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UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MEXICO

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

LICENCIATURA: QFBT. Periodo: 2022-2

“Análisis y determinación de los efectos en las proteínas


presentes en la unión estrecha por la exposición a e-
líquidos mexicanos”

DISCENTE:

CASTILLA CARO CASANDRA

NOMBRE DEL ASESOR:

GARCIA DEBRAY YAZMÍN

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NOMBRE DEL ALUMNO:

SÁNCHEZ SÁNCHEZ

XIMENA

340259567

INSTITUCIÓN (ES):

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO CAMPUS LOMAS VERDES


.

ASESOR (ES):
GARCÍA DEBRAY YAZMÍN

TITULO:
“Análisis y determinación de los efectos en las proteínas
presentes en la unión estrecha por la exposición a e-
líquidos mexicanos”

SEPTIEMBRE 2022
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CONTENIDO

DEL

ESCRITO

ÍNDICE

I. MARCO TEÓRICO

II. MARCO DE REFERENCIA

III. JUSTIFICACIÓN

IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

V. HIPÓTESIS

VI. OBJETIVOS

X. CRONOGRAMA O CALENDARIO DE ACTIVIDADES

XI. REFERENCIAS

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“ANÁLISIS Y DETERMINACIÓN DE LOS EFECTOS EN LAS PROTEÍNAS


PRESENTES EN LA UNIÓN ESTRECHA POR LA EXPOSICIÓN A E-
LÍQUIDOS MEXICANOS”

MARCO TEÓRICO

Los cigarros electrónicos también conocidos como “e-cigarrillos”, “e-


cigarettes”, “ecigs”, “plumas de vapor”, “vapeadores”, “sistemas de tanque” o
“sistemas electrónicos de suministro de nicotina”, son dispositivos que
producen aerosoles por el calentamiento y posterior enfriamiento de un
líquido también conocido como e-líquido 1. El primer dispositivo se patentó en
1963 por Herbert A. Gilbert, pero fue hasta 2003 que comenzó a
comercializarse. Inicialmente surgió como una alternativa para poder fumar
en lugares donde el cigarrillo estaba prohibido 2, como lo son lugares
cerrados. Posteriormente se distribuyó como una alternativa para dejar de
fumar, sin embargo, reportes en Estados Unidos demuestran que los jóvenes
quienes son los principales usuarios de estos dispositivos jamás habían
fumado antes, por lo cual tienen más probabilidades de usar cigarros
electrónicos que los adultos con hábitos tabáquicos. En 2018 más de 3.6
millones de estudiantes de escuelas secundaria media y superior (20.8%)
habían usado estos dispositivos en el último mes, y de ellos, los jóvenes entre
18 a 24 años (40%) no habían sido fumadores de cigarros regulares 3
induciendo así a estos jóvenes a consumir estos productos por primera vez.

Los componentes tecnológicos que constituyen un cigarro electrónico son:


una batería que usualmente es recargable; una bobina de calentamiento o
resistencia que puede alcanzar temperaturas variables dependiendo de la
cantidad de vapor que se desee generar; una cámara de vaporización o
tanque, en donde se incluye el almacén de e-líquido y una mecha la cual tiene
contacto directo con las sustancias y finalmente la boquilla2,3. Los usuarios de
los cigarrillos electrónicos inhalan directamente estos aerosoles por la boca
hacia las vías respiratorias. El contenido químico de la e-líquido continúa
siendo difícil de conocer debido a la gran variedad de productos en el
mercado, generalmente se componen de una base o solvente de
propilenglicol (PG) y glicerina (Glc); saborizantes, que se pueden clasificar en
similares a tabaco, frutales, mentolados, sabores dulces; otros sabores como
café, té negro, vino, los hace más atractivos para su consumo; y la sustancia
activa que puede o no contener nicotina en concentraciones variables de 0
mg/ml a 24 mg/ml.
Se han estudiado una gran variedad de compuestos tanto en los e-líquidos
como en los aerosoles generados por el vapeo, éstos se pueden dividir en
nitrosaminas, aldehídos4, metales como cadmio, níquel, plomo, arsénico,
cromo 5 ; compuestos orgánicos volátiles, fenoles, hidrocarburos aromáticos
policíclicos y alcaloides 6 , entre otros. Se conocen efectos sobre la salud por
la exposición a estos compuestos, ocasionados por la ingesta y/o la
combustión del cigarro convencional y aunque recientemente se han descrito
los efectos por la inhalación de aerosoles provenientes de e-cigarro, su
mecanismo no ha sido bien dilucidado.
A pesar de que los grupos pro-vapeo y las empresas dedicadas al comercio
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de los ecigarros justifican que tiene menos sustancias dañinas que los
cigarros convencionales, es importante demostrar que no son dispositivos
inocuos. En México, la Comisión Coordinadora de Institutos Nacionales de
Salud y Hospitales de Alta Especialidad (CCINSHAE) en coordinación con la
Comisión Nacional contra las Adicciones publicó en mayo de 2019 un
comunicado que explica que no se ha demostrado la seguridad de los
sistemas electrónicos de administración de nicotina (SEAN) y que se carece
de información científica que avale la efectividad de dichos dispositivos para
dejar de fumar. En agosto de 2019 el departamento de salud de Utah (UDOH),
recibió reportes de múltiples casos de lesión aguda pulmonar asociados al
uso de e-cigarros. Todos los pacientes presentaron disnea progresiva,
náusea, vómito, dolor abdominal y fiebre, se diagnosticaron como neumonía
lipoidea ya que en las muestras de los lavados broncoalveolares se observó
en los macrófagos, la presencia de gotas lipídicas7, generando una lesión
pulmonar local con alteración en el intercambio gaseoso. Se sugiere que la
presencia de las gotas lipídicas en los macrófagos es por la presencia de
vitamina E en las soluciones utilizadas en el vapeo 7, 8. Debido a las
manifestaciones clínicas reportadas, se ha comenzado a evaluar los efectos
a nivel celular provocados por los compuestos de los e-líquidos 9. Un estudio
reveló la alteración en la permeabilidad de la membrana en cultivos primarios
de células endoteliales obtenidas de pulmón de ratas, mostrando que a mayor
tiempo de exposición (5 a 20 h) y concentración de nicotina de e-cigarros (5,
10 15 y 25 Mm), disminuye la resistencia eléctrica transepitelial (TEER por
sus siglas en inglés, transepithelial electrical resistance), para
concentraciones menores a 5mM de nicotina, solo se veía alteración a las 20
h 10.

ANTECEDENTES CIENTÍFICOS

El sistema respiratorio se divide por sus estructuras anatómicas en vía aérea


alta y baja, es esencial que cada una de las partes que lo conforman
mantenga adecuadamente sus funciones para lograr un adecuado
intercambio gaseoso. La vía aérea alta inicia en la nariz y fosas nasales, a
continuación, se encuentra la faringe la cual es una estructura tubular que
abarca el espacio ubicado entre la base del cráneo hasta el borde inferior del
cartílago cricoides, las principales funciones de la vía aérea alta son olfato,
filtración, humidificación y calentamiento aéreo11. La vía aérea inferior
comienza en la laringe, a continuación, se encuentra la tráquea, la cual se
situada en el mediastino superior. El siguiente componente anatómico son los
bronquios, que posteriormente se divide en bronquios principales derecho e
izquierdo. Estos bronquios principales se subdividen en bronquios lobares, el
derecho en superior, medio e inferior y el izquierdo en superior e inferior.
Posteriormente se dividen en bronquios segmentarios y subsegmentarios, y
continuaran hasta formar bronquiolos terminales y respiratorios11,12. Los
alveolos son la última porción del árbol bronquial. Corresponde a diminutas
celdas o casillas en racimo con un diámetro de 300 micras, son similares a un
panal de abejas que conforman los sacos alveolares, cuya función principal
es el intercambio gaseoso12,13.
Los alveolos se encuentran conformados por un epitelio plano, el cual
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contiene dos células principales, los neumocitos tipo I y tipo II y un espacio


intersticial a base de elastina y colágeno. Los neumocitos tipo I son células
de sostén y los más abundantes, abarcan el 95% de la superficie alveolar,
pero solo corresponden al 40% de ésta, su fin fisiológico es aumentar la
superficie de intercambio gaseoso ya que son muy delgadas y generalmente
impermeables al agua. Por su parte, los neumocitos tipo II son células
cuboides y se sitúan en las uniones de los tabiques alveolares, que abarcan
el 5% de la superficie alveolar y corresponden al 60% de ésta 11, poseen gran
actividad metabólica, la mitad de la cual está dedicada casi exclusivamente a
producir, almacenar y secretar el surfactante, el cual es el encargado de
disminuir la tensión superficial, lo cual impide el colapso de los alveolos y
permite el intercambio gaseoso.

La integridad de la membrana alveolo capilar es fundamental para el


adecuado intercambio gaseoso. Está integrada desde el alveolo al capilar por
una fina capa de líquido, que cubre el alveolo y contiene el surfactante, el
epitelio alveolar compuesto por los neumocitos tipo I y tipo II, la membrana
basal alveolar, el espacio intersticial, la membrana basal capilar y finalmente
el endotelio capilar. Su grosor es de solo 0.5 micras, considerando que el ser
humano posee en 400 a 600 millones de alveolos, se puede considerar que
su superficie de intercambio es muy amplia, con más de 70 metros cuadrados.
La difusión de los gases se realiza siguiendo los gradientes de presión por lo
cual el oxígeno cruza desde el alveolo al capilar, y el CO2, desde el capilar al
21 alveolo14. El daño al epitelio alveolar puede tener graves consecuencias
fisiológicas, como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), una
afección en la que el aumento de la permeabilidad capilar conduce a un daño
alveolar difuso y a la liberación de citocinas proinflamatorias. El intercambio
de gases pulmonar es un mecanismo estrictamente regulado, cuando existe
una interrupción existe una retención de dióxido de carbono en los pacientes
lo que a su vez conduce a bajos niveles de oxígeno, que tiene el potencial de
afectar de manera aguda o crónica la función pulmonar. Como ya
mencionamos uno de los principales factores implicados en el intercambio de
gases pulmonares es el surfactante, que es una mezcla delicadamente
equilibrada de proteínas y lípidos, ante una lesión e inflamación pulmonar es
insuficiente, causando un intercambio de gases deficiente 15. Se ha
demostrado in vivo que los aerosoles del PG de los EC provocan
fluctuaciones en la composición del surfactante, lo que conduce a anomalías
en el intercambio de gases16.

Entendiendo lo fundamental en la integridad del epitelio pulmonar, debemos


comprender que la unión celular necesita una gran cantidad de proteínas, las
cuales además de mantener a las células unidas, regulan una gran cantidad
de funciones indispensables para su adecuado funcionamiento. Las proteínas
de la unión estrecha son un tipo especializado de proteínas intercelular que
forma parte de un complejo de unión entre dos células epiteliales contiguas,
sus principales funciones son la regulación del transporte de iones a través
del espacio paracelular, el establecimiento de la polaridad celular y la
transducción de señales desde y hacia las proteínas de la unión estrecha 17.
De esta manera contribuyen a evitar la difusión libre de moléculas pequeñas,
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macromoléculas, microorganismos y células a través del espacio paracelular


regulando diversos procesos celulares como la proliferación, la expresión
génica y la diferenciación celular18. Las proteínas de la unión estrecha
constan de tres grupos principales de proteínas, que son, proteínas
transmembrana , las claudinas y ocludina ; las proteínas de placa
citoplasmática ZO-1, ZO-2, ZO-3 (Zonula occludens) y cingulina , y finalmente
las proteínas citoesqueléticas y de señalización, por ejemplo, actina, miosina
II y PKCζ18. Las claudinas, tienen un papel muy importante en el
mantenimiento de las funciones de barrera, se ha relacionado con la
permeabilidad y la polaridad celular de los epitelios, los estudios indican que
a mayor expresión de claudina 2, el epitelio es más permeable y viceversa;
además, se ha reportado que la alteración de claudinas está asociada al
desarrollo de procesos oncológicos19.

El estrés oxidante es una alteración en el estado óxido-reductor de un


organismo o una alteración en el equilibrio entre la producción de especies
reactivas de oxígeno y del nitrógeno (ERON) y las defensas antioxidantes,
que conducen a la oxidación de lípidos, proteínas y ADN de formas que
perjudican la función celular20. El oxígeno es esencial para la vida biológica
compleja, ya que es fundamental para el metabolismo celular y la producción
de energía. La descomposición del oxígeno produce productos intermedios
altamente reactivos o especies reactivas de oxígeno (ERO), incluido el
superóxido y el peróxido de hidrógeno (H2O2), desempeñan funciones
intracelulares fisiológicas cruciales. Los radicales libres son un subproducto
del metabolismo aeróbico; 2-3% del oxígeno consumido por una célula se
convierte en radicales libres. Los oxidantes son producidos por varios tipos
de células en el pulmón, incluidas las inflamatorias (neutrófilos y macrófagos),
fibroblastos, endoteliales y epiteliales. Estas células expresan enzimas
generadoras de EROS como NADPH oxidasa (Nox), óxido nítrico sintasa,
lipoxigenasa y xantina oxidasa. Dado que los oxidantes pueden actuar de
manera indiscriminada para modificar de forma no selectiva las biomoléculas
cercanas, se ha desarrollado un extenso arsenal de defensas antioxidantes
celulares que sirven para ayudar a restaurar el equilibrio oxidativo, proteger
del daño y mantener la homeostasis celular. Las fuentes de antioxidantes
incluyen fuentes enzimáticas (superóxido dismutasas, catalasas,
peroxiredoxinas, sistemas de glutatión) y fuentes no enzimáticas, que están
presentes de forma endógena o por ingesta dietética, como vitaminas o
aminoácidos, que tienen efectos antioxidantes directos o sirven como
precursores o cofactores de enzimas antioxidantes 21.

Como ya se mencionó los aerosoles de los e-líquidos contienen menos


cantidad de sustancias tóxicas que los cigarros convencionales, sin embargo,
los estudios revelan daños en diferentes modelos celulares por los
compuestos que contienen. Se ha demostrado en células NCI-H292
(epiteliales bronquiales humanas), la activación de Nrf2, posterior a 6 horas
de exposición a los aerosoles condensados de e-líquidos; regula la expresión
de proteínas antioxidantes que protegen contra el daño oxidante. De la misma
manera existe un aumento en la generación de EROS a nivel intracelular en
menor intensidad por el e-cigarro que por el humo del tabaco 22.
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JUSTIFICACIÓN

Los efectos biomoleculares y celulares de los aerosoles generados por los e-


cigarros sobre la salud pulmonar continúan siendo desconocidos, el
panorama en nuestro país comienza a ser alarmante, de acuerdo con la
Encuesta Nacional de Consumo de Drogas, Alcohol y Tabaco (ENCODAT)
2016-2017, en México, reportan que más de 5 millones de mexicano (5.9%)
de la población entre 12 a 65 años ha probado alguna vez el cigarro
electrónico. Los e-cigarros y los e-líquidos están fuera de toda regulación
sanitaria en nuestro país, muchos de ellos fabricados de manera artesanal, y
no se cuenta con estudios que identifiquen los compuestos químicos tóxicos
que forman parte de éstos. Aunado a esto su bajo costo y amplia distribución,
los hace fácilmente accesibles para la población de adolescentes y adultos
jóvenes de nuestro país. El consumo de cigarros electrónicos está
aumentado, se han reportado casos de lesiones pulmonares asociadas al
vapeo (EVALI por sus siglas en inglés, e-cigarette, or vaping, product use-
associated lung injury). El uso, manufactura y exposición a los derivados de
los e-cigarros representa un problema de salud pública emergente. Se
desconoce el potencial tóxico de los e-líquidos por su consumo a nivel
pulmonar, celular y molecular en la alteración de elementos que participan en
la permeabilidad epitelial (proteínas de la unión estrecha). Las claudinas y
ocludina son componentes de la unión estrecha, que se localizada en el límite
de la parte apical y basolateral de las células. Su alteración se ha relacionado
con cambios en la permeabilidad celular, daño pulmonar agudo y
diferenciación epitelio-mesénquima, predisponiendo a fibrosis y cáncer
pulmonar. Por lo anterior, es de gran relevancia evaluar la posible alteración
sobre las proteínas de la unión estrecha.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Dado que la membrana alveolo capilar está conformada por una monocapa
epitelial, es indispensable su integridad para que se lleve a cabo un adecuado
intercambio gaseoso, este proceso depende de proteínas estructurales y de
andamiaje. Actualmente existe escasa evidencia científica de la alteración de
las proteínas de la unión estrecha por la exposición a e-líquidos. Por lo que
este trabajo pretende evaluar el efecto de la exposición de los e-líquidos, para
poder dilucidar los efectos sobre la integridad de la barrera epitelial pulmonar.

HIPÓTESIS

La exposición de e-líquidos modificara las proteínas de la unión estrecha.

OBJETIVOS

Evaluar los efectos de e-líquidos mexicanos sobre las proteínas de la unión


estrecha en la línea celular A549 en cocultivo con células monocíticas THP1.

Específicos
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1. Determinar la viabilidad en células A549, THP-1 y en cocultivo de las


bases y los elíquidos.
2. Evaluar la alteración de las proteínas de la unión estrecha (Claudina 1,
2, 4 y ocludina), posterior a la exposición a las bases y a los e-líquidos
en la línea celular en cocultivo.

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CRONOGRAMA O CALENDARIO DE ACTIVIDADES


TABLA DE GANTT

PERIODOS Tiempo: Especificar días, semanas o meses según sea


FASES conveniente, para cada una de las actividades.

1. Fecha de inicio 16 de agosto

2. Verificación de laboratorios, 19 de agosto 22 de agosto 25 de agosto a 13 de septiembre


gabinetes, quirófanos, bioterios, etc.
y equipos necesarios para la
investigación
3. Acopio de materiales y reactivos 16 de agosto a 13 de septiembre

4. Obtención de la muestra(s) de Pendiente de


estudio o sujetos definir

5. Estandarización de metodologías y 25 de agosto a 13 de septiembre


técnicas
Estandarización de metodología
6. Estudio piloto (cuando sea Pendiente de
pertinente) definir

7. Realización de las observaciones Pendiente de


y/o experimentos definir

8. Acopio y organización de los Pendiente de


datos definir

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9. Análisis de los datos Pendiente


de definir
10. Elaboración y selección del Pendiente
material gráfico (tablas, cuadros, de definir
gráficos, fotografías, videos, etc. )

11. Interpretación de los resultados Pendiente


de definir
12. Experimentos u observaciones Pendiente
complementarias de definir

13. Elaboración del informe escrito Pendiente


de definir

14. Presentación oral y revisión del Pendiente


trabajo escrito de definir

15. Realización de correcciones Pendiente


de definir

16. Presentación del informe final Pendiente


escrito del trabajo (Tesis en original y de definir
1 copia. Entrega de tesis en formato
electrónico. CD)
17. Remisión del artículo para Pendiente
publicación de definir

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