PRÁCTICA 6.

MICOLOGÍA

FISIOLOGÍA DE LEVADURAS
Características generales de las levaduras
Pueden vivir en diversos hábitat y con múltiples fuentes de energía (preferentemente
carbohidratos). Poseen crecimiento cremoso o bacteriforme
(muchas colonias no pueden distinguirse a simple vista de
las bacterias)
Estructuralmente, son entidades microbiológicas
independientes, por lo general unicelulares, con membrana
y pared celular conformada normalmente por quitina; su
citoplasma contiene vacuolas y un núcleo pequeño.
Tamaño: 3-6 micrómetros
Forma: globosa, ovoide, elongada, rectangular, cilíndrica,
triangular, etc.

REPRODUCCIÓN asexuada / anamórfica o sexuada / teleomórfica

Las "levaduras verdaderas" pueden reproducirse mediante ambas formas, teleomórficamente
por ascosporas y por basidiosporas.
Las “células levaduriformes" se reproducen únicamente anamórficamente (gemaciones o
blastoconidios, fisión transversal o binaria).

CONDICIONES DE CRECIMIENTO
pH: neutro o ligeramente ácido. El rango óptimo oscila entre 4.5 - 6.5
Temperatura: la mayoría son mesófilas (20 - 48°C)
Requerimientos de O2: la mayoría son aerobios (a excepción de las levaduras fermentativas)
Fuente de alimentación: carbohidratos simples o disacáridos

Colonias cremosas levaduriformes
de Candida krusei
DIMORFISMO FÚNGICO
El hongo puede pasar de la forma micelial a la levaduriforme,
dependiendo de dos condiciones: temperatura y nutrientes. Este
fenómeno se observa en algunos hongos patógenos de
importancia clínica, en donde su forma de levadura se presenta
por lo regular al estar parasitando.

Morfología microscópica y macroscópica

Candida albicans
MACROSCÓPICA
Colonias blancas o cremosas que pueden volverse más opacas con el
tiempo. Anverso: lisas y húmedas, con bordes regulares. Reverso: rugosas y
de color amarillento oscuro (por producción de pigmentos o acumulación Morfología
macroscópica
de esporas)

MICROSCÓPICA
Levaduras ovales o esféricas, unicelulares (2-5 µm). Pueden mostrar
brotaciones (pequeñas protuberancias en forma de yema) individuales o en
cadena. Puede transformarse en su forma filamentosa “hifa
pseudohifal”, especialmente en condiciones de estrés. Morfología
microscópica

Cryptococcus neoformans
MACROSCÓPICA
Colonias cremosas, mucoides y brillantes en medios de agar.
Morfología Anverso: color blanco a crema con textura mucosa. Reverso: colonias
macroscópica opacas y rugosas; a menudo toman un color marrón debido a la producción
de melanina.

MICROSCÓPICA
Células esféricas-ovaladas. Son unicelulares (5-10 µm) y están rodeadas
por una cápsula mucosa que se tiñe positivamente con tinciones especiales
Morfología como la tinta china y que es importante para su patogenicidad.
microscópica

Malassezia furfur
MACROSCÓPICA
Anverso: colonias de color blanco a crema con textura húmeda y brillante.
Reverso: colonias opacas, pueden desarrollar una coloración más oscura
debido a la acumulación de lípidos intracelulares. La producción de lípidos y
Morfología
la lipodependencia son dos de sus características distintivas. macroscópica
MICROSCÓPICA
Células ovales-redondeadas. Unicelulares (2-6 µm). A menudo, están
dispuestas en forma de racimo o racimos, y pueden mostrar brotaciones en
ciertas condiciones. Forma blastoconidios. Morfología
microscópica

Rhodotorula spp.
MACROSCÓPICA
Anverso: tamaño limitado (2-3 cm en un tiempo de cuatro días); color: rosa-
Morfología rojo; forma y aspecto: cremosa, ligeramente acuminada, lisa y en ocasiones
macroscópica presenta surcos o pliegues. Reverso: con pigmento carotenoide rojo-rosa,
que no difunde al medio.

MICROSCÓPICA
Tipo de seudomicelio: presenta en excepcionales ocasiones seudohifas.
Reproducción anamórfica a base de blastoconidios (2-4 µm), con gemas de
Morfología la mitad de su tamaño. Fase teleomórfica: basidiosporas.
microscópica

Medios de cultivo usados para aislamiento

AGAR HARINA DE MAÍZ CON TWEEN 80
UTILIDAD
Estudio taxonómico de levaduras mediante inducción de formación de filamentos y
clamidosporas.

AGAR BIGGY
UTILIDAD
Siglas en inglés Bismuth Glucose Glycine Yeast, es usado para el aislamiento y diferenciación de
levaduras del género Candida spp. También es conocido como Agar de Nickerson.

AGAR PBC + BASE LEVADURA

UTILIDAD
Su formulación es ampliamente nutritiva y provee proteínas, péptidos,aminoácidos, nitrógeno,
vitaminas, minerales, iones esenciales e hidratos de carbono para el adecuado desarrollo de
hongos filamentosos y levaduras

AGAR NOBLE
UTILIDAD
Utilizado como agente solidificante esencialmente libre de impurezas. Es usado para
procedimientos electroforéticos y nutricionales donde se requiera una mayor pureza.

AGAR ALPISTE NEGRO

UTILIDAD
Utilizado como agente solidificante esencialmente libre de impurezas. Es usado para
procedimientos electroforéticos y nutricionales donde se requiera una mayor pureza.
 Tinción de tinta china

FUNDAMENTO
La tinta china es un método de
contraste, no de coloración, que
permite destacar la cápsula de
levaduras al no poder penetrarla,
produciéndose así un campo
oscuro que permite la observación
de la cápsula, un halo
transparente dentro del cuál se
observa la levadura.
UTILIDAD
Se emplea especialmente en el diagnóstico de la
criptococosis, enfermedad sistémica causada por
la levadura encapsulada Cryptococcus
. neoformans.
En algunos hongos, especialmente en levaduras del
género Cryptococcus
Cryptococcus, la tinta china se utiliza para
identificar las esporas producidas por el hongo.
Detección de melanina producida por hongos.

Blastoconidios encapsulados de
Cryptococcus
Cryptococcus neoformans
neoformans (tinta china
100X)

Pruebas de identificación del género Candida spp.

AUXONOGRAMA
FUNDAMENTO
Se fundamenta en la aplicación por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o
nitrogenados, sobre un medio sintético base para apreciar el crecimiento selectivo de una
levadura en la cercanía de los nutrientes necesarios para su desarrollo. Para su realización
pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtración, cilindros de Oxford en
pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapados con el nutriente.

TÉCNICA
1. La levadura en estudio se siembra previamente en caldo INTERPRETACIÓN
glucosado de Sabouraud más cloranfenicol a 28 °C En la zona circulante a
durante 48 hrs. los pocillos o los
2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como inóculo discos, crecen
del medio sintético fundido. Enfriar a 50 °C, mezclar y abundantes colonias
verter en placa. de levaduras si utilizan
3. Preparar las soluciones estériles de los nutrientes, los el nutriente
azúcares al 10% y las sustancias nitrogenadas al 1%. correspondiente; por
4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de un tubo de el contrario, no
cristal, agujerear 5-6 pocillos por placa. Sobre cada aparecen en los
pocillo se vierten dos gotas de los distintos nutrientes en contornos de los no
estudio. (Si se utilizan discos de papel absorbente, deben utilizados.
confeccionarse de distintos colores o rotularse La intensidad del
previamente. Una vez esterilizados, y antes de su empleo, cultivo periférico se
se empapan con dos gotas de las soluciones acuosas de expresa mediante
los nutrientes (al 20% para los azúcares y al 2% para los cruces: 5 mm de radio
substratos nitrogenados). Se secan en estufa y se aplican (+), 5-10 mm (++), >10
sobre el medio con pinzas estériles. mm (+++).
5. Incubar a 28 °C. (2-4 días).
ZIMOGRAMA
FUNDAMENTO
La fermentación de carbohidratos evalúa la
capacidad de fermentación y producción de
ácidos a partir de diversos azúcares, dispuestos
en un medio base de composición variable que
incluye un indicador de pH. El estudio de
fermentación puede ayudar a diferenciar la
mayoría de las especies del género Candida y de
otros géneros no fermentadores. Las reacciones
de fermentación son, sin embargo, menos
seguras que las pruebas de asimilación, pues
están sujetas a variaciones; los hidratos de
carbono fermentados son asimilados, pero
algunos asimilados no son fermentados
TÉCNICA
1. Distribuir en tubos de hemólisis con campanas
Durhan, 2ml de medio para zimograma (g/l:
extracto de levadura, 4:5; peptona, 7:5; púrpura
de bromocresol 6%, 2ml) y 100 microlitros de
una solución al 20% de los siguientes azúcares:
glucosa, maltosa, galactosa, lactosa y
trehalosa.
2. Expulsar el aire colocando los tubos en baño
María hasta la ebullición durante unos minutos y
dejar enfriar.
3. Sembrar 50 microlitros de una suspensión de
levaduras con opacidad equivalente al tubo Nº3
de MacFarland.
4. Incubar a 28ºC durante dos semanas.

La fermentación positiva se observa por la acumulación de gas (CO2) en las campanas

INTERPRETACIÓN y el viraje del indicador del violeta al amarillo.

Producción de clamidonocidios
FUNDAMENTO
La formación de hifas, blastoconidias, clamidosporas o artrosporas por parte de las levaduras constituye
una característica morfológica de gran importancia para la identificación de algunas especies de levaduras.
Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, lo primero que hay que determinar es si se trata de
pseudohifas o, por el contrario, son verdaderas hifas. Las clamidosporas son formas de resistencia,
redondas u ovales, de 6-12 µm de diámetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales.
Su producción es característica y diagnóstica de C. albicans. También puede hacerse una identificación
presuntiva de esta especie si se observa la formación de grupos compactos de blastoconidias, a intervalos
regulares, a lo largo de la pseudohifa

TÉCNICA
1. La inoculación se debe realizar, según la técnica de
Dalmau (tomar con el asa una pequeña cantidad de la
colonia, la cual se insertó en el medio de cultivo Agar
harina de maíz en forma de tres cortes paralelos en el
agar, separados 1 cm manteniendo el asa en un ángulo
aproximado de 45°).
2. Colocar un cubreobjetos sobre la superficie de agar
cubriendo una parte de las estrías de siembra.
3. Incubar las placas sembradas a 30 °C durante 24- 48 h
y luego examinar al microscopio a través del cubre-
objetos a 10x, 40x y 100x.
Formación de pseudomicelios y
clamidosporas de Candida albicans
C. albicans desarrolla abundantes
INTERPRETACIÓN
pseudomicelios y clamidosporas

Producción de tubo germinal

FUNDAMENTO
El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho
suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre. Sólo
C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras especies como C.
tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una
zona de constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta prueba es útil para
diferenciar C. albicans del resto de las especies de Candida, aunque no está exenta de falsos negativos.

TÉCNICA FALSOS NEGATIVOS

1. Emulsionar una porción de la colonia aislada en 0,5 ml de
suero humano o de conejo.
2. Incubar a 35 °C durante 2 h.
3. Depositar una gota de la emulsión sobre un portaobjetos
limpio y desengrasado, colocar un cubreobjetos y
visualizar a 10x, 40x y 100x
4. La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales
Aproximadamente un 5% de cepas de C.
albicans son negativas para tubos
germinales.
Si se utiliza un inóculo demasiado
abundante de levaduras, también pueden
obtenerse falsos resultados negativos.

Producción de tubo germinal o filametación

precoz por Candida albicans
SISTEMA API-20
FUNDAMENTO
La galería API 20 se compone de 20 cúpulas con sustratos deshidratados que permiten realizar 19 pruebas
de asimilación. Las cúpulas se inoculan con un medio mínimo semisólido y las levaduras sólo se reproducen si
son capaces de utilizar el sustrato correspondiente Permite identificar un total de 34 especies diferentes.

TÉCNICA INTERPRETACIÓN Y LECTURA

1. A partir de un cultivo joven de la levadura a
identificar, realizar una suspensión en 2 ml de
agua destilada estéril hasta obtener una
turbidez igual a 2 de McFarland.
2. Transferir 100 µl (2 gotas) de esta suspensión a
una ampolla de C. Medium y homogeneizar
evitando la formación de burbujas.
3. Llenar las cúpulas con la suspensión anterior
evitando la formación de burbujas y creando un
nivel horizontal para generar resultados
correctos.
4. Incubar a 30 °C durante 48-72 h.
Observar el crecimiento de las levaduras en
comparación con la cúpula del control negativo. Una
cúpula más turbia que el testigo indica una reacción
positiva que debe anotarse en la hoja de resultados.
En esta última, los diferentes nutrientes están
separados en grupos de tres y se adjudica a cada uno,
en caso de ser positivo, un valor diferente: 1 para el
primero, 2 para el segundo y 4 para el que ocupa el
tercer lugar. Sumando cada triplete se obtiene un
número de siete cifras que constituye el perfil
numérico.
La identificación debe hacerse mediante el Catálogo
Analítico o el Programa Informático de Identificación
suministrado por el fabricante.

SISTEMA UNI-YEAST-TEK
FUNDAMENTO
El sistema Uni-Yeast Tek (Remel) está constituido por una placa plástica con múltiples compartimentos que
contienen un medio con agar para la asimilación diferencial de siete hidratos de carbono. También incorpora
una cubeta central con agar harina de maíz-Tween 80 para determinar el crecimiento micelial y la
producción de clamidosporas. Además, está provisto de agar urea, agar para la asimilación y reducción de
nitratos y de un caldo con extracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para realizar la prueba del
tubo germinal

TÉCNICA
1. A partir de un cultivo de 24-48 h en medios
habituales, realizar una suspensión en agua
destilada estéril equivalente a 4 McFarland.
Inocular cada uno de los compartimentos con
una gota de esta suspensión.
2. El compartimiento con agar harina de maíz se
siembra, con una pequeña porción de la colonia,
haciendo dos o tres surcos paralelos con aguja
de inoculación. Seguidamente, se coloca un
cubreobjetos flameado sobre el área inoculada.
3. Incubar a 30-35 °C durante 2-7 días.
INTERPRETACIÓN Y LECTURA
La observación de cambio de color del azul al amarillo
indica asimilación de los hidratos de carbono.
El medio de nitrato se interpreta como reducción
cuando el color azul original vira al color verde o
verde azulado.
La detección de hifas, blastosporas y clamidosporas
en el agar harina de maíz se detecta mediante
visualización con objetivo de 40X.

CROmagar
FUNDAMENTO
Medio cromogenico selectivo para
detectar levaduras, inhibe el
crecimiento bacteriano y permite el
crecimiento de levaduras. Las peptonas
especialmente seleccionadas son los
nutrientes en el medio. La mezcla
cromogénica consiste en sustratos
artificiales (cromógenos), los cuales
colorean los diferentes compuestos
producidos por la degradación con las
diferentes enzimas específicas. .
APLICACIÓN
Esta destinado a la detección cualitativa directa,
diferenciación e identificación presuntiva de
especies de Candida. La prueba se realiza en
muestras de frotis de piel, de garganta, de oídos y
vaginal, así como con muestras de esputo, orina y
heces, en paralelo a los cultivos en agar
Sabouraud, para ayudar al diagnóstico de la
candidiasis. Los resultados pueden interpretarse
tras 20-48 h de incubación aeróbica a 35-37 °C.
La falta de crecimiento o la ausencia de colonias
no excluye la presencia de Candida.
 Verde: malva: Azul tropical:
Candida albicans Candida glabrata Candida tropicalis

Roza Rizado: Crema

Candida krusei Candida orthopsilosis

Pruebas bioquimicas para levaduras

UREASA (candida es ureasa negativa)

MEDIO CHRISTENSEN
Fundamento: La tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes
para el desarrollo, el NaCl mantiene el balance osmótico y el rojo
de fenol es indicador de pH. El agar es el agente solidificante. Los
microorganismos hidrolizan la urea por medio de la enzima
ureasa liberan amoníaco y dióxido de carbono, alcalinizando el
medio haciendo virar el indicador de amarillo a rojo.

CALDO UREA DE STUART

La degradación de la urea forma 2 moléculas de amoniaco por
acción de la enzima ureasa. La urea es la fuente de nitrógeno y
permite la detección de la hidrólisis de la urea, el extracto de
levadura aporta vitaminas necesarias para el desarrollo de
microorganismos, los fosfatos mantienen el balance osmótico y
el rojo de fenol es el indicador de pH (positivo rojo)

L-DOPA CITRATO FERRICO (candida es L-DOPA citrato ferrico negativa)

fundamento: La producción de melanina mediante la prueba de la L – DOPA

citrato férrico, es realizada por la enzima difenoloxidasa (laccasa) que por
oxidación convierte las catecolaminas (difenoles) tales como la 3,4-
dihidroxifenilalanina (DOPA) en dopaquinona compuesto que reacciona con
el citrato ferrico y forma un precipitado negro o marron

REDUCCIÓN DE NITRITOS (candida es nitrito-reductasa negativa)

Se analiza la presencia de nitrato reductasa y nitrito reductasa.Si los

nitratos han sido reducidos, el caldo de cultivo virará a un color rojo
intenso por la presencia de nitritos, Si todo el nitrato ha sido reducido
hasta nitrógeno, no se revelará la presencia de nitritos, pero se
observará la aparición de burbujas de nitrógeno que se desprenden
dentro del tubo.

REFERENCIAS
1. Cromagar Candida TM. The chromogenic media pioneer. [internet]. [Consultado 5 noviembre 2023].
Disponible en: https://www.chromagar.com/es/product/chromagar-candida/
2. Perez C. Goitía K, Mata S, et. al. Utilización del caldo de urea de Stuart para el test de la ureasa, como prueba
en el diagnóstico de las levaduras. Rev. Soc. Ven. Microbiol.2002; 22(2): pp 136-140.
3. Linares M, Solis F. Identificación de levaduras. Revista iberoamericana de micología. 2007; 11: pp 14-20.
4. Bonifaz Trujillo JA, Vázquez González D, Araiza J. Micología médica básica (4a. ed.). México, D.F.: McGraw-Hill
Interamericana; 2012.
5. Ordóñez A, Jaramillo J, Ibarra M. (2016). China ink in adherents ceil in culture. NOVA, 13(25): 09-17.
6. Quindós Andrés G. Micología clínica. Barcelona: Elsevier Health Sciences Spain - R; 2015.
7. González R, Elizalde B, Cortés M, Orduña M. Las tinciones básicas en el Laboratorio de Microbiología: Un
enfoque gráfico [internet]. México: Facultad de Estudios superiores “Zaragoza”, UNAM; 2015 [consultado el
31 de octubre del 2023]. Disponible en: https://www.zaragoza.unam.mx/wp-
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/Tinciones.pdf