Guiones Practicas Toxicologia-2023-24

Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas
CURSO: CUARTO CURSO
ASIGNATURA: TOXICOLOGIA ALIMENTARIA
AUTORES: Mª SOLEDAD PEREZ COELLO
Actividades Prácticas del Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Toxicologia Alimentaria
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS EN

LECHE.
1. OBJETIVO.
El objetivo de esta práctica es aprender la metodología del análisis de residuos de

antibióticos en alimentos utilizando un método microbiológico semicuantitativo que es un
método oficial de la AOAC.
2. CAMPO DE APLICACIÓN
Control y detección de fraudes alimentarios relacionados con el uso inadecuado de
antibióticos en animales como promotores del crecimiento.
La utilización de antibióticos en la ganadería requiere que se respeten unos tiempos de

espera, o periodos de supresión, antes de dedicar la leche, huevos o carne del animal al
consumo humano, de manera que no permanezcan en estos productos los residuos del
fármaco empleado.
Por este motivo es necesario determinar la presencia de antibióticos en los alimentos ya

que puede suponer un problema sanitario debido a su toxicidad o poder alergénico, así
como porque puede provocar la aparición de resistencias bacterianas promovidas por un
uso incontrolado de los mismos.
3. FUNDAMENTO
La determinación de penicilina se realiza utilizando el método microbiológico semi-

cuantitativo en el que se utiliza como determinante el poder inhibidor del crecimiento
microbiano que tiene este antibiótico.

Se utiliza para ello un cultivo de un microorganismo sensible a la penicilina de manera

que la presencia del antibiótico genera halos de inhibición en la placa Petri. El tamaño
del halo será proporcional a la cantidad de penicilina que se encuentra en la leche. Se
compara con el halo producido por disoluciones de penicilina de concentración
conocida.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Material
- Placas Petri estériles

- Asa de siembra
- Pipetas estériles
- Pinzas estériles
- Discos estériles
- Disoluciones de penicilina y de penicilinasa.
4.2. Medios de cultivo

- Medio peptona/ dextrosa/ extracto de carne/ extracto de levadura/ casitona
- cultivo reciente de Bacillus subtilis en caldo TSB.
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Método estándar para el examen de productos lácteos

 Preparar medio de siembra para la prueba de antibióticos (peptona/ dextrosa/
extracto de carne/ extracto de levadura/ casitona) y un cultivo reciente de
Bacillus subtilis en caldo TSB.
 Realizar una siembra del cultivo de Bacillus en superficie sobre la placa con un
bastoncillo procurando que toda la superficie quede cubierta.
 Coger un disco de papel de filtro estéril con unas pinzas previamente flameadas,
tocar la muestra de leche con el borde del filtro y dejar que se humedezca por
capilaridad. Colocar el disco en la parte central de la placa Petri.
 Mojar un disco estéril de igual forma en una solución de penicilina de 0.1

unidades /ml y de 0.5 unidades/ml, y colocarlos sobre la placa con suficiente
separación.
 Mojar un disco estéril en la solución de penicilinasa y después en la leche y
colocarlo sobre la placa.
 Incubar las placas a 32ºC de 14-24 horas.
5.2. Lectura de los resultados.
 Los discos control de penicilina 0.1 y 0.5 u/ml deben tener un halo de inhibición
de crecimiento alrededor proporcional a la concentración de penicilina. Si el
disco impregnado en la leche tiene también un halo de inhibición, ésta contiene
algún antibiótico o bien alguna sustancia inhibidora del crecimiento de
microorganismos.
 Midiendo el diámetro del halo y comprando con los halos producidos por los
patrones de puede saber aproximadamente la cantidad de penicilina que contenía
la leche.
 Si no aparece halo de inhibición alrededor del disco de penicilinasa el antibiótico
que tiene la leche es penicilina.
 Para inactivar las posibles sustancias inhibidoras de la leche se puede calentar la
muestra previamente a 82ºC durante 2-5 minutos.
6. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
Utilizar la información sobre lectura de los resultados para evaluar si las muestras en
estudio presenta o no contaminación con el antibiótico penicilina y realizar el cálculo
aproximado de su concentración haciendo referencia al diámetro del halo de inhibición.
Hacer un dibujo de la placa y comentar los resultados obtenidos con respecto a la

legislación vigente.

7.- REFERENCIAS
Official methods of analysis of AOAC International. William Horwitz, editor (2000).

Edición: 17th ed.

ANALISIS DE PLOMO EN MUESTRAS DE AGUA
1. OBJETIVO.
Aprender como se realiza el análisis de plomo en muestras de agua utilizando un

método espectrofotométrico y comparar los resultados obtenidos con los límites legales
permitidos .
Control de metales pesados en agua potable. Este método puede aplicarse también a
muestras de alimentos realizando una digestión previa de la muestra para eliminar la
materia orgánica.
El plomo es uno de los cuatro metales que tienen un mayor efecto nocivo sobre la salud
humana. Este puede entrar en el cuerpo humano a través de la comida (65%), agua
(20%) y aire (15%). Se distribuye en órganos y tejidos afectando principalmente al
riñón, hígado, encéfalo y huesos. La ingestión crónica de plomo se acompaña con
frecuencia de anemias leves por inhibición de la síntesis de la hemoglobina. También
produce una alteración del sistema nervioso con deterioros mentales y parálisis motoras.
Exposiciones prolongadas pueden producir neuropatías crónicas.
3. FUNDAMENTO
El plomo forma un complejo rojo con la ditizona (difeniltiocarbazona). Aunque la

ditizona no es específica para la determinación de plomo, en un medio de cianuro básico
que contiene un agente reductor, los elementos de interferencia significativos solo son el
bismuto y el estaño, los cuales, igual que e1 plomo, forman ditizonatos extractables con
cloroformo a un pH de 11.5. Si estos elementos están presentes, particularmente el
bismuto, e1 cual esta siempre asociado con el plomo, se eliminan primero por la

extracción preliminar de sus ditizonatos en cloroformo a pH entre 2 a 2.5 antes de

proceder can 1a determinación del p1omo.
En presencia de una solución de cianuro alcalino, el exceso de ditizona 1ibre que

colorea de verde no es extraído por cloroformo. Si el bismuto y el estaño están ausentes,
puede omitirse 1a extracción preliminar.
Ya que el método es sensible deben tomarse precauciones para prevenir la

contaminación de reactivos y aparatos. Como la luz brillante del sol tiende a
descomponer la ditizona y los ditizonatos, la determinación debe rea1izarse con luz
difusa.
Figura 1.- Complejo de plomo y ditizona formado en medio débilmente básico. La

proporción de plomo que se une a la ditizona es 1:2.
Figura 2.- Espectro de un blanco de ditizona (azul) 1 μg/5 mL (rojo) y 4 μg/5 mL

(morado) del complejo plomo-ditizona.

4.1. Material
- Espectrofotómetro o colorímetro para medición a 520 nm, que provea un paso

de luz de 1 cm.
- Embudos de decantación.
- Pipetas
4.2. Reactivos
- Disolución alcalina de cianuro: Se disuelven 3.0 g de sulfito de sodio,

Na2S03.7H20, en una mezcla de 340 ml de hidr6xido de amonio, (densidad
relativa: 0.88) y 680 ml de agua. Se añaden 30 ml de cianuro de potasio de 10
g/L y se mezclan bien.
- Hexametafosfato de sodio 100 g/L : Se disuelven 10 g de hexametafosfato de
sodio en 100 ml de agua. Se extraen las trazas de plomo por extracción con
solución de ditizona de 1 g/L a pH 9, se ajusta con hidróxido de amonio. Se
lleva justo al ácido y se extrae con cloroformo para eliminar las trazas de
ditizona. Se ajusta a pH 9.5 para una estabilidad máxima durante el
a1macenamiento.
- Hidróxido de amonio 0.5N: Diluir 3.5 ml de hidróxido de amonio en 100 ml
con agua.
- C1oroformo.
- Disolucion stock de ditizona de 1 g/L en cloroformo. Se disuelven 0.10 g de
difeniltiocarbazona en 100 ml de cloroformo. Se almacena en refrigerador.
- Disoluci6n de trabajo de ditizona en agua. Se transfieren 6 ml de solución stock
de ditizona en cloroformo a un embudo de decantación de 100 mL. Se añaden
10 ml de hidróxido de amonio N/2 y se agita. Se deja que las capas se separen.
se rechaza la capa inferior de cloroformo y se filtra 1a capa acuosa a través de un
papel de fi1tro humedecido para quitar las gotitas de cloroformo.

- Disolución de clorhidrato de hidroxilamina. Se disuelven 10 g de clorhidrato de

hidroxilamina en 1 1itro de agua destilada.
- Disolución stock de plomo. Se disuelven 1.599 g de nitrato de plomo, Pb(N03)2,
en agua
- destilada, se añaden 10 ml de ácido nítrico (densidad relativa: 1.42), y se diluye
a 1 litro. En esta disolución 1ml = 1 mg Pb.
- Disolución de trabajo de plomo. Se diluyen 10 ml de solución stock a un litro.
Se prepara recientemente, cuando se requiera. En esta disolución 1ml = 10 g
Pb.
5.1.- Preparación de la recta de calibrado:
 En una serie de embudos de decantación de tallo corto de 100 ml colocar 50 ml

de agua 1ibre de plomo y agregar volúmenes de la disolución de trabajo de
plomo para cubrir rango de hasta 20 g de Pb. Utilizar un embudo de
decantación que no contenga plomo, Proceder como se describe en el apartado
5.2.
 Se deduce la absorbancia del blanco de aquella de las disoluciones estandar y se
construye una recta de calibrado que relacione la absorbancia neta con los g de
Pb (plomo). Si durante el análisis de la muestra se propone usar el
procedimiento de extracción preliminar a pH de 2 a 2.5 para eliminar posibles
interferencias por estaño y/o bismuto, entonces debe incorporarse un paso
similar en la preparación de la gráfica de ca1ibración.
5.2.- Análisis de la muestra:
 En un embudo de decantación de tallo corto de 100 ml medir 50 ml de la

muestra de agua, o un volumen mas pequeño diluido a 50 ml, que no contenga
mas de,20 g de plomo. Si se sabe que no hay bismuto ni estaño, se omite el
procedimiento del siguiente párrafo:

- Usando un medidor de pH y acido clorhídrico diluido ajustar el pH de la

muestra a 2 - 2.5. Anadir 20 ml de la disolución stock de ditizona en
cloroformo.
- Agitar por dos minutos, dejar que las fases se separen y botar la capa de
cloroformo. Repetir esta extracción con 5 ml mas de disolución stock de
ditizona, y nuevamente desechar la capa de cloroformo. Lavar la disolución
acuosa con 5 ml de cloroformo, dejar que las capas se separen y descartar los
lavados (capa de cloroformo).
 A los 50mL de la muestra de agua añadir, mezclando entre cada adición:
1.0 ml de disolución de hexametafosfato de sodio.
1.0 m1 de disolución de clorhidrato de hidroxilamina.
30 ml de disolución alcalina de cianuro
0.5 ml de disoluci6n de trabajo de ditizona (en agua), añadida convenientemente

desde una bureta con divisiones a 0.02 ml.
y 10 ml de cloroformo.
 Agitar vigorosamente el embudo por un minuto y dejar que las fases se separen.
Secar el tallo del embudo de decantación con papel filtro e insertar un tapón de
lana de algodón. Dejar que cerca de 2 ml de la capa de c1oroformo corran y
descartar.
 Rea1izar paralelamente una determinación del blanco sobre todos los reactivos
usados.
 Medir la absorbancia de la fase orgánica (cloroformo) a 510 nm con c1oroformo
en la celda de referencia. Restar 1a absorbancia del blanco de la de las muestras
para obtener 1a absorbancia neta de el1as.

Determinar la cantidad de plomo (g Pb) equivalente a la absorbancia neta a partir de la

gráfica de calibrado.
mg/L de Pb = g Pb/ muestra, ml
g Pb g Pb
Calibrado1 Muestra 1
Calibrado 2 Muestra 2
Calibrado 3 Muestra 3
Comentar los resultados obtenidos en todas las muestras de agua analizadas por los
distintos grupos en base a la legislación.
7.- REFERENCIAS
Official methods of analysis of AOAC International [Archivo de ordenador] / William

Horwitz, editor (2000). Edición: 17th ed.

EXTRACCION Y DETECCION DE CLEMBUTEROL EN HIGADO
1.- OBJETIVO
Aprender como se realiza la extracción de residuos de medicamentos en alimentos

mediante una extracción con disolventes orgánicos y determinar la presencia del
medicamento, en este caso clembuterol, en el extracto utilizando cromatografía en capa
fina.
2.- CAMPO DE APLICACIÓN
El clembuterol es un fármaco utilizado en veterinaria como broncodilatador en el

tratamiento de afecciones pulmonares. Además de los efectos farmacológicos, en los
animales tiene un efecto promotor del crecimiento capaz de reducir el contenido graso y
aumentar la masa muscular, con la consiguiente ganancia de peso. Sin embargo, aunque
su uso está prohibido con este fin por la legislación europea y española, en ocasiones se
emplea de forma fraudulenta, por lo que se requiere un control analítico de aquellos
productos animales que puedan ser consumidos por el hombre.
Entre los posibles efectos tóxicos del clembuterol en el hombre están: la taquicardia,
palpitaciones, inquietud, temblor de los dedos, náuseas, cefaleas, sudoración, mareos,
fatiga y vasodilatación periférica.
3.- FUNDAMENTO
Se realiza una extracción líquido - líquido del clembuterol con acetato de etilo en medio
alcalino y a continuación se realiza una cromatografía en capa fina. La visualización del
clembuterol se consigue mediante un revelado específico con una mezcla de nitrito
sódico y naftil etilendiamina que origina un azo-compuesto coloreado.

4.-REACTIVOS Y MATERIAL
4.1. Material
- Tubos de vidrio con tapón de rosca de 25 ml (2)

- Probeta de 25 ml
- Centrífuga
- Embudo de decantación de 100 ml
- Cápsula de porcelana
- Placa calefactora
- Capilares de 25 µl
- Tubos de hemólisis
- Placas de HTPLC de gel de sílice HF 254 (Merck) de 10 x 5 cm y de 0.2 mm de
espesor
- Cubeta de desarrollo para CCF
- Cámara de pulverización
4.2.- Reactivos
- Acido clorhídrico 0.01N

- Hidróxido sódico 1M
- Acetato de etilo
- Sulfato sódico anhidro
- Patrón de clembuterol (0,5 mg/ml en HCl 0.01N)
- Fase móvil: Acetato de etilo: Metanol: Acido acético (80:10:10) (en campana)
- Nitrito sódico 1% en HCl 1 M (en campana)
- Naftil etilendiamina 0.4% en Metanol (en campana)

5.- PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación de la Muestra
 Triturar la pieza de hígado en la picadora. Pesar 3 g de hígado triturado en un

vaso de precipitado. Agregar 15 ml de HCl 0.01N y mezclar bien con ayuda de
una varilla de vidrio.
 Transferir el homogeneizado a un tubo de vidrio cilíndrico de 25 ml de
capacidad con tapón de rosca y extraer durante 10 minutos. A continuación,
centrifugar 10 minutos a 1800 g (aprox. 4000 rpm). Decantar el sobrenadante en
otro tubo limpio.
 Ajustar el pH a 9.2 ± 0.2 añadiendo 9 gotas de NaOH 1M.
 Transferir el contenido del tubo a un embudo de decantación. Extraer con 40 ml
de acetato de etilo, por inversión suave, durante 3 minutos. Dejar en reposo
hasta que se separen las fases.
 Desechar la fase acuosa y recoger la fase orgánica sobre una cápsula de
porcelana. Para ello se filtrará a través de un embudo de vidrio provisto de filtro
de papel en el que se ha depositado una pequeña cantidad de sulfato sódico
anhidro.
 Llevar a sequedad en la placa calefactora. Evitar que se reseque el extracto. Una
vez fría la placa, redisolver el residuo en 5 ml de ClH 0.01N y transferir a un
tubo.
5.2.- Desarrollo cromatográfico
 Coger una placa para cromatografía en capa fina de HTPLC y con un lápiz muy
blando, para no dañar el gel, marcar los puntos donde se aplicarán las muestras.
Estos puntos deben estar a 1,5 cm de la base y separados entre sí 1 cm.
 Con la placa en posición horizontal, aplicar 20 µl del extracto en acetato de etilo
apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la
celulosa. Esta operación debe hacerse aplicando y secando la misma muestra

varias veces, para evitar una excesiva superficie del punto de aplicación. Se
puede utilizar un secador de pelo.
 Aplicar en la misma placa 10 µl de patrón de clembuterol de concentración 0.5

mg/ ml.
 Colocar la fase móvil en la cubeta (o tarro de cristal) de forma que cubra el
fondo hasta una altura máxima de 1 cm.
 Una vez que las manchas se hayan secado, introducir la placa verticalmente en la
cubeta de forma que las muestras queden en la base de la cubeta. Además,
siempre se debe cuidar que los puntos de aplicación queden por encima del nivel
del disolvente. Poner la tapa y dejar que el disolvente suba por capilaridad
(aproximadamente unos 30 minutos).
 Cuando el frente haya subido aproximadamente 8 cm, sacar la placa de la
cubeta, marcar con un lápiz el frente y secar la placa al aire, con un secador de
pelo o en una estufa.
 Una vez seca la placa, pulverizar en campana con una disolución acuosa de
nitrito sódico al 1% en HCl 1M. Secar la placa con aire caliente (por ejemplo
con un secador de pelo) hasta que no desprenda olor a HCl. Posteriormente
pulverizar con una solución de naftil etilendiamina al 0.4% en metanol.
 En caso positivo, el clembuterol se detectará por la aparición de una mancha de
color ROJO - ANARANJADO que debe coincidir en color y Rf con el patrón
analizado al mismo tiempo.

La migración relativa de una sustancia (Rf) en una fase móvil (disolvente) y

estacionaria (gel) determinada va a ser constante. Esta característica nos permite
mediante la comparación con patrones la identificación de la sustancia en una mezcla.
El valor del recorrido relativo (Rf) de un compuesto es una medida de la migración de
este compuesto:
Rf= _distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm)

Distancia recorrida por el eluyente desde el origen (cm)
Calcular el Rf del patrón de clembuterol y determinar su presencia en la muestra.
7.- REFERENCIAS
Apoyo multimedia a la enseñanza práctica de la toxicología (2014).Departamento de

Medicina Legal, Toxicología y psiquiatría. Universidad de Granada. http://www.ugr.es

CUANTIFICACIÓN DE AFLATOXINA M1 EN LECHE MEDIANTE

UN MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO COMPETITIVO
1. OBJETIVO.
El objetivo de esta práctica es aprender la metodología de un inmunoensayo enzimático,

como es la técnica ELISA, en este caso para determinar la cantidad de aflatoxina M1 que
puede aparecer en leche y leche en polvo.
Este kit inmunoenzimático puede ser utilizado para el análisis cuantitativo de aflatoxina
M1 en leche y leche en polvo con el objetivo de determinar si cumple los límites legales
establecidos.
Las aflatoxinas son productos metabólicos cancerígenos y altamente tóxicos producidos

por los mohos del género Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus y Aspergillus
nomius. La aflatoxina M1 es un producto metabólico producido a partir de la aflatoxina
B1, que es segregada por vacas después de haber consumido alimentos que contengan
aflatoxina B1. La aflatoxina M1 es relativamente estable ante el proceso de
pasterización; por lo tanto, no sólo es necesario un extenso control de las materias
primas, sino también del producto terminado.
Los limites para Aflatoxinas en diversos alimentos (cereales, frutos secos y leche) se
recogen en los reglamentos: REGLAMENTO (CE) 1881/2006 y REGLAMENTO
(CE) 165/2010. En el caso de la aflatoxina M1 la cantidad máxima permitida en leche
cruda y tratada por calor es de 0,05 µg/L (50 ppt).

3. FUNDAMENTO
El test se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Los pocillos que se incluyen en el

test están recubiertos con anticuerpos de captura específicos para la Aflatoxina M1. La
muestra o estándar se añaden al pocillo y si la Aflatoxina M1 está presente, se unirá al
anticuerpo que se encuentra en el micropocillo.
Después, se añade un conjugado de aflatoxina M1 unido a un enzima (peroxidasa de

rábano) que cataliza una reacción coloreada, el cual se unirá al anticuerpo que todavía
no ha sido ocupado por la Aflatoxina M1 de la muestra o estándar. Tras un periodo de
incubación, el contenido de los pocillos es decantado, lavado y por último se añade el
sustrato de la enzima peroxidasa, lo que desarrollará un color azul en los pocillos. La
intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de conjugado unido, e
inversamente proporcional a la cantidad de Aflatoxina M1 presente en la muestra o
estándar.
Para parar la reacción se añade una solución ácida stop, lo que produce un cambio de
color de azul a amarillo. Los micropocillos son medidos ópticamente utilizando un
lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. La densidad óptica (OD) de las
muestras se compara con la OD de los estándares y se interpolan los resultados
obtenidos.

4.1. Contenido del kit
- Placa con 96 pocillos recubiertos con anticuerpos.

- Soluciones de estándares: 0 (estándar cero), 5, 10, 25, 50 y 100 pg/mL (ppt) de
aflatoxina M1 en tampón de leche listo para su uso.
- Conjugado (conjugado aflatoxina M1-peroxidasa HRP), en tampón con
conservante listo para su uso. TAPÓN VERDE
- Sustrato de tetrametilbencidina (TMB) listo para su uso. TAPÓN AZUL
- Solución stop ácida. TAPÓN ROJO
- Tampón de lavado (sal de tamponado).
- Leche para la preparación de la muestra, libre de Aflatoxina M1. TAPÓN
BLANCO
4.2. Equipo
- Espectrofotómetro para placas de pocillos (450 nm).
- Centrífuga.
- Pipetas.
- Micropipetas de 100 y 200 microlitros.
Precauciones
- Los estándares contienen aflatoxina M1, por lo que se deberá tener

particularmente cuidado con su manejo. Evitar contacto cutáneo (UTILIZAR
GUANTES).
- La solución stop contiene ácido, por lo tanto, no tocar piel u ojos.
- Considerar que todo el material, recipientes y aparatos están expuestos a la
muestra o estándares que contienen Aflatoxina M1, por lo que utilizar guantes
como protección.

- El conjugado HRP y el sustrato TMB son fotosensibles. Almacenar en

oscuridad.
- Almacenar los reactivos entre 2-8 ºC.
5.1. Preparación de las muestras
Las muestras deben ser almacenadas en un lugar fresco, protegidas de la luz.

Posteriormente, con la muestra de leche:
- Centrifugar para descremar: 10 min/3500 g/10 ºC.
- Utilizar directamente la muestra de leche homogeneizada en el ensayo.
5.2. Preparativos
- Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de ser
utilizados.
- Tras el análisis, conservar los reactivos a 2-8 ºC.
5.3. Procedimiento
Un lavado exhaustivo es muy importante. No permitir que los pocillos se sequen

completamente. Evitar intervalos prolongados entre los pasos de trabajo. La
reproducibilidad de los resultados depende en gran parte de un lavado uniforme de los
pocillos. Seguir cuidadosamente la secuencia de lavado descrita en el procedimiento.
Cubrir los pocillos durante los periodos de incubación evitando así la exposición directa
a la luz del sol.
1. Colocar suficientes pocillos en el marco portapocillos para los estándares y las

muestras a analizar. Marcar la posición de los estándares y las muestras.
2. Devolver los pocillos que no se vayan a utilizar al sobre y resellar para evitar
que entre humedad.

3. Agregar 200 µL de los estándares y de las muestras a analizar a los pocillos

correspondientes, en duplicado. Utilizar una punta de pipeta nueva para cada
estándar y cada muestra.
4. Cubrir la placa con la tapa de sellado para evitar la evaporación y proteger del
exceso de luz UV.
5. Incubar a temperatura ambiente (19-25 ºC) durante 2 horas.
6. Vaciar el contenido de los pocillos en un recipiente adecuado. Lavar los pocillos
con la solución de lavado utilizando para ello un frasco lavador o una pipeta
multicanal, e inmediatamente después vaciar de nuevo. Repetir el proceso de
lavado 3 veces. Tras cada vaciado, golpear enérgicamente (tres veces
consecutivas) el marco portapocillos sobre un papel absorbente limpio para
asegurar la eliminación completa de restos líquidos.
7. Añadir 100 µL del conjugado en cada pocillo.
8. Volver a tapar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
9. Repetir el paso 6.
10. Añadir 100 µL de la enzima sustrato (TMB) a cada pocillo e incubar durante 15
minutos. Cubrir para evitar la luz directa.
11. Parar la reacción añadiendo 100 µL de la solución stop. El color azul cambiará a
amarillo.
12. Leer la absorbancia de cada pocillo con un lector de microplacas a 450 nm
utilizando un blanco al aire o un filtro diferencial a 630 nm.

Para la evaluación y análisis de los resultados deberá utilizarse la siguiente ecuación:
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 (𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)

𝑥 100 = % 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑐𝑒𝑟𝑜
De esta forma, el estándar cero es igual al 100 % y los demás valores de absorción se
indican en porcentaje. Los valores calculados para los estándares se utilizan para
elaborar una curva de calibrado respecto a la concentración de aflatoxina M1 (pg/mL).
Para obtener la concentración real de aflatoxina M1 en pg/mL de cada muestra debe ser
multiplicada la concentración leída en la curva por el factor de dilución correspondiente.
En el caso de la leche, se tomará un valor igual a 1.

ANALISIS DE AMINAS BIÓGENAS EN VINO MEDIANTE HPLC
1. OBJETIVO.
Aprender la metodología de análisis de las aminas biógenas mas representativas en

alimentos utilizando la cromatografía de líquidos de alta resolución. Se realizará la
identificación de los compuestos por comparación con patrones comerciales y su
cuantificación por el método del patrón externo.
2. CAMPO DE APLICACION
Análisis de aminas biógenas en alimentos, principalmente en productos fermentados.

Las aminas biógenas están presentes normalmente en baja concentración en los
alimentos formándose por descarboxilación de los aminoácidos debido a la acción de las
levaduras o de las bacteria lácticas durante procesos de fermentación o de otros
microorganismos contaminantes. Los aminoácidos histidina, tirosina, fenilalanina, lisina
y ornitina son los precursores de las aminas biógenas histamina, tiramina, fenietilamina,
cadaverina y putrescina, respectivamente. Algunas de estas aminas como la histamina,
la tiramina, la putrescina y la cadaverina, son perjudiciales para la salud. El umbral
toxicológico de ingestión de histamina por via oral es de 5 a 8 mg y valores de 8 a 40
mg de esta amina producen síntomas ligeros de intoxicación. Cantidades superiores
causan síntomas graves.
El vino al ser un alimento fermentado es susceptible de contener aminas biógenas.
3 FUNDAMENTO.
Dado que los aminoácidos, las aminas biógenas y el ión amonio carecen de un grupo
cromóforo que permita su medida con los detectores clásicos (UV-Vis, fluorescencias,
índice de refracción) el primer paso a la hora de abordar su análisis es su derivatización
con un agente que les aporte un grupo cromóforo.

En este caso, el compuesto elegido para la derivatización es el etoximetilenmalonato

(EMMDE) (Ver figura 1), que muestra una gran absorción en la zona UV del espectro.
Posteriormente las aminoenonas formadas por reacción del agente derivatizante con los
aminoácidos, las aminas biógenas o el ión amonio se separan mediante HPLC en fase
reversa y se cuantifican mediante detección UV-Vis.
4. MATERIAL Y REACTIVOS.
4.1. Material
- Balanza
- Matraces aforados de distintos volúmenes
- Pipetas de distintos volúmenes
- Sistemas de filtración por 0,45 µm para muestras y fase móvil

- Tubos de ensayo con tapón de rosca de 10 ml.

- Baño de ultrasonidos
- Estufa de laboratorio
- Sistema HPLC equipado con:
o Bomba binaria
o Columna C18 (250 x 4,6 mm.)
o Detector UV-Vis que permita recoger el cromatograma a 280 nm o
detector de fotodiodos
4.2. Reactivos
- HCI 0,1 N
- Tampón borato 1M pH=9. (61.83 g de ácido Bórico en 1 litro, llevar a pH=9 con
NaOH 40% p/p)
- Etoximetilenmalonato de dietilo (Sigma D97208)
- Disolución madre de los compuestos a determinas (preparada en HCI 0,1 N):
200 mg/L:
- Cadaverina (Fluka 33211-11ML-F)
- Fenietilamina (Sigma P2641)
- Histamina (Fluka 53290)
- Tiramina (Aldrich T90344)
- Putrescina (Aldrich D13208)
- Agua Milli.Q
- Metanol (calidad HPLC)
- Acetonitrilo (calidad HPLC)
- Äcido acético glacial
- NaOH, PA
- Azida sódica

5. PROCEDIMIENTO.
5.1. Reacción de derivatización
 En un tubo de ensayo de tapón roscado se mezclan 1,75 ml de tampón borato

1M (pH=9), 750 µm de metanol, 1 ml de la muestra a analizar (previamente
filtrada por 0,45 µm) y 30 µl de EMMDE.
 La reacción de derivatización se desarrolla durante 30 minutos en baño de
ultrasonidos.
 Posteriormente, la muestra se calienta 2 horas a 70ºC para la completa
degradación del exceso de EMMDE y de sus productos secundarios de reacción.
5.2. Condiciones cromatográficas
 Fase móvil:
- Fase A: Tampón acetato 50 mM pH 8.75 (2,9 ml ácido acético
glacial y 2.2 g de azida sódica en 1 litro de agua Milli-Q, llevar a
pH= 8.75 con NaOH)
- Fase B: Acetonitrilo : metanol (80:20)
Gradiente de fase móvil durante el análisis de derivados aminoenona por HPLC:
Tiempo 0.0 12 16 21 23 25 28 30
min
Fase 72 72 28 18 0 0 72 72
A%
Fase 28 28 72 82 100 100 28 28

B%
 Flujo: 0,9 ml/min

 Volumen de inyección: 100 l
 Detección: 280 nm

1. RESULTADOS
El contenido en aminas biógenas, del vino se expresan en mg/l con 2 decimales.
Para ello se debe construir una recta de calibrado para cada uno de los compuestos a
analizar representando Area x frente a [x] donde:
Area x, es el área del pico cromatográfico correspondiente al compuesto x, [x], es la

concentración del compuesto x.
La de calibrado tendrá la siguiente forma:
Area x= a+[x].b
Donde: a, es la ordenada en el origen de la curva de calibrado para el compuesto x; y b,

es la pendiente de la curva de calibrado para el compuesto x
Por interpolación en esta recta de calibrado podremos conocer la concentración del

compuesto en muestras desconocidas.
7. REFERENCIAS
Gómez-Alonso S., Hermosín-Gutiérrez I., García-Romero E. Simultaneous HPLC

analysis of biogenic amines, amino acids and ammonium ion as aminoenones
derivatives in wine and beer samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2007, 55 (608-613)


8. ANEXOS


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