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Determinación de la actividad de superóxido dismutasa total (SOD),

mediante la técnica que usa hematoxilina como cromóforo

FUNDAMENTO
La actividad de la SOD se puede determinar gracias a su habilidad de inhibir en
un 90-95% la autooxidación de la hematoxilina a hematina a pH fisiológico
(rango 6,8-7,8) y a temperatura de 25° C.

REACTIVOS
Buffer Pi 50 mM (pH = 7,5) + EDTA 0,1 mM.
Para preparar 200 mL de buffer Pi: mezclar 8 mL de Solución stock A (27,22
g fosfato de potasio monobásico en 1 L de agua destilada) + 42 mL de
Solución stock B (34,84 g de fosfato de potasio dibásico en 1 L de agua
destilada), queda una solución 200 mM. Agregar 150 mL de agua destilada
para diluir a 50 mM. Finalmente, agregar 7,45 mg de EDTA (PM 372,24 g/mol).

Hematoxilina 5mM en buffer PO4HK 50 mM.


Pesar 75.6 mg de hematoxilina (PM 302,29 g/mol) y disolver en 50 mL de
buffer PO4HK 50 mM (que se prepara con 25 mL de la Solución stock A y se
lleva a 100 mL con agua destilada).

TÉCNICA
La lectura de absorbancia se realiza a 560nm. El buffer Pi debe estar en
agitación para que se airee y a 25° C de temperatura.
1) En cubeta de 1 mL de capacidad (plástico o vidrio), se colocan 960 uL de
buffer Pi y se lleva a cero. Luego se agregan 40 µL de hematoxilina 5 mM.
Mezclar. Se determina la aparición de hematina y se registra cada 20
segundos, durante 3 o 4 min. Se toma la pendiente a de ese gráfico.
2) Se realiza el mismo procedimiento pero colocando 940 uL de buffer + 20 uL
de la muestra, mezclar, llevar a cero, y luego se agregar 40 uL de hematoxilina
y leer de igual modo. Así se obtiene la pendiente b.
3) Se realiza el mismo procedimiento pero colocando 920 uL de buffer + 40 uL
de la muestra, mezclar, llevar a cero, y luego se agregar 40 uL de hematoxilina
y leer de igual modo. Así se obtiene la pendiente c.
En todos los casos verificar que a los 60 segundos el  Absorbancia sea
cercano a 0,100.
NOTA1: la temperatura de reacción es óptima alrededor de 25° C, si varía
mucho, es necesario hacer la medición de la pendiente a antes de cada
muestra.
NOTA 2: para el caso de que las muestras sean de sangre deben extraerse
previamente con una solución cloroformo: etanol (3:5), en proporción 200 uL de
sangre + 600 uL de cloroformo: etanol + 200 uL de agua destilada. Se mezcla y
centrifuga, se utiliza la porción acuosa para las mediciones.

CÁLCULO
Se calculan los cocientes de las pendientes para cada volumen de muestra.
Posteriormente se grafica el log b/a ó log c/a = f (x) (µL de muestra agregado).
Se busca el 50% o sea el log 0.5 y se interpola para calcular los volúmenes
correspondientes.
1U SOD = 1000 / Vol de muestra que inhiben en un 50% la tasa de formación
de hemateina a 25 ºC. Aquí 1000 corresponde al volumen de reacción o sea
1000 uL

U SOD/ mg de proteínas = 1000 / (Vol de muestra que inhibe en un 50 % x mg


de proteínas)

BIBLIOGRAFÍA
Martin J.P. Jr., Dailey M. & Sugarman E. (1987). Negative and Positive Assays
of Superoxide Dismutase Based on Hematoxylin Autoxidation, Arch. Biochem.
Biophys. 255:329-336.

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