos reducido, no se observó una
correlación significativa (R2 = 0,69, P = 0,078, Fig. S9).

Discusión

Como el ecosistema de alta elevación más grande del mundo, la meseta de Qinghai-Tíbet (QTP)
se caracteriza por una alta riqueza de especies y abundantes especies endémicas, y ha sido
22
identificada como uno de los centros de biodiversidad más importantes del mundo. . El estado
23 24
único del QTP surge debido a la influencia de su historia geológica en su biodiversidad , . Sin
embargo, el QTP ha sido identificado como una región que necesita protección urgente para
conservar su biodiversidad debido a las muchas amenazas antropogénicas a las que se enfrenta
25
ahora . Si bien se han puesto en marcha medidas de conservación para proteger a algunos peces
de agua dulce QTP (el Área Nacional de Conservación de Recursos de Germoplasma Acuático
Basum-Tso en el Tíbet fue establecida en 2011 por el Ministerio de Agricultura de China) y S.
waltoni en particular (por ejemplo, un programa de reproducción y reposición), es poco
probable que tales acciones salvaguarden el futuro a largo plazo de esta especie. Si bien la
identificación de amenazas a la biodiversidad de los peces de agua dulce puede ser relativamente
2
sencilla y ha sido bien documentada , el establecimiento de estrategias para mitigar las
:
 amenazas que ocurren a escala global (por ejemplo, el cambio climático) es una perspectiva
mucho más difícil, y es el verdadero desafío al que se enfrenta ahora la biología de la
conservación.

26
Como otros peces esquizothoracinos poliploides en el Tíbet , S. waltoni exhibe altos niveles de
diversidad genética dentro de la población. Si bien no se identificó una diferenciación genética
de población obvia mediante el análisis de las secuencias de ADNmt, se observó una estructura
poblacional pronunciada basada en el análisis de microsatélites. La naturaleza de gradiente de la
diferenciación genética (de oeste a este) observada para el microsatélite de ADN nuclear sugiere
fuertemente que el resultado es real y no artefacto, a pesar del número limitado de sitios desde
los que fue posible recoger peces. Estos análisis también identificaron claramente por primera
vez tres subpoblaciones genéticamente distintas: oeste (SG), centro (MG, QX y SN) y este (ML)
dentro del YLTR. El muestreo adicional en el futuro de sitios en las regiones aguas arriba
(oeste) y aguas abajo (este) del YLTR permitirá probar tanto la principal diferenciación este-
oeste como también de los tres clados.

Diversidad genética

La UICN ha identificado la diversidad genética como una forma importante de biodiversidad,

27
que merece conservación dentro de cada población . Nuestro estudio, utilizando marcadores
mitocondriales y nucleares, reveló que la variación genética es relativamente alta en S. waltoni,
a pesar de las amenazas a las que se enfrenta actualmente esta especie. Los resultados del
ADNmt (tanto los índices de variación genética Hd como π) revelan que S. waltoni tiene altos
niveles de diversidad genética comparable a otros peces esquizotorácicos que se encuentran en o
23 26 28
alrededor del QTP , , . Sin embargo, cuando se combinan, los resultados del ADNmt indican
que S. waltoni cae en un grupo con un alto nivel de diversidad de haplotipos (Hd > 0,5) y un
29
nivel moderado de diversidad de nucleótidos (π > 0,005) , que es diferente del patrón de
diversidad genética (alta diversidad de haplotipos pero baja diversidad de nucleótidos)
23 26 28
observado en otros peces esquizotorácico , , .

Debido al patrón de herencia tetraploide de los peces esquizothoracina, se han reportado pocos
estudios genéticos de población basados en marcadores de microsatélites para estos peces, lo
que significa que es difícil juzgar los niveles absolutos de diversidad de ADN nuclear. El
número medio de bandas por locus de microsatélite (24,18) de S. waltoni se encuentra entre las
28 30
dos estimaciones anteriores con las que se puede hacer la comparación , .

Un alto nivel de diversidad de haplotipos de ADNmt y un nivel moderado de diversidad de

nucleótidos en S. waltoni son indicativos de contacto secundario entre linajes diferenciados o de
29
una gran población estable con una larga historia evolutiva . Diferenciar entre estas dos
:
 explicaciones es difícil. El QTP ha experimentado varios períodos de elevación pronunciada
31
desde el Cuaternario, creando cambios sustanciales en el clima y el medio ambiente natural e
influyendo significativamente en los rangos de distribución de los peces esquizothoracinas. Por
lo tanto, el contacto secundario de las poblaciones de S. waltoni anteriormente aisladas puede
haber ocurrido debido al aumento y el cambio climático del QTP. En apoyo de la segunda
explicación, observamos que las pruebas de neutralidad y los análisis de distribución de
desajuste confirmaron la probable existencia de una población estable sin eventos de expansión
recientes para S. waltoni.

Estructura genética de la población

Dadas sus diferentes historias evolutivas, tasas de mutación, modos de herencia y tamaños
efectivos de la población, se espera que los marcadores de ADNmt reflejen con mayor precisión
la situación histórica (astral), mientras que se espera que los marcadores de ADN nuclear
reflejen mejor la situación contemporánea. En conjunto, los resultados pueden ser informativos
en términos de comprensión de cómo los cambios en el paisaje (por ejemplo, una elevación
importante y rápida en el QTP que resulta en el aislamiento en un entorno de gran altitud) han
influido en las distribuciones a lo largo del tiempo de S. waltoni y su estructura genética de la
23 32
población , .

El análisis de los datos de la secuencia de ADNmt concatenado indicó que había una
diferenciación genética moderada-alta y significativa entre ML (población más al este) y las
otras cuatro poblaciones aguas arriba (SG, MG, QX, SN) que formaban un grupo
indiferenciado. Sin embargo, las cinco poblaciones tenían haplotipos privados, lo que sugiere
que debe haber alguna barrera menor para el flujo de genes entre las poblaciones para mantener
este bajo nivel de diferenciación a lo largo de muchas generaciones. En los análisis filogenéticos,
se identificaron dos grupos (linajes evolutivos). Sin embargo, los haplotipos agrupados en un
subgrupo no eran de una población específica, sino de las cinco poblaciones (Fig.2; Tabla S1).

Los haplotipos compartidos de ADNmt y las distribuciones espaciales superpuestas de los peces
en los dos linajes evolutivos probablemente reflejan un escenario de contacto secundario
después de un período de aislamiento. Históricamente, los eventos geológicos y el cambio
climático han influido significativamente en la diversidad y la estructura genética de la
33 34
población de los organismos endémicos en el QTP , . Hacia el extremo oriental del YLTR,
entre Shannan y Mainling, está la cascada Nierikar de 30 m de altura (NW, que significa "los
peces están bloqueados aquí" en tibetano). Esta cascada, que se encuentra en el desfiladero de
Jiacha (3.300 m sobre el nivel del mar (asl)), impide la migración contemporánea de peces aguas
34
arriba. Sin embargo, debido a los varios lagos glaciares incautados por la morrena , la cascada
Nierikar podría no haber impedido la dispersión (histórica) aguas arriba de S. waltoni. Desde
:
 finales del Pleistoceno hasta principios del Holoceno, estos antiguos lagos glaciares se
encontraban en la corriente principal que se encuentra inmediatamente aguas arriba de la Gran
35 34
Garganta de Tsangpo . Según él y Chen , la elevación de la superficie de estos antiguos lagos
glaciares (3.800 a 3.530 m a.l) superó la elevación de la cascada de Nierikar (3.300 m a.a.a.).
Por lo tanto, los antiguos lagos podrían haberse extendido hasta el arroyo superior del
desfiladero de Jiacha y la cascada Nierikar observada hoy en día y no habrían evitado la
34
dispersión aguas arriba de S. waltoni en el Pleistoceno . No se encuentran cascadas o cascadas
importantes a lo largo del YLTR entre Shigatse (SG) y Shannan (SN), y por lo tanto no hay
ningún impedimento para el flujo de genes (conectividad) entre las poblaciones de S. waltoni
dentro de estos ~300 km del río. Como consecuencia de la morfología y la historia geológica del
río, se observó una pronunciada diferenciación genética de ADNmt entre ML (aguas abajo de la
cascada Nierikar) y las otras cuatro poblaciones. Los tiempos de divergencia entre los clados
principales están correlacionados con el posterior Movimiento Kunlun-Huanghe (alrededor de
31
0,6 Ma-1,1 Ma) y el Movimiento Gonghe (~0,15 Ma) , los resultados son consistentes con el
principal tiempo de divergencia reportado para S. o'connori en la misma región (0,30 Ma-0.43
23
Ma) .

La estructura genética de la población pronunciada de S. waltoni se identificó mediante el

análisis de la variación de los microsatélites que refleja el flujo genético contemporáneo (últimas
generaciones). De acuerdo con los resultados del ADNmt, los resultados del ADN nuclear
revelaron una divergencia genética significativa entre ML en el este y las cuatro poblaciones
aguas arriba (oeste), y también revelaron una divergencia genética pequeña pero significativa
entre SG (población más occidental) y las tres poblaciones centrales (MG, QX, SN). Tal
discordancia entre los marcadores nucleares y de ADNmt es un fenómeno de los que se informa
36
a menudo . Sin embargo, no se encontró una estructura genética de población obvia basada en
los análisis de 257 bandas de microsatélites putativamente neutras. Por lo tanto, la señal genética
de diferenciación está contenida en gran parte o únicamente dentro de las nueve bandas que
están bajo supuesta selección, lo que destaca la importancia de retener las bandas portadoras de
señal (alelos) bajo ciertas circunstancias para la cuantificación de la diferenciación genética
37 38
espacial , . Sin embargo, observamos que la retención de bandas que están suponiendo la
selección violará algunas suposiciones de neutralidad asociadas con muchos análisis. Además,
observamos que el tratamiento de los loci de microsatélites codominantes como loci dominantes
(los fenotipos alélicos se transformaron en un conjunto de datos de presencia/ausencia) es
inusual, pero está justificado en el presente caso dada la naturaleza tetraploide de la especie
focal. En cualquier caso, desde una perspectiva de gestión, el conjunto de datos es informativo
porque proporciona evidencia de una estructura genética espacial que de otro modo podría
haberse pasado por alto.
:
 La existencia de dos linajes evolutivos recibió un fuerte apoyo de los análisis de STRUCTURE y
BAPS de la variación de microsatélites, que mostraron que las poblaciones de SG (más al este) y
ML (más al este) representan dos grupos diferentes de S. waltoni, mientras que se encontró un
grupo mixto en las tres poblaciones centrales (MG, QX, SN). Estos resultados fueron
confirmados por el PCoA y por un patrón significativo de EII. Esta pronunciada estructura
genética de la población de microsatélites refleja la erosión contemporánea de las diferencias
genéticas que se acumuló cuando la población original de S. waltoni se dividió en dos, y es, en
efecto, una zona secundaria de contacto entre los dos linajes contemporáneos. En términos de
flujo direccional de genes entre los dos linajes, no hay cascadas sustanciales a lo largo del YLTR
en la región de las tres poblaciones centrales (MG, QX, SN) hoy en día, aunque se encuentran
varias cascadas pequeñas entre SG y QX que pueden actuar para reducir o prevenir el flujo de
genes y/o la dispersión por el río (desde QX y más arriba hasta SG en el oeste), pero no en la
otra dirección. Estos resultados indican que las cascadas en las regiones del extremo este (cerca
de ML) y del extremo oeste (cerca de SG), específicamente entre las poblaciones SN y ML y
entre SG y QX, pueden bloquear el flujo genético contemporáneo de S. waltoni, mientras que es
probable que el flujo genético contemporáneo sea frecuente entre las tres poblaciones centrales
donde no hay cascadas. Claramente, estos hallazgos y nuestra interpretación de ellos, se
beneficiarán de un mayor muestreo de las poblaciones de S. waltoni, tanto en el oeste, por
encima de la cascada de Nierikar para probar la diversidad de los clados, y en particular en el
este, por debajo de la cascada de Nierikar, desde donde actualmente solo tenemos una
población. Un mayor muestreo en el este ayudará a cuantificar la distribución y abundancia de
este pez en una región que parece estar fuera de su rango principal de distribución.

Implicaciones de conservación y gestión

Debido a sus características de historia de vida seleccionadas por K, S. waltoni es susceptible a

39
la sobrepesca por crecimiento y al agotamiento de las poblaciones . Debido a las dificultades
inherentes en el estudio de S. waltoni, la biología de la especie sigue siendo poco entendida, un
hecho que ha obstaculizado su conservación efectiva y ha permitido la planificación de la
conservación solo a escala local (es decir, el Reglamento de Protección de Peces Silvestres de
Lhasa).

Los peces del YLTR se enfrentan a una serie de amenazas antropogénicas, incluida la fuerte
presión de la pesca, la pérdida/modificación del hábitat, el cambio climático y las especies
introducidas. Sin embargo, de particular preocupación es la construcción de la presa, que es una
amenaza inmediata y a largo plazo para la conectividad. El impacto ambiental de mayor
40
preocupación es que la presa cambia el flujo del río de un valle del río río arriba a un embalse .
Además, puede haber cambios en la calidad del agua aguas abajo, incluyendo la temperatura del
40
río, la carga de nutrientes, los gases disueltos, los metales pesados y los sedimentos. . Las
:
 presas pueden causar pérdida de hábitat, cambiar los entornos reproductivos de los peces y
obstaculizar la migración de peces reproductores, lo que resulta en una disminución sustancial
40 42
de los recursos genéticos de los peces – . En 2014, se completó la construcción de la presa de
Zangmu (con una escalera de peces), la primera presa en la corriente principal del YLTR. En el
futuro se construirán otras siete (al menos) presas en la corriente principal del YLTR y las siete
presas se ubicarán en la región entre SN y ML. Estas presas se sumarán a la barrera natural
existente para el movimiento de peces que ya existe en esta región causada por la cascada
Nierikar. Las diferencias genéticas existentes entre los linajes pueden mejorarse con la
construcción de presas que pueden reducir o prevenir aún más el movimiento de peces aguas
abajo (es decir, SN a ML) incluso más que la cascada de Nierikar existente. Aunque el plan de la
presa incluye escaleras de peces, se desconoce el éxito de una escalera de peces y tendrá que ser
evaluado durante mucho tiempo para determinar su éxito, dado que incluso las medidas de
protección más eficientes no pueden evitar algún nivel de deterioro de la función del
40 42
ecosistema , .

Las unidades evolutivamente significativas (ESU) y las unidades de gestión (MU) son dos
43
conceptos importantes en la genética de conservación . Una ESU se define como una población
que intercambia pocos migrantes con otros y que ha estado aislada geográficamente durante el
43
tiempo suficiente para ser genéticamente distinta e independiente . Alta diferenciación genética
(entre ML y las otras cuatro poblaciones), pero no se observó una estructura de población obvia
en S. waltoni basada en el análisis de ADNmt. Sin embargo, la diferenciación genética
moderada y la estructura poblacional pronunciada se encuentran en base al análisis de
microsatélites. Debido a que no se encontró monofilia recíproca en este estudio, proponemos
una única ESU para las cinco poblaciones de S. waltoni. Dados los resultados de los análisis de
microsatélites, tres grupos ([SG], [MG + QX + SN] y [ML]) deben definirse como diferentes
MU dignos de protección como existencias distintas. Sin embargo, los S. waltoni recogidos en la
región occidental (SG o MG) se han utilizado como reproductores en el programa de
reproducción artificial en ML. Surge la pregunta de si estos peces de los padres occidentales son
genéticamente similares a los peces locales en ML y si los juveniles (utilizados para la
reintroducción aguas abajo) eclosionados de los padres occidentales son capaces de adaptarse al
área de su liberación (p. ej. ML). Nuestros resultados muestran claramente que el oeste de S.
waltoni (peces de SG, MG, QX, SN) son genéticamente diferentes de los peces de ML, en el
este. Como tal, sugerimos que sea apropiado cancelar, o al menos posponer, la recolección
adicional de S. waltoni sexualmente maduro de la región occidental para ser utilizado como
reproductor para la liberación de juveniles en ML hasta que se disponga de herramientas que
permitan determinar la aptitud de los individuos en entornos específicos.

Material y métodos
:
 Declaración de ética

No se requerían permisos específicos para la investigación de campo en este estudio.

Confirmamos que no hubo participación de ninguna especie en peligro de extinción en el
muestreo de campo. El plan de muestreo de peces y el protocolo de investigación animal fueron
aprobados por el comité de supervisión de la investigación animal de la Universidad Agrícola de
Huazhong (HZAU). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la HZAU, y todos los métodos se realizaron de
acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

Recogida de muestras, tamaños de muestra y aislamiento de ADN

El muestreo fue diseñado para recoger S. waltoni de tantos sitios como sea posible en el YLTR
(Fig.1) porque S. waltoni solo se encuentra en el canal principal y en la mayoría de los afluentes
(p. ej. Río Lhasa (LSR) y río Nyang (NYR)) del YLTR sobre el Gran Cañón de Yarlung
14
Tsangpo . Sin embargo, en nuestro muestreo, fue difícil encontrar a S. waltoni en los afluentes
(p. ej. Nyingchi a lo largo de la RNY), e incluso en el canal principal (p. ej. Paizhen). Por lo
tanto, basándose en el éxito del muestreo en lugar de en el número de sitios visitados, se
recogieron peces de cinco poblaciones (Shigatse (SG), Maldrogongkar (MG), Quxu (QX),
Shannan (SN) y Mainling (ML)) durante 2012 a 2013 (Tabla S8). Basado en su posición en
relación con la cascada Nierikar de 30 m de altura (Fig.1), las poblaciones se dividieron en
regiones occidentales y orientales (al oeste de NW: SG, MG, QX y SN; al este de NW: ML).
Todos los peces fueron capturados por redes de enmalle o electropesca; los clips de aletas se
conservaron en etanol al 95 % a -20 °C.

Los tamaños de muestra específicos de la población reflejan un equilibrio entre una serie de
factores diferentes, incluido el tiempo/esfuerzo de muestreo, el costo, el contenido de
información del marcador en sí y el hecho de que S. waltoni es una especie amenazada que es
difícil de capturar y que ahora existe en números de población bajos. Está claro que el tamaño de
la muestra es importante e influirá en los resultados y su interpretación. Para los análisis de
microsatélites, de 25 a 30 individuos por población son suficientes para estimar con precisión las
frecuencias alélicas si los niveles de polimorfismo específicos del locus no son muy altos para
44
este tipo de marcador de ADN nuclear heredado biparentalmente . Para el ADNmt, que es
hereditario materno y no experimenta recombinación, generalmente se acepta que la mitad del
tamaño de la muestra de microsatélite es suficiente para los análisis filogeográficos y de genética
de poblaciones. En este estudio, los tamaños de muestra para los análisis de microsatélites
promediaron 44,2 y para el ADNmt promediaron 22,8 individuos por población.
:
 El aislamiento del ADN genómico y la estimación de la concentración se realizaron siguiendo a
23
Guo et al. .

amplificación, secuenciación y análisis de datos del ADNmt

El citocromo b completo (Cyt b, 1141 pb) y la región de control parcial (CR, 712 pb) se
23
secuenciaron de acuerdo con Guo et al. . Las secuencias de Cyt b se amplificaron con los
34 23
cebadores L14724 y H15915 , y las secuencias CR se amplificaron usando DL-F y DL-R . Las
secuencias de Cytb se secuenciaron en direcciones hacia adelante y hacia atrás, las secuencias de
CR se secuenciaron en la dirección hacia adelante.

La alineación de secuencias múltiples, la diversidad de haplotipos (Hd), la diversidad de

nucleótidos (π), el número de sitios de separación (S), el número de haplotipos (h), el número de
diferencias de nucleótidos (K), la red de conexión de mediana y las distancias genéticas de 2
parámetros de Kimura (K2P) entre las poblaciones se realizaron/estimaron después de Guo et
23
al. . Nos centramos principalmente en los resultados de la secuencia concatenada (Cyt b + CR)
porque Cyt b + CR proporcionó la mayor parte de la información. El análisis de la varianza
45
molecular (AMOVA) se llevó a cabo utilizando Arlequin 3.5 para probar la diferenciación
genética entre poblaciones/regiones. Se realizaron 10.000 permutaciones para examinar la
significación estadística de los índices de fijación (Φ). La corrección de las pruebas múltiples se
46
realizó utilizando la tasa de descubrimiento falso del método Benjamini-Yekutieli (BY-FDR) , y
las comparaciones se consideraron significativas a P < 0,05.

Para examinar las relaciones entre las poblaciones y para probar la evidencia de dispersión
histórica, se empleó un análisis filogenético basado en Cyt b, CR y el conjunto de datos
concatenados (Cyt b + CR) de forma independiente utilizando la unificación de vecinos (NJ) y
47
la máxima probabilidad (ML) en MEGA 5.0 . A excepción de los modelos HKY + G (Cyt b),
T92 + G (CR) y HKY + G (Cyt b + CR) utilizados para los análisis de ML, los otros
23
procedimientos de análisis filogenético se llevaron a cabo siguiendo a Guo et al. . S. o'connori
(GenBank accession no.KC513575), S. macropogon (KC020113) y Schizopygopsis
younghusbandi (KC351895) se utilizaron como grupos externos.

Se realizaron análisis filogenéticos bayesianos para construir árboles de Monte Carlo de cadena
de Markov (MCMC) con Cyt b y los datos de ADNmt concatenados (Cyt b + CR) de forma
23
independiente siguiendo a Guo et al. , y el tiempo de divergencia entre los clados principales se
añadieron en los árboles de MCMC. Las parcelas del horizonte bayesiano (BSP) basadas en la
coalecencia y las distribuciones de desajuste se utilizaron para estimar la dinámica histórica de
23
la población. Los BSP se llevaron a cabo después de Guo et al. para estimar la variación
:
 temporal del tamaño efectivo de la población para determinar la historia demográfica.
48 49
Distribuciones no coincidentes se implementaron en Arlequin 3.5 y DnaSP 5.1 . Las pruebas D
y Fs de Tajima y Fu se realizaron para probar si las dos secuencias de ADNmt se ajustaban a las
50 51
expectativas de neutralidad , . La suma de las desviaciones al cuadrado (SSD) y el índice de
irregularidad (r) se calcularon utilizando Arlequin 3.5 para probar si las secuencias se desviaban
52
significativamente de un modelo de expansión de la población . Todos los valores de P se
corrigieron utilizando el BY-FDR. El tiempo de expansión de la población en años (T) se estimó
23
según lo descrito por Guo et al. . El tiempo de generación de S. waltoni se estimó en 10 años en
18
función de la edad de maduración femenina . Solo consideramos la edad femenina debido a la
herencia materna del ADN mitocondrial. Se asumió que las tasas de mutación de Cyt b, CR y
23
Cyt b + CR eran del 1,0 %, 3,6 % y 1,69 % por sitio por millón de años, respectivamente .

Genotipo de microsatélites nucleares y análisis de datos

23
Once marcadores de microsatélites se seleccionaron en función del rango de tamaño alélico, la
temperatura de recocido y el rendimiento de puntuación. Los cebadores (Tabla S3) se sintetizaron
23
y etiquetaron con tintes fluorescentes en los extremos de 5' para la amplificación de PCR . La
37
separación capilar y la puntuación del tamaño del alelo se realizaron después de Wei et al. y
23
Guo et al. . Debido a que S. waltoni es un pez tetraploide, y debido a que se desconoce qué
53
alelos forman pares, no pudimos usar software como LOSITAN para probar si se trata de loci
atípicos. Por lo tanto, los loci de microsatélites se consideraron como marcadores dominantes y
los fenotipos alélicos de multilocus se transformaron en presencia (1) o ausencia (0) para cada
individuo. Cada banda se consideraba como un solo locus bialélico con un alelo aplificable
(dominante) y nulo (recesivo). Para detectar las bandas candidatas bajo selección, el método de
54 55
valor atípico FST se realizó utilizando tres softwares: BayeScan 2.1 , Arlequin 3.5 y Mcheza .
Para BayeScan, utilizamos los valores predeterminados con respecto al intervalo de
adelgazamiento, el ajuste de las distribuciones de la propuesta, el número de carreras piloto y los
límites previos uniformes para el FIS e incluimos un período de grabación de 50.000 iteraciones
y las probabilidades previas del modelo neutro de 10. Los ajustes predeterminados también se
utilizaron en los análisis de Arlequin y Mcheza. El conjunto de datos se dividió en dos
56
subgrupos, loci "neutral" y "seleccionado" (ejecual), siguiendo a Luikart et al. . Para el
conjunto de datos neutros, eliminamos las bandas supuestamente identificadas como valores
atípicos, tanto las clasificadas como bajo selección direccional como estabilizadora, por dos de
los tres métodos (BayeScan, Arlequin y Mcheza). Todos los análisis se realizaron en todas las
bandas y en los conjuntos de datos de bandas neutras.

Los índices de diversidad genética como el índice de diversidad génica de Nei (H), el índice de
información de Shannon (I), el porcentaje de loci polimórficos (PPL), la distancia genética
imparcial de Nei y las relaciones entre poblaciones e individuos (PCoA) se evaluaron después de
23
:
 23
Guo et al. . Utilizando el conjunto de datos binarios, se llevó a cabo un análisis de agrupación
57
bayesiana en la ESTRUCTURA 2.3 para determinar el número esperado de grupos genéticos,
23
según lo descrito por Guo et al. . Se realizaron diez ejecuciones independientes para cada
58
conjunto de grupos (K) de 1 a 5. La métrica ΔK se utilizó para evaluar el mejor ajuste K a
través de Structure Harvester (http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/) y las carreras
se agruparon y se mostraron visualmente usando CLUMPAK (http://clumpak.tau.ac.il/). Para
confirmar la distribución de los individuos entre los grupos genéticos y verificar la atribución de
los individuos a los grupos revelados por STRUCTURE, también utilizamos el enfoque de
59 60
agrupación implementado en BAPS 6.0 , . Los análisis BAPS se llevaron a cabo en grupos de
individuos (es decir, muestras de sitio) en lugar de individuos, con supuestos simples de modelo
(es decir, sin mezclas y frecuencias de alelos no correlacionadas). BAPS se estableció con 10
carreras de réplicas para cada K (de 2 a 5) y otras 100 carreras de réplica con K fijada al número
inferido de grupos genéticos (mejor K). El K de mejor ajuste se evaluó utilizando el valor de
probabilidad marginal de Log más alto [Log(ML)]. Y luego, se ejecutó un modelo de mezcla
para el número inferido de grupos (1000 iteraciones, individuos mínimos por grupo = 5,
individuos de referencia = 200, iteraciones para individuos de referencia = 10).

Aislamiento por distancia (IBD)

Probamos la EII utilizando GENEPOP (http://genepop.curtin.edu.au/) para investigar si la

distancia genética ([ΦST/(1 − ΦST)] para los datos de ADNmt o [FST/(1 − FST)] para los datos
de microsatélites) se correlacionó con la distancia geográfica [Ln(d)] entre las cinco poblaciones
61
(Tabla S9), como se recomienda para un modelo bidimensional . Los niveles de significación se
determinaron utilizando pruebas de Mantel separadas para los conjuntos de datos de ADNmt y
microsatélites implementados en ISOLDE por GENEPOP empleando 20 000 permutaciones.

Información complementaria

Información complementaria para la filogeografía de <i>Schizothorax waltoni</i>(2.3M, pdf)

Conocimientos

Agradecemos a Bin Huo y Hui-Juan Zhang por su ayuda en la recogida de muestras. Este trabajo
fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No.
31772851), el Fondo Especial para la Investigación Agrocientífica de Interés Público
:
 (Subvención No. 201203086-13), y la Fundación de Investigación Científica para la
Introducción de Talentos de Alto Nivel, Universidad Agrícola de Huazhong (Subvención No.
2012RC012).

Contribuciones de los autores

K.-J.W., X.-Z.G., G.-R.Z. y Q.-W.W.W. concibió y diseñaron el estudio; X.-Z.G. recogió las
muestras del campo; X.-Z.G., G.-R.Z., W.J. y R.-J.Y. realizaron experimentos; X.-Z.G., K.-J.W.,
G.-R.Z. y J.P.A.G. analizaron los datos; X.-Z.G., K.-J.W. y J.P.A.G. escribieron el artículo; todos
los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Notas

Intereses en competencia

Los autores no declaran intereses en conflicto.

Notas al pie

Nota del editor: Springer Nature sigue siendo neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales
en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales.

Material complementario electrónico

La información complementaria acompaña a este documento en 10.1038/s41598-019-39128-y.

Referencias

1. Cuerno MH. La cantidad de espacio disponible para los peces marinos y de agua dulce. Pescado. Toro. EE.
UU.1972;70:1295–1298. [Google Académico]

2. Magurran AE. Amenazas para los peces de agua dulce. Science.2009;325:1215–1216. doi:
10.1126/science.1177215. [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

3. Dudgeon D. Peces de río asiáticos en el Antropoceno: amenazas y desafíos de conservación en una era de rápido
cambio ambiental. J. Fish Biol.2011;79:1487–1524. doi: 10.1111/j.1095-8649.2011.03086.x. [PubMed] [CrossRef]
[Google Académico]
:
 4. Cao L, Zhang E, Zang C, Cao W. Evaluar el estado de los peces continentales de China y analizar sus causas de
peligro a través de la evaluación de la lista roja. Biodivers. Sci. 2016;24:598-609. doi: 10.17520/biods.2015331.
[Referencia cruzada] [Google Académico]

5. Cooke SJ, et al. No involucrar al público en cuestiones relacionadas con los peces y la pesca en el interior:
estrategias para crear la voluntad pública y política para promover una conservación significativa. J. Pescado Biol.
2013;83:997–1018. [PubMed] [Google Académico]

6. Freitas CEC, Siqueira-Souza FK, Florentino AC, Hurd LE. La importancia de las escalas espaciales para el análisis
de la diversidad de peces en los lagos aluviales amazónicos y las implicaciones para la conservación. Ecol. Freshw.
Fish.2014;23:470–477. doi: 10.1111/eff.12099. [Referencia cruzada] [Google Académico]

7. Barnosky AD, et al. ¿Ya ha llegado la sexta extinción masiva de la Tierra? Naturaleza. 2011;471:51–57. doi:
10.1038/nature09678. [PubMed] [CrossRef][Google Académico]

8. Mirza MR. Una contribución a la sistemática de los peces esquizothoracinas (Piscis: Cyprinidae) con la descripción
de tres nuevas tribus. Pak. J. Zool.1991;23:339–341. [Google Académico]

9. Chen, Y. & Cao, W. Schizothoracinae in Fauna Sinica, Osteichthyes: Cypriniformes III (ed. Yue, P.) 273-390
(Science Press, 2000).

10. Zan R, Liu W, Song Z. Relación tetraploide-hexaploide en Schizothoracinae. Acta Genet. Sin.1985;12:137–142.
[Google Académico]

11. Cui J, Ren X, Yu Q. Variación del contenido de ADN nuclear en peces. Citología. 1991;56:425−429.[Google
Académico]

12. Wang X, Gan X, Li J, Chen Y, He S. La filogenia de Cyprininae reveló orígenes independientes de los ciprinidos
poliploides endémicos de la meseta tibetana y sus diversificaciones relacionadas con el levantamiento neógeno de la
meseta. Sci. China Life Sci. 2016;59:1149–1165. doi: 10.1007/s11427-016-0007-7. [PubMed] [CrossRef] [Google
Académico]

13. FishBase. Species 2000 & ITIS Catalogue of Life (versión 02/2017). Disponible en
http://www.catalogueoflife.org/col. [consultado el 30 de mayo de 2017] (2017).

14. Wu, Y. & Wu, C. Esquizothoracinas en Los peces de la meseta de Qinghai-Xizang (eds Wu, Y. & Wu, C.) 297-
513 (Sichuan Publishing House of Science & Technology, 1992).

15. Wu Y, Kang B, Men Q, Wu C. Diversidad cromosómica de peces tibetanos. Zool. Res. 1999;20:258–264. [Google
Académico]

16. UICN. La Lista Roja de Especies Amenazadas de la UICN (versión 2016-3). Disponible en
http://www.iucnredlist.org. [consultado el 30 de mayo de 2017] (2017).

17. Jiang Z, et al. Lista roja de vertebrados de China. Biodiversos. Sci. 2016;24:500–551. doi:
10.17520/biods.2016076. [Referencia cruzada] [Google Académico]
:
 18. Zhou X, et al. Biología reproductiva de Schizothorax waltoni (Cyprinidae: Schizothoracinae) en el río Yarlung
Zangbo en el Tíbet, China. Environ.Biol. Peces. 2015;98:597–609. doi: 10.1007/s10641-014-0293-0. [Referencia
cruzada][Google Académico]

19. Chen F, Chen Y. Estrategias de investigación y protección de los peces del río Lhasa. Acta Hydrobiol. Pecado.
2010;34:278–285. doi: 10.3724/SP.J.1035.2009.00278. [Referencia cruzada][Google Académico]

20. Fan L, Liu H, Lin J, Pu Q. Peces no nativos: distribución y estructura de ensamblaje en la cuenca del río Lhasa,
Tíbet, China. Acta Hydrobiol. Sin.2016;40:958–967. [Google Académico]

21. Simoons F. El pescado como alimento prohibido: El caso de la India. Ecol. Comida. Nutr. 1974;3:185–201. doi:
10.1080/03670244.1974.9990381. [Referencia cruzada][Google Académico]

22. Myers N, Mittermeier RA, Mittermeier CG, da Fonseca GA, Kent J. Puntos críticos de biodiversidad para las
prioridades de conservación. Naturaleza. 2000;403:853–858. doi: 10.1038/35002501. [PubMed] [CrossRef][Google
Académico]

23. Guo X, et al. Filoeografía y genética de la población de Schizothorax o'connori: fuerte subdivisión en el río
Yarlung Tsangpo inferida a partir del ADNmt y los marcadores de microsatélites. Sci. Rep.2016;6:29821. doi:
10.1038/srep29821. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

24. Yang S, Dong H, Lei F. Filoeografía de la fauna regional en la meseta tibetana: Una revisión. Prog. Nat. Sci.
2009;19:789-799. doi: 10.1016/j.pnsc.2008.10.006. [Referencia cruzada] [Google Académico]

25. Kang B, et al. Mapeo de los peces de agua dulce de China: diversidad y biogeografía. Pescado, pescado.
2014;15:209–230. doi: 10.1111/faf.12011. [Referencia cruzada] [Google Académico]

26. Guo S, et al. La diversidad genética y la estructura de la población de Schizopygopsis younghusbandi Regan en el
río Yarlung Tsangpo se infieren a partir del análisis de la secuencia de ADN mitocondrial. Bioquímica. Syst. Ecol.
2014;57:141−151. [Google Académico]

27. Reed DH, Frankham R. Correlación entre la condición física y la diversidad genética. Conserv. Biol.2003;17:230–
237. doi: 10.1046/j.1523-1739.2003.01236.x. [Referencia cruzada] [Google Académico]

28. Liu D, et al. La fuerte estructura de la población de Schizopygopsis chengi y el origen de S. chengi baoxingensis se
revelan por el ADN mt y los marcadores de microsatélites. Genética. 2015;143:73−84. doi: 10.1007/s10709-015-
9815-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

29. Grant W, Bowen B. Historias de poblaciones poco profundas en profundos linajes evolutivos de peces marinos:
ideas de sardinas y anchoas y lecciones para la conservación. J. Hered. 1998;89:415−426. [Google Académico]

30. Yang T, et al. Polimorfismo genético del ADN de microsatélites en poblaciones de Schizothorax biddulphi. Zona
árida. Res. 2014;31:1109−1114.[Google Académico]
:
 31. Li J, Fang X. Elevación de la meseta tibetana y cambios ambientales. Chin. Sci. Bull.1999;44:2117−2124. [Google
Académico]

32. Avise, J. C. Filogeografía intraespecífica empírica en filogeografía: la historia y formación de especies (eds Avise,
J. C.) 109-211 (Harvard University Press, 2000).

33. Favre A, et al. El papel de la elevación de la meseta tibetana de Qinghai para la evolución de las biotas tibetanas.
Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2015;90:236–253. doi: 10.1111/brv.12107. [PubMed] [CrossRef][Google Académico]

34. He D, Chen Y. Filoeografía de Schizothorax o'connori (Cyprinidae: Schizothoracinae) en el río Yarlung Tsangpo,
Tíbet. Hydrobiologia.2009;635:251–262. doi: 10.1007/s10750-009-9918-2. [Referencia cruzada] [Google Académico]

35. Montgomery DR. Evidencia de megainundaciones del Holoceno en el desfiladero del río Tsangpo, en el sureste del
Tíbet. Quat. Int. 2004;62:201–207.[Google Académico]

36. Toews DP, Brelsford A. La biogeografía de la discordancia mitocondrial y nuclear en animales. Mol. Ecol.
2012;21:3907–3930. doi: 10.1111/j.1365-294X.2012.05664.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

37. Wei K, Wood AR, Gardner JPA. Variación genética de la población en el mejillón verde de Nueva Zelanda: señales
conflictivas dependientes del locus de estructura débil y alto flujo genético equilibrado con una estructura pronunciada
y un alto autoreclutamiento. Mar. Biol. 2013;160:931–949. doi: 10.1007/s00227-012-2145-9. [Referencia cruzada]
[Google Académico]

38. Gagnaire PA, et al. Usando loci neutros, seleccionados y autoestopistas para evaluar la conectividad de las
poblaciones marinas en la era genómica. Evol. Appl.2015;8:8769–8786. doi: 10.1111/eva.12288. [Artículo gratuito de
PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

39. Winemiller KO. Estrategias de historia de vida y la efectividad de la selección sexual. Oikos.1992;63:318–327.
doi: 10.2307/3545395. [Referencia cruzada][Google Académico]

40. Xie P. Crisis de biodiversidad en el río Yangtze: el culpable fueron las presas, seguidas de la sobrepesca. J. Lake
Sci. 2017;29:1279–1299. doi: 10.18307/2017.0601. [Referencia cruzada] [Google Académico]

41. Park YS, Chang J, Lek S, Cao W, Brosse S. Estrategias de conservación para especies de peces endémicas
amenazadas por la presa de las Tres Gargantas. Conserv. Biol.2003;17:1748−1758. doi: 10.1111/j.1523-
1739.2003.00430.x. [Referencia cruzada] [Google Académico]

42. Li X, Zhang J, Xu L. Una evaluación de las pérdidas ecológicas del desarrollo de la energía hidroeléctrica en el
Tíbet. Ecol. Inglés. 2015;76:178–185. doi: 10.1016/j.ecoleng.2014.03.034. [Referencia cruzada][Google Académico]

43. Moritz C. Definir "unidades evolutivamente significativas" para la conservación. Tendencias Ecol.
Evol.1994;9:373–375. doi: 10.1016/0169-5347(94)90057-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]
:
 44. Hale ML, Burg TM, Steeves TE. Muestreo para estudios genéticos poblacionales basados en microsatélites: de 25
a 30 individuos por población es suficiente para estimar con precisión las frecuencias de los alelos. PloS
ONE.2012;7:e45170. doi: 10.1371/journal.pone.0045170.[ Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google
Académico]

45. Excoffier L, Lischer HE. Arlequin suite ver 3.5: una nueva serie de programas para realizar análisis de genética de
poblaciones en Linux y Windows. Mol. Ecol. Recursos. 2010;10:564–567. doi: 10.1111/j.1755-0998.2010.02847.x.
[PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

46. Narum SR. Más allá de Bonferroni: análisis menos conservadores para la genética de la conservación. Conserv.
Genet.2006;7:783–787. doi: 10.1007/s10592-005-9056-y. [Referencia cruzada] [Google Académico]

47. Tamura K, et al. MEGA5: análisis de la genética evolutiva molecular utilizando métodos de máxima verosimilitud,
distancia evolutiva y máxima parsimony. Mol. Biol. Evol.2011;28:2731–2739. doi: 10.1093/molbev/msr121.[ Artículo
gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

48. Rogers AR, Harpending H. El crecimiento de la población hace olas en la distribución de las diferencias genéticas
por pares. Mol. Biol. Evol. 1992;9:552–569. [PubMed] [Google Académico]

49. Librado P, Rozas J. DnaSP v5: un software para el análisis exhaustivo de los datos del polimorfismo del ADN.
Bioinformática. 2009;25:1451–1452. doi: 10.1093/bioinformática/btp187. [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

50. Tajima F. Método estadístico para probar la hipótesis de la mutación neutral mediante el polimorfismo del ADN.
Genética. 1989;123:585–595. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [Google Académico]

51. Fu YX. Pruebas estadísticas de neutralidad de las mutaciones contra el crecimiento de la población, el autostop y la
selección de antecedentes. Genética. 1997;147:915–925.[ Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [Google Académico]

52. Harpending H. Firma del crecimiento de la población antigua en una distribución de desajuste de ADN
mitocondrial de baja resolución. Hum. Biol. 1994;66:591–600. [PubMed] [Google Académico]

53. Antao T, Lopes A, Lopes RJ, Beja-Pereira A, Luikart G. LOSITAN: un banco de trabajo para detectar la
adaptación molecular basada en un método FST-outlier.BMC Bioinformatics. 2008;9:323. doi: 10.1186/1471-2105-9-
323. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

54. Foll M, Gaggiotti O. Un método de escaneo del genoma para identificar loci seleccionados apropiados tanto para
los marcadores dominantes como para los codominantes: una perspectiva bayesiana. Genética. 2008;180:977-993. doi:
10.1534/genetics.108.092221. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

55. Antao T, Beaumont MA. Mcheza: un banco de trabajo para detectar la selección utilizando marcadores
dominantes. Bioinformática. 2011;27:1717–1718. doi: 10.1093/bioinformática/btr253. [PubMed] [CrossRef] [Google
Académico]
:
 56. Luikart G, Inglaterra PR, Tallmon D, Jordan S, Taberlet P. El poder y la promesa de la genómica de la población:
desde el genotipo hasta la tipificación del genoma. Nat. Rev. Genet. 2003;4:981–994. doi: 10.1038/nrg1226. [PubMed]
[CrossRef] [Google Académico]

57. Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P. Inferencia de la estructura de la población utilizando datos de genotipo
multilocus. Genética. 2000;155:945−959. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [Google Académico]

58. Evanno G, Regnaut S, Goudet J. Detectar el número de grupos de individuos que utilizan el software
STRUCTURE: un estudio de simulación. Mol. Ecol.2005;14:2611−2620. [PubMed] [Google Académico]

59. Corander J, Marttinen P, Sirén J, Tang J. Modelado bayesiano mejorado en el software BAPS para aprender las
estructuras genéticas de las poblaciones. BMC Bioinformática. 2008;9:539. doi: 10.1186/1471-2105-9-539. [Artículo
gratuito de PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Académico]

60. Corander J, Marttinen P. Identificación bayesiana de eventos de mezcla utilizando marcadores moleculares
multilocus. Mol. Ecol. 2006;15:2833–2843. doi: 10.1111/j.1365-294X.2006.02994.x. [PubMed] [CrossRef] [Google
Académico]

61. Rousset F. Diferenciación genética y estimación del flujo genético de la estadística F bajo aislamiento por
distancia. Genética. 1997;145::1219–1228. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed] [Google Académico]
: