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Validación de metodologías de cromatografía líquida de alta resolución en

alimentos.

Presentation · January 2004

DOI: 10.13140/RG.2.2.26411.85289

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Jaime Valls Puig

Central University of Venezuela
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 1

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS
POSTGRADO INTERFACULTADES EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

VALIDACIÓN DE METODOLOGÍAS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

ALTA RESOLUCIÓN EN ALIMENTOS.

Tutor: Seminario I de Doctorado

Dr. Andrés Escalona Msc. Jaime E. Valls P.

CARACAS-VENEZUELA
2004
 2

Resumen

Una vez desarrollada y optimizada una metodología por cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC), esta debe ser validada, con lo cual se confirma y documenta
que los resultados que produce son confiables y seguros. El proceso de validación no
solo debe evaluar las características de la metodología, también debe juzgar que es
apropiada para el uso que se requiere de ella (Fabre y Altria, 2001). La validación de un
método analítico consiste en asegurar que sea exacto, específico y reproducible dentro
de un rango de concentración de interés en el cual se va a analizar uno o varios
analitos.

En HPLC se tiene una gran posibilidad de variables que pueden afectar la

metodología, entre estas: tipo de columna, detector, fase móvil, muestra, etc. Lo cual
implica que los procesos de validación son únicos para cada método y que en la
mayoría de los casos dependerá de la disponibilidad de equipos e insumos, así como
también del conocimiento que tienen los analistas involucrados en el desarrollo de una
metodología en particular. Todas las metodologías deben ser validadas, de manera de
tener certeza y seguridad sobre los datos obtenidos y de que esta técnica puede ser
transferida con confianza y ser aplicada en otros laboratorios de análisis.

El proceso de validación de cualquier metodología no comienza con el método

en si. El equipo instrumental, insumos y software empleados deben estar certificados o
validados y los datos de este proceso deben ser registrados y conservados. Según la
AOAC, (1997); USP, (2002) y Waters, (2002) en la validación por HPLC se deben
considerarse los siguientes parámetros: 1.- Selectividad, 2.- Linealidad y rango., 3.-
Precisión., 4.- Exactitud., 5.- Límites de detección y cuantificación., 6.- Robustez., 7.-
Fortaleza del método y 8.- Aseguramiento del sistema.

La validación no termina cuando una metodología ha sido completamente

validada ya que se debe tener certeza de que cada vez, que se emplee el equipo para
realizar el análisis, se encuentre en óptimas condiciones operacionales y sea confiable.
 3

Por lo tanto se debe implementar un sistema de aseguramiento integral que incluya:

equipo, electrónica, operaciones analíticas y muestras (Krull y Swartz, 1999).

De la revisión realizada principalmente en los últimos años se puede observar

que los investigadores que proponen un método por HPLC, realizan validación, sin
embargo en algunos casos no es del todo completa o no es realizada con un completo
diseño experimental. Los parámetros como robustez y fortaleza son poco evaluados por
los investigadores que han desarrollado métodos por HPLC en alimentos. Por otra parte
numerosos investigadores toman un procedimiento reportado en la revistas y es
aplicado usualmente con otros equipos, columnas o detectores, sin realizarle un mínimo
de validación que les otorgue un margen de seguridad a los resultados obtenidos.
 4

GLOSARIO DE TÉRMINOS

 Factor de separación

AB Ancho de banda

AOAC Association of Official Analytical Chemist

BPL Buenas Prácticas de Laboratorio

BPM Buenas Prácticas de Manufactura

CG Cromatografía de gases (Gas chromatography)

CV Coeficiente de variación

DE Desviación estándar

DQ Calidad de Diseño (Design Qualification)

DSR% Porcentaje de desviación estándar relativa

EC Electroforesis Capilar

EI Estándar interno

EM Espectroscopia de Masas

FDA Food Drug Administration

FTIR Transformadas de Fourier con Infrarrojos (Fourier Transform Infrared )

G1PM Gausiana tipo 1 Polimonial Modificada

HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Performance Liquid

Chromatography

ICH International Conference on Harmonization

id Diámetro interno

IQ Calidad de Instalación (Installation Qualification)

IR Detector de Índice de Refracción

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

k´ Factor de capacidad

LC Límite de cuantificación
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LD Límite de detección

LIMS Sistema Central de Manejo de Información de Laboratorio (Links

Information Manager System)

µ micro

min Minutos

mM Milimolar

N Número de platos teóricos

N 1/2 Factor de eficiencia

nm Nanómetros

OQ Calidad Operacional (Operational Qualification)

ppb Partes por billón

ppm Partes por millón

PQ Calidad del Desempeño (Performance Qualification)

R Resolución (entre dos picos cromatográficos)

RDE Resultados Desviados de Especificaciones

SOPs Procedimientos Estandarizados Operacionales (Standart Operational

Procedures)

S/R Relación Señal/Ruido

T Factor de cola de un pico (Tailing)

TLC Cromatografía en Capa Fina (Thin Layer Chromatography)

tn Tiempo de elución del analito

to Tiempo de elución del volumen muerto

TR Tiempo de retención de un pico en un cromatograma

USP “United States Pharmacopeia”

UV Ultravioleta

Vis Visible

wtan Ancho del pico entre las tangentes a los puntos de inflexión y la línea base.
 6

Validación de metodologías de cromatografía líquida de alta resolución en

alimentos

Introducción.

La cromatografía es usada principalmente para la separación de los

componentes de una muestra, mediante su distribución en dos fases, una estacionaria y
otra móvil. La estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un
gel. La fase móvil puede ser líquida, sólida e inclusive un fluido supercrítico. Las
principales modalidades de la cromatografía incluyen a: cromatografía gaseosa,
cromatografía en capa delgada, cromatografía en columna abierta y cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC). Esta última ha tenido una creciente difusión desde
sus inicios hace más de treinta años y es actualmente una de las técnicas más
versátiles, empleada ampliamente en laboratorios: farmacéuticos, químicos, industriales
y control de calidad de alimentos (Quattrocchi et al. 1992).

El desarrollo de HPLC es atribuido a un "salto natural" de la cromatografía en

columna, frente a nuevas mejoras en rellenos, sistemas de inyección, bombas,
detectores etc. Originalmente el acrónimo de HPLC era de cromatografía líquida de alta
presión, sin embargo fue cambiado por cromatografía líquida de alta resolución por dos
razones, la primera se quería enfatizar sobre las altas eficiencias de separación que se
obtenían con los nuevos rellenos y la segunda era que la presión empleada no
constituía en sí, una variable significativa del sistema (Quattrocchi, et al. 1992).

Los métodos de HPLC fueron inicialmente desarrollados en alimentos, para

cuantificar: aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos y vitaminas. Estos
compuestos no podían trabajarse adecuadamente con los equipos de cromatografía de
gases disponibles en esos momentos, ya que presentaban problemas como: baja
volatilidad, dificultad para la formación de sus respectivos derivados o inconvenientes
para su separación de la matriz de la muestra (Matissek, 1990).
 7

Actualmente se han incrementado considerablemente el número de aplicaciones

en HPLC en alimentos, debido a nuevos desarrollos y mejoras como: automatización de
los equipos, desarrollo de detectores con alta sensibilidad y especificidad, nuevos
rellenos de columnas y mejor calidad de los mismos, sistemas de intercambio de
columnas, posibilidad de emplear varios detectores en línea y sistemas de tratamiento
de muestras que son acoplados al HPLC en trabajos automatizados.

Cualquier método desarrollado por HPLC debe ser validado para asegurar que
es exacto, específico y reproducible dentro de un rango de interés, en el cual se va a
analizar un analito o varios. Esto a su vez permite tener más confianza en que la
metodología puede ser transferida a otros laboratorios de análisis, para su correcta
aplicación.

El objetivo del presente seminario es la de realizar una revisión bibliográfica

sobre la validación de metodologías por cromatografía líquida de alta resolución
aplicadas en alimentos. Se discutirán y evaluarán principalmente los parámetros que
son considerados por los investigadores para procesos de validación, así como también
sus limitaciones, alcances y aplicabilidad en el área de análisis de alimentos.

1.- Aspectos básicos de la cromatografía líquida de alta resolución.

Los equipos de HPLC pueden ser integrados o modulares, en los primeros cada
una de las partes (reservorios de solventes, programador de solventes, bombas,
inyector, detector e inclusive el integrador) pueden estar en una sola unidad. En los
segundos los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el
equipo según las necesidades, sino también aumentar su complejidad (Quattrocchi, et
al 1992).
 8

Los componentes básicos de un HPLC se muestran en la Figura 1, y son

principalmente: reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna, detector y
registrador-integrador. Las bombas dispensan la fase móvil disponible en los
reservorios, a través de todo el equipo. Los caudales de las bombas pueden ser muy
variables, pero usualmente son del orden de 0,5 a 3,0 mL/min. El puerto de inyección es
donde se va a introducir la muestra a determinar por medio de una jeringa y se
mezclará con la fase móvil, impulsada por la bomba. Algunos sistemas constan de un
lazo o "loop" de volumen fijo, de manera de disminuir los errores por inyección. Los
volúmenes típicos de inyección son entre 10-100 µL, pero inclusive se emplean
mayores de 1-10 ml y menores de 2µL, dependiendo del puerto de inyección (Rounds y
Gregory III, 1998).

FIGURA 1. Componentes básicos de un equipo de HPLC.

Adaptado de: Quattrocchi et al. (1992).

Se puede señalar que el desarrollo de HPLC, paso por dos fases, en la primera:
se deseaba separar compuestos hidrofóbicos, con lo cual se empleo solventes
orgánicos y columnas con relleno de sílica. Posteriormente ocurre una segunda fase,
debido a la necesidad de determinar sustancias solubles en solventes acuosos, lo cual
originó desarrollos que empleaban mezclas de fases móviles polares (agua-metanol-
acetonitrilo) y columnas con sílica modificada con grupos funcionales hidrofóbicos
(octadecilsilano (C18), octilsilano (C8), fenilo, ciano (CN), amino, diol etc). En esta
última con respecto a la primera, la polaridad de las fases se invertía y el proceso fue
llamado cromatografía en fase reversa (conocida también como: inversa o invertida),
mientras que el término cromatografía en fase normal se empleó para las separaciones
con solventes orgánicos y columnas de sílica. Además de la cromatografía en fase
 9

normal y fase reversa, se aplican otras modalidades como: cromatografía de

intercambio iónico y de exclusión molecular, en la primera la fase estacionaria contiene
grupos funcionales iónicos que retienen un soluto de características iónicas pero de
signo opuesto, intercambiándolo por un proceso reversible con iones de la fase móvil,
en la segunda se separan sustancias en base a su tamaño efectivo en solución
(Quattrocchi, et al. 1992; Rounds y Nielsen, 1998). Otras formas de separaciones por
HPLC incluyen: afinidad, interacción hidrofóbica y quiral (Matissek, 1990).

La columna es considerada como el "alma" del equipo y es donde se va a

realizar el proceso de separación. Son usualmente construidas en: acero inoxidable,
poliéster éter cetona o resinas. Tienen una longitud entre 10-20 cm y entre 3-5 mm de
diámetro interno, dentro del cual se localiza el relleno, constituido por una sustancia
química que usualmente en cromatografía en fase reversa es sílica modificada. El
tamaño de partícula del relleno puede ser de 3, 5 o 10 µm (Pomeranz y Meloan, 1994a;
Rounds y Gregory III, 1998). El uso actual de las fases estacionarias en HPLC, es
según Majors, (2003) C18, 39%; C8, 26%; ciano-propilo, 14,5%; fenil, 12%; C4, 3,7%;
sílica, 1,8%; C2, 1,1%; C1, 0,8% y otros 1,3%.

Los registradores-integradores, que también pueden estar acoplados a sistemas

de computación, son los equipos que mediante un software preinstalado permiten la
conversión de la señal electrónica proveniente del detector o detectores, para su
evaluación cualitativa o cuantitativa. La información principal aportada corresponde al
principio, máximo y final de cada pico cromatográfico con su correspondiente tiempo de
retención y área integrada. Estos equipos pueden tener paquetes de software más
completos, como bases de datos de compuestos que permiten identificar sustancias
con cierto grado de probabilidad. Adicionalmente pueden estar instalados en red a un
sistema central de manejo de la información del laboratorio, que permita la recolección
de datos, análisis y almacenamiento de información de diferentes laboratorios y equipos
(Rounds y Gregory III, 1998).
 10

Los detectores permiten ubicar en el tiempo y espacio la posición de cada

componente de una muestra a la salida de la columna (Quattrocchi et al. 1992). Su
funcionamiento se basa principalmente en las propiedades espectrofotométricas,
electroquímicas, físicas, estructurales etc, de los compuestos a determinar. Los
principales detectores empleados en HPLC son los siguientes:

1.-Índice de refracción: mide los cambios en el índice de refracción (RI) de la fase

móvil por analitos disueltos. Este detector es considerado como universal, ya que en
principio puede medir cualquier componente. Sin embargo, es poco específico y puede
generar picos positivos o negativos dependiendo del índice de refracción del analito en
relación al solvente, es también sensitivo a los cambios de temperatura y no se puede
emplear en corridas con gradiente. Este detector se usa principalmente en sustancias
que no tienen cromóforos UV y/o visible, tales como carbohidratos y lípidos (Rounds y
Gregory III, 1998).

2.- Ultravioleta (UV) y/o Visible (Vis): son los más empleados en HPLC y miden la
absorción de la radiación por parte de un cromóforo contenido dentro de la molécula del
analito. El UV puede operar entre 190 a 350 nm y Vis. de 350 a 700nm, en numerosos
equipos se poseen ambas partes y se les conoce como detector UV-Vis, estos abarcan
los rangos antes mencionados. Se pueden cuantificar grupos como alquenos,
aromáticos y compuestos que tienen enlaces múltiples entre carbono y oxígeno,
nitrógeno o azufre. Es deseable que la fase móvil no muestre absorción especialmente
en UV. Dentro de los detectores espectrofotométricos se encuentra el de ordenamiento
de fotodiodos (conocido también como arreglo de diodos), del cual se comentará más
adelante (Lindsay y Kealey, 1987).

3.- Fluorescencia: algunos compuestos tienen la capacidad de absorber

radiación UV y emitir una radiación de longitud de onda más corta y de menor energía
en forma instantánea, esta característica es conocida como fluorescencia. Basándose
en esta propiedad los detectores de fluorescencia emplean un haz de luz (longitud de
onda de excitación) que se hace incidir sobre una muestra, la cual absorbe e
 11

inmediatamente emite otra longitud de onda de baja energía (longitud de onda de

emisión). Este proceso de activación y desactivación ocurre en forma simultánea y es
única para cada sistema molecular, con lo cual se aumenta considerablemente la
especificidad, ya que se pueden ajustar los máximos de excitación y emisión del
detector (Penner, 1998).

La formación de derivados es factible para obtener o mejorar la absorción de

compuestos que normalmente no tienen o poseen una baja absorción, y es
ampliamente empleada en UV, Vis y fluorescencia. Al respecto Nissen y Kreysei, (1990)
y Pomeranz y Meloan, (1994a) indican que para compuestos que no tienen
fluorescencia natural es factible la formación sus derivados con reactivos como: cloruro
de dansilo (para aminas primarias, secundarias, fenoles, péptidos y amino ácidos),
fluoroescamina (aminas primarias, amino ácidos), o-ftalaldehído (aminas primarias,
amino ácidos), dansil hidrazida (azúcares reductores, aldehídos y cetonas), 4-
bromometil-7-metil cumarina (ácidos carboxílicos). De esta manera se amplia el número
de sustancias que pueden ser analizadas con este detector.

4.- Electroquímico: se emplea para la detección de compuestos que son

fácilmente oxidables o reducibles. Se basan en la oxidación-reducción electroquímica
de un analito o también en cambios de la conductividad de la fase móvil. Es un detector
muy sensible, unas 1000 veces en relación al UV, y altamente selectivo, ya que puede
seleccionarse cuidadosamente el potencial aplicado de manera de evitar la interferencia
de otros compuestos. Se dividen en detectores amperométricos que miden los cambios
de corriente cuando el analito (catecolaminas, fenoles, antioxidantes, aminas
aromáticas etc) es oxidado o reducido, por la aplicación de un voltaje por los electrodos
en la celda y detectores conductométricos para compuestos (aniones y cationes
orgánicos e inorgánicos) que pueden ser ionizados y que por lo tanto tienen una carga
que es medida al pasar también por los electrodos en la celda (Nissen y Kreysel, 1990;
Quattrocchi et al. 1992; Rounds y Gregory III, 1998).
 12

5.- Infrarrojos e Infrarrojos con Transformadas de Fourier (FTIR): se basan en las

características de absorción generalmente en el rango infrarrojo medio (650-4.000 nm)
por parte de moléculas orgánicas. Estos detectores tienen limitada aplicación en la
cromatografía en fase reversa ya que los solventes tienen absorción, por lo tanto se han
desarrollado más aplicaciones en fase normal (Galensa, 1990). En los equipos que
emplean FTIR el haz de luz infrarrojo proveniente de la fuente no es dispersado, con lo
cual todas las longitudes de onda llegan simultáneamente al detector, estas son
tratadas matemáticamente mediante las Transformadas de Fourier, convirtiendo las
múltiples señales en un espectro típico de infrarrojos (Wehling, 1998).

6.- Dispersión de luz: la fase móvil es pulverizada en una corriente de gas

caliente la cual evapora el solvente y deja a los analitos no volátiles en forma de
aerosol. Estás gotas o partículas producen una dispersión de un haz de luz (láser a 1
mWatio de He o Ne) que es medida por un detector. Se emplea para la determinación
de ácidos grasos, lípidos y carbohidratos como una alternativa al detector de índice de
refracción (Siouffi, 1992; Rounds y Gregory III, 1998).

7.- Espectroscopía de masas: es uno de los detectores más sensitivos y

selectivos empleado en HPLC para análisis cualitativo y cuantitativo. El paso crítico
para acoplar un HPLC a un detector de masas, consiste en la eliminación de la fase
móvil, antes de su introducción al detector: Una forma consiste en la aplicación de calor,
seguido de una rápida expansión del gas formado por un sistema de vacío,
posteriormente se toma una porción que es introducida en una cámara para su
ionización química, donde se forman los respectivos iones moleculares, que son
detectados por el analizador de masas. Para acoplar HPLC a masas se emplean
interfaces como: termospray, electrospray e ionización química a presión atmosférica
(Siouffi, 1992; Smith y Thakur, 1998). Algunas de las aplicaciones se han realizado en
micotoxinas, pesticidas y agentes emulsificantes (Rounds y Gregory III, 1998).
 13

2.- Desarrollo y Optimización de métodos.

El desarrollo de un método para el caso concreto de HPLC consiste en que un

laboratorio o institución desea realizar una metodología que permita evaluar un
compuesto o varios compuestos determinados. En la mayoría de los casos se enfoca
desde un punto de vista empírico, se intenta algún tipo de separación, si no se tiene
éxito, se continua modificando aspectos tales como: columna, fase móvil o pH, lo cual
conduce a numerosas pruebas de ensayo y error que no aseguran completamente
separaciones eficientes, o picos simétricos. Dado que esto produce un costo y consumo
de tiempo es preferible emplear procedimientos sistemáticos, efectuando los ensayos
preliminares con un criterio de mayor seguridad y probabilidad de éxito (Quattrocchi et
al. 1992).

Según Rounds y Gregory III, (1998) inicialmente se debe conocer acerca de la

muestra y sus componentes para así definir las bases de su separación. Se deben
tomar en cuenta aspectos como: número de componentes a separar, grado de
resolución requerido, tipo de información (cualitativa o cuantitativa), peso molecular,
polaridad, características iónicas del analito de interés que conformarán la posible
separación (fase reversa, normal, filtración o permeación de gel, intercambio iónico etc).
Una vez seleccionada la cromatografía se considera el tipo de columna, fase móvil
(composición, isocrático o gradiente), detector, etc. Se realizan a continuación ensayos
que pueden ser modificaciones de métodos reportados en la literatura, experiencia
previa o recomendaciones de expertos. Al obtener la separación deseada se procede a
su optimización.

El proceso de optimización involucra principalmente la manipulación de la fase

móvil en base a la variación de la naturaleza y porcentaje de sus componentes, pH,
fuerza iónica o aditivos (par-iónico). Sin embargo otras variables como largo de
columna, parámetros del detector (longitud de onda), flujo, temperatura etc, pueden ser
optimizados, siempre a juicio del analista cuando considere que estos pueden conducir
a una mejor resolución (Matsuda et al. 1994).
 14

Según Quattrocchi et al. (1992), el proceso de optimización esta basado en el

ajuste de la resolución, en función de varios parámetros cromatográficos, relacionados
mediante la formula:

R = 1/4 (-1)/  x N 1/2 x k /(1+k)

donde:
k : factor de capacidad
1/2
N : eficiencia de la columna
 : factor de selectividad

A su vez el factor de capacidad se calcula como: k = (tn - to) / to. Siendo tn, el
tiempo de retención del pico de interés y to el tiempo del volumen muerto (tiempo al
cual aparece el primer pico que no es retenido por la columna o alteración de la línea
base ocasionada por el solvente).

El factor de eficiencia es proporcional a los platos teóricos de la columna y se

calcula por: N = 16 (tn / wtan) 2. Donde wtan es el ancho del pico medido entre las
tangentes a los puntos de inflexión y la línea base.

Finalmente, el factor de selectividad se calcula como el cociente de los factores

de capacidad de un par de picos continuos:  = k1 / k2

Sin embargo otros autores toman en cuenta otros parámetros para optimizar, así
por ejemplo en un trabajo realizado por Vallé y Malle, (1997) en la cual desarrollaron
una metodología para evaluar aminas en pescado, los investigadores realizaron un
protocolo de trabajo que consistió en diez (10) procesos de optimización basados en la
cantidad extraída de estos compuestos (rendimiento). La investigación se centró en
evaluar el efecto del tratamiento de la muestra sobre el rendimiento, para lo cual
tomaron como variables: molienda de la muestra, centrifugación, pH extracción, tipo de
 15

solventes y concentración de los solventes, concentración de los reactivos y tiempo

para la formación de los derivados, tiempo de neutralización, distribución de los analitos
en los solventes de extracción y solvente de extracción. Este tipo de optimización está
enfocada en obtener un máximo de extracción de las aminas, mientras que otros están
dirigidos a la obtención de un máximo de resolución en las condiciones cromatográficas.

Es recomendable el empleo de diseños factoriales para el estudio de estas

variables. Un diseño factorial de 2k es de utilidad en las etapas iniciales del trabajo
experimental, cuando probablemente se están investigando muchos factores y se desea
una selección de los que tienen significado estadístico. En base a los factores
seleccionados, se puede posteriormente emplear otro tipo de diseño como una
metodología de respuesta de superficie, para evaluar la importancia de cada factor y
construir mapas de resolución, que indican los máximos de resolución. De esta manera
se disminuye el número de experiencias a realizar y expresar con ecuaciones el grado
de resolución, en función de las diferentes variables con significado estadístico (Siouffi,
1992).

Para mayor información sobre desarrollo y optimización de métodos

cromatográficos se sugiere consultar especialmente la referencia de Quattrocchi et al.
(1992).

3.- Razones para validación de métodos y estrategia de validación en HPLC.

Una vez desarrollada y optimizada una metodología por HPLC, debe ser
validada, con lo cual se confirma y documenta que los resultados que produce son
confiables y seguros. El proceso de validación no solo debe evaluar las características
de la metodología, también debe juzgar que es apropiada para el uso que se requiere
de esta (Fabre y Altria, 2001). La validación de un método analítico consiste en
asegurar que es exacto, específico, reproducible y consistente dentro de un rango de
interés, en el cual se va a analizar el o los analito(s).
 16

En HPLC se tiene una gran cantidad de variables tales como: columna, detector,
fase móvil, e inclusive tipo de muestra, temperatura, etc. Lo cual implica que los
procesos de validación son únicos para cada método y en la mayoría de los casos
dependerá de las posibilidades y conocimientos que tienen los analistas que estén
involucrados en este desarrollo. Generalmente se considera que un método puede ser
realizado si tiene una buena precisión y si el cromatograma presenta características de
buena "apariencia" y eficiencia de separación. Sin embargo estos parámetros no son
suficientes para asegurar que la metodología es confiable. Las variaciones naturales
intrínsecas entre los diferentes alimentos que se comercializan, así como los diferentes
tratamientos que puedan emplearse, pueden ocasionar serias diferencias entre los
resultados obtenidos y los verdaderos.

Todo nuevo método debe ser validado para demostrar su idoneidad frente a
variaciones que se le puedan realizar como: tipo de muestra, sistemas y/o solventes
para extracción o concentración, cambios en las cantidades a medir o valorar,
diferencias instrumentales e inclusive capacidad de los equipos para cuantificar con
certeza los analitos a considerar. Se han desarrollado metodologías de las cuales ya se
conoce de una manera retrospectiva que cumplen con las exigencias o necesidades
que se requieren. Estas o bien son empleadas a nivel mundial o han sido ensayadas
exhaustivamente y se conocen por lo tanto sus limitaciones y alcance. Sin embargo
cuando estas son utilizadas en una muestra distinta a la cual fue propuesta inicialmente,
pueden surgir dudas sobre su aplicabilidad, razón por la cual se hace necesario realizar
una nueva validación.

En la AOAC, los métodos de HPLC reportados para análisis de alimentos, ya han

sido validados de acuerdo a los lineamientos, lugar y tiempo en que fueron inicialmente
publicados o a lo largo de su respectivo uso. Sin embargo al aplicarse por primera vez
en un laboratorio, es recomendable realizar al menos una mínima revalidación (AOAC,
1997a).
 17

Se puede estar desarrollando un método nuevo para la cuantificación de algún

analito de interés, esto requiere de un proceso completo de validación. Así por ejemplo
Cabras et al. (2001) reportan un método para determinar los insecticidas rianodina y
dehidrorianodina en frutas, según estos autores no existía ningún trabajo previo al
respecto.

Puede cambiarse un paso del protocolo de trabajo para disminuir su tiempo o

mejorar la resolución de picos (Ozogul et al. 2000). En HPLC es usual modificar
métodos, empleando cartuchos de extracción de fase sólida del tipo "Sep-Pack", con lo
cual se incrementa la resolución en los cromatogramas y se prolonga la vida útil de las
columnas (Akiyama et al. 2001; Naik, 2001). En otros casos se desea aumentar la
sensibilidad para la detección de uno o varios compuestos, así por ejemplo Dreassi et
al. (2001) proponen un método para la cuantificación de levamisol en productos
cárnicos, de manera de mejorar el nivel de detección hasta 4 ppb, ya que otros trabajos
reportados solo detectan hasta 20 ppb.

Otra razón consiste, en alguna modificación de las condiciones instrumentales

como el cambio de un sistema de solventes de gradiente a otro isocrático, con lo cual
se reduce el tiempo de trabajo o también por el cambio de una longitud de onda para
mayor sensibilidad (Valls et al. 1999).

También se han desarrollado nuevas metodologías en las cuales se han

acoplado varios detectores de manera de realizar múltiples cuantificaciones. Jaime et
al. (2001) desarrollan un método que les permite determinar 18 toxinas paralíticas,
basándose en una separación por HPLC de intercambio iónico, seguido de una
oxidación electroquímica postcolumna con detección fluorométrica, acoplado a otro
detector de espectroscopia de masas. Actualmente se desarrollan aplicaciones
analíticas por HPLC en las cuales se realizan una gran interconexión de partes, así por
ejemplo Buglass y Lee, (2003) para la cuantificación de las formas D y L de ácido
láctico y también ácido málico en mostos, vinos, yogurt y cerveza, emplean
acoplamiento de un puerto de inyección, con un sistema de válvulas, que permite
 18

trabajar simultáneamente con dos equipos de HPLC, dos columnas y dos detectores
acoplados.

El empleo de nuevos rellenos en las columnas basados en zirconio, titanio,

poliestireno y polivinilbenceno, así como también la aplicación de nuevas tecnologías
para el llenado de grupos y espacios funcionales, en monocapas altamente ligadas,
además del uso de fases estacionarias "monolíticas" en forma de bastón, basadas en
polímeros de acrilatos y meta acrilatos, aumentan la posibilidad de desarrollo de nuevas
aplicaciones en HPLC que deben ser validadas (Buchmeiser, 2001).

Se han integrado equipos para realizar múltiples tareas en HPLC, Dilkin et al.
(2001) diseñaron una estación automatizada para la detección de fumonisinas B1, B2
en maíz y alimentos a base de este cereal. Pueden realizar el análisis a 40 muestras
con su respectiva extracción en fase sólida, formación de derivados, inyección,
detección fluorescente y cuantificación en 15 horas. Este tipo de tecnología requiere
también de procesos de validación que permitan evaluar el desempeño de cada una de
sus partes.

Un resumen de las principales razones por las cuales se valida en HPLC se

numeran en la ESQUEMA 1.

Principales razones para la validación en HPLC en alimentos

1.- Desarrollo de una metodología completamente nueva

2.- Aplicación de un método en una matriz (alimento) diferente
3.- Aplicación de un método para un(a) sustancia(s) que se aplicará a un grupo mayor de estas
sustancias.
4.- Cambio de algún paso(s) del método (instrumental detector/ sistema de extracción) para
aumentar la sensibilidad o reducir el tiempo de análisis. Cambio de gradiente a isocrático.
5.-Método tradicional

ESQUEMA 1. Principales razones para validar metodologías por HPLC.

 19

Generalmente el desarrollo de metodologías involucra el trabajo de un

laboratorio, que tiene ciertas características e inclusive limitaciones que pueden
ocasionar que no pueda ser transferida completamente o "fielmente" a otros
laboratorios para su implementación total. En otros casos se proponen ciertos pasos, o
instrumental que no son accesibles a la mayoría de los laboratorios, con lo cual deben
realizarse modificaciones para adaptarlo a las posibilidades particulares de cada
laboratorio. Estos cambios, deben ser evaluados para medir su impacto sobre el
resultado y confirmar la validez del análisis, este proceso es conocido como
revalidación. Para este propósito la USP, (2002) indica que puede emplearse una
sustancia, la cual es inyectada junto con el analito de interés y se determina su
resolución entre el analito y dicha sustancia, además de parámetros como precisión y
simetría de los picos, en base a los resultados que se obtengan se puede considerar
que se cumple con la validación.

En este punto se debe considerar ¿ Qué es un ajuste ? y ¿ Qué es un cambio ?,

de condiciones al implementar un método ya validado. Es de esperar que dentro de
ciertos límites puedan introducirse ajustes, los cuales no provoquen desviaciones
significativas del propósito para el cual fue diseñado. Por otra parte se pueden introducir
cambios significativos que hacen necesario volver a realizar una validación. No existen
unas directrices completamente fiables sobre ajustes, sin embargo Furman et al. (1998);
Krull y Swartz, (1999) señalan la posibilidad de realizar los siguientes ajustes, sin
necesidad de realizar una nueva validación:

1.- Flujo puede variar en  50%

2.- Columna, largo  70% y diámetro interno  25%
3.- pH, para compuesto sin grupos iónicos  1 unidad de pH, para compuestos con
grupos iónicos  0,2 unidades de pH.
4.- Concentración del buffer  10%
5.-Tamaño de partícula 3 o 3,5 µm en lugar de 5µm.
6.- Temperatura  20°C
 20

7.- Volumen de inyección se puede aumentar hasta el doble, manteniendo la forma,

resolución y tiempo de retención. Se puede disminuir hasta mantener una precisión y
sensibilidad aceptables.

4.- Pre-validación.

El proceso de validación de cualquier metodología no comienza con el método

en si, se deben considerar aspectos previos tales como: equipo instrumental, insumos y
software empleados, los cuales deben estar certificados o validados y los datos de este
proceso deben ser también registrados y conservados. Según el FDA, (1987) en su
documento sobre directrices generales, los procesos integrales de validación en
laboratorios constan de los siguientes pasos: 1.- Validación del software., 2.- Validación
y certificación del instrumental., 3.- Validación de la metodología y 4.- Aseguramiento de
la calidad del instrumental.

Henson, (2000) y Green y Morgan, (2001) indican que la validación es solamente

uno de los aspectos contemplados en las Buenas Prácticas de Laboratorio y es
necesaria por lo tanto como un requisito para el aseguramiento de la calidad en los
resultados que se generan en un laboratorio analítico, los principales aspectos
contemplados en este plan son los indicados en el ESQUEMA 2.

Según Green y Morgan, (2001) la validación está constituida por tres fases
generales: 1.- Pre-validación, que consiste en las actividades preliminares a la
validación, incluyendo la certificación de los estándares, reactivos, probable
metodología de manipulación de la muestra, insumos e instrumental que pueden ser
empleados, evaluación de antecedentes similares reportados en la bibliografía. 2.- La
segunda fase corresponde al proceso de validación, con su correspondientes estudio y
3.- Como última fase está el mantenimiento de la validación, en la cual se puede auditar
la metodología, revisando los registros de resultados, condiciones empleadas,
certificación de la vida útil de los equipos o insumos involucrados.
 21

1.- Aspectos Generales

1.1.- Actitud y filosofía de la gerencia
1.2.- Estado de limpieza del laboratorio
1.3.- Mantenimiento de los equipos

2.- Documentos y su control

2.1.- Especificaciones de análisis y sus límites
2.2.- Disponibilidad de métodos para cada análisis
2.3.- Procedimientos Estandarizados Operacionales (SOPs), para documentación
2.4.- Formas de documentación.

3.- Control de laboratorio

3.1.- Manejo de químicos, reactivos y materiales
3.2.- Control de estándares del laboratorio
3.3.- Manipulación e identificación de muestras
3.4.- Control del estado de los equipos

4.- Procesamiento de datos

4.1.- Generación y procesamiento de resultados.
4.2.- Forma y métodos de cálculo
4.3.- Revisión final de datos y resultados

5.- Validación de métodos

5.1.- Selectividad
5.2.- Exactitud
5.3.- Precisión
5.4.- Linealidad
5.5.- Límite de detección y límite de cuantificación
5.6.- Robustez y fortaleza

6.- Calibración
6.1.- SOPs, referentes a la calibración.
6.2.- Establecimiento de los intervalos de calibración y sus límites
6.3.- Identificación de estándares y posibilidad de conocer datos sobre su origen
6.4.- Documentación para cada actividad de calibración
6.5.- Procedimientos en caso de desviaciones de las especificaciones.

7.- Entrenamiento
7.1.- Protocolos de entrenamiento para nuevos analistas
7.2.- Formación y capacitación
7.3.- Entrenamiento para nuevas metodologías o métodos modificados
7.4.- Entrenamiento para desviaciones de especificaciones.
7.5.- Documentación de los entrenamiento

8.- Resultados desviados de las especificaciones (RDE)

8.1.- Procedimientos y acciones correctivas a tomar en caso de RDE
8.2.- Análisis de errores sistemáticos, aleatorios.
8.3.- Documentación de los RDE

9.- Sistema computarizados y sus datos

9.1.- Seguridad del sistema
9.2.- Funcionamiento del sistema y su eficiencia operativa
9.3.- SOPs, para validación de datos del sistema

ESQUEMA 2. Aspectos requeridos para Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en

laboratorios analíticos. Adaptado de: Henson, (2000); Green y Morgan, (2001).
 22

Feinberg, (1998) señala que el proceso conocido como estrategia de validación

se puede definir como la suma de la validación de los siguientes aspectos: muestreo,
instrumental y resultados generados. En la FIGURA 2 se muestran los seis pasos de
esta estrategia. Cada paso genera una respuesta subsiguiente.

A partir del problema analítico y tomando en cuenta las especificaciones,

necesidades o posibilidades, se procede a un muestreo, del cual se toma un porción o
alícuota, que es manipulada o procesada para originar un extracto que es analizado, es
factible también a partir de una alícuota, realizar un análisis directo. Finalmente se
originan unos resultados que conducen a una decisión.

Lesnik et al. (2000) señalan que inicialmente se debe identificar bien, que
objetivos se quieren alcanzar y evaluar, los posibles pasos que se puedan realizar y su
alcance. En caso de disponer de alguna normativa en la cual se indiquen los niveles
máximos o mínimos permitidos, en base a estos se debe determinar que pasos o
procesos deben o pueden realizarse, de manera de alcanzar estos niveles.

Entre los factores que se pueden considerar están: matriz de la muestra,

sensibilidad, precisión, disponibilidad de los equipos e inclusive su costo. Es deseable
que la instrumentación y equipos empleados en la validación del método estén
disponibles a los usuarios potenciales, este aspecto es muy importante, ya que
proponer una metodología que después no puede ser aplicada en otros laboratorios
puede conducir a un fracaso de su difusión.
 23

Problema analítico Especificaciones

Muestreo Manipulación Preparación de la

de la muestra muestra

Muestra Extracción
Alícuota

Digestión

Método directo

Señal Operación
Instrumental

Decisión Resultado

Análisis de Calibración
datos

FIGURA 2. Proceso de desarrollo analítico.

Adaptado de: Feinberg, (1998).

Antes de emplear tiempo, trabajo y recursos, es necesario asegurar que el

sistema por si mismo se encuentra en las condiciones deseadas y que este validado o
calificado, para el trabajo que se le exigirá. Este proceso comienza inclusive en la
fábrica en la cual el equipo es diseñado y construido. Otro aspecto sumamente
importante es la validación y comprobación adecuada del software que puede tener el
 24

instrumento. Todo esto debe ser realizado en un ambiente de Buenas Prácticas de

Laboratorio, Buenas Prácticas de Manufactura, y /o estándares de aseguramiento de la
calidad basadas en las normativas ISO 9000 (FIGURA 3).

Vendedor Usuario Usuario

Validación funcional

Validación Instalación Calibración

equipo IQ Mantenimiento
software Aseguramiento
DQ Operacional del sistema
OQ OP y PQ
Desempeño
PQ

Antes venta Antes del uso Después del uso

FIGURA 3. Proceso integral de validación.

DQ: Calidad del Diseño; IQ: Calidad de Instalación; OQ: Calidad Operacional; PQ: Calidad del
Desempeño.
Adaptado de: Waters, (2002).

Los errores del software en un equipo de laboratorio pueden no ser totalmente

evidentes y su chequeo es difícil, ya que no son algo físico. Evitar su ocurrencia
requiere por lo tanto de un mayor control y es por esto que el FDA, (2002) tiene una
guía sobre los principios y requerimientos necesarios para validación del software,
aplicado en instrumentos clínicos, equipos de bioanálisis, producción de equipos
controladores programables, equipos de laboratorio, equipos de aseguramiento de la
calidad, así como también sugerencias sobre el mantenimiento de datos y firmas
electrónicas.

La validación durante la instalación del instrumental en el lugar de trabajo

incluye: 1.- Preinstalación del equipo, en la cual se chequean los documentos relativos
 25

a la instalación, operación y mantenimiento. 2.- Instalación: evaluación del espacio y

lugar (chequeo de conexiones, puntos de corriente, vibraciones, capacidad de los
reguladores y estabilizadores de corriente, ergonomía, registro de los seriales, posible
contaminación del área etc). Se debe documentar como se instala el equipo, la persona
responsable e inclusive pruebas de chequeo del desempeño o eficiencia de los equipos
(GHTF, 1999).

En los documentos del FDA, (2001; 2003) se recomiendan los procedimientos a

seguir para la validez y mantenimiento de datos electrónicos. Señalan los criterios para
la aceptación por parte de esta organización de registros electrónicos, firmas
electrónicas y firmas registradas por scanner. De tal manera que la información
guardada bajo este formato tenga validez. Igualmente se comentan sobre: forma y
limitaciones de acceso a los sistemas, chequeos operacionales, entrenamientos del
personal a cargo, responsabilidades por parte de los firmantes, formas de control,
requerimientos de las firmas, auditorias, control de copias, tiempo de guarda etc. Todos
los lineamientos indicados en esta forma, complementan las regulaciones de Buenas
Prácticas de Manufactura (21CFR Parte 211), Sistema de Regulación de la Calidad
(21CFR Parte 820), Buenas Prácticas de Laboratorio No-Clínicos y Regulaciones para
Estudios de Laboratorio (21 CFR Parte 58).

Otro aspecto a considerar en la pre-validación es referente al empleo de

estándares y reactivos. Estos deben ser certificados y pueden provenir de: instituciones
o organismos como "United States Pharmacopeia" (USP), de casas comerciales,
laboratorios particulares, universitarios, institucionales etc. Swartz y Krull, (2003)
especifican que los estándares deben ser idénticos al analito que se desea evaluar, se
debe tener cuidado con variaciones químicas provenientes de especie como sales,
ácidos, bases, esteres o grado de hidratación. La documentación debe incluir número
de lote, fecha de caducidad, certificado de pureza, evidencia de identidad, condiciones
de almacenamiento e inclusive en casos especiales forma de transporte y manipulación.
 26

Se recomienda el añadido de un estándar interno para disminuir los errores

durante todo los procesos de extracción, formación de derivados etc. El compuesto
seleccionado no debe encontrarse de manera natural en el alimento que se desea
evaluar y es deseable que su tiempo de retención sea lo más cercano al analito, sin que
represente una interferencia (McCluskey y Devery, 1993). Li, (2001) desarrolla un
procedimiento para la selección de los estándar internos para determinaciones de
HPLC. Empleó una base de datos de propiedades fisicoquímicas de más de 700
compuestos y basándose principalmente en la energía de solvatación, puede predecir
cuales compuestos pueden situarse a cierta distancia de un pico de interés, en los
espacios donde no hay presencia de picos (ventanas). El error entre los valores
estimados y los experimentales no fueron mayores del 20%, con lo cual de una manera
sistemática se puede ahorrar tiempo y recursos, ya que no se estaría tanteando cuales
compuestos pueden ser aptos.

5.- Validación de metodologías por HPLC en alimentos

La validación de los métodos por HPLC, se basa en la evaluación de ciertos

parámetros que permitirían, al analista tener a futuro una certeza o confianza de
obtener resultados confiables. Por lo tanto la validación consiste en asegurar que el
método es exacto, específico, reproducible y que se pueden obtener resultados iguales
o similares, dentro de ciertos límites al cambiar de analista, equipos, laboratorios etc.

Según la USP, (2002) en su Capítulo <1225> sobre validación de HPLC aplicada

a la industria farmacéutica, considera los siguientes parámetros:

1.- Selectividad
2.- Linealidad y rango.
3.- Precisión.
4.- Exactitud
5.- Límites de detección y cuantificación
 27

6.- Robustez.
7.- Fortaleza
Mientras que Waters, (2002) señala que el ICH (Conferencia Internacional de
Harmonización) considera los siguientes aspectos:

1.- Selectividad
2.- Linealidad
3.- Precisión.
4.- Exactitud
5.- Límites de detección y cuantificación
6.- Robustez.
7.- Rango
8.- Aseguramiento del sistema

Las diferencias entre los aspectos a validar realmente no son tan distintas, ya que
fortaleza es considerada como parte de la precisión en ICH y el aseguramiento del
sistema es incluido en un capítulo aparte el número <621> en USP, (2002).

Los aspectos mencionados anteriormente si bien están tomados principalmente de

bibliografía relacionada con la industria farmacéutica, son también reconocidos por la
FDA, (2000; 2001) para la validación de metodologías de HPLC por parte de la industria
química y alimentos. Por otra parte en la bibliografía consultada relacionada con la
validación de HPLC en alimentos la mayoría de los trabajos, toman en cuenta estos
parámetros para la realización de sus investigaciones. Por lo tanto a continuación se
procederá a realizar un análisis de cada uno de estos índices en referencia a su uso y
aplicabilidad en métodos por HPLC en alimentos.

5.1.- Selectividad.
 28

Se refiere a la capacidad del método de producir una respuesta representada por

una señal de manera cuantificable, que puede ser atribuida exclusivamente al analito de
interés. Esta señal debe ser preferiblemente libre de interferencias y de un orden de
magnitud de acuerdo a las exigencias que se esperan del análisis (Swartz y Krull,
2003). Algunos investigadores emplean indistintamente los términos selectividad y
especificidad, sin embargo según la USP, (2002) organismos como IUPAC y AOAC
prefieren emplear el término selectividad más que especificidad, ya que este último
debería ser empleado en procedimientos analíticos completamente selectivos, como
podría ser la cromatografía de afinidad.

La complejidad de la matriz de las muestras, los niveles de algunos analitos en

cantidades de trazas, la posible degradación de los compuestos de interés, e inclusive
la complejidad del equipo instrumental empleado, implican que cada proceso de
evaluación de la selectividad es único y que sea un reto su cabal desarrollo.

Las interferencias pueden provenir de numerosas fuentes tales como: 1.-

Productos de degradación del mismo analito (por acción microbiana, química, térmica,
enzimática, metabolitos de degradación, etc). 2.- Substancias que se encuentran
presentes de manera natural en la matriz de la muestra y que poseen una estructura
química similar, pueden provenir de una misma familia o grupo funcional como: amino
ácidos, nucleótidos, flavonoides, ácidos grasos etc. 3.- Compuestos que si bien no
poseen estructuras similares, presentan características químicas o físicas iguales tales
como una misma absortividad a una longitud de onda, solubilidad etc (McCluskey y
Devery, 1993). Esto implica un conocimiento sobre la estructura del compuesto de
interés y como puede ser afectado. En el caso de alimentos también deben
considerarse aspectos como la presencia de otros compuestos, manipulación y
procesamiento, además de las condiciones de almacenamiento.

El primer parámetro que se determina para evaluar la pureza de un pico, consiste

en su tiempo de retención en relación a un estándar, o su factor de capacidad (k). Se
 29

comparan el tiempo y la forma de los picos de un estándar en relación a una muestra y

en caso de observarse deformidades, pueden ser ocasionadas por interferencias.

La integración del área de un pico, por parte del registrador-integrador es

obtenida generalmente a partir de programas, que se basan en funciones matemáticas
como la Gausiana Polimonial Modificada (G1PM), Exponencial Gausiana y la función de
Loventzian, sin embargo estas funciones no poseen una resolución completamente
eficiente en el caso de picos superpuestos y es por esto, que algunos autores han
desarrollado nuevas funciones matemáticas que permiten obtener una mayor
estabilidad de la línea base, resolución de picos superpuestos, definición en la forma y
simetría de los picos (Nikitas et al. 2001; Pap y Pápai, 2001). Estas aproximaciones
matemáticas permitirían precisar mejor la pureza de un pico, ya que no son tan
afectadas por las interferencias y presentan además una mejor estabilidad durante el
proceso de integración debido a la reducción de ruido de la línea base.

Otro procedimiento sencillo para evaluar la pureza de un pico consiste en realizar

una mezcla de la muestra con el estándar y proceder a su inyección en el equipo, de
observarse formación de dobletes de picos o deformaciones, puede implicar la
presencia de interferencias. En algunos casos se puede hacer variaciones a la fase
móvil, cambiando la proporción de alguno de sus componentes o pH, fuerza iónica, con
el objetivo de verificar si ocurre alguna deformación o partición del pico. Por otra parte
Wang et al. (2000) recomiendan la inyección de un estándar concentrado y/o una
muestra, seguido de un blanco para determinar si se observa el fenómeno de
"memoria", que consiste en la aparición de picos que son originados por cierto grado de
retención de una muestra anteriormente inyectada, generalmente debido a una
sobrecarga.

Dolan, (2001) señala que la sobrecarga al momento de la inyección, puede

ocasionar cambios en el tiempo de retención, formación de cola y/o ensanchamiento del
pico que pueden originar incertidumbre sobre la selectividad, ya que la deformación del
pico, no se sabe si es ocasionada por la presencia de una interferencia o debido a una
 30

sobrecarga. Esta última puede provenir de: 1.- Volumen grande de inyección en
comparación al volumen del pico. 2.- Sobrecarga de masa en comparación a la
capacidad de la columna y 3.- Sobrecarga de la matriz de la muestra, en la cual si bien
la concentración del analito es la adecuada, componentes de la matriz pueden bloquear
o enmascarar la superficie de la columna y cambiar por lo tanto la respuesta del analito.

Para solucionar estos problemas se puede:

1.- Inyección de un 15% del volumen del pico, así por ejemplo si el volumen del
pico es de 0,5 min., (diferencia de tiempos entre el comienzo y final del pico, o bien
ancho del pico expresado en min.) empleando un flujo de 0,3 mL/min., se tiene por lo
tanto 150µL y un 15% de este valor representa 22,5 µL. Este valor sería el máximo y un
volumen adecuado de inyección podría ser 20 µL.

2.-Emplear la aproximación práctica de que aproximadamente 1µg de analito

puede ser tolerado para su resolución, por cada un centímetro de una columna de 4,6
mm (i.d). Se tiene por lo tanto que 10-20 µg pueden ser resueltos en una columna de 15
cm x 4,6 mm. Si se inyecta 50 µL de un estándar de 10 µg/mL, se estaría introduciendo
una masa de 0,5 µg en una columna de 15 cm, lo cual no representa una sobrecarga.

3.- En el caso de sobrecarga de la matriz su evaluación es más compleja. Se

recomienda en este caso cambiar el proceso de extracción o purificación de la muestra,
de manera de tener un menor efecto por esta variable.

Para tener mayor certeza en la pureza del pico a evaluar, se puede a partir de un
estándar puro del analito, realizar las siguientes experiencias:

1.- Someterlo a una degradación provocada por agentes químicos, enzimáticos,

térmicos o por fotólisis. Este estudio puede contribuir a una mayor comprensión de los
resultados que se obtienen ya que permitiría visualizar la estabilidad del analito y en
caso de degradarse, evaluar si sus subproductos pueden interferir en los resultados.
 31

2.- También en el caso de alimentos es factible que se puedan aplicar las

condiciones de abuso a las cuales puede ser sometido y aplicarlas al analito, para
determinar si sufre algún tipo de modificación.

3.- En caso de disponer de muestras puras de las posibles interferencias, se

pueden añadir al estándar y muestras, para determinar si existe una interferencia real
en la resolución de los picos cromatográficos (Fabre y Altria, 2001). En estudios
realizados por Kim-Kang et al. (2001) para evaluar la presencia del medicamento
emamectina en salmón cultivado, analizaron la posible interferencia de otras 16 drogas
empleadas comúnmente en esta especie para tratar sus enfermedades, además de dos
productos de degradación de la emamectina. El objetivo era determinar si alguna de
estas substancias interfería en el pico de emamectina, sus resultados indicaron que no
existían interferencias por parte de estos compuestos.

La selectividad debe complementarse con la evaluación de la pureza y

homogeneidad del pico. Es factible que en un cromatograma que presente un pico
homogéneo, este incluido dentro otro pico superpuesto con lo cual se obtienen valores
mayores a los reales. Para evidenciar esta interferencia se puede utilizar el mismo
sistema cromatográfico en el cual se cambia solamente el detector (un UV por otro de
fluorescencia) para chequear mejor la pureza del pico. También se emplean
electroforesis capilar, cromatografía de gases, capa fina etc y se comparan los
resultados por evaluación estadística o también por comparación del número y
proporción de los picos entre ambas metodologías.

En algunos desarrollos se emplean más de un detector de manera de cuantificar

un mayor número de compuestos, así por ejemplo Zeppa et al. (2001) emplean un
detector: UV ( 210 y 290 nm) en línea con un detector de índice de refracción de esta
manera pueden cuantificar 12 compuestos distintos en 30 minutos. Los cromatogramas
se muestran en la FIGURA 4, y se observan picos que están sobrepuestos, sin
embargo ya que se emplea un detector de índice de refracción, que es más selectivo
 32

para azúcares se pueden realizar los correspondientes cálculos y determinar cada

compuesto. Así por ejemplo, en el cromatograma A (UV a 290 nm) se tiene el pico 4,
que corresponde al ácido pirúvico, mientras que en el cromatograma B (detector de
índice de refracción) muestra un pico de ácido pirúvico (4) unido a galactosa (18). Ya
que por el cromatograma A se puede cuantificar el ácido pirúvico, se resta su
contribución al área reportada por la señalada del detector de índice de refracción,
empleando estándares de este ácido para así obtener la cuantificación individual de la
galactosa.

FIGURA 4. Separación por HPLC, de ácidos orgánicos (1, oxálico; 2, cítrico; 3, orótico;
4, pirúvico; 5, láctico; 6, fórmico; 7, acético; 9, propiónico; 10, isobutírico; 11, butírico;
12, isovalérico; 13, valérico; 14 hipúrico y 15, úrico. Azucares: 16, lactosa; 17, glucosa y
18, galactosa. Diacetilo 8, y acetoína 19. Muestra de un queso comercial, con detección
UV a 210 nm (A), y 290 nm (C) y detector de índice de refracción (B).
Referencia: Zeppa et al. (2001).

Carlsson et al. (2001) modifican un método de HPLC en base al procedimiento

de extracción de inositol fosfato en cereales. Como parte de su protocolo de validación
comparan sus resultados con la metodología original de HPLC, determinando que no
 33

existen diferencias significativas (P > 0,05). Confirmando que el nuevo proceso de

extracción es adecuado ya que es más rápido y emplea menor cantidad de solventes.
En la FIGURA 5, se muestra una gráfica en al cual se comparan los resultados
obtenidos por ambas metodologías de HPLC, es de esperarse valores de pendiente
cercano a uno y un punto de corte cercano a cero, en el caso de que ambas obtengan
exactamente los mismos resultados.

FIGURA 5. Comparación de un método de referencia (HPLC fase reversa) y otro

método (cromatografía iónica) propuesto para la determinación de inositol fosfato en
alimentos.
Referencia: Carlsson et al. (2001).

Quattrocchi et al. (1992) señalan que en los equipos de HPLC, que disponen de
un sistemas de válvulas, es factible el "cortar" una sección de una corrida
cromatográfica y desviar este flujo a otra columna con otro detector con lo cual se
puede separar más eficientemente la sustancia de interés y evaluar así la pureza del
pico (FIGURA 6).
 34

FIGURA 6. Cromatografía con intercambio de columnas; simulación de un proceso de

corte central.
Referencia: Quattrocchi et al. (1992).

Según Krull y Swartz, (2001) HPLC no evidencia completamente la

homogeneidad de un pico, aún empleando un estándar. Puede darse el caso de que
una muestra tenga dentro del pico de interés, otro pico que perfectamente se
sobreponga al del analito. La mayoría de las aplicaciones de HPLC emplean detectores
UV y Vis, las cuales miden la absorción de un grupo funcional (cromóforo) a una
determinada longitud de onda. Si bien la columna es un factor de resolución y selección,
al pasar un analito al detector puede estar presente eluyendo simultáneamente una
interferencia. Inclusive una combinación multidimensional de HPLC, GC, o TLC, no
evidencia de forma satisfactoria la pureza de un pico (Zeppa et al. 2001). Sin embargo
se emplean sistemas de software con detectores de fotodiodos, espectroscopia de
masas (EM), infrarrojo con Transformadas de Fourier (FTIR), con la respectiva
evaluación de los espectros obtenidos que permiten precisar mejor la pureza de los
picos. El auge de los sistemas de computación unido a la creación de numerosas
librerías, permiten comprobaciones más sofisticadas, rápidas y con mínimos márgenes
de error.
 35

Una herramienta ampliamente empleada es el detector de ordenamiento de

fotodiodos, este sistema tiene la capacidad de evaluar para una muestra las
absorbancias dentro de un rango de longitudes de onda, en función del tiempo con lo
cual se generan gráficas que permiten visualizar espectros en tres dimensiones (tiempo,
aborbancia y longitud de onda) la forma y tamaño de los picos, así como también la
presencia de algún otro componente que este presente dentro del pico.

Los detectores convencionales como los UV y Vis generan datos puntuales en

los cuales se fija una longitud de onda y se obtienen valores de absorbancia, los cuales
al pasar al registrador-integrador permiten obtener los cromatogramas que son una
variación de la absorbancia a una longitud de onda puntual en función del tiempo, estos
detectores generan puntos de datos que son registrados en un tiempo. Mientras que el
detector de fotodiodos realiza un barrido de longitudes de onda en un tiempo
determinado, con lo cual se obtiene un espectro de absorción completo en tiempo real,
se tiene por lo tanto un espectro completo entre 190 a 900 nm, en un intervalo de
tiempo que puede ser menor de un segundo. El software del sistema permite la
ampliación o reducción de sectores de interés, así como también su rotación de manera
de permitir una mejor visualización y análisis (Quattrocchi et al. 1992; Rounds y Gregory
III, 1998).

Huber y Winter, (2000) señalan que debido a las características de entrega de

resultados en forma de tres dimensiones (3D) el número de puntos de datos generados
durante una corrida es de varios ordenes de magnitud, en relación a los sistemas
convencionales de detección UV y Vis. Los requerimientos de almacenaje pueden ser
de varios megabites para un análisis simple. Sin embargo el software del sistema de
fotodiodos permite al analista, seleccionar porciones de las corridas para su
correspondiente almacenaje como información, así por ejemplo un espectro completo
puede ocupar un espacio de 40 Mbytes, mientras que la selección de la porción de
interés, solo puede ocupar 40 Kbytes.
 36

Existen sistemas automatizados que permiten recolectar porciones de un solo

pico de interés, el cual es fraccionado de esta manera. A cada una de estas fracciones
se le miden sus espectros tanto con el detector de fotodiodos y también por EM, de
manera de determinar diferencias.

El empleo de espectros UV, Vis y de FTIR tiene una utilidad limitada, ya que las
absorciones dependerán de los cromóforos presentes, de esta manera pueden dos
compuestos diferentes presentar espectros de absorción similares. Pueden tomarse
espectros (UV, Vis y FTIR) al estándar y a la muestra (pico interés), estos son
comparados y normalizados matemáticamente para ser representados como vectores
en un espacio multidimensional, de esta manera espectros similares muestran vectores
que tienen como características: la misma dirección y el ángulo entre ellos, en casi cero.

Baunsgaard et al. (2000) analizaron la presencia de compuestos con

propiedades de fluorescencia entre ellos tirosina y triptofano, en jugo de remolacha,
mediante HPLC de exclusión molecular con dos tipos de detectores, el primero UV-Vis
de fotodiodos (rango de 210-550 nm) y el segundo de fluorescencia excitación (250/450
nm) y emisión (300/500 nm). Los autores para identificar la pureza (FIGURA 7) de los
picos de tirosina y triptofano realizan las siguientes pruebas: 1.- Añaden estándares a
una muestra para observar el comportamiento sobre el tiempo de retención y forma de
picos. 2.- Con el detector de fotodiodos realizan un espectro entre 200-300 nm, tanto a
las fracciones de los picos de la muestra, como a estándares.

Adicionalmente elaboran un mapa de fluorescencia para una fracción obtenida

entre los 22-23,5 min., de una corrida cromatográfica obteniendo la FIGURA 8. Esta
permite determinar con mayor certeza el número de compuestos presentes en esta
fracción, así como la forma y homogeneidad de los picos.
 37

FIGURA 7. Cromatografía de exclusión molecular con adición cualitativa de tirosina (1)

y triptofano (2), a una muestra de jugo de remolacha, empleando un detector de
fluorescencia a 285/325 nm. Los cromatogramas UV-Vis obtenidos con detector de
diodos, (200-300 nm), corresponden a los estándares respectivos.
Referencia: Baunsgaard et al. (2000).

Para tener una mayor seguridad en la pureza del pico, se puede emplear un
detector de masas, que identifica la estructura química del compuesto. Este sistema ha
sido recomendado por el FDA especialmente para el estudio de pesticidas en alimentos
(Fernández et al. 2001). Se puede inyectar la muestra y el estándar bajo idénticas
condiciones HPLC y en un sistema en línea acoplar detectores UV y masas, para
comparar los espectros obtenidos (Krull y Swartz, 2001).

Chandra et al. (2001) en un trabajo sobre la separación, identificación y

cuantificación de antocianinas, en jugos deshidratados en polvo, confirman la presencia
de cianidina 3-rutinosa, mediante el añadido de un estándar a la muestra como se
muestra en la FIGURA 9, adicionalmente emplearon un detector de masas para
confirmar completamente la sustancia.
 38

FIGURA 8. Gráfica de fluorescencia determinada por HPLC, de la fracción N° 9, de un

jugo de remolacha, obtenida de la medición de 31 longitudes de onda de excitación
(230-460 nm) y 431 longitudes de onda de emisión (288-700 nm).
Referencia: Baunsgaard et al. (2000).

FIGURA 9. Cromatogramas por HPLC, de antocianinas (cianidina 3-rutinosa) en jugos

deshidratados en polvo. Añadido en dos niveles 129 y 158%.
Referencia: Chandra et al. (2001).
 39

En la Tabla 1, se muestra un resumen de varios trabajos en alimentos en los

cuales, se han empleado diferentes procedimientos y detectores, para conocer la
selectividad de la metodología. El más empleado consiste en la comparación con un
estándar a la muestra, determinando tiempo de retención (tr) y forma de pico, es usual
también el añadido de un estándar para así evaluar si se manifiesta algún tipo de
alteración en estos parámetros. Los detectores de fotodiodos y masas, cada vez tiene
mayor utilidad como criterio para la evaluación de la pureza de pico.

5.2.- Linealidad.

La linealidad se refiere a la capacidad del método para obtener resultados

proporcionales entre la concentración de un analito y su respuesta, dentro de un rango
de interés, en algunos casos se pueden realizar transformaciones matemáticas para
obtener este parámetro (USP, 2002). Es deseable conocer dentro de que límites de
concentración se obtienen respuestas que tengan proporcionalidad, entre la variable
independiente (concentración) y la dependiente (respuesta del detector). Es una
costumbre general en métodos que han sido validados el inyectar un solo estándar y en
base a este, cuantificar una muestra. En esta caso es deseable que la concentración
del estándar sea lo más aproximada o cercana del valor esperado de la muestra, de
manera de disminuir el error experimental, este procedimiento puede ser realizado en
determinaciones rutinarias, en las cuales previamente se ha evaluado la linealidad y se
tiene suficiente confianza en el método como para efectuar un análisis con un solo
estándar.

También puede ser considerado el rango como parámetro de validación y este

consiste en el intervalo entre los valores bajos y altos de la concentración del analito
entre los cuales se tiene un adecuado nivel de precisión, exactitud y linealidad.
 40

TABLA 1. Selectividad en metodologías por HPLC aplicadas a alimentos.

Referencia Alimento Detector Analito Identificación

Bicchi et al. Pulpa de manzana Diodo UV Daminozida Pico /tr a 295 y 325 nm
(2001) Espectro UV 200-375
Espectro de masas
Breithaupt, Jugos de frutas Diodos UV Ácido fólico Pico /tr
(2001) 284 nm Espectro UV
Esteve et al. Hongos Fluorescencia Tiamina Pico /tr
(2001) Riboflavina
Grande et al. Alimento para Diodos UV Sulfametazina Pico /tr
(2001) animales 264 y 230 nm Trimetoprina Espectro UV
Kim-Kang et Atún Fluorescencia Emamectina Pico /tr
al. (2001) Espectro de masas
Nyman y Cerezas, fresas y Diodo Vis Antocianidinas Pico/tr
Kumpulainen, vinos 530 y 510 nm (6) Espectro UV
(2001)
Pripis-Nicolau Vinos y mostos Fluorescencia 22 amino Pico /tr
et al. (2001) ácidos (AA)
Rose-Sallin et Cereales instantáneos Fluorescencia Niacina Pico /tr
al. (2001)
Elmadfa, Aceite oliva Fluorescencia Vitamina K Pico /tr
(2000) Brócoli 243, 272 y 330 nm de ex.
Izquierdo et Bebidas alcohólicas Fluorescencia Cumarinas Pico /tr
al. (2000) Espectros UV
Mattila et al. Cebollas, té, limón, Diodo UV-Vis Flavonoides Pico/tr
(2000) naranja, brócoli, etc 270, 280 ,329 (17) Espectros
y 370 nm Voltametría
Electroquímico
Sotelo y Papas UV-Vis Solanina (S) Pico/tr
Serrano, 200 nm Chaconina (Ch)
(2000)
Wang et al. Té verde Diodo Cafeína Pico /tr
(2000) Fluorescencia Ácido gállico Espectro UV
Woollard et al. Leche y formulas Diodo UV Ácido Pico/tr
(2000) infantiles pantoténico 200, 205 y 240 nm
 41

Los modelos lineales pueden ser expresados por y = A 0 + A1x + e en donde A0

es la respuesta analítica del blanco, A1 es la sensibilidad y e corresponde al ruido de
fondo del instrumento y los errores. Este modelo permite estimar los coeficientes por
regresión lineal con mínimos cuadrados, cuando los errores (e) están normalmente
distribuidos (Feinberg, 1998).

Para la determinación de la linealidad se puede:

1.- Proceder a la inyección de diferentes concentraciones del estándar y se

determina cada una de las respuestas, elaborándose una gráfica, donde se estima el
comportamiento de la curva obtenida, es de esperar que muestre una tendencia a la
linealidad para proceder posteriormente a la interpolación de la respuesta que se
obtiene con una muestra.

2.- Añadir a la muestra diferentes concentraciones del estándar de manera de

evaluar el efecto de la matriz sobre la linealidad.

Para estimar las concentraciones a las cuales se va a inyectar los estándares, se

pueden tomar en cuenta factores tales como: niveles máximos o mínimos permitidos o
recomendados por normativas nacionales o internacionales. Si una sustancia tiene un
nivel máximo permitido, o mínimo requerido, se puede ajustar el método de tal manera
que este nivel (después de realizar los tratamientos y diluciones o concentraciones
respectivas), se localice en la mitad de la curva añadiendo puntos con un exceso del
50% y un defecto también del 50%. Por otra parte Fabre y Altria, (2001) señalan que
también se puede evaluar la linealidad, entre 80-120% o 60-140%, mientras que para
impurezas se puede determinar cerca de su nivel máximo permitido, hasta un 200%. Si
bien las consideraciones anteriores son referidas principalmente para estudios por
HPLC en medicamentos, estas son también aplicables en alimentos.

Una vez seleccionado en rango en el cual se desea evaluar la linealidad, se

realizan al menos cinco concentraciones distintas de un estándar y se inyectan al
 42

menos por duplicado, determinándose la curva de regresión lineal sobre el total de

todas las determinaciones, lo cual permite calcular los estimadores estadísticos de
punto de corte con el eje Y, (a), pendiente (m) y coeficiente de regresión lineal (r). Con a
y m, se obtiene la curva que describe el comportamiento de la respuesta del detector en
función de la concentración del analito, mientras que r, señala la linealidad: un valor de
uno o cercano a este, implica una recta lineal y un r cercano a cero señala no relación
entre respuesta y concentración, o desviaciones fuertes de la misma. Se emplea
también el coeficiente de determinación (r2), ya que da una mejor percepción para
juzgar la linealidad, así por ejemplo un valor de r2 de 0,99886 representa que solo un
0,114% (1,00000 - 0,98886 = 0,00114 x100 = 0,114%) de los datos tienen una
desviación de la linealidad obtenida (Smith, 1998).

A los resultados se les puede calcular sus intervalos de confianza, a una

probabilidad dada (usualmente 95%) dando los valores límites máximos y mínimos de la
curva (Montgomery, 2002) y también deben evaluarse los residuos que son la diferencia
entre los valores de las respuesta medidas y los calculados con la ecuación de la recta.
A estos residuales se les debe comprobar su normalidad mediante las siguientes
pruebas:

1.- Ajuste a una curva de normalidad.

2.- Gráficas de residuales contra tiempo y valores ajustados.
3.- Histograma de frecuencias
4.- Prueba de Chi-cuadrado.

Se pueden comparar los resultados obtenidos de inyectar el estándar puro, con

una mezcla de una muestra más el estándar, lo cual permite valorar si la matriz de la
muestra tiene algún efecto sobre el analito. Los resultados pueden ser que se
incremente la señal o que disminuya. El aumento de señal puede deberse a la
presencia adicional del analito en la muestra que produce una mejor extracción,
mientras que la disminución es generalmente atribuida a compuestos de la matriz que
 43

acomplejan o reaccionan con el analito de forma irreversible, disminuyendo por lo tanto

su concentración.

Algunos de estos resultados se pueden ver en la FIGURA 10. Al obtener rectas

paralelas al estándar puro el efecto es aditivo, lo cual indica que a cualquier
concentración el aumento es similar en todos los casos, mientras que los efectos
también pueden ser multiplicativos, reflejando un aumento de la respuesta, proporcional
a la concentración (Quattrocchi et al. 1992).

FIGURA 10. Efectos de matriz, (a) aditivos y (b) multiplicativos, en comparación con (c)
estándar puro.
Referencia: Quattrocchi et al. (1992).

En la Tabla 2, se muestran los resultados de linealidad determinados en

diferentes trabajos por HPLC en alimentos. Abarcan una gran diversidad de alimentos,
así como también de detectores. Todos los valores obtenidos de coeficiente de
correlación se encuentran cercanos a 1,000 lo cual es de esperarse, ya que no se
reportaría una método con valores significativamente distintos de una tendencia lineal,
esperándose también este comportamiento por parte de los detectores empleados. La
mayoría de los investigadores reportan el rango dentro del cual fue determinada esta
linealidad, a excepción de unos pocos.
 44

TABLA 2. Linealidad de metodologías por HPLC aplicadas a alimentos.

Referencia Alimento Detector Analito Coeficiente de

correlación
Rango (ppm)
Bicchi et al. (2001) Pulpa de Diodos UV Daminozida 0,997
manzana 0,005-0,05
Breithaupt, (2001) Jugos de frutas Diodos UV Ácido fólico 0,999
0,06-2,0
Carlsson et al. (2001) Cebada, avena UV Inositol 1,000
arroz, pan fosfatos 0,1-0,8 mM
Chandra et al. (2001) Jugos en polvo Vis Antocianinas 0,999
deshidratados 4-400
Esteve et al. (2001) Hongos Fluorescencia Tiamina 0,999
Riboflavina (T) 1,3-573 ppb
(R) 8,6-1.030 ppb
Grande et al. (2001) Alimento para Diodos UV Sulfametazina 0,9996
animales Trimetoprina 0,9992
1-100
Kim-Kang et al. Atún Fluorescencia Emamectina mínimo 0,9800
(2001) 2-100 ppb
Pripis-Nicolau et al. Vinos y mostos Fluorescencia 22 amino 0,970 - 0,999
(2001) ácidos (AA) (*)
Rose-Sallin et al. Cereales Fluorescencia Niacina 0,9995
(2001) instantáneos 0,25-100
Mattila et al. (2000) Cebollas, té, Diodos UV-Vis Flavonoides > 0,999
limón, naranja, Electroquímico (17) 2- 4
brócoli, etc
Sotelo y Serrano, Papas UV-Vis Solanina (S) NR
(2000) Chaconina S: 12 - 24
(Ch) Ch: 15 - 30
Wang et al. (2000) Té verde Diodos Cafeína 0,988 a 1,000
Fluorescencia Ácido gállico NR
(*) Evaluaron 22 amino ácidos por lo tanto el rango de concentraciones es muy variable.
NR: no reporta
 45

5.3.- Precisión

La precisión es la dispersión de las medidas alrededor de su valor promedio,

cuando es valorada a partir de una muestra homogénea. Se expresa matemáticamente
como la desviación estándar (DE), también como porcentaje de la desviación estándar
relativa (DER%) o coeficiente de variación (CV) (Smith, 1998). Estos estadísticos
permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la medida, debido a errores
sistemáticos y aleatorios que producen la dispersión alrededor del promedio. La
precisión depende por lo tanto del número de determinaciones que son realizadas
(Fabre y Altria, 2001).

Según Quattrocchi et al. (1992) la precisión es determinada en base a:

1- Sistema: evaluando la dispersión de al menos 6 inyecciones del estándar.

2.-Método: evaluando la dispersión de varias preparaciones de la muestra final

homogénea. En este caso se deben realizar todo el procedimiento desde el tratamiento
de la muestra hasta su cuantificación final.

La precisión puede ser considerada en tres niveles:

1.- Repetitiva: se refiere a cualquier variabilidad en un método cuando es

realizado por el mismo analista y equipo en un intervalo corto de tiempo (usualmente un
día). Pueden ser cinco inyecciones (intra-día) por cinco días consecutivos (inter-día) con
un mismo analista.

2.- Intermedia: es la precisión que se obtiene cuando uno o varios de los factores
(analista, día de operación, otra columna pero de la misma marca y características) son
cambiados dentro de un mismo laboratorio. Puede ser inyección de una muestra por
duplicado por cinco días diferentes, con tres analistas distintos (Transfiguración et al.
2001).
 46

3.- Reproducibilidad: se refiere a estudios en los cuales la misma muestra es

analizada por diferentes laboratorios para propósitos comparativos, bajo estas
condiciones se tienen diferentes analistas, día de análisis y casi siempre diferentes
instrumentos y columnas. Este tipo de precisión es considerado por algunos
investigadores y organismos como fortaleza (en inglés "ruggedness"). En esta revisión
se tomará como un aspecto aparte de precisión y se discutirá por lo tanto en otra parte
del seminario.

La DER%, del sistema para precisión repetitiva, no debería ser mayor del 2%
inyectando cinco veces una solución estándar, en algunos casos se pueden obtener
valores inferiores al 1% e inclusive menores. Mientras que en muestras complejas o en
trazas, es factible DER% de 5 a 10%. Según Transfiguración et al. (2001) en HPLC
valores normalmente aceptados de DER%, en relación a los parámetros área del pico y
tiempo de retención son iguales o menores de 15% y 2%, respectivamente.

Se recomienda un mínimo de cinco determinaciones por cada concentración

empleada en conjunto con un mínimo de tres concentraciones. Para la precisión se
puede calcular el intervalo de confianza de la medida, lo cual indica dentro de que
rango se encuentra el valor de la población con respecto a un nivel de probabilidad.
Cuando se determina la precisión con un número mínimo de 30 muestras
independientes y que siguen una distribución normal, se puede emplear para el cálculo
del intervalo la distribución Z. Pero cuando el número de muestras es inferior a 30 debe
emplearse una distribución t-student (Smith, 1998).

En la TABLA 3, se muestran los resultados obtenidos por Carlsson et al. (2001)

en la determinación de inositol fosfafo en avena en hojuelas. Se indican los valores de
precisión repetitiva consistente de dos muestras inyectadas 10 veces cada una en dos
días distintos (uno por muestra), los DER% obtenidos fueron de 1,25 y 4,85%, por otra
parte la precisión intermedia (8,16%) se evaluó en dos muestras inyectadas por
duplicado por seis días.
 47

TABLA 3. Precisión repetitiva (mismo día) e intermedia (diferentes días), evaluada en

avena en hojuelas por HPLC, en la determinación de inositol fosfato (µmol/g).

Día de extracción y análisis

Corrida 1 2 3 4 5 6 DER%
1 12,70 13,22 12,34 14,74 15,24 13,42 8,16
2 12,82 12,00 12,27 14,84 14,28 13,69
3 12,83 11,69
4 12,41 11,52
5 12,55 11,80
6 12,37 11,76
7 12,69 11,77
8 12,49 11,18
9 12,61 11,22
10 12,63 11,54
DER% 1,25 4,85
Referencia: Carlsson et al. (2001).
Observación: Las experiencias faltantes no fueron realizadas por los investigadores.

En estudios realizados por Pripis-Nicolau et al. (2001) para la cuantificación de

22 amino ácidos en vinos y mostos, determinaron la precisión repetitiva (mismo día) e
intermedia (diferentes días). Los resultados principales se muestran en la TABLA 4. Se
puede observar que existe una gran variabilidad de la precisión entre los distintos amino
ácidos. Según estos autores una DER% superior al 15% para una concentración de 10
ppm es el máximo permitido, con lo cual lisina y ornitina exceden este valor. Estos
autores introducen un paso adicional de validación que no se ha observado en la
bibliografía consultada, que consiste en chequear la linealidad de todas las curvas de
calibración de los amino ácidos, realizando dos determinaciones con cuatro días de
diferencia, determinando que la pendiente y punto de corte se mantenían constantes,
como se puede observar en la FIGURA 11.

Kim-Kang et al. (2001) determinan la precisión a varios niveles de incorporación

de la droga emamectina, en músculo y piel de atún cultivado. Los resultados se
muestran en la TABLA 5. Al evaluar la precisión con este tipo de diseño experimental,
 48

se podría valorar adicionalmente si las diferentes concentraciones tenían influencia

sobre la precisión.

TABLA 4. Precisión repetitiva (mismo día) e intermedia (diferentes días), evaluada en

vino por HPLC en la determinación de amino ácidos (ppm).

Repetitiva Intermedia
Diez determinaciones Tres días por duplicado
Amino ácido DE DER% DE DER%
Triptofano 0,019 2,0 ND ND
Histidina 0,005 3,7 0,009 14,9
Alanina 0,030 4,0 0,114 2,7
Lisina 0,010 19,8 0,009 17,5
Ornitina 0,011 18,5 0,012 18,7
Cisteína 0,006 5,7 0,002 3,7
Tirosina 0,013 8,0 0,017 2,6
Glutamina 0,004 7,0 0,003 18,9
ND: no detectado
Adaptado de: Pripis-Nicolau et al. (2001).

FIGURA 11. Cambios en la curva de calibración de cisteína e isoleucina en 4 días.

Referencia: Pripis-Nicolau et al. (2001).
 49

TABLA 5. Precisión repetitiva (mismo día) e intermedia (diferente día), evaluada en atún
por HPLC, en la determinación de emamectina.

Añadido de emamectina (ppb) DER% Repetitiva DER% Intermedia

Quintuplicado Triplicado
Músculo
50 9,71 4,25
100 8,01 2,83
200 6,14 1,52
400 6,41 3,09
800 4,19 1,18
Promedio 6,89 2,57

Piel
50 4,95 2,31
100 6,37 2,78
200 4,50 3,57
400 5,56 1,72
500 5,36 3,04
Promedio 5,35 2,68
Adaptado de: Kim-Kang et al. (2001).

Smith, (1998) señala que los errores asociados a una determinación analítica
afectan tanto a la precisión como la exactitud. Se pueden clasificar en sistemáticos
(determinados), aleatorios (indeterminados) y errores por omisión o equivocación. Los
primeros producen resultados que tienen desviaciones consistentes en un sentido u otro
y pueden ser ocasionados por una inadecuada calibración de un equipo, reactivos
contaminados, etc, este tipo de error se corrige, mediante calibración, blancos de
reactivos, o usando otro procedimiento analítico. El segundo son aleatorios y pueden
ser originados por malas lecturas de una pesada en balanza, inestabilidad de un equipo
de pH para la preparación de una fase móvil o inestabilidad de una línea base en un
cromatograma. Los terceros son ocasionados por errores por omisión o equivocación,
por ejemplo utilizar acetonitrilo en lugar de agua en una fase móvil, también por el
empleo de un reactivo que no corresponde o por la omisión en un protocolo de un
reactivo o un paso del procedimiento.
 50

Un parámetro asociado a la precisión y exactitud de una medida, lo constituye la

incertidumbre del resultado. Este valor puede contribuir a evaluar mejor los factores que
afectan los errores sistemáticos de una metodología en los diferentes pasos y por lo
tanto puede generar información sobre como disminuirlos. Según Grande et al. (2001)
el cálculo de este parámetro es de carácter obligatorio para laboratorios acreditados
bajo la normativa de estándares Europeos EN 45001.

Para su determinación se deben tomar en cuenta todos los errores que pueden
ser ocasionados por factores tales como apreciación y tolerancia tanto del material de
vidrio empleado para realizar las diluciones o concentraciones, así como también las
tolerancias y/o sensibilidades de los equipos. Se consideran los errores de pesada,
pureza, volumetrías, calibración del HPLC, tolerancia del flujo de la bomba, error del
ancho de banda del detector, tolerancia del controlador de temperatura, errores de área
de los picos, resolución etc. Se analiza también como se pueden multiplicar estos
efectos en los pasos subsiguientes, en lo que se denomina "una incertidumbre
expandida", que es expresada en base a la concentración del analito en una muestra.
Esta incertidumbre representa el valor mínimo a partir del cual no se puede tener una
certeza de que la determinación tenga validez (Barwick et al. 2001).

En la Tabla 6, se muestra la precisión obtenida en varios trabajos en HPLC

aplicados a alimentos. En general los investigadores para chequear este parámetro
realizan un número determinado de inyecciones (5-14) y proceden a calcular la DE y
DER%. Los valores obtenidos usualmente son inferiores a un 5%, sin embargo también
se reportan hasta un 10% de DER%, estos resultados se obtienen en determinaciones
múltiples de varios compuestos, en los cuales se puede estar "sacrificando" precisión
en la determinación de un compuesto, por mejorar la de otro. Lo recomendable para la
valoración de este parámetro, sería aumentar en número de muestras, de manera de
ajustarse mejor a una distribución normal y proceder por lo tanto a un mejor ajuste por
medio de los estadísticos que se empleen.
 51

TABLA 6. Precisión de metodologías por HPLC aplicadas a alimentos.

Referencia Alimento Detector Analito N DS DER%

Bicchi et al. (2001) Pulpa de manzana UV Daminozida 6 7,8 6,7

Chandra et al. (2001) Jugos en polvo Vis Antocianinas 5 0,012 3,1

deshidratados
Dreassi et al. (2001) Cárnicos UV Levamisol 5 NR 2,7 -4,0

Esteve et al. (2001) Hongos Fluorescencia Tiamina (T) 6 (T) NR 2,5

Riboflavina (R) (R) NR 2,5
Grande et al. (2001) Alimento para Diodos UV Sulfametazina 6 NR 1,0
animales Trimetoprina
Nyman y Cerezas, fresas y Diodos Vis Antocianidinas 14 NR 1,4-2,6
Kumpulainen, (2001) vinos
Rose-Sallin et al. Cereales Fluorescencia Niacina 10 0,05 0,8
(2001) instantáneos
Zeppa et al. (2001) Quesos UV Azúcares, 10 NR 3,6- 0,7
Índice ácidos
refracción diacetilo y
acetoína
Elmadfa, (2000) Brócoli Fluorescencia Vitamina K 8 NR 7,6

Izquierdo et al. (2000) Bebidas alcohólicas Fluorescencia Cumarinas 10 0,37 0,3

Mattila et al. (2000) Cebollas, té, limón, Diodo UV-Vis Flavonoides NR NR 2,9 - 10,4
naranja, brócoli, etc Electroquímico (17)
Sotelo y Serrano, Papas UV-Vis Solanina 9 NR 0,1 -0,4
(2000) Chaconina
Wang et al. (2000) Té verde Diodos Cafeína (CF) 10 CF NR 0,3
Fluorescencia Ácido gállico AG NR 8,9
(AG)
Woollard et al. (2000) Leche y formulas Diodo UV Ácido 12 NR 2,68
infantiles pantoténico
N: Número de muestras. DE: Desviación estándar. %DER: Porcentaje de desviación estándar relativa.
NR: No reporta
 52

5.4.- Exactitud.

La exactitud es conocido también como error sistemático o tendencia, y

corresponde a la diferencia entre el valor obtenido (promedio) y el valor verdadero. Este
parámetro determina las desviaciones del método analítico de uno "ideal" y estas
variaciones pueden ser: método inadecuado, interferencias en la extracción, alteración
del analito durante su análisis, etc.

La exactitud puede ser evaluada de dos maneras:

1.- Método absoluto, cuando se dispone de una muestra que tiene una cantidad
conocida de un compuesto, sin embargo ya que es realmente difícil disponer de una
muestra con un valor verdadero, es factible emplear otra metodología (quizás más
compleja), que sea más exacta que la que se desea evaluar y emplear ese valor como
el verdadero.

2.- Se emplea con más frecuencia el porcentaje de recuperación de la muestra,

que consiste en añadir a la muestra unas cantidades conocidas del analito, dentro de
un rango de interés y proceder a su cuantificación (Pomeranz y Meloan, 1994b).

Es deseable que los valores de recuperación sean lo más cercanos al 100%, lo

cual indicaría que la presencia de errores probablemente es mínima o que su sumatoria
(valores negativos y positivos) tiende a cero. Sin embargo es frecuente encontrar
valores entre 80 y hasta 110%, en el caso de trazas generalmente se obtienen
recuperaciones entre 60 al 80%. Se recomienda usar un mínimo de cinco
determinaciones por cada concentración, en conjunto con un mínimo de tres
concentraciones, el promedio debería estar dentro de un 15% del valor esperado, pero
cuando se trata de valores mínimos se puede estar dentro de un 20% (Swartz y Krull,
2003).
 53

Este parámetro mide generalmente las pérdidas causadas por la unión del
analito a compuestos contenidos en la matriz del alimentos, que evitan su extracción y
por lo tanto su cuantificación, por otra parte también se manifiestan efectos de
diferencias de solubilidad de un compuesto a diferentes concentraciones o por la
presencia de otros componentes (interferencia) en la matriz (Fabre y Altria, 2001). La
exactitud se puede ver seriamente afectada cuando una interferencia, se encuentra en
niveles variables en muestras diferentes, con lo cual un método se diseña y valida para
ciertas condiciones, que después no necesariamente cumple para todas las muestras
(Pomeranz y Meloan, 1994b).

En caso de una muestra con un valor aceptado como verdadero, se procede a

realizar varias determinaciones con el procedimiento que se desea evaluar. A los
resultados obtenidos se les realiza su análisis estadístico, para conocer si existen
diferencias significativas mediante una t-student, entre el método a evaluar y el valor
verdadero. Un procedimiento clásico consiste en determinar la relación lineal entre los
valores aceptados y los obtenidos por el método a evaluar, mediante su coeficiente de
correlación (Feinberg, 1998). Se puede evaluar los resultados obtenidos por HPLC con
otra metodología como electroforesis capilar (EC), en este caso se deben normalizar las
áreas (área dividido entre el tiempo de retención), para compensar las diferencias que
se producen en EC en relación al tiempo de residencia dentro del detector, ya que en
HPLC todos los analitos se trasladan a la misma velocidad (de la fase móvil) y tienen
por lo tanto el mismo tiempo de residencia dentro del detector, mientras que en EC el
tiempo de residencia dentro del detector dependerá de la movilidad de la especie
(Fabre y Altria, 2001).

En la TABLA 7, se indican trabajos de validación en los cuales se ha empleado

un segundo método con fines comparativos, para así tener mayor certeza de que los
resultados obtenidos con el método que se está proponiendo son exactos. Es preferible
emplear para fines comparativos un método oficial, sin embargo se puede señalar que
en la bibliografía consultada este procedimiento no es muy frecuente entre los
investigadores, ya que se encontró poca información al respecto.
 54

TABLA 7. Comparación de resultados por HPLC con otras metodologías.

Referencia Alimento Detector Analito Método de

comparación
Carlsson et al. Cereales UV Inositol fosfato HPLC
(2001)
Esteve et al. Hongos Fluorescencia Tiamina (T) AOAC
(2001) Riboflavina (R) Fluorometría

Rose-Sallin et al. Cereales Fluorescencia Niacina Microbiológico

(2001) instantáneos
Izquierdo et al. Bebidas Fluorescencia Cumarinas Fluorometría
(2000) alcohólicas
Woollard et al. Leche y Diodos UV Ácido pantoténico Microbiológico
(2000) formulas Cromatografía
infantiles de gases

Para porcentajes de recuperación se emplean al menos 3 concentraciones del

analito por triplicado, que pueden ser entre 50-150%, 80-120% y 60-140% del valor
esperado). A los valores del porcentaje de recuperación se les compara versus el 100%
(valor añadido), para así determinar si existen diferencias significativas.

Krull y Swartz, (2000) señalan que para principios activos de medicamentos, el

FDA recomienda un mínimo del 90% de recuperación y que porcentajes inferiores a
este valor unido a baja reproducibilidad, pueden ser motivo de rechazo por parte de
este organismo, en la aprobación de la validación de métodos. Mientras que Breithaupt,
(2001) indica que los rangos aceptables en alimentos recomendados por la AOAC, son
entre 80-110% para un nivel de 1ppm.

Generalmente bajos porcentajes de recuperación pueden ser ocasionados por

una inadecuada preparación de la muestra, sistema de extracción, interferencias o
interacciones con la matriz (Lesnik et al. 2000).
 55

Según Kontou et al. (2001) deben evaluarse si los porcentajes de recuperación

son independientes de la concentración a la cual se añade el analito, debido a que en
una metodología que involucre varios pasos de extracción, el coeficiente de partición
del analito en los solventes puede ocasionar diferentes rendimientos finales. Para este
propósito se realizan varias replicas a diferentes concentraciones y se determina
mediante un análisis de varianza (ANOVA) si existen diferencias significativas.
Adicionalmente se comprueba que los errores tengan una distribución normal e
independiente, mediante una estudio de los residuales en base a:

1.- Análisis de curva de probabilidad normal.

2.- Gráficas de residuales del tipo de secuencia en el tiempo y valores ajustados.
3.- Histograma de los residuales.
4.- Chi-cuadrado.
5.- Prueba de Bartletts, de homogeneidad de varianza (Montgomery, 2002).

En la TABLA 8, se muestran trabajos en los cuales se han determinado el

porcentaje de recuperación de diferentes analitos en muestras de alimentos. El número
de ensayos para evaluar este parámetro es muy variable ya que van desde 2 hasta 14
muestras, esto dependerá principalmente del grado de dificultad o trabajo para realizar
este ensayo. La mayoría no reporta un estudio sobre el porcentaje de recuperación a
varios niveles. Los valores son generalmente mayores del 95% hasta 102%, pero
también se indican valores bajos de 59% especialmente en determinaciones múltiples,
en las cuales la metodología está optimizada para la mayoría de los compuestos o los
de mayor interés, pero es difícil armonizarla integralmente para todas las substancias.
 56

TABLA 8. Exactitud de metodologías por HPLC, aplicadas a alimentos.

Referencia Alimento Detector Analito N % recuperación

Bicchi et al. Pulpa de UV Daminozida 6 71-90
(2001) manzana
Breithaupt, Jugos de frutas diodos UV Ácido fólico 3 jugo 97 néctar 79
(2001) (284 nm)
Chandra et al. Jugos en polvo Vis Antocianinas 2 102
(2001) deshidratados
Dreassi et al. Cárnicos UV Levamisol 5 99 - 106
(2001)
Esteve et al. Hongos Fluorescencia Tiamina (T) 2 (T) 91 (R) 96
(2001) Riboflavina (R)
Nyman y Cerezas, fresas Diodos Vis Antocianidinas 2 a 14 79 - 103
Kumpulainen, y vinos excepto malvidina 59-67
(2001)
Rose-Sallin et Cereales Fluorescencia Niacina 13 89- 110
al. (2001) instantáneos
Zeppa et al. Quesos UV Azúcares, 3 >89 excepto lactosa y
(2001) Índice ácidos ácido orótico con 80
refracción diacetilo y
acetoína
Elmadfa, Brócoli Fluorescencia Vitamina K 8 97
(2000)
Izquierdo et al. Bebidas Fluorescencia Cumarinas 9 87-95
(2000) alcohólicas
Mattila et al. Cebollas, té, Diodos UV-Vis Flavonoides NR 70 - 124
(2000) limón, naranja, Electroquímico (17)
brócoli, etc
Sotelo y Papas UV-Vis Solanina 3 99
Serrano, 200 nm Chaconina
(2000)
Woollard et al. Leche y Diodo UV Ácido 4 98
(2000) formulas pantoténico
infantiles
N: Número de muestras., NR: no reporta
 57

5.5.- Límites de detección y cuantificación.

Al validar un método se requiere conocer cual es la cantidad mínima de un

analito que puede producir una respuesta en un equipo. Los principales parámetros
según Quattrocchi et al. (1992), involucrados con este concepto son:

1.- Límite de detección (LD): corresponde a la menor cantidad del analito que
puede producir una señal en un equipo, pero que no es cuantificable. En este caso se
observa en el cromatograma una desviación del comportamiento de la línea base, sin
embargo el equipo no procede a su integración de una manera clara. Puede ser una
concentración de una sustancia que es inyectada y en ocasiones produce una
integración pero en otras no. Con lo cual el equipo detecta una alteración pero no tiene
la capacidad para dar una respuesta proporcional.

2.- Límite de cuantificación (LC): corresponde a la menor cantidad del analito

que produce una señal que puede ser cuantificable con precisión y exactitud razonable,
bajo las condiciones de estudio.

LC y LD, son frecuentemente asociados con el término sensibilidad, este último

está más relacionado con la variación de una respuesta a un cambio de concentración
del analito, que corresponde a la pendiente en la curva de linealidad (Krull y Swartz,
1998).

Los LC y LD se valoran principalmente para el análisis de impurezas, trazas,

productos de degradación o cuando el nivel de analito a evaluar se encuentra cercano
al límite de detección. Sin embargo es deseable el conocer hasta que nivel el equipo y
el método tiene capacidad para dar una respuesta.

La importancia de estos dos parámetros en la validación radica en que; es

factible que al evaluar un analito no se detecte su presencia en un alimento, esta
situación plantea la siguiente interrogante: ¿ Hasta que nivel realmente no está
 58

presente el compuesto ?, no es adecuado señalar que la sustancia se encuentra

ausente o que su valor es cero. Cada metodología con sus respectivos equipos tienen
una capacidad para cuantificar un compuesto, si este se encuentra por debajo del
potencial del método para su medición, debe señalarse que el compuesto no es
detectado e indicar el límite de detección y/o cuantificación, con lo cual se asegura que
la sustancia puede estar presente en un nivel inferior o igual a los límites calculados.

Se emplean varias aproximaciones sencillas para LD y LC, las más utilizadas

son:

1.- La evaluación de la relación señal/ruido (S/R) que puede ser obtenida a partir
de un blanco de reactivos o de una muestra, se recomienda realizar aproximadamente
20 inyecciones. Un S/R de 3 es generalmente estadísticamente aceptado para LD y
para LC un S/R de 10. En caso de no mostrar señal y tener una línea base recta, sin
fluctuaciones se puede tomar el ruido de fondo para obtener un LD y LC técnicos, que
se calculan también a partir de 3 y 10 veces esta señal (IUPAC, 1997).

2.- Se pueden realizar inyecciones repetitivas de un estándar lo más diluido

posible. El nivel correspondiente a cuando el equipo puede registrar un área de
integración pero no siempre puede (aproximadamente un 50-50%), se toma como el
LD. Para LC se puede tomar en cuenta la concentración inyectada para LD, se le
multiplica por un factor de 2-3, se procede a su inyección y si obtiene un pico pequeño,
pero estable en cuanto a área, tiempo de retención este valor se puede tomar como LC
(Ruyck et al. 2001).

Krull y Swartz, (1998) señalan a respecto que estos procedimientos no presentan

gran confiabilidad, ya que al realizar cromatogramas de analitos en soluciones muy
diluidas, la integración de las áreas generalmente presenta problemas, no se registran
bien el principio y final del pico, por otra parte en algunas ocasiones la línea base no
tiene siempre un comportamiento constante y frecuentemente se tienen picos
aleatorios, que puede ser un compromiso por parte del analista, para decidir cuales
 59

deben ser tomados en cuenta y cuales no. Estos autores, indican la posibilidad de
emplear otro método alternativo de carácter no instrumental y que sea visual, como TLC
o una titulación para confirmar los LD y LC.

Los detectores UV-Vis debido a que durante su uso pierden sensibilidad por
agotamiento de la lámpara, pueden variar los LD y LC que se determinen con estos,
inclusive se ha señalado que dependiendo de la casa comercial pueden existir
variaciones en el cálculo de estos parámetros hasta por un factor de tres (CDER, 1994).

Según Transfiguración et al. (2001) el LD y LC pueden ser determinados

combinando inyecciones de un blanco de reactivos y un estándar diluido, empleando
las siguientes formulas:

LD = ( Ab + (3 x Sb) x Tst.dil ) / Sst.dil

LC = ( Ab + (10 x Sb) x Tst.dil ) / Sst.dil

Donde:
Ab es el posible promedio de área generada por un blanco
Sb es la desviación estándar de un blanco
Tst.dil es la concentración de un estándar lo más diluido posible.
Sst.dil es la desviación estándar de un estándar lo más diluido posible

Quattrocchi et al. (1992) proponen otro procedimiento para calcular LC y LD, en

base a una curva de regresión lineal, en conjunto con otra curva a concentraciones más
diluidas, posteriormente por extrapolación a concentración cero, se obtienen estimados
conocidos como respuesta del blanco (Ybl.) y desviación estándar del blanco (Sbl.), que
se aplican en las formulas indicadas por estos autores. Este procedimiento si bien es
más laborioso permite una mayor confianza para la obtención de estos parámetros ya
que se basan en estadísticos. Es altamente recomendable que las diluciones se
realicen a partir de una sola solución madre para disminuir los errores y comparar la
DER producidas por las soluciones diluidas con respecto a otras más concentradas,
 60

estos valores deberían ser aproximadamente similares, si el ruido de fondo es

constante (Krull y Swartz, 1998).

En HPLC los LD y LC son usualmente son bajos y se pueden mejorar,

empleando un volumen de inyección mayor o de ser factible aumentando el volumen de
la celda del detector. Krull y Swartz, (1998) y Lesnik et al. (2000) señalan que LD y LC
pueden ser alterados por efectos de la matriz de la muestra y eficiencia de la columna
por lo tanto no deben extrapolarse metodologías que se aplican a una muestra en
particular a otra distinta o entre columnas diferentes.

En la TABLA 9, se muestran algunos valores de LD y LC determinados por

diferentes investigadores en alimentos. La mayoría de los trabajos se fundamentan para
la determinación de estos parámetros en el procedimiento de estimación del ruido de
fondo y considerando un S/R de 3 para LD y S/R de 10 para LC. La gran variabilidad de
resultados es obvia, debido principalmente a las características de absorción UV-Vis de
cada compuesto ya que la absortividad puede variar en varias ordenes de magnitud de
una sustancia a otra, la sensibilidad del detector, la vida útil de la lámpara y tipo de
detector tienen también una gran influencia en estos índices.

5.6.- Robustez.

Aunque se seleccionen las mejores condiciones operacionales para un método

analítico, es factible debido a las múltiples variables involucradas que se puedan
obtener resultados distintos entre laboratorios. Para evaluar estas variabilidades se
procede a determinar la robustez, la cual permite cuantificar el grado de confiabilidad
del método ante cambios de variables comunes. Estas pueden ser diferentes analistas,
columnas, equipos, temperatura del controlador, flujo, pH, fases móviles etc (USP,
2002).
 61

TABLA 9. Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC) de metodologías por

HPLC aplicadas a alimentos.

Referencia Alimento Detector Analito LDppm Determinación

LC ppm
Bicchi et al. (2001) Pulpa de UV Daminozida 0,100 Dilución
manzana 0,150
Breithaupt, (2001) Jugos de Diodos UV Ácido fólico 0,04 Linealidad
frutas 0,06
Esteve et al. (2001) Hongos Fluorescencia Tiamina 0,0013 Refiere a un
Riboflavina 0,0086 método
Grande et al. (2001) Alimento para Diodos UV Sulfametazina NR Refiere a un
animales Trimetoprina 0,3- 0,4 método
Kim-Kang et al. Atún Fluorescencia Emamectina 0,050 Dilución
(2001) 0,800
Nyman y Cerezas, Diodos Vis Antocianidinas 0,32-0,85 S/R
Kumpulainen, fresas y vinos NR
(2001)
Pripis-Nicolau et al. Vinos y Fluorescencia 22 amino LD: 0,002 a 0,125 S/R
(2001) mostos ácidos (AA) LC: 0,007 a 0,416 (*)
Rose-Sallin et al. Cereales Fluorescencia Niacina 0,1 S/R
(2001) instantáneos 1,0
Zeppa et al. (2001) Quesos UV Azúcares, 0,22-119,00 S/R
Índice ácidos NR
refracción diacetilo y
acetoína
Mattila et al. (2000) Cebollas, té, Diodo UV-Vis Flavonoides Diodos 0,08-0,25 S/R
limón, naranja, Electroquímico (17) NR
brócoli, etc (EQ) EQ 0,004-0,040
NR
Woollard et al. Leche y Diodo UV Ácido 3 Dilución
(2000) formulas pantoténico NR
infantiles
(*) Los valores indicados corresponden a todos los amino ácidos excepto lisina y ornitina que registraron
valores más altos de LD y LC de 2,1 y 7,1 ppm (lisina) y 1,9 y 6,3 ppm (ornitina).
Determinación: Dilución: corresponde a diluciones de estándares o muestras., S/R: Método de
Señal/Ruido., Linealidad: Mediante Gráficas y extrapolación., Refiere a un Método: Remite a una
referencia y no explica el procedimiento., NR: No reporta.
 62

Según Quattrocchi et al. (1992) el método debe ser robusto en determinados

rangos de posibles cambios (pH, longitud de onda, porcentaje de fase móvil etc), pero
no necesariamente debe serlo frente a todos, así por ejemplo una variación de pH en un
buffer puede producir cambios drásticos en la separación. En este caso se puede
evaluar el rango de pH, en el cual la fase móvil, no genera diferencias significativas en
el resultado del análisis, con lo cual se obtiene una mayor confianza para la variable pH.

En HPLC las columnas de un mismo tipo pueden variar de lote a lote, pero
especialmente entre diferentes casas comerciales. Se puede tener unas
especificaciones como: largo, diámetro interno, tipo de material de relleno y su tamaño
de partícula, sin embargo es usual encontrar diferencias en la resolución para columnas
equivalentes pero de diferentes marcas. Por lo tanto es recomendable al realizar un
validación, el emplear un mínimo de dos columnas que difieran en especificaciones
(Krull y Swartz, 2000).

Este aspecto fue comprobado por Kele y Guiochon, (1999a; 1999b; 2000 y 2001)
que estudiaron el desempeño de quince columnas "Symmetry" C18; treinta de
"Kromasil" C18; treinta de "Luna" C18 y treinta de "Vydac 218TP" C18. El objetivo era
mediante parámetros tales como tiempos de retención y factores de retención de varios
compuestos, determinar la reproducibilidad y repetibilidad entre diferentes lotes y para
un mismo lote. En el caso de los estudios donde emplearon treinta columnas estás
estaban conformadas por 5 columnas de un mismo lote, con seis lotes distintos. En
general sus resultados indicaron que entre un mismo lote y diferentes lotes pero de una
sola casa comercial, la DER%, era menor del 5%, sin embargo determinaron grandes
diferencias en el grado de selectividad y resolución entre las distintas columnas de
casas comerciales, atribuido por estos investigadores a la tecnología de empaque, tipo
y grado de acidez de los grupos silanol.

En la validación de una metodología para la determinación de emamectina en

atún cultivado, Kim-Kang et al. (2001) chequean la robustez del método, utilizando dos
diferentes cartuchos de extracción: PRS-SPE y LC-SCX Supelco y también dos
 63

columnas: Zorbax Rx-C8 de MacMod y Supelcosil LC-8-DB de Supelco. Otros

parámetros como composición de la fase móvil y flujo también puede ser sometidos a
una valoración de robustez, así por ejemplo Dreassi et al. (2001) emplean como fase
móvil (metanol:acetato de amonio, 0,55 M 55:65) y flujo de 1,0 ml/min., estas variable
demostraron ser robustas dentro de una rango de 2 y 10% respectivamente.

Fabre y Altria, (2001) señalan que en la evaluación de la robustez, se aplican

generalmente diseños factoriales, como los de Plackett y Burman, que permiten
identificar los factores críticos que tiene mayor peso o influencia sobre el método.
Puede que se determine que algunos factores tienen cierta influencia, sin embargo si
esta es aceptable dentro del criterio de la metodología, se puede considerar el método
como lo suficientemente robusto. Por otra parte, si algún factor tiene una influencia
significativa, se puede emplear para precisar mejor este efecto, la metodología de
respuesta de superficie, de manera de predecir la variación de la respuesta dentro del
intervalo que se desee. En HPLC la determinación de la robustez generalmente implica
un gran trabajo instrumental, se deben seleccionar las variables que se desean
considerar, de manera de no generar un diseño experimental demasiado laborioso.

En la revisión bibliográfica no se observo que la robustez fuera realizada en los

procesos de validación, el trabajo más completo es el realizado por Romero et al.
(2002) y por lo tanto se procederá a realizar un análisis y descripción del mismo, ya que
este puede ser considerado como un guía para futuras experiencias. Estos autores
señalan que la robustez de un método analítico puede ser realizada en las siguientes
fases:
1.- Identificación de los factores a evaluar.
2.- Selección del nivel de los factores y número.
3.- Selección del diseño experimental
4.- Realización de los experimentos y medición de la respuesta del analito
5.- Cálculo del efecto de las variables
6.- Análisis e interpretación de los resultados
 64

Para la robustez en HPLC se debe precisar bien que parámetro se va a

considerar para medir el efecto que tienen las variables, ya que dependiendo de cual se
elija y del método empleado para su cálculo, se pueden obtener diferentes
interpretaciones de los resultados. Como parámetros cromatográficos se pueden tomar
en cuenta: altura del pico, área del pico, tiempo de retención y/o resolución.

Cuando se valora la robustez se introducen variaciones experimentales de las

variables operacionales propuestas, con el objetivo de predecir la dependencia del
método en relación a cada una de las variables. En este sentido se toman niveles
superiores (+) o menores (-) en relación a un valor nominal o central, diseñando una
experiencia preferiblemente balanceada, en la cual cada factor debe aparecer el mismo
número de veces en un nivel de -1 y +1. Usualmente el valor nominal o central de cada
factor es el propuesto en la metodología y debería corresponder al obtenido durante la
optimización. Es importante en estos diseños de robustez por HPLC la determinación
del valor central, ya que estos modelos matemáticos están basados en curvas lineales y
por lo tanto se debe tener la certeza de que la robustez se encuentre dentro de un
dominio lineal, la manera de comprobar mejor este comportamiento, es precisamente
con el valor central (Montgomery, 2002).

La interpretación de los resultados puede ser evaluada desde un punto de vista

estadístico mediante un análisis de varianza (ANOVA) y por análisis gráfico, en el cual
si el valor de la variable se encuentra en una meseta o "plateau", el valor de los
coeficientes es cercano a cero y por lo tanto el método es robusto para esta variable,
por otra parte si el valor óptimo se encuentra cercano a un punto con inflexión, el
coeficiente tendrá un valor diferente de cero y el método no es robusto para esta
variable. En la FIGURA 12, se puede observar como la variable respuesta Y es
afectada por ligeras variaciones de X1 y no es robusta con respecto a este factor, en el
caso contrario Y no es afectada por pequeños cambios de X 2, con lo cual es robusta
para esta variable.
 65

Estos autores emplean un diseño experimental de 7 factores, para la

determinación de la robustez de un método para la separación de aminas biógenas
(triptamina, feniletilamina, espermina, espermidina, histamina, cadaverina y putrescina).
Los factores empleados se muestran en la TABLA 10. Emplearon tres fases de
gradiente y se utilizo el nivel de (-1) para el primer gradiente empleado, (0) para el
segundo y (+1) para el tercero, por otra parte el porcentaje de trietilamina y
dimetilformamida, componentes de la fase móvil también fueron evaluados.

FIGURA 12. Relación geométrica entre la robustez y la superficie de respuesta en un

dominio de los factores X1 y X2. El sector P corresponde al empleado para el
procedimiento experimental de robustez para los valores de X1 y X2.
Referencia: Romero et al. (2002).

TABLA 10 . Niveles de los factores empleados en el diseño experimental.

Factor Valor nominal Nivel bajo (-1) Nivel alto (+1) %variación
Gradiente 1 0 2 ----
Temperatura de la columna (° C) 40 38 42 5
Concentración del buffer (mM) 40 36 44 10
pH buffer 5 4,8 5,2 4
Longitud de onda (nm) 446 441 451 1
% trietilamina 0,23 0,21 0,25 8
% dimetilformamida 10 9,5 10,5 5
mM: milimolar, nm: nanómetros.
Referencia: Romero et al. (2002).
 66

El diseño experimental para robustez, se muestra en la TABLA 11, incluye un

análisis por triplicado del valor central y la ejecución en forma aleatoria de las
experiencias. Como respuestas determinaron altura y área del pico para feniletilamina,
espermina y espermidina. Mientras que para tiramina, las respuestas fueron tiempo de
retención y tiempo de retención ajustado, por otra parte para; histamina y cadaverina
fue el factor de resolución entre los picos de ambas aminas. Se puede observar como
estos autores emplean distintas variables dependientes para determinar la robustez.

TABLA 11. Diseño experimental para la determinación de robustez.

Factor
Experiencia Gradiente Temperatura Buffer pH Longitud % %
columna concentración buffer de onda trietilamina dimetilformamida
1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
2 +1 +1 -1 -1 +1 -1 -1
3 +1 -1 +1 +1 -1 -1 -1
4 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1
5 -1 +1 -1 -1 -1 +1 -1
6 -1 +1 +1 +1 -1 -1 +1
7 -1 -1 -1 -1 +1 -1 +1
8 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1
9 0 0 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0
Referencia: Romero et al. (2002).

Los resultados estadísticos se muestran en la FIGURA 13, obtenidos para el

caso particular de la amina feniletilamina. La FIGURA 13a, indica que la concentración
del buffer y dimetilformamida son robustas en el intervalo estudiado, mientras que en la
FIGURA 13b, la temperatura de la columna y la longitud de onda, son factores
significantes, finalmente la FIGURA 13c, que representa la influencia de la temperatura
de la columna y el porcentaje de trietilamina sobre altura del pico, esta variable es
sensitiva solamente a la temperatura de la columna (significativa) mientras que no es
sensible (no significativa) para el porcentaje de trietilamina. Este tipo de evaluación
permite indicar dentro de que intervalos las variables pueden ser trabajadas, como se
 67

muestra en al TABLA 12, sin que tengan un efecto significativo sobre la determinación.
Este trabajo permite ilustrar la importancia que tiene la evaluación de la robustez, como
parte de la validación analítica, mostrando como puede ser un diseño experimental y la
forma de interpretación de los resultados, de manera de determinar cuales variables
pueden ser robustas, y cuales tienen un efecto significativo sobre la respuesta que se
desea evaluar.

FIGURA 13. Gráficas de la estimación de la respuesta lineal para feniletilamina, con

respecto: (a) concentración del buffer y porcentaje de dimetilformamida; (b) temperatura
de la columna y longitud de onda de detección y (c) temperatura de la columna y
porcentaje de trietilamina.
Referencia: Romero et al (2002).

TABLA 12. Intervalos de los niveles de factores en los cuales los efectos significativos
pueden ser eliminados.
Variables respuesta
Factor Feniletilamina Tiramina Tiramina
altura pico tr (min) tr (ajustado)
Temperatura columna °C 40,0  1,2 40,0  0,4 40,0  1,3
Concentración Buffer mM 40,0  2,8
pH buffer 5,00  0,07
Longitud de onda nm 446,0  4,3
% dimetilformamida 10,0  0,2 10,0  0,3
mM: milimolar., nm: nanómetros.
Referencia: Romero et al (2002).
 68

En la revisión bibliografía realizada se pudo constatar que son muy pocos los
investigadores que determinan la robustez de su metodología, es más frecuente el
análisis de los otros parámetros (selectividad, precisión, exactitud, linealidad, rango, LC
y LD). La razones pueden ser que se considere que este ensayo involucra un mayor
número de determinaciones, que en algunos laboratorios por tiempo y costo, son más
difíciles de aplicar. También puede ser por un cierto desconocimiento de cómo aplicar
en sí un procedimiento de robustez, basado en un diseño experimental.

5.7-Fortaleza

La fortaleza del método ("ruggedness" en inglés) es considerada por algunos

investigadores como parte de la precisión, o también de la robustez. En esta revisión se
tomará como un aspecto aparte, ya que el concepto de fortaleza implica cuan sólido o
estable es un método y como es su grado de reproducibilidad obtenida bajo una
variedad de condiciones de diferentes laboratorios, analistas, instrumentos y reactivos
etc (USP, 2002). Esto marca una diferencia con respecto a la robustez, que se refiere a
la capacidad del método para permanecer inalterable por el efecto de cambios
deliberados, (generalmente pequeños, pero significativos), por ejemplo de: pH,
proporciones de la fase móvil, fuerza iónica, temperatura etc.

La fortaleza determina que problemas pueden surgir en un método cuando se

cambian reactivos, columnas, instrumentos o laboratorios, por lo tanto el proceso de
validación se puede considerar en dos niveles, en primer lugar se procede a un estudio
dentro de un laboratorio, en caso de que el método cubra las expectativas que se
esperan, se procede en segundo lugar a un trabajo de validación en otros laboratorios,
preferiblemente un mínimo de tres, de manera que se demuestre que cualquier analista
o laboratorio, tiene la capacidad de reproducir resultados confiables. En este paso el
objetivo principal consiste en determinar si se obtienen los mismos resultados dentro de
un nivel de confianza, empleando operarios distintos e inclusive insumos, equipos e
instrumentales diferentes (Lesnik et al. 2000).
 69

La AOAC, (1997ab) señala los procedimientos exigidos por está asociación para
los estudios colaborativos, en los cuales se desea determinar la viabilidad de aplicación
en diferentes condiciones, un resumen del protocolo es el siguiente:

1.- Se elige un método y se realizan estudios preliminares para demostrar la

aplicabilidad a la matriz y a las concentraciones de interés.
2.- Se determinan los niveles críticos y su aplicabilidad de ser posible con otros
insumos (columnas, equipos HPLC de otra marca etc).
3.- El método es escrito en forma detallada y chequeado nuevamente por un
analista completamente nuevo.
4.- En caso de estándares, reactivos, y equipos poco comunes, se evalúa como
suministrarlos a los laboratorios.
5.- Se elabora una muestra homogénea, de manera de disminuir el error y está
se refiere junto con la metodología a evaluar, generalmente a un mínimo de 8
laboratorios, a los cuales se les suministra un mínimo de 5 muestras para su estudio,
realizando preferiblemente una sola determinación por muestra.

Horwitz, (1982) citado por Quattrocchi et al. (1992) desarrollo una ecuación
empírica que relaciona la DERinter, de un método con respecto la concentración del
analito en un estudio entre laboratorios. La ecuación representa la DER% que se puede
llegar a obtener, entre laboratorios distintos, en relación al orden de magnitud que se
desea cuantificar. La relación fue obtenida a partir de los resultados de 150 ensayos
entre laboratorios de la AOAC, con al menos 5 metodologías diferentes (cromatografía,
absorción atómica, espectrofotometría, bioensayos) y es la siguiente:

DERinter = 2 (1-0,5 log C)

Donde C es la concentración del analito expresada en potencias de 10. En el

caso de 1 ppm (10-6), la DERinter esperada será de:

DERinter = 24 = 16%
 70

Si la concentración es de 1 ppb (10-9), la DERinter será de:

DERinter = 25,5 = 45%

Esta relación permite por lo tanto, estimar si la DERinter es apropiada (Kontou et

al. 2001). Usualmente DER% que se obtiene dentro de un mismo laboratorio representa
de un tercio a dos tercios del valor de DERinter obtenido entre laboratorios. Los valores
de DERinter y DER% tienden a disminuir a medida que los analistas tienen mayor
experiencia y al emplear equipos con mayor estabilidad y detección (Pomeranz y
Meloan, 1994b).

En estudios entre laboratorios, no es raro la entrega de resultados por parte de

laboratorios que se encuentran claramente fuera de la tendencia, esto es conocido
como "resultados aberrantes" y la filosofía señalada en la normativa ISO 5725:1994, es
que pueden ser removidos estos datos mediante la prueba estadística de Cochran,
aplicada para eliminar resultados con extremas variaciones para un mismo laboratorio y
la prueba de Grubbs, que remueve laboratorios con promedios extremos (AOAC,
1997a; Lipp et al. 2000).

En un estudio entre laboratorios realizado por Woollard et al. (2000) en leche y

formulas infantiles, para la cuantificación de ácido pantoténico, emplean para validar el
método, seis tipos de columnas cromatográficas :

1.- Resolve C18 (5µ, 100 x mm) de Waters

2.- Nomura Develosil ODS-MG-5 (5µ, 250 x 4,6 mm) de Phenomenex.
3.- YMC AQ312 (5µ, 150 x 4,6 mm) de YMC Inc.
4.- Platinum EPS (3µ, 53 x 7 mm) de Alltech.
5.- Luna Phenyl-C6 (5µ, 250 x 4,6 mm) de Phenomenex
6.- Luna C8 (5µ, 250 x 4,6 mm) de Phenomenex.

Las experiencias fueron realizadas en tres laboratorios distintos, con tres equipos
distintos: uno modular compuesto por bombas 510 de "Waters", inyector 7125 de
 71

"Rheodyne", controlador 680 de "Waters" y detector de diodos SPD-M10A de

"Shimadzu", por otra parte los otros dos equipos de HPLC, eran integrados modelos
HP1050 y HP1100 de "Hewlett Packard". Sus resultados mostraron que las seis
columnas tenían diferentes capacidad de resolución. En la FIGURA 14, se comparan
los cromatogramas obtenidos con las columnas "Devolosil" y C18, se observan
diferencias en los tiempos de retención y forma del pico (B5) para las diferentes
longitudes de onda estudias (200, 205 y 240 nm). Sin embargo los autores señalan que
las columnas podían emplearse indistintamente para la determinación requerida. Para
análisis frecuentes y debido a una mayor selectividad recomiendan especialmente la
columna Luna C8.

La revisión bibliográfica realizada, permite señalar que el parámetro fortaleza es

poco empleado como parte de la validación en HPLC en alimentos. Es factible que el
principal inconveniente sea el acuerdo entre laboratorios para realizar el mismo ensayo,
ya que deben coincidir intereses comunes, así como disponibilidad de equipos y
recursos humanos. En el caso del trabajo de Woollard et al. (2000) señalado
anteriormente esta investigación fue realizada en Nueva Zelanda, donde existe una
gran industria láctea con interés en métodos para cuantificar vitaminas en estos
alimentos. Los autores pertenecen a industrias como "Anchor Products" y "Wyeth".

La aplicación de fortaleza puede ser llevada a cabo, principalmente por

instituciones como la AOAC, FDA y universidades que disponen de una red de
laboratorios que pueden prestar servicios de colaboración. Los métodos por HPLC
incluidos en la AOAC (1997ab) fueron validados en su tiempo o a lo largo de su
respectivo uso o también a través de un estudio entre laboratorios, de acuerdo a las
directrices señaladas anteriormente. Se podría indicar que este aspecto de validación
es realizado por estas instituciones u organizaciones.
 72

FIGURA 14. Cromatogramas UV a múltiples longitudes de onda; superior 200 nm;

medio 205 nm y bajo 240 nm. Para extracto de muestra de formulas infantiles,
obtenidos en dos columnas: (a) Devolosil y (b) C18.
Referencia: Woollard et al. (2000).

5.8.-Estabilidad de soluciones.

Es importante evaluar la estabilidad de las soluciones de reactivos y estándares.

Se deberían chequear como mínimo su estabilidad durante el tiempo de análisis e
inclusive tomar en cuenta cualquier posibilidad de retraso eventual que pueda ocurrir en
una determinación. Los resultados de este análisis deben ser indicados en el protocolo
que se establezca de validación.

Esta evaluación es importante ya que se establece el tiempo en que puede

emplear estas soluciones, sin necesidad de una preparación nueva y obtener por lo
tanto resultados confiables. Se facilita el empleo de un estándar ya elaborado, por un
período de semanas o meses, así como también le da seguridad al analista para volver
a comprobar un extracto de una muestra, cuando ha surgido una duda sobre un
resultado previamente obtenido.
 73

Krull y Swartz, (2000) señalan que la validación debe demostrar que las
soluciones son estables en las condiciones de trabajo del laboratorio. No pueden
presentar problemas como precipitaciones, turbidez, fotosensibilidad, degradación
térmica etc. Es altamente recomendable que tanto las soluciones de los estándares
como los de las muestras se preparen en los mismos solventes, de manera de
aumentar la exactitud y precisión de los resultados, para evitar que puedan originarse
variaciones en los fenómenos de afinidad a los sitios activos de la columna
cromatográfica. En sistemas automatizados deben estudiarse la estabilidad de todas las
soluciones que se emplean, estos equipos tienen capacidad para trabajar por períodos
extensos de tiempo de 24 horas o más, y debe por lo tanto determinarse si los extractos
de muestras, reactivos o derivados son estables entre cada uno de los tiempos que
tardan los procesos del equipo (CDER, 1994).

El FDA, (2000) en su guía para inspecciones de laboratorios farmacéuticos,

recomienda el chequeo del uso de soluciones de estándares, tomando en cuenta
aspectos tales como estabilidad y almacenamiento (puede ser refrigeración), así como
también su identificación apropiada y un historial o registro del uso del reactivo.

La estabilidad de las fases móviles empleadas en HPLC deben ser tomadas en

cuenta, especialmente en el caso de buffers. Se deben etiquetar con su composición,
fecha de elaboración, de ser posible su fecha de caducidad y nombre del analista que la
elaboró (Orr et al. 2003). Este aspecto constituye parte del proceso de validación y
aseguramiento de la calidad de un laboratorio.

Los estudios de estabilidad del analito pueden abarcar desde la recolección de la

muestra, manipulación, almacenamiento, e inclusive conservación en condiciones de
refrigeración o congelación, con procesos de congelación y descongelación (Swartz y
Krull, 2003). El estudio puede llegar a ser más completo cuando las soluciones
preparadas son almacenadas, generalmente a bajas temperaturas y son evaluadas
periódicamente durante un intervalo de tiempo, hasta que se determina un cambio
significativo en la concentración del componente de interés. A través de un análisis
 74

estadístico puede determinarse se existen las diferencias significativas, con lo cual se

puede anexar al protocolo de validación, durante cuanto tiempo y en que condiciones
pueden realizarse con confianza las respectivas determinaciones.

Algunos autores han determinado la estabilidad de extractos de muestras y

estándares durante un período de almacenamiento a temperaturas de refrigeración y
congelación. En la TABLA 13 se muestran algunos de estos estudios, no es frecuente
encontrar en la bibliografía este tipo de análisis y las condiciones experimentales varían
ampliamente entre los diferentes trabajos, lo cual puede ser atribuido principalmente a
distintos intereses e inclusive disponibilidad de equipos de bajas temperaturas para
realizar el ensayo de almacenamiento.

TABLA 13. Estudios y condiciones de almacenamiento de extractos y/o estándares.

Referencia Alimento Analito Observaciones

Kim-Kang et al. (2001) Atún cultivado Emamectina Extractos de muestras a -10° x 28
meses
Valls et al. (2001) Sardinas ATP y sus Estándares y extractos de
productos de muestras a -40° C x 20 semanas
degradación
Sotelo y Serrano, (2000) Papas Glicoalcaloides Extractos de muestras a 14° C x 4
semanas
Valls et al. (1999) Conservas de Aminas biógenas Estándares y extractos de
pescado muestras a -30° C por 20
semanas
Veciana-Nogues et al. Atún y ATP y sus Estándares a 4° C x 5 semanas
(1997) conservas productos de Extractos de muestras a -18° C x
degradación 26 semanas
 75

6.- Aseguramiento del sistema

Un método puede ser validado por un laboratorio, sin embargo como resultado
de un mal diseño del proceso de validación, cuando es transferido a otro laboratorio o
un organismo que certifiquen su aplicabilidad pueden surgir objeciones. Krull y Swartz,
(2000) señalan las principales causas de errores encontrados por el FDA (Food Drug
Administration) de los Estados Unidos, en la validación de métodos que son enviados a
este organismo para su certificación:

1.- No se indica la capacidad del sistema de HPLC en referencia a factor de cola

o asimetría, platos teóricos, eficiencia de la columna etc.
2.- Se observan picos de impurezas que no son identificados.
3.- No se específica el proceso de dilución de las muestras.
4.- Las concentraciones de los buffers en la preparación de estándares y
muestras son cambiadas y no se aclara la razón.
5.- Inadecuada preparación previa del estándar (por ejemplo mal secado).
6.- Separaciones incompleta del pico de interés de otros picos.
7.- Límites de detección y cuantificación mal determinados
8.- Fallas en la metodología de extracción que originan presencia de turbidez,
separación de fases en el extracto final.
9.- Fallas del proceso de limpieza de la muestra.
10.- Empleo de pocas muestras para la determinación de desviación estándar
relativa.
11.- Inestabilidad de las muestras en función del tiempo, especialmente en
equipos automáticos.
12.- Baja recuperación del analito
13.- Falta de explicación en la preparación de las muestras, estándares, etc.

Cada vez que se va a emplear un equipo para una determinación, se debe tener
certeza de que se encuentre en óptimas condiciones. Para este fin se debe implementar
un programa de verificación del desempeño del equipo, que puede consistir en la
 76

inyección de una sustancia, para evaluar su respuesta a parámetros como: área del
pico, tiempo de retención, platos teóricos de la columna, simetría del pico etc. Estos
resultados son determinados periódicamente y registrados en gráficas de control, en las
cuales se establecen límites, cuando estos son excedidos se toman las respectivas
acciones correctivas, como cambio de columna, lámpara etc. Todo estos procesos
deben quedar registrados y almacenados (FDA, 1987; Krull y Swartz, 1999).

Para el chequeo del software de un equipo integrador en HPLC, Felinger y

Guichom, (2001) proponen el uso de un programa que simula diferentes
cromatogramas, empleando señales electrónicas generadas desde un computador
conectado al integrador, con el objeto de determinar parámetros como precisión,
exactitud, forma de integración de los picos, tiempos de retención etc. De esta manera
se puede validar el desempeño del software, antes diferentes situaciones y condiciones.

Krull y Swartz, (1999) proponen como valores aceptables para el aseguramiento

del sistema, los siguientes parámetros:

1.- Factor de retención (k), mayor de 2 en relación a otros picos o volumen

muerto.
2.- Precisión como DER% menor de 1-2%, de un estándar por quintuplicado, en
relación al área del pico y tiempo de retención.
3.- Resolución (Rs), mayor de 2, entre el pico de interés y cualquier otro pico
cercano.
4.- Factor de cola o asimetría, menor o igual a 2.
5.- Platos teóricos (N), mínimo 2000.
Un programa de mantenimiento preventivo para los componentes de un equipo
de HPLC es indispensable tanto para proceder a la validación de un método, así como
también para su mantenimiento posterior. Según Huber, (2001) una de las causas
principales de error en los laboratorios, consiste en que las partes dañadas de un
equipo son remplazadas al quedar el sistema inoperativo, no procediendo al cambio de
la pieza o corrección del problema con una anterioridad razonable. Esto ocurre cuando
 77

el número de análisis se incrementa y el equipo es utilizado con mayor frecuencia de lo

esperado, en algunos laboratorios se realizan sustitución de partes en base a un
calendario, sin embargo en determinados períodos pueden incrementarse la cantidad
de mediciones, lo cual resta le validez al programa de mantenimiento.

Por otra parte es usual que los equipos al ser prendidos, realicen
automáticamente rutinas de diagnóstico interno que comprueban su calibración interna
con respecto a una longitud de onda (detector) o flujo (bomba) (FDA, 1987). Los
equipos de HPLC usualmente poseen medidores del tiempo de uso, así por ejemplo, el
detector puede tener acoplado un sistema que señala el tiempo de empleo de la
lámpara. Por otra parte algunos equipos de HPLC llevan un registro de diferentes
parámetros tales como: cantidad de solventes bombeados o número de inyecciones
realizadas. De esta manera cuando se excede ciertos límites se alerta al analista para
que proceda al mantenimiento del equipo, evitando que la eficiencia del instrumento
llegue a niveles inaceptables y ocasione resultados erróneos.

Las partes más sensibles en un HPLC constituyen principalmente los sellos de

las bombas, la vida útil de las lámpara y la columna. El uso de gráficas de control de
calidad han sido sugeridas para chequear estos parámetros. Las columnas cambian su
eficiencia durante su uso, ocasionando cambios en el número de platos teóricos,
selectividad o simetría de los picos, estos parámetros tienen un impacto en la capacidad
de resolución entre picos o en la producción de cola, afectando por lo tanto los
resultados. Equipos automatizados pueden medir estos índices y chequearlos mediante
gráficas de control, en las cuales al aproximarse a ciertos límites predeterminados,
permite tomar acciones correctivas.

Es recomendable implementar un protocolo de limpieza de las columnas,

después de una jornada de trabajo o cuando se justifique. Majors, (2003) señala que
sales, lípidos, compuestos grasos, proteínas de carácter hidrofóbicas son substancias
que se acomplejan sobre las fases estacionarias, disminuyendo la capacidad de
resolución de las columnas. Estos compuestos se acumulan en la cabeza de la columna
 78

y pueden llegar a constituir un nueva fase estacionaria, que altera las características de
retención.

Los detectores UV y Vis son ampliamente empleados en HPLC, al respecto se

puede señalar que al realizar una cuantificación de un compuesto se fija una longitud de
onda, sin embargo estos equipos trabajan con un ancho de banda, que consiste en un
intervalo de longitud de ondas que emite la fuente, cuando se ajusta a una longitud de
onda particular. Esto significa que al colocar un longitud de onda en un equipo
dependiendo de su calidad, realmente puede emitir un rango, con lo cual se pueden
afectar algunos parámetros de la cuantificación.

Vial y Jardy, (1999) evaluaron el efecto del ancho de banda de detectores UV

empleados en HPLC, sobre el rango de linealidad. Los investigadores señalan que cada
casa comercial emplea una metodología distinta para realizar la medición de este
parámetro en sus equipos, por lo tanto procedieron a la cuantificación
espectrofotométrica del ancho de banda de los detectores de "Waters 2487" y "Varian
2050", determinando valores de 6,3 y 13 nm respectivamente a 235 nm. Emplearon el
antibiótico espiramicina, para la evaluación de su pico y su respuesta a cambios en
intervalos de longitud de onda equivalentes a los anchos de banda de los detectores.

Obtuvieron una disminución muy drástica de la linealidad con una variación de 13

nm (equivalente al ancho de banda del detector "Varian") lo cual puede modificar los
resultados por un factor de dos. Los autores señalan que para tener una linealidad
robusta, se debe tomar en cuenta: características del detector, longitud de onda
empleada y propiedades espectrofotométricas del compuesto. El efecto del ancho de
banda puede llegar a ser más crítico en equipos con mayor uso, lo cual señala la
necesidad de verificación periódica de los detectores.
 79

7.- Resumen de la aplicación de los procedimientos de validación en

metodologías por HPLC en alimentos.

De la revisión bibliográfica realizada en los últimos años, se puede observar que

los investigadores que proponen un método por HPLC realizan validación, sin embargo
en algunos casos no es completa. Un muestra de aplicaciones de validación en
metodologías por HPLC en alimentos en estos últimos años, se indica en la TABLA 14.
En casi todos los trabajos para validación se toman en cuenta los parámetros de;
selectividad, linealidad, rango, precisión y exactitud, así como también LD y LC, sin
embargo en algunos no determinan LC o linealidad. La robustez y especialmente la
fortaleza son muy poco consideradas para validar un método.

En general se puede afirmar que si bien las nuevas metodologías son validadas
por los investigadores, estas en ocasiones no son completas, adicionalmente se pueden
observar distintos criterios en los diseños experimentales para validación,
especialmente de precisión y LC, y LD.

Aspectos como: estudio de la estabilidad de soluciones, procesos de

.comparación de resultados con otras metodologías, determinación de la incertidumbre
en los resultados, son muy escasamente tomados en cuenta para validación de HPLC
en alimentos.

Por otra parte numerosos investigadores toman un procedimiento reportado en

la revistas y es aplicado usualmente con otros equipos, columnas o detectores, sin
realizarle un mínimo de validación que les otorgue un margen de seguridad a los
resultados obtenidos. Al emplear un método ya reportado y usarlo en un laboratorio se
debe considerar la diferencia entre un ajuste y un cambio del método, en este último
caso es recomendable volver a validar.
 80

TABLA 14. Aplicación de la validación en metodologías por HPLC en alimentos

Referencia Alimento Selectividad Linealidad Precisión Exactitud LD LC

Bicchi et al. (2001) Pulpa de + + + + +
manzana
Breithaupt, (2001) Jugos de frutas + + - + +
Carlsson et al. Cereales + + + - -
(2001)
Chandra et al. Jugos + + + + -
(2001) deshidratados
Dreassi et al. (2001) Cárnicos + + + + +
Elmadfa, (2000) Brócoli + - + + -
Esteve et al. (2001) Hongos + + + + +
Grande et al. (2001) Alimento para + + - - LD
animales
Kim-Kang et al. Atún + + + + +
(2001)
Nyman y Cerezas, + + + + LD
Kumpulainen, (2001) fresas y vinos
Pripis-Nicolau et al. Vinos y mostos + + + + +
(2001)
Rose-Sallin et al. Cereales + + + + +
(2001) instantáneos
Zeppa et al. (2001) Quesos + + + + LD
Izquierdo et al. Bebidas + - + + -
(2000) alcohólicas
Mattila et al. (2000) Cebollas, té, + + + + LD
limón, naranja,
brócoli, etc
Sotelo y Serrano, Papas + + + + +
(2000)
Wang et a.l (2000) Té verde + + + - -
Woollard et al. Leche y + + + + LD
(2000) formulas
infantiles
 81

Conclusiones y recomendaciones

.- Al desarrollar un método por HPLC, este debe ser validado para así tener
confianza sobre los datos que se pueden obtener a partir del mismo, es importante que
pueda ser transferida y aplicada en otros laboratorios de análisis, con la menor cantidad
posible de ajustes.

.- El concepto de validación debe considerarse como un proceso integral en el

cual se deberían incluir aspectos previos de validación tales como: equipo, software,
instalación y aseguramiento del sistema antes de su uso. Posteriormente después de
validar un método deben mantenerse programas de aseguramiento del sistema, de
manera de tener la seguridad sobre su cabal desempeño.

.- Las metodologías en las cuales se emplea HPLC propuestas por ejemplo en la

AOAC, para el análisis de alimentos ya han sido validadas, de acuerdo a los
lineamientos, lugar y tiempo en que fueron inicialmente publicadas o a lo largo de su
respectivo uso. Sin embargo al aplicarse por primera vez en un laboratorio, es
recomendable realizar al menos una mínima revalidación.

.- El proceso de validación debería cubrir aspectos mínimos tales como: 1.-

Selectividad, 2.- Linealidad y rango., 3.- Precisión., 4.- Exactitud., 5.- Límites de
detección y cuantificación y 6.- Robustez., Adicionalmente se podrían incluir también:
fortaleza del método y estudio de estabilidad de soluciones.

.- De la revisión realizada principalmente en los últimos años, se ha podido

observar que los investigadores que proponen un método por HPLC en alimentos,
realizan un proceso de validación, sin embargo en algunos casos no es del todo
completo, o no es efectuado con un adecuado diseño experimental. Los parámetros
como robustez y fortaleza son poco evaluados. Por otra parte numerosos
investigadores toman un procedimiento reportado y es aplicado usualmente con otros
 82

equipos, columnas o detectores, sin realizarle un mínimo de validación que les otorgue
un margen de seguridad a los resultados obtenidos.

.- Se puede observar un mayor normativa o lineamientos de este tema en

aplicaciones farmacéuticas por HPLC, mientras que en el campo de alimentos es
menor, sin embargo cada día toma más importancia este aspecto y es considerado al
momento de proponer un método por HPLC.

.- Se recomienda por lo tanto al desarrollar una metodología por HPLC, proceder

a su validación respectiva y de ser posible incluir ensayos entre laboratorios, este
aspecto permitiría determinar si la transferencia del ensayo es posible y su idoneidad.
 83

Referencias bibliográficas

Akiyama, H., Goda, Y., Tanaka, T., and Toyoda, M. 2001. Determination of aflatoxins B1,
B2, G1 and G2 in spices using a multifunctional column clean-up. J. Chromatogr A. 932: 153-
157.

AOAC., 1997a. Collaborative study procedures of the Association of Official Analytical

Chemist. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.
Maryland. EUA. Edt. Cunniff, P . Edición 16. 3 Revisión. Vol. I. pp. xxii-xxvi.

AOAC., 1997b. Appendix D: Guidelines for collaborative study procedures to validate

characteristics of a method of analysis. Official Methods of Analysis of the Association of Official
Analytical Chemists. Maryland. EUA. Edt. Cunniff, P. Edición 16. 3 Revisión. Vol. I. pp. D1-D13.

Barwick, V., Ellison, S., Lucking, C., and Burn, M. 2001. Experimental studies of
uncertainties associated with chromatographic techniques. J. Chromatogr A. 918: 267-276.

Baunsgaard, D., Andersson, C., Arndal, A., and Munck, L. 2000. Multi-way chemometrics
for mathematical separation of fluorescent colorants and colour precursors from
spectrofluorimetry of beet sugar and beet sugar thick juice validated by HPLC analysis. Food
Chemistry. 70 : 113-121.

Bicchi, C., Cordero, C., Rubiolo, P., and Occelli, A. 2001. Determination of daminozide
residues in apple pulp using HPLC-DAD-UV. J. Agric. Food Chem. 49: 3548-3552.

Breithaupt, D. 2001. Determination of folic acid by ion-pair RP-HPLC in vitamin-fortified

fruit juices after solid-phase extraction. Food Chemistry. 74: 521-525.

Buchmeiser, M. 2001. New synthetic ways for the preparation of high-performance liquid
chromatography supports. J. Chromatogr A. 918: 233-266.

Buglass, A., and Lee, S. 2003. Applications of chiral ligand-exchange chromatography for
the analysis of D and L- lactic acid content of wine and other foodstuffs. LCGC North America.
21(6): 554-562.
 84

Cabras, P., Caboni, P., and Cabras, M. 2001. Analysis by HPLC of ryanodine and
dehydroryanodine residues on fruits and in ryania powdery wood. J. Agric. Food Chem. 49:
3161-3163.

Carlsson, N., Bergman, E., Skoglund, E., Hasselblad, K., and Sandberg, A. 2001. Rapid
anlysis of inositol phosphates. J. Agric. Food Chem. 49: 1695-1701.

CDER. 1994. Validation of chromatographic methods. Reviewer Guidance. Committee of

the Chemistry Manufacturing Controls Coordinating Committee (CMCCC). Center for Drug
Evaluation and Research (CDER). pp. 33.

Chandra, A., Rana, J., and Yingqin, L. 2001. Separation, identification, quantification, and
method validation of anthocyanins in botanical supplement raw materials by HPLC and HPLC-
MS. J. Agric. Food Chem. 49 (8): 3515-3521.

Dilkin, P., Mallmann, C., Almeida, C., and Correa, B. 2001. Robotic automated clean-up
for detection of fumonisins B1 and B2 in corn and corn-based feed by high-performance liquid
chromatography. J. Chromatogr A. 925: 151-157.

Dolan, J. 2001. When ideal isn't practical. LCGC North America. 19(9): 956-960.

Dreassi, E., Corbini, G., La Rosa, C., Politi, N., and Piero, C. 2001. Determination of
levamisole in animal tissues using liquid chromatography with ultraviolet detection. J. Agric.
Food Chem. 49: 5702-5705.

Elmadfa, E. 2000. Rapid and simple HPLC analysis of vitamin K in food, tissues and
blood. Food Chemistry. 68: 219-221.

Esteve, M., Farré, R., Frógola, A., and García-Cantabella, J. 2001. Simultaneous
determination of thiamin and riboflavin in mushrooms by liquid chromatography. J. Agric. Food
Chem. 49: 1450-1454.
 85

Galensa, R. 1990. Components in Foods with a High Carbohydrate Content. In High

Performance Liquid Chromatography in Food Control and Research. Technomic Publishing. Inc.
Edt. Matissek, R., and Wittkowski, R. pp. 383.

GHTF. 1999. Process validation guidance. The Global Harmonization Task Force. pp.
34.

Grande, B., Falcón, M., Comesaña, M., and Gándara, J. 2001. Determination of
sulfamethazine and trimetroprim in liquid feed premixes by HPLC and diode array detection, with
an analysis of uncertainty of the analytical results. J. Agric. Food Chem. 49: 3145-3150.

Green, C., and Morgan, J. 2001. A step-by-step approach to implementing Good

Laboratory Practice. Journal of GXP Compliance. 5 (3): 51-66.

Fabre, H., and Altria, K. 2001. Key points for validating CE methods, particularly in
pharmaceutical analysis. LCGC North America. 19(5): 498-505.

FDA. 1987. Guideline on general principles of process validation. Food Drug

Administration. Center for Drugs and biologics & Center for Devices and Radiological Health.
Disponible en http://www.fda.gov/ List of FDA Guidance Documents. pp. 14.

FDA. 2000. Guide to inspections of pharmaceutical quality control laboratories. Food

Drug Administration. Department of Health & Human Services. Journal of GXP Compliance. 4
(4): 29-38.

FDA. 2001. Analytical procedures and method validation: highlights of the FDA´s Draft
Guidance. Food Drug Administration. LCGC North America. 19(1): 74-79.

FDA. 2002. General principles of software validation; final guidance for industry and FDA
staff. Food Drug Administration. Disponible en http://www.fda.gov/ List of FDA Guidance
Documents. pp. 47.
 86

FDA. 2003. Guidance for industry. Part 11, Electronic records: electronic signatures-
scope and application. Disponible en http://www.fda.gov/ List of FDA Guidance Documents. pp.
12.

Feinberg, M. 1998. Data processing and software requirement for analytical method
validation. J.A.O.A.C. International. 81(5): 1065-1075.

Felinger, A., and Guiochom, G. 2001. Validation of a chromatography data analysis

software. J. Chromatogr A. 913: 221-231.

Fernández, M., Picó, Y., Girotti, S., and Mañes, J. 2001. Analysis of organophosphorus
pesticides in honeybee by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-
mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 49: 3540-3557.

Furman, W., Dorsey, J., Snyder, L. 1998. System suitability test in regulatory liquid and
gas chromatographic methods: adjustments versus modifications. Pharmaceutical Technology.
58-64.

Henson, E. 2000. New applications of GMPs to analytical laboratories: an auditor´s

perspective. Journal of GXP Compliance. 4 (4): 16-28.

Huber, L. 2001. Preventing Out-of-Specification (OOS) situations caused by laboratory

errors. Journal of GXP Compliance. 6 (1): 24-31.

Huber, L., and Winter, W. 2000. The impact of Part 11 on Chromatoghaphic data
systems. Journal of GXP Compliance. 5 (1): 30-39.

IUPAC, 1997. Compedium of Chemical Terminology. 2Ed. Disponible en línea en:

http://www.iupac.org/goldbook/L03540.pdf y D01629.pdf.

Izquierdo, M., Granados, J., Mir, M., and Martínez, M. 2000. Comparison of methods for
determining coumarins in distilled beverages. Food Chemistry. 70: 251-258.
 87

Jaime, E., Hummert, C., Hess, P., and Luckas, B. 2001. Determination of paralytic
shellfish poisoning by high-performance ion-exchange chromatography. J. Chromatogr A. 929:
43-49.

Kele, M., and Guiochon, G. 1999a. Repeatability and reproducibility of retention data and
band profiles on reversed-phase liquid chromatography columns. II. Results obtained with
Symmetry C18 columns. J. Chromatogr A. 830: 55-79.

Kele, M., and Guiochon, G. 1999b. Repeatability and reproducibility of retention data and
band profiles on reversed-phase liquid chromatography columns. III. Results obtained with
Kromasil C18 columns. J. Chromatogr A. 855: 423-453.

Kele, M., and Guiochon, G. 2000. Repeatability and reproducibility of retention data and
band profiles on reversed-phase liquid chromatography columns. IV. Results obtained with Luna
C18 columns. J. Chromatogr A. 869: 181-209.

Kele, M., and Guiochon, G. 2001. Repeatability and reproducibility of retention data and
band profiles on reversed-phase liquid chromatography columns. V. Results obtained with
Vydac 218TP C18 columns. J. Chromatogr A. 913: 89-112.

Kim-Kang, H., Crouch, L., Robinson, R., and Wu, J. 2001. Determination of emamectin in
the tissues of atlantic salmon (Salmo salar L.) using HPLC with fluorescence detection. J. Agric.
Food Chem. 49: 5294-5302.

Kontou, S., Tsipi, D., Oreopoulou, V., Tzia, C. 2001. Determination of ETU in tomatoes
and tomato products by HPLC-PDA. Evaluation of cleanup procedures. J. Agric. Food Chem.
49: 1090-1097.

Krull, I., and Swartz, M. 1998. Determining limits of detection and quantitation. LCGC
North America. 16 (8): 716-718.

Krull, I., and Swartz, M. 1999. System-suitability samples-what they are, why we use
them, and what they should do. LCGC North America. 17 (3): 244.
 88

Krull, I., and Swartz, M. 2000. Regulatory review of method validation protocols. LCGC
North America. 18 (6): 620-625.

Krull, I., and Swartz, M. 2001. Determining specificity in a regulated environment. LCGC
North America. 19 (6): 604-614.

Lesnik, B., Krull, I., and Swartz, M. 2000. Method validation issues for the resource
conservation and recovery act program. LCGC North America. 18 (10): 1048-1056.

Li, J. 2001. Prediction of internal standards in reversed-phase liquid chromatography. 1.

Initial study on predicting internal standards for use with neutral samples based on linear energy
relationships. J. Chromatogr A. 927: 19-30.

Lindsay, S., and Kealey, D. 1987. High Performance Liquid Chromatography. Analytical
Chemistry by Open Learning. John Wiley & Sons. London. pp. 247.

Lipp, M., Anklam, E., and Stave, J. 2000. Validation of an immunoassay for detection and
quantitation of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference
materials: Interlaboratory study. J.A.O.A.C. International. 83 (4): 919-927.

Majors., R. 2003. The cleaning and regeneration of reversed-phase HPLC columns.

LCGC North America. 21 (1): 19-24.

Matissek, R. 1990. Modern High Performance Liquid Chromatography- Fundamentals

and Developments. In "High Performance Liquid Chromatography in Food Control and
Research". Technomic Publishing. Inc. Edt. Matissek, R., and Wittkowski, R. pp. 383.

Matsuda, R., Hayashi, Y., Isibashi, M., and Takeda, Y. 1994. Optimization of a liquid
chromatographic method based on information theory: Application of the method to dissolution
testing. JAOAC. Inter. 77(2): 338-343.

Mattila, P., Astola, J., and Kumpulainen, J. 2000. Determination of flavonoids in plant
material by HPLC with diode-array and electro-array detections. J. Agric. Food Chem. 48: 5834-
5841.
 89

McCluskey, S., and Devery, R. 1993. Validation of chromatographic analysis of

cholesterol oxides in dried foods. Trends in Food Science & Technology. 4 (6): 175- 178.

Montgomery, D. 2002. Diseño y análisis de experimentos. 2 Ed. Editorial Limusa,

México. pp. 681.

Naik, J. 2001. Improved high-performance liquid chromatography method to determine

theobromine and caffeine in cocoa and cocoa products. J. Agric. Food Chem. 49: 3579- 3583.

Nikitas, P., Pappa-Louisi, A., and Papageorgiou, A. 2001. On the equations

chromatographic peaks and the problem of the deconvolution of overlapped peaks. J.
Chromatogr A. 912: 13-29.

Nissen, H., and Kreysei, H. 1990. Separation Systems and Instrumentation. In "High
Performance Liquid Chromatography in Food Control and Research". Technomic Publishing.
Inc. Edt. Matissek, R., and Wittkowski, R. pp. 383.

Nyman, M., and Kumpulainen, J. 2001. Determination of anthocyanidins in berries and

red wine by high performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 49: 4183-4197.

Orr, J., Krull, I., and Swartz, M. 2003. Validation of impurity methods-Part I. LCGC North
America. 21(7): 626-633.

Ozogul, F., Taylor, A., Quantick, P., and Ozogul, Y. 2000. A rapid HPLC-determination of
ATP-related compounds and its application to herring stored under modified atmosphere. Inter.
J. Food Sci, and Tech. 35: 549-554.

Pap, T., and Pápai, Zs. 2001. Application of a new mathematical function for describing
chromatographic peaks. J. Chromatogr A. 930: 53-60.

Penner, M. 1998. Ultraviolet, Visible, and Fluorescence Spectroscopy. Chapter 26. In

"Food Analysis" 2 Ed. Aspen Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen. pp. 397- 412.
 90

Pomeranz, Y., and Meloan, C. 1994a. High Performance Liquid Chromatography and Ion
Chromatography. In "Food Analysis. Theory and Practice". 3 Ed. Chapman & Hall, International
Thomson Publishing. pp. 325-351.

Pomeranz, Y., and Meloan, C. 1994b. Reporting results and realiability of analyses. In
"Food Analysis. Theory and Practice". 3 Ed. Chapman & Hall, International Thomson Publishing.
pp. 37-52.

Pripis-Nicolau, L., Revel, G., Marchand, S., Beloqui, A., and Bertrand, A. 2001.
Automated HPLC method for the measurement of free amino acids including cysteine in musts
and wines; first applications. J. Sci. Food Agric. 81: 731-738.

Quattrocchi, O., Andrizzi, S., y Laba, R. 1992. Introducción a la HPLC. Aplicación y

práctica. Edt. Artes Gráficas Farro. Buenos Aires. Argentina. pp. 407.

Romero, R., Gázquez, D., Sánchez-Viñas, M., Cuadros-Rodríguez, L., and Bagur, M.
2002. A geometric approach to robustness testing in analytical HPLC. LCGC North America. 20
(1): 72-80.

Rose-Sallin, C., Blake, C., Genoud, D., and Taglaferri, G. 2001. Comparison of
microbiological and HPLC-fluorescence detection methods for determination of niacin in fortified
food products. Food Chemistry. 73: 473-480.

Rounds, M., and Gregory III, J. 1998. High Performance Liquid Chromatography.
Chapter 32. In "Food Analysis" 2 Ed. Aspen Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen.
pp. 509- 526.

Rounds, M., and Nielsen, S. 1998. Basic Principles of Chromatography. Chapter 31. In
"Food Analysis" 2 Ed. Aspen Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen. pp. 485- 508.

Ruyck, H., Daeseleire, E., Grijspeerdt, K., De Ridder, H., Van Renterghem, R., and
Huyghebaert, G. 2001. Determination of flubendazole and its metabolites in eggs and poultry
with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 49: 610-617.
 91

Siouffi, A. 1992. Introduction HPLC. In "Food Analysis by HPLC". Edt. Nollet, Leo. Marcel
Dekker, Inc. pp. 1-52.

Smith, J. 1998. Evaluation of analytical data. Chapter 4. In "Food Analysis" 2 Ed. Aspen
Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen. p. 55- 69.

Smith, J., and Thakur, R. 1998. Mass Spectrometry. Chapter 29. In "Food Analysis" 2
Ed. Aspen Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen. pp. 443- 454.

Sotelo, A., and Serrano, B. 2000. High-performance liquid chromatographic

determination of the glycoalkaloids solanine and chaconine in 12 commercial varieties of
mexican potato. J. Agric. Food Chem. 48: 2472-2475.

Swartz, M., and Krull, I. 2003. Validation of bioanalytical methods-Highlights of FDA's

guidance. LCGC North America. 21(2): 136-142.

Transfiguración, J., Bernier, A., Arcand, N., Chahal, P., and Kamen, A. 2001. Validation
of a high-performance liquid chromatographic assay for the quantification of adenovirus type 5
particles. J. Chromatogr B. 761: 187-194.

USP, 2002. Chapter 1125. Validation of chromatographic procedures. United States

Pharmacopeia. NF. Vol. III. The National Formulary. Edt. Webcom Limited. Toronto, Canada.
pp. 2256-2259.

Vallé, M., and Malle, P. 1997. Optimization of a liquid chromatographic method for
determination of amines in fish. J. AOAC. Inter. 80(1): 49-56.

Valls, J., Bello, R., and Kodaira, M. 1999. Validation of liquid chromatography analysis of
biogenic amines in canned fish products. J. Aquatic Food Product Tech. 8(3): 79-91.

Valls, J., Bello, R., and Kodaira, M. 2001. Validation of liquid chromatographic analysis of
ATP-related compounds in sardines. J. Aquatic. Food Product Tech. 10(3): 67- 78.
 92

Veciana-Nogues, M., Izquierdo-Pulido., and Vidal-Carou, M. 1997. Determination of ATP

related compunds in fresh and canned tuna fish by HPLC. Food Chemistry. 59: 467-472.

Vial, J., and Jardy, A. 1999. Study of the linear range in HPLC analyses with UV
detection: methodology and experimental application to the influence of the analyte UV
spectrum. J. High Resol. Chromatogr. 22(4): 217-221.

Wang, H., Helliwell, K., and You, X. 2000. Isocratic elution system for the determination
of catechins, caffeine and gallic acid in green tea using HPLC. Food Chemistry. 68: 115-121.

Waters, 2002. Web site. Validation procedures. http//www.

forumsci.co.il/HPLC/chrometh.html.

Wehling, R. 1998. Infrared Spectroscopy. Chapter 27. In "Food Analysis" 2 Ed. Aspen
Publication, Maryland, EUA. Edt. Suzanne Nielsen. pp. 413- 424.

Woollard, D., Indyk, H., and Christisnsen, S. 2000. The analysis of pantothenic acid milk
and infant formulas by HPLC. Food Chemistry. 69: 201-208.

Zeppa, G., Conterno, L., and Gerbi, V. 2001. Determination of organic acids, sugars,
diacetyl, and acetoin in cheese by high-performance liquid chromatography. J. Agric. Food
Chem. 49:2722-2726.

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