Agrosavia

Sistema gráfico
Gobierno de la República de Colombia
L ib ertad y O rd e n
Metodologías de análisis
normalizadas para la red de
laboratorios lácteos que
hacen análisis de leche cruda

para pago por calidad
VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA
Mosquera, 2013
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria / Metodologías de análisis normalizadas
para la red de laboratorios lácteos que hacen análisis de leche cruda para pago por calidad. Bogotá
(Colombia): CORPOICA, 2013. 36 p.
Palabras clave: LECHE CRUDA, LABORATORIOS, CALIDAD DEL PRODUCTO, INOCUIDAD ALIMENTARIA.
Sistema gráfico
Gobierno de la República de Colombia
Convenio 20120289 del 2012 entre CORPOICA y el MADR para aunar esfuerzos
técnicos, científicos, administrativos y financieros en virtud de la política establecida
en el documento CONPES 3675 de 2010
© Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Corpoica

CI, Tibaitatá
ISBN: 978-958-740-159-2
CUI: 1451
CA: 4590
Primera edición: Junio de 2013
Tiraje: 500 ejemplares
Línea de atención al cliente: 018000121515

atencionalcliente@corpoica.org.co
www.corpoica.org.co
Impreso en Colombia
Printed in Colombia
La presente publicación ha sido elaborada con la cofinanciación del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural,
MADR. El contenido de la misma es responsabilidad exclusiva de los investigadores y en ningún caso debe
considerarse que refleja los puntos de vista del MADR.
Tabla de contenido
Introducción 5
Determinación de grasa. Método Gerber 6
1. Objetivo 6
2. Materiales y equipos 6
3. Reactivos 7
4. Consideraciones previas 7
5. Metodología 7
Referencias biliográficas 9
Determinación de proteína. Método Kjeldahl 10

1. Objetivo 10
3. Reactivos 10
4. Principio de método 11
6. Metodología 12
Determinación de proteína. Método Kjeldahl (método manual) 15

1. Objetivo 15
3. Reactivos 15
6. Metodología 17
Determinación de sólidos totales. Método secado con

aire forzado a 100 ºc 21
1. Objetivo 21
3. Reactivos 21
6. Metodología 22
Referencias biliográficaS 24
Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 3

que hacen análisis de leche cruda para pago por calidad
Determinación de grasa, proteína y sólidos totales.
Método Automatizado Infrarrojo 25
1. Objetivo 25
3. Reactivos 25
5. Metodología 26
6. Especificaciones de desempeño 26
7. Control de funcionamiento 27
Recuento de microorganismos mesófilos aerobios (ac).

Método Placas 3M™ Petrifilm™ 28
1. Objetivo 28
2. Definiciones 28
4. Reactivos 29
7. Metodología 30
Recuento de microorganismos aerobios mesófilos.

Método UNE-EN ISO 4833 : 2003 33
1. Objetivo 33
2. Definiciones 33
4. Reactivos 34
6. Metodología 35
Protocolo recuento de bacterias mesofilas aerobias.

Metodo de Citometria de Flujo 40
1. Objetivo 40
2. Definiciones 40
4. Reactivos 41
7. Metodología 41
8. Reporte de resultados 42
9. Control de calidad en el laboratorio 42
4 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

Introducción
Este documento hace parte de la actividad que tiene

como propósito la difusión de las técnicas analíticas
normalizadas y la capacitación en el desarrollo de las
mismas en los laboratorios que hacen análisis para pago
por calidad en leche cruda.
Esta actividad se halla dentro del convenio 20120289 del

2012 realizado entre CORPOICA y el MADR que busca
aunar esfuerzos técnicos, científicos, administrativos
y financieros en virtud de la política establecida en el
documento CONPES 3675 de 2010, para dar inicio a una
primera fase de pre evaluación y fortalecimiento de la red
que permita a mediano plazo dinamizar el subsistema de
laboratorios para asegurar la calidad e inocuidad de la
leche cruda.
Además se busca asegurar una oferta de laboratorios que

permita a todo agente comprador de leche cruda a nivel
nacional, realizar los análisis de calidad para la liquidación
del pago de leche cruda al proveedor y dar cumplimiento a
lo establecido por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo
Rural en la resolución 0017 de 2012.
NOTA:
DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE
CORPOICA –Corpolac es consciente de la necesidad de apoyo en términos de capacitación para los laboratorios que emprendan la ardua
labor de la implementación de la norma ISO 17025 en temas como la determinación de incertidumbre de las mediciones; por eso reiteramos
nuestra disposición de brindar soporte a través de la implementación de cursos de capacitación que serán anunciados de manera oportuna
por los medios de comunicación usuales, de igual manera nuestro correo institucional ensayoleche@corpoica.org.co está a su disposición
para recibir las inquietudes acerca de este tema y cualquier otro en que podamos ser útiles para todos ustedes.

Determinación de grasa.
Método Gerber
CÓDIGO: VC-R- 7 • VERSIÓN: 01 • FECHA APROBACIÓN: 05-02-2013
1. OBJETIVO
Determinar el contenido de grasa en muestras de leche empleando el método Gerber
según la norma internacional AOAC 2000.18 / 2000.
2. MATERIALES Y EQUIPOS
2.1. Materiales
• Pipetas aforadas Gerber de 11,0 mL.
• Butirómetros con escala de 0 a 8 ± 0,5 %, plano de sección transversal uniforme
graduado longitudinalmente, dividido en 80 partes iguales, cada uno equivalente
a un volumen de 0,0125 mL. El error de la longitud total calibrada no debe exceder
de ± ½ de la menor graduación. Las líneas de graduación están uniformemente
centradas en la cara del tubo plano, con líneas de 0,1 % no menores de 3 mm de
largo. La graduación en el tubo plano va de 0 a 8 al lado derecho.
• Tapones de caucho para butirómetro y llave de ajuste. El tapón es de material de
caucho resistente, de dimensiones estandarizadas, adecuado para el cuello del
butirómetro.
• Gradilla metálica para colocar el butirómetro en una posición segura.
• Pipeteador.
2.2. Equipos
• Centrífuga Gerber con control de temperatura.
• Balanza analítica de 0,01 g para pesar con precisión. Comprobar la exactitud
periódicamente y mantener un registro de los controles de verificación de la balanza.
• Pesas para la verificación de la balanza analítica clase S dentro del rango de peso que
se va a utilizar, para pesar los butirómetros de leche vacíos y los butirómetros que
contengan las muestras.
• Dosificador de 10 mL con tolerancia a sustancias corrosivas (ácido sulfúrico).

• Dosificador de 1 mL para el alcohol isoamílico.
• Baño de agua termostatado para llevar las muestras de leche a una temperatura de
39 °C ± 1 °C antes de realizar el pesaje y para mantener la temperatura de la columna
de grasa entre 60 y 63 °C, y proporcionar una agitación intermitente o constante.
La profundidad del baño de agua debe permitir la inmersión vertical del bulbo
pequeño del butirómetro.
3. REACTIVOS
• Ácido sulfúrico grado analítico 91,2 % (d15/15 = 1.820 a 1.825 - 15,5 °C g/mL).
• Alcohol isoamílico 98,5 % (d15= 0,814 – 0,816 g/mL) punto de ebullición 128 °C a
133 °C, libre de agua, ácidos, grasas y furfural. (Precaución: los vapores son tóxicos).
4. CONSIDERACIONES PREVIAS
4.1 Medidas de Seguridad
• Utilizar siempre los elementos de protección personal adecuados (bata de
laboratorio, guantes de carnaza, monogafas, paño, zapatos antideslizantes).
• Utilizar máscara para vapores de gases inorgánicos.
• Utilizar siempre el pipeteador para el ácido sulfúrico.
• Leer y tener a mano las fichas de seguridad de los reactivos utilizados.
• Leer las notas de seguridad sobre el manejo de las centrífugas.
• Recolectar los residuos de la determinación de la grasas en un contenedor plástico
para realizar la disposición de acuerdo con las normas aplicables y regulaciones
ambientales.
4.2 Medidas de Aseguramiento de la Calidad

4.2.1 Duplicados de análisis de muestras
Se debe analizar una muestra por duplicado por cada set de muestras analizadas; este
duplicado debe tener una desviación estándar de 0,023.
5. METODOLOGÍA
5.1 Preparación de la Muestra
• Llevar el frasco con la muestra de leche a un baño de agua a 20 ºC aproximadamente,

mezclar hasta homogeneidad invirtiendo el frasco varias veces, y sin demora pesar o
medir la porción analítica. Si los grumos de nata no se dispersan, calentar la muestra
en un baño de agua caliente a aproximadamente 38 °C y seguir mezclando hasta
homogeneidad; utilizar una varilla de agitación, si es necesario, para incorporar

la grasa que se puede quedar adherida a la tapa o pared del frasco de la muestra.
Mientras sea práctico y la grasa permanezca dispersa, enfriar la muestra a
aproximadamente 20 °C antes de transferir la porción analítica.
• No demorar para pesar o medir la muestra y mantener la mezcla siempre homogénea.
5.2 Procedimiento
• Colocar un butirómetro en la gradilla metálica.
• Adicionar 10,0 ± 0,2 mL de ácido sulfúrico a 15 - 21 °C en el butirómetro.
• Tarar el butirómetro que contiene ácido sulfúrico (H2SO4) en la balanza analítica.
• Con la pipeta de 11,0 mL adicionar 11,13 ± 0,03 g de muestra de leche templada en
el butirómetro. Adicionar la leche poco a poco dentro del butirómetro para evitar la
carbonización de la leche y no conducir a una reacción violenta con el ácido. Debe
observarse claramente la separación de ambas fases, ácida y de leche.
• Agregar a continuación 1,0 ± 0,05 mL de alcohol isoamílico en el butirómetro que
contiene la porción de muestra y cerrar el butirómetro insertando el tapón de
caucho de forma segura. Verifique que el tapón de caucho se encuentre bien inserto.
(Utilizar guantes aislantes).
• Tomar el butirómetro por el cuello graduado con el extremo tapado hacia arriba
envuelto en un paño para evitar posibles proyecciones, y agitar hasta la total disolución
de la fase proteica de la leche (ruptura de coágulos de leche).
• Colocar el butirómetro en la centrífuga con el bulbo pequeño hacia arriba y hacer el
contrapeso; centrifugar 4 minutos después de alcanzar la velocidad adecuada (Tabla
2000.18B).
• Retirar el butirómetro de la centrífuga con cuidado para no mezclar la capa superior
de la grasa ya separada.
• Transferir el butirómetro a baño de agua, sumergir y mantener entre 60 °C y 63 °C.
Dejar expuesto solamente el bulbo pequeño hasta que la grasa se mantenga en la
columna durante 5 minutos.
• Retirar el butirómetro del baño de agua y secar con un trapo.
• Aplicar una suave presión sobre el tapón para que la columna inferior lleve la grasa
hacia arriba y coincida con la marca más cercana al porcentaje de graduación.
• Leer inmediatamente en la escala de la parte inferior del menisco superior con una
precisión de 0,05 %.
Tabla 2000.18B. Velocidad de centrifugado

Radio de efectividad (mm) Revoluciones por minuto ±70 rpm
240 1 140
250 1 120
260 1 100
270 1 080
300 1 020

5.3 Análisis de Repetición
Es preciso repetir el análisis si la columna de grasa está turbia o de color oscuro, o si hay
material blanco o negro en la parte inferior de la columna de grasa. La columna de grasa
es aceptable si el color es amarillo traslúcido fuerte y uniforme sin partículas.
5.4 Cálculos y Resultados

El porcentaje de grasa en la muestra se determina calculando la resta entre el mayor
valor y el menor valor del menisco observado en la escala del butirómetro:
% Grasa (p/p) = (Lectura Superior - Lectura Inferior)
REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS
AOAC. Official Methods Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.
2000.18. 18th edición del 2005, cuarta revisión del 2011.
Consejo Nacional Lácteo. Sistema Nacional de Análisis de Leche Fresca. Manual de
Calidad del Sistema Nacional de Análisis de Leche Fresca –SISLAC–. Edición 5°.
Febrero de 2005. pp. 26-28.
Instituto Colombiano de Normas Técnicas Icontec. GTC 3 PARTE 1. G. S., Luis Enrique;
C.G. Carlos Eduardo. Manual de Métodos Fisicoquímicos para el Control de
Calidad de la Leche y sus Derivados. pp. 18-19.

Determinación de proteína.
Método Kjeldahl
1. OBJETIVO
Determinar el contenido de proteína en muestras de leche empleando el método
Kjeldhal (método de referencia) según la norma internacional AOAC 991.20 para
determinación de nitrógeno total en leche.
2.1 Materiales
• Tubos de digestión de 250 mL de capacidad.

• Erlenmeyer de 500 mL.
• Pipetas de vidrio graduadas 5,0 mL o 10,0 mL.
2.2 Equipos
• Balanza analítica con precisión de 0,001 g.

• Sistema de digestión para Kjeldhal.
• Unidad de destilación para Kjeldhal.
• Cabina extractora de gases.
• Bureta digital automática ± 0,05 mL.
3. REACTIVOS
• Ácido sulfúrico 95 % – 98 % (densidad 1,84 g/mL, libre de nitrógeno).
• Solución catalizadora de sulfato de cobre al 5 % p/v. Pesar 5 g de CuSO4.5H2O en 100
mL de agua destilada.
• Cristales de sulfato de potasio (K2SO4).
• Solución de hidróxido de sodio al 40 % w/w. Pesar 400 g de hidróxido de sodio (libre
de nitrato de sodio) en 1 L de agua.

• Solución indicadora, rojo de metilo/verde bromocresol. Disolver 0,2 g de rojo de
metilo en 100 mL de etanol al 95 %. Disolver 1 g de verde de bromocresol en 500
mL de etanol. Luego, mezclar 1/5 partes de una solución de rojo de metilo 0,2 % en
alcohol con una de verde de bromocresol 0,5 % en alcohol.
• Solución de ácido bórico al 4 % p/v con indicador. Disolver 40 g de H3BO3 y diluir en un
1 L de agua; luego añadir 3 mL de solución indicadora de rojo de metilo/bromocresol.
• Solución de ácido clorhídrico 0,1 N estandarizado. Tomar 8,35 mL y aforar a 1 L.
• Para hallar la concentración del ácido, pesar 0,5 g de ftalato de potasio y disolverlos
en 20 mL de agua destilada.
(Nota: Tome 2 g de ftalato de potasio y colóquelos en el horno de convección de aire

forzado a una temperatura de 105 ºC ± 1 durante una hora, luego deposítelo en el
desecador hasta que llegue a temperatura ambiente.)
• Sulfato de amonio (NH4)2SO4 99,9 %.

• Triptófano o clorhidrato de lisina. 99 % C11H12N2O2 o C6H15ClN2O2.
• Sacarosa libre de nitrógeno.
4. PRINCIPIO DE MÉTODO
La cantidad de proteína en la leche es un indicativo de su valor nutricional, así como de
las características organolépticas. Puesto que el nitrógeno representa en la mayoría de
las sustancias proteicas un porcentaje relativamente constante (alrededor del 16 %), su
determinación sirve como medida del contenido proteico en la leche.
El método para determinar la proteína se basa en la medición de la cantidad de

nitrógeno de la muestra a través del método estandarizado de Kjeldhal y la conversión
de nitrógeno a proteína, multiplicando el porcentaje de nitrógeno determinado por
6,38 (factor constante). Este método se fundamenta en la combustión en húmedo
de la muestra por calentamiento con ácido sulfúrico concentrado en presencia de
catalizadores para reducir el nitrógeno orgánico de la muestra hasta amoniaco, y este
queda en solución en forma de sulfato de amonio. El digerido, una vez alcalinizado, se
destila directamente o por arrastre con vapor para desprender el amoniaco, el cual es
atrapado y luego titulado para posterior determinación.
5.1. Medidas de Seguridad

laboratorio, guantes de carnaza, monogafas, zapatos antideslizantes).

Se deben analizar muestras por duplicado por cada set de muestras analizadas;
este duplicado debe tener una desviación estándar de 0,038.
6. METODOLOGÍA

• No demorar para medir o pesar la muestra y mantener la mezcla siempre homogénea.
6.2 Digestión de la Muestra

• Adicionar a cada tubo que contiene la muestra, 12 g de sulfato de potasio (K2SO4) y
1 mL de solución de sulfato de cobre (CuSO4) al 5 % p/v.
• Pesar en balanza analítica 5,0 mL ± 0,1mL de muestra de leche homogeneizada en
un tubo de digestión sin mojar las paredes. Registrar el peso de la muestra (Pm).
• Agregar cuidadosamente 20 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.
• Colocar el tubo(s) en la unidad de digestión, tapar con el tren de evacuación de
gases del digestor asegurándose de sellar bien las bocas de los tubos, y conectar la
manguera del tren a la trampa con solución alcalina para absorción de gases. Llevar
la temperatura del digestor a 230 °C (tener cuidado de que sea lentamente, para no
generar demasiada espuma) y digestionar durante ½ hora, o hasta cuando dentro
del tubo se observe formación de humos blancos.
• Aumentar gradualmente la temperatura (para evitar la formación excesiva de
espuma) de digestión a 430 °C y mantenerla durante 1 hora o el tiempo necesario
para que no se observen vapores dentro del tubo y la solución que se encuentra
dentro alcance un color verde claro. El tiempo total de digestión es de 1,75 – 2,5 h.
• Finalizada la digestión, dejar enfriar los tubos hasta el fin de emisión de vapores y a
temperatura ambiente; luego retirar del digestor, empleando los guantes de asbesto.
Verificación de recuperación: Cada vez que se realice una determinación de proteína
se debe colocar una muestra con urea que pese 0,05 g y que esté bajo las mismas
condiciones que el resto de las muestras. Así mismo, se coloca una muestra control con
características determinadas.

6.2.1. Precauciones
• En la preparación de los reactivos hay que tener especial cuidado principalmente
en la preparación de la soda al 40 %, pues es altamente corrosiva, los vapores son
tóxicos y la reacción de la soda con el agua es altamente exotérmica.
• La determinación de proteína para las muestras de remuestreo debe realizarse por
duplicado.
6.3. Destilación de la Muestra

• Colocar NaOH al 40 % en el tanque de álcali de la unidad de destilación.
• Ajustar el volumen del dispensador en 65 mL de NaOH al 40 %.
• Conectar el tubo de digestión en la unidad de la destilación.
• Poner el Erlenmeyer de 500 mL, que contiene 50 mL de solución de H3BO3 con indicador
en la plataforma, y accionar la solución según el instructivo de manejo del equipo.
• Adicionar lentamente y con agitación suave 80 mL de agua desionizada al tubo de
digestión de la muestra.
• Iniciar la destilación hasta recoger 150 mL o 200 mL de destilado sobre la solución
de ácido bórico.
6.4 Titulación de la Muestra

• Retirar el matraz con la muestra y valorar la solución de H3BO3 con ácido clorhídrico
HCl 0,1 N al primer cambio de color rosa.
• Registrar los mL de ácido clorhídrico (HCl) al 0,05 mL más cercano.
6.5 Verificación de la Recuperación del Nitrógeno

Ejecutar la recuperación de nitrógeno para comprobar la exactitud de los procedimientos
y del equipo.
a. Pérdida de nitrógeno. Pesar 0,12 g de sulfato de amonio y 0,85 g de sacarosa en

el tubo. Añadir todos los demás reactivos como se indica en la preparación de la
muestra. Digerir y destilar en las mismas condiciones que para una muestra de leche.
Las recuperaciones serán de al menos el 99 %.
b. Eficiencia de la digestión. Pesar 0,16 g de clorhidrato de lisina o 0,18 g de triptófano,
con 0,67 g de sacarosa por tubo. Añadir todos los demás reactivos como se indica en
la preparación de la muestra. Digerir y destilar un blanco en las mismas condiciones
que para una muestra de leche. Las recuperaciones serán de al menos el 98 %.
6.6 Titulación
Titular el destilado empleando la bureta digital con ácido clorhídrico 0,1 N hasta el viraje
de la solución azul claro a un primer trazo a color rosa claro. Registrar los mL de HCl al
0,05 más cercano.

6.7 Cálculos
Por medio de la siguiente relación se obtiene el porcentaje de proteína:
[(V - B) x N ] * ( fx 1.4007)
% PROTEINA (p/v) =
PM
Donde,
N = Normalidad de la solución de ácido clorhídrico previamente estandarizado.

V = Volumen en mL de ácido clorhídrico gastado en la titulación.
B = Volumen en mL de ácido clorhídrico gastado en la titulación del blanco.
F = Factor de conversión de nitrógeno a proteína cruda; para leche es 6,38.
PM: Peso de la muestra en gramos.
El resultado se debe presentar en porcentaje con aproximación de 0,1 g de nitrógeno /

100 g de muestra.
Para hallar la concentración del ácido clorhídrico, emplear la siguiente fórmula:
V1 * C1
C2 =
V2
Donde,
C2 = Concentración real de ácido clorhídrico.

V1 = Alícuota tomada de ftalato de potasio.
C1 = 0,1
V2 = Volumen gastado en la titulación del ftalato de potasio.
C. G., Carlos Eduardo. Manual de Métodos Fisicoquímicos para el Control de

Determinación de proteína.
Método Kjeldahl (método manual)
1. OBJETIVO
Determinar el contenido de proteína en muestras de leche empleando el método
Kjeldhal (método de referencia) según norma internacional AOAC 991.20 para
determinación de nitrógeno total en leche.
2.1 Materiales
• Tubos de digestión de 250 mL de capacidad.
• Erlenmeyer de 500 mL.
• Pipetas de vidrio graduadas 5,0 mL o 10,0 mL.
2.2 Equipos
• Balanza analítica con precisión de 0,001 g.

• Frascos de digestión para Kjeldhal.
• Frascos de destilación para Kjeldhal.
• Cabina extractora de gases.
• Bureta de titulación ± 0,05 mL.
3. REACTIVOS
• Ácido sulfúrico 95 % – 98 % (densidad 1,84 g/mL, libre de nitrógeno).

• Solución catalizadora de sulfato de cobre al 5 % p/v. Pesar 5 g de CuSO4.5H2O en 100
mL de agua destilada.
• Cristales de sulfato de potasio (K2SO4).
• Solución de hidróxido de sodio al 50 % w/w. Pesar 500 g de hidróxido de sodio (libre
de nitrato de sodio) en 1 L de agua.
• Solución indicadora, rojo de metilo/verde bromocresol. Disolver 0,2 g de rojo de
metilo en 100 mL de etanol al 95 %. Disolver 1 g de verde de bromocresol en 500

mL de etanol. Luego mezclar 1/5 partes de una solución de rojo de metilo 0,2 % en
alcohol con una de verde de bromocresol 0,5 % en alcohol.
• Solución de ácido bórico al 4 % p/v con indicador. Disolver 40 g de H3BO3 y
diluir en un 1 L de agua. Añadir 3 mL de solución indicadora de rojo de metilo/
bromocresol.
• Solución de ácido clorhídrico 0,1 N estandarizado. Tomar 8,35 mL y aforar a 1 L.
• Para hallar la concentración del ácido, pesar 0,5 g de ftalato de potasio y disolverlos
en 20 mL de agua destilada.
(NOTA: Tome 2 g de ftalato de potasio y colóquelo en el horno de convección de aire

forzado a una temperatura de 105 ºC ± 1 durante una hora; luego deposítelo en el
desecador hasta que llegue a temperatura ambiente).
• Sulfato de amonio (NH4)2SO4 99,9 %

• Triptófano o clorhidrato de lisina. 99 % C11H12N2O2 o C6H15ClN2O2.
• Sacarosa libre de nitrógeno.
La cantidad de proteína en la leche es un indicativo de su valor nutricional, así como de

las características organolépticas. Puesto que el nitrógeno representa en la mayoría de
las sustancias proteicas un porcentaje relativamente constante (alrededor del 16 %), su
determinación sirve como medida del contenido proteico en la leche.
El método para determinar la proteína se basa en la medición de la cantidad de

nitrógeno de la muestra a través del método estandarizado de Kjeldhal y la conversión
de nitrógeno a proteína, multiplicando el porcentaje de nitrógeno determinado por
6,38 (factor constante). Este método se fundamenta en la combustión en húmedo
de la muestra por calentamiento con ácido sulfúrico concentrado en presencia de
catalizadores para reducir el nitrógeno orgánico de la muestra hasta amoniaco, y este
queda en solución en forma de sulfato de amonio. El digerido, una vez alcalinizado, se
destila directamente o por arrastre con vapor para desprender el amoniaco, el cual es
atrapado y luego titulado para posterior determinación.

laboratorio, guantes de carnaza, monogafas, zapatos antideslizantes).

Se deben analizar muestras por duplicado por cada set de muestras analizadas; este
duplicado debe tener una desviación estándar de 0,038.
6. METODOLOGÍA
• No demorar para medir o pesar la muestra y mantener la mezcla siempre homogénea.
6.2 Digestión de la Muestra

• Adicionar a cada tubo que contiene la muestra, 15 g de sulfato de potasio (K2SO4) y
1 mL de solución de sulfato de cobre (CuSO4) al 5 % p/v.
• Pesar en balanza analítica 5,0 mL ± 0,1 mL de muestra de leche homogeneizada en
un tubo de digestión sin mojar las paredes. Registrar el peso de la muestra (Pm).
• Agregar cuidadosamente 25 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.
• Determinar la temperatura máxima de calentamiento con un ensayo previo
usando un quemador a gas o eléctrico precalentados (tome 250 mL de agua en un
Erlenmeyer y caliente el agua hasta ebullición en un tiempo de 5-6 minutos; esta
temperatura será la usada en el proceso de digestión).
• Colocar los tubos en posición inclinada con el sistema de expulsión de gases
encendido, iniciar a una temperatura baja y aumentar gradualmente para evitar
la formación de espuma. Digestionar por 20 minutos o hasta que aparezcan
humos blancos en los tubos. Llevar la temperatura del digestor a la mitad de
la temperatura más alta determinada en el paso anterior, y calentar por 15
minutos.
• Aumentar gradualmente la temperatura al máximo determinado y mantenerla
durante 1 hora o el tiempo necesario para que no se observen vapores dentro del
tubo y la solución que se encuentra dentro alcance un color verde claro. El tiempo
total de digestión es de 1,8 – 2,25 h.
• Finalizada la digestión, dejar enfriar los tubos hasta el fin de emisión de vapores
y a temperatura ambiente; luego retirar del digestor, empleando los guantes
de asbesto.

• Una vez fríos los tubos, agregar 300 mL de agua y agitar. La mezcla debe estar
fría antes de destilar (al agregar agua pueden formarse cristales y caer dentro de
la solución, esto es normal). Los tubos se pueden tapar y reservar para destilar
posteriormente.
Verificación de recuperación: Cada vez que se realice una determinación de proteína

se debe colocar una muestra con urea que pese 0,05 g y que esté bajo las mismas
condiciones que el resto de las muestras. Así mismo, se coloca una muestra control con
características determinadas.
6.2.1. Precauciones
• En la preparación de los reactivos hay que tener especial cuidado principalmente
en la preparación de la soda al 40 %, pues es altamente corrosiva, los vapores son
tóxicos y la reacción de la soda con el agua es altamente exotérmica.
• La determinación de proteína para las muestras de remuestreo debe realizarse por
duplicado.
6.3 Destilación de la Muestra:

• Encender el condensador de agua.
• Adicionar al Erlenmeyer de 500 mL, 50 mL de solución de H3BO3 con indicador.
• Conectar el Erlenmeyer a la punta del condensador asegurándose de que la punta
esté bajo la superficie de la solución indicadora.
• Al tubo con el digerido diluido agregar cuidadosamente 75 mL de NaOH 50 % sin
agitación.
• Inmediatamente conectar al bulbo de destilación.
• Agitar vigorosamente para mezclar el contenido.
• Calentar hasta que todo el NH3 haya sido destilado (>150 mL de destilado; volumen
total de 200 mL).
• Bajar el Erlenmeyer y dejar escurrir el líquido de la punta del condensador.
• Apagar el destilador.
6.4 Titulación de la Muestra
• Titular la solución de H3BO3 con ácido clorhídrico HCl 0,1 N al primer cambio de color
rosa.
• Registrar los mL de ácido clorhídrico (HCl) al 0,05 mL más cercano.
6.5 Verificación de la Recuperación del Nitrógeno
Ejecutar la recuperación de nitrógeno para comprobar la exactitud de los procedimientos

y del equipo.

a. Pérdida de nitrógeno. Pesar 0,12 g de sulfato de amonio y 0,85 g de sacarosa en
el tubo. Añadir todos los demás reactivos como se indica en la preparación de la
muestra. Digerir y destilar en las mismas condiciones que para una muestra de
leche. Las recuperaciones serán de al menos el 99 %.
b. Eficiencia de la digestión. Pesar 0,16 g de clorhidrato de lisina o 0,18 g de triptófano,

con 0,67 g de sacarosa por tubo. Añadir todos los demás reactivos como se indica en
la preparación de la muestra. Digerir y destilar un blanco en las mismas condiciones
que para una muestra de leche. Las recuperaciones serán de al menos el 98 %.
6.6 Titulación
Titular el destilado empleando la bureta digital con ácido clorhídrico 0,1 N hasta el viraje
de la solución azul claro a un primer trazo a color rosa claro. Registrar los mL de HCl al
0,05 más cercano.
6.7 Cálculos
Por medio de la siguiente relación se obtiene el porcentaje de proteína:
[(V - B) x N ] * ( fx 1.4007)
% PROTEINA (p/v) =
PM
Donde,
N = Normalidad de la solución de ácido clorhídrico previamente estandarizado.

V = Volumen en mL de ácido clorhídrico gastado en la titulación.
B = Volumen en mL de ácido clorhídrico gastado en la titulación del blanco.
F = Factor de conversión de nitrógeno a proteína cruda; para leche es 6,38.
PM = Peso de la muestra en gramos.
El resultado se debe presentar en porcentaje con aproximación de 0,1 g de nitrógeno /

100 g de muestra.
La diferencia máxima recomendada entre duplicados es 0,03 % de proteína.
Para hallar la concentración del ácido clorhídrico, emplear la siguiente fórmula:
V1 * C1
C2 =
V2
Donde,
C2 = Concentración real de ácido clorhídrico.

V1 = Alícuota tomada de ftalato de potasio.
C1 = 0,1
V2 = Volumen gastado en la titulación del ftalato de potasio.


Determinación de sólidos totales.
Método secado con aire forzado a 100 ºc
1. OBJETIVO
Determinar el contenido de sólidos totales en muestras de leche empleando el método
de secado con aire forzado a 100 ºC según la norma internacional AOAC 990.19.
2.1 Materiales
• Desecador provisto con desecante eficiente (sílica gel con indicador de humedad).
• Cajas de Petri de 100 x 15 mm: material de vidrio circular de 100 mm de diámetro
para permitir la difusión más uniforme de la muestra y 15 mm de alto sin tapa.
• Pipetas graduadas de 5,0 mL.
• Pipeteador.
• Pinzas metálicas para crisol.
• Marcador indeleble.
2.2 Equipos
• Balanza analítica de 210 g con precisión de 0,001 g.

• Baño de agua termostatado provisto de control de temperatura, entre 38 ºC ± 1 ºC
y 45 ºC ± 2 ºC.
• Horno de convección forzada con control digital de temperatura a 100 ºC ± 1 ºC.
• Cronómetro.
3. REACTIVOS
No aplica.

Los sólidos totales o extracto seco de la leche corresponden a los nutrientes disueltos y
suspendidos en el agua, representados principalmente por proteínas, grasa, minerales,
lactosa y vitaminas, y cuyo contenido es expresado en porcentaje en peso, obtenido
después de efectuada la desecación de la leche. En este procedimiento se describe
el método gravimétrico para la determinación de sólidos totales, que corresponde al
descrito en la norma internacional AOAC 990.19.
laboratorio, guantes, monogafas, zapatos antideslizantes).
5.2. Medidas de Aseguramiento de la Calidad
5.2.1. Duplicados de análisis de muestras

Se deben analizar muestras por duplicado por cada set de muestras analizadas. El
duplicado de la muestra debe tener una desviación estándar no mayor a 0,049.
6. METODOLOGÍA

en un baño de agua caliente a aproximadamente 38 ºC y seguir mezclando hasta
aproximadamente 20 ºC antes de transferir la porción analítica.
• No demorar para pesar o medir la muestra y mantener la mezcla siempre homogénea.
6.2 Preparación de las cajas de Petri
• Antes de iniciar el ensayo, es necesario precalentar el horno de secado por lo menos

30 minutos antes.
• Presecar la caja de Petri un tiempo ≥ a 2 horas en el horno de secado a 100 ºC ± 1 ºC.
• Cuando termine el tiempo de secado, llevar rápidamente a un desecador durante
30 minutos.

• Almacenar la caja de Petri en el desecador hasta que sea necesario (la caja de Petri
debe ser utilizada dentro de una semana o se debe volver a secar). Manipular la caja
de Petri solo con pinzas limpias y secas.
6.3 Pesaje de la Muestra
• Pesar la caja previamente presecada en la balanza analítica con aproximación de 0,1

mg, registrar el peso (Po) hasta peso constante y tarar la balanza.
• Pesar directamente en la caja 3,0 g de la muestra de leche a 20 ºC ± 1 ºC (anotar peso
con cuatro cifras decimales) en la balanza analítica. Registrar el peso (Pm).
• Retirar la caja de la balanza para llevarla al baño de María. Asegurarse de que la
balanza esté siempre en cero entre pesada y pesada.
6.4 Secado de la Muestra
• Colocar la caja de Petri con la muestra sobre la gradilla que se encuentra ubicada en
el baño de agua termostatado, permitiendo que el fondo de la caja quede cubierta
con el agua, y realizar un blanco con una caja vacía. Tener cuidado de que el baño no
esté demasiado lleno y ocasione que las cajas floten o se volteen.
• Presecar la muestra hasta que quede muy poca cantidad o hasta que no haya
movimiento de la misma y dejar allí por lo menos 25 minutos.
• Precalentar el horno a 100 ºC ± 1 ºC. En seguida, colocar todas las cajas de Petri
(incluyendo los blancos) en la bandeja del horno. Inmediatamente después de meter
todas las cajas en el horno, cerrar la puerta y permitir que alcance la temperatura
recomendada.
(Nota: No coloque ninguna otra cosa en el horno; esto impide que el calor circule
uniformemente alrededor de las cajas.)
• Dejar secar la muestra por 3 horas (el tiempo debe ser controlado con el cronómetro
digital que tiene incorporado el horno). Se recomienda que durante el tiempo de
secado de las muestras no se abra el horno.
• Pasado este tiempo, transferir la caja de Petri al desecador y enfriar la caja hasta
temperatura ambiente durante 30 minutos o más.
• Pesar la caja con el residuo seco en la balanza analítica y registrar el peso (Pf ).
(Nota: Al manipular las muestras, tener cuidado que las pinzas no entren en contacto con
la muestra.)
6.5 Cálculos y Resultados
Utilizar siempre los valores del blanco en el cálculo. El contenido de sólidos totales es
expresado como porcentaje en peso. Se calcula según la siguiente ecuación (el resultado
final se da con una aproximación de 0,01%):

( Pf - P0 ) - B
% Sólidos totales ( p/p ) = x 100
( Pm )
Donde,
P0 = Peso de la caja de Petri vacía en gramos.

Pf = Peso de la caja de Petri con el residuo seco en gramos.
Pm = Peso de la muestra en gramos.
B = Peso del blanco en gramos.
925.21 18th edición del 2005, cuarta revisión del 2011.

Determinación de grasa, proteína y sólidos
totales. Método Automatizado Infrarrojo
1. OBJETIVO
Determinar el contenido de proteína, grasa y sólidos totales en muestras de leche cruda
empleando el método automatizado Infrarrojo por espectrofotometría de análisis
infrarrojo según la norma internacional AOAC 972.16.
2.1 Materiales
• Papel absorbente
2.2 Equipos
• Equipo Infrarrojo.
• Computador con software para sistema Infrarrojo.
• Baño de agua termostatado.
3. REACTIVOS
• Solución de Ajuste de Cero.
• Solución o Agente de Limpieza.
4.1 Medidas de Seguridad
laboratorio, monogafas).

4.2 Medidas de aseguramiento de la calidad
4.2.1 Duplicados de análisis de muestras:
Se debe analizar muestras por duplicado por cada set de muestras analizadas. El
duplicado de la muestra debe tener una desviación estándar de la diferencia < a 0.02%
para grasa, proteína y < 0.04% para sólidos totales.
5. METODOLOGÍA
5.1. Preparación de la muestra
• Llevar el frasco con la muestra de leche a un baño de agua a 45ºC durante 15 minutos,
en donde la muestra alcanzara una temperatura de 39°C.
• Mezclar la muestra con ayuda de un agitador vórtex o mediante agitación manual
durante 30 segundos, para obtener una distribución homogénea de la grasa.
• Agitar con movimientos de mano formando un arco de 45º tres veces.
• Comprobar la temperatura con el termómetro digital (T = 39 ± 1ºC).
• Las muestras para análisis por Infrarrojo deben encontrarse en buenas condiciones.
No deben haber empezado de cuajar o separar y no deben contener suciedades o
partículas ajenas a la muestra.
5.2 Análisis de la muestra

• Analizar la muestra preparada operando el instrumento según las instrucciones del
fabricante.
5.3 Cálculos y resultados

• Los resultados del análisis automatizado de las muestras de leche cruda son
registrados automáticamente por el software del equipo.
6. ESPECIFICACIONES DE DESEMPEÑO
Las siguientes especificaciones de desempeño están basadas en el análisis de 8
muestras.
• Desviación estándar de la diferencia entre duplicados del instrumento:

Grasa, proteína < 0.02%
Solidos totales < 0.04%
• Diferencia promedio entre duplicados del instrumento:


• Desviación estándar de la diferencia entre resultados del instrumento y métodos de
referencia:
• Diferencia promedio entre resultados del instrumento y métodos de referencia:

7. CONTROL DE FUNCIONAMIENTO
Periódicamente se preparara una muestra control, a la cual se le realizaran análisis
mediante los métodos de referencia.
Diariamente se iniciara la lectura de las muestras pasando por el equipo la muestra

control mínimo por triplicado, se compararan estos resultados con los obtenidos por los
métodos de referencia y según los parámetros de desempeño anteriormente anotados,
adicionalmente la diferencia se reportara en la grafica de trazabilidad de resultados
como control al funcionamiento del equipo.
972.16. 1998. 16 Edición. 4 revisión. Capítulo 33. 972.16 ISO-IDF.
Instituto Colombiano de Normas Técnicas. ICONTEC. GTC 3 PARTE 1. G.S. Luis
Enrique; C.G. Carlos Eduardo; Manual de Métodos Fisicoquímicos para el
Control de Calidad de la Leche y sus Derivados. pp. 16-17.

Recuento de microorganismos mesófilos
aerobios (ac). método Placas 3M™ Petrifilm™
1. OBJETIVO
Determinar el número de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL) de
microorganismos mesófilos aerobios provenientes de células viables en leche cruda
empleando Placas 3M™ Petrifilm™, según la norma internacional AOAC método oficial
986.33 leche y productos lácteos.
2. DEFINICIONES
• Células viables. Son células activas metabólicamente, capaces de dividirse y dar
descendencia. Cada célula viable da origen a una colonia visible después del tiempo
adecuado de incubación.
• Unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL). Término que se emplea
para expresar el contenido de bacterias viables, asumiendo que una bacteria da
origen a una colonia. Es el término que debe utilizarse para reportar el recuento de
colonias en placa.
• Leche cruda. Leche que no ha sido sometida a ningún tipo de calentamiento; es
decir, su temperatura no ha superado la de la leche inmediatamente después de ser
extraída de la ubre (no más de 40 ºC).
• Placas 3M™ Petrifilm™. Medio de cultivo listo para utilizar que contiene los
nutrientes del Agar Standard Methods.
• Frascos de dilución autoclavables.
• Tubos de dilución de vidrio, estériles.
• Gradillas autoclavables.
• Puntas desechables de 5 mL y 10 mL, estériles.
• Dispersor o esparcidor de muestra.
• Recipiente para la extracción de muestra y medición del pH.

• Pipeta electrónica programable de 1 mL – 5 mL 3M.
• Pipeta automática de 10 a 100 µl.
• Pipeta automática de 1 a 10 mL.
• Pipeta automática de 1 mL.
• Refrigerador para medios de cultivo y reactivos a 0 ºC – 6 ºC.
• Refrigerador para muestras a 0 ºC – 6 ºC.
• Cabina de flujo laminar.
• Incubadora programada a 32 ºC.
• Potenciómetro.
• Lector sistematizado de Placas 3M™ Petrifilm™.
• Autoclave para material limpio.
• Autoclave para material sucio.
4. REACTIVOS
• Placas de recuento de mesófilos aerobios Placas 3M™ Petrifilm™.
• Agua peptonada al 0,1 % estéril.
• Solución 0,1 N de HCl estéril.
• Solución 0,1 N de NaOH estéril.
• Solución de alcohol etílico al 70 %.
Las placas de recuento de mesófilos aerobios Placas 3M™ Petrifilm™ son un medio de
cultivo listo para utilizar que contiene los nutrientes del Agar Standard Methods, un
agente gelificante soluble en agua fría y un tinte indicador de color rojo (tetrafenil
tetrasolium clorado TTC) para facilitar el recuento de colonias. Las Placas 3M™ Petrifilm™
AC se utilizan para el recuento de la población de bacterias mesófilas en productos.
• Desinfectar en la cabina de flujo laminar la tapa del frasco y sus alrededores con
solución de alcohol etílico al 70 %.
• Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogeneización antes de preparar

las diluciones.
• Abrir asépticamente y adecuadamente la muestra.

7. METODOLOGÍA
7.1 Preparación de Diluciones
7.1.1 Dilución 10-1
• Transferir 10 mL de la leche con una transferpipeta S a un frasco de dilución que

contenga 90 mL de agua peptonada al 0,1 %. Descartar la punta.
• Mezclar muy bien la muestra y asegurar su homogeneización.
• Dejar en reposo un minuto.
7.2 Preparación de Diluciones

7.2.1. Dilución 10-2
Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogeneización de la dilución 10-1.
Extraer con la transferpipeta S, 4,5 mL de agua peptonada al 0,1 %. Inmediatamente

después, empleando la pipeta automática, tomar 0,5 mL de la dilución 10-1. Adicionar
esta mezcla a un tubo de dilución estéril. Descartar la punta.


Extraer con la transferpipeta S, 4,5 mL de agua peptonada al 0,1 %; inmediatamente
esta mezcla (5mL) a un tubo de dilución estéril. Descartar la punta.

7.3. Inoculación de Diluciones
• Servir 1 mL en la Placa 3M™ Petrifilm™ previamente identificada con el código de la

muestra y la dilución correspondiente a la siembra.
• Colocar la Placa 3M™ Petrifilm™ en una superficie plana y levantar la película superior.

• Colocar 1 mL de la dilución en el centro de la película cuadriculada inferior
empleando la pipeta.
• Liberar la película superior dejando que caiga sobre la dilución y asegurándose
de que no queden burbujas entre la película y la muestra. No se debe deslizar la
muestra hacia abajo.
• Tomar el dispersor o esparcidor con el lado rugoso hacia abajo y colocarlo sobre la
película superior de la placa, cubriendo totalmente la muestra; presionar suavemente
para distribuir la muestra sobre el área circular. No girar ni deslizar el dispersor. Se
debe distribuir la muestra antes de inocular la siguiente placa.
• Levantar el dispersor o esparcidor. Esperar por lo menos un minuto a que se
solidifique el gel y proceder a la incubación.
• Repetir este procedimiento para cada una de las diluciones.
• Incubar cada una de las placas cara arriba en grupos de no más de 20 piezas, a una
temperatura de 32 ºC durante 48 ± 3 h.
7.4. Controles
• Control de esterilidad del agua peptonada al 0,1 %. Se inocula en una placa 1 mL
de agua peptonada y se incuba. Se realiza control a cada lote de agua esterilizado.
• Control de ambiente de cabina de flujo laminar. Se debe realizar antes de comenzar
la jornada de trabajo, así: ubicar la Placa 3M™ Petrifilm™ en el área de actividad de
siembra (no a un lado); separar las dos láminas que conforman la placa de Petrifilm y,
previamente hidratadas con agua peptonada al 0,1 %, dejarlas al aire por 30 segundos;
cerrar ambas láminas e incubar a una temperatura de 32 ºC durante 48 ± 3h.
• Registrar los resultados de los controles en el formato ‘Controles diarios de esterilidad
mesófilos aerobios’.
7.5. Interpretación de Resultados y Cálculo

• Las Placas 3M™ Petrifilm™ para el recuento de AC pueden utilizarse para el conteo
estándar de colonias. Para ello se enumeran todas las colonias de color rojo sin tomar
en cuenta su intensidad y tamaño, se seleccionan las placas correspondientes que
presenten entre 30-300 colonias, y se cuentan todas las colonias de la placa.
• El área de crecimiento circular es aproximadamente 20 cm2. Esta área puede ser
estimada sobre las placas que contengan un crecimiento de 300 colonias en dos
o más cuadros representativos, determinándose además un número promedio
por centímetro cuadrado (multiplique el número promedio por 20 y determine el
conteo estimado para cada placa).
• Las altas concentraciones de colonias sobre las Placas 3M™ Petrifilm™ para recuentos
aerobios AC, pueden desarrollarse sobre los bordes. Cuando esto ocurra, tome la
dilución siguiente.
• Algunos organismos pueden licuar el gel, permitiendo que este se separe y
oscurezca la presencia de otras colonias. Si el gel afectado causa interferencia en la
enumeración, se tendrá que realizar un conteo estimado de las áreas no afectadas.

• Si la placa no puede contarse en la hora adecuada, remuévala de la incubadora y
almacénela en el congelador en un contenedor sellado para enumeración posterior.
• Si no hay colonias en la placa correspondientes a la dilución de mayor concentración,
se debe informar el recuento como menor a 1, multiplicado por el factor de dilución
más concentrada.
7.5.1. Captura de resultados

• El software del lector de Placas 3M™ Petrifilm™ tiene la opción de transferir los datos
a Excel. Se reporta como “UFC/mL” en el formato ‘Reporte de mesófilos aerobios
Petrifilm (AC)’.
• En el conteo manual, reportar como “UFC/mL” en el formato ‘Reporte de resultados
recuento de mesófilos aerobios (SPC)’ solamente los primeros dos dígitos de manera
significativa, redondeando por encima cuando el tercer dígito sea mayor o igual a 6 o
redondeando al número anterior cuando el tercer dígito sea menor o igual a 5.
7.5.2. Reporte de resultados

Los datos se registran en el formato de captura de datos y se procede a hacer el informe
correspondiente.
7.6. Entrega de Muestras al Laboratorio Fisicoquímico

• Las muestras de leche que han sido procesadas en el laboratorio de microbiología
y a las cuales se les deba efectuar análisis fisicoquímicos, deben ser enviadas al
laboratorio fisicoquímico para completar los análisis.
• Si las muestras son por duplicado, es preciso enviar un frasco inmediatamente,
luego de diligenciar el formato ‘Entrega de muestras al laboratorio fisicoquímico’ y
entregar las muestras a dicho laboratorio.
986.33 leche y productos lácteos.
Guías de interpretación de Placas 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plate.
Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos Invima. Manual de
técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para
consumo.
Norma Técnica Colombiana NTC 4491:2004. Microbiología de alimentos y alimentos
para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y
diluciones decimales para análisis microbiológico.
Norma Técnica Colombiana TNC 399:2002. Leche cruda.

Recuento de microorganismos aerobios
mesófilos. Método UNE-EN ISO 4833 : 2003
CÓDIGO: 074 • VERSIÓN: 00 • FECHA APROBACIÓN: 06-02-2013
1. OBJETIVO
Determinar el número de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL) de
Microorganismos Aerobios Mesófilos Mediante Método Tradicional de Cultivo: UNE-EN
ISO 4833:2003.
2. DEFINICIONES
• Unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL): Término que se emplea
para expresar el contenido de bacterias viables, asumiendo que una bacteria da
origen a una colonia. Es el término que debe utilizarse para reportar el recuento de
colonias en placa.
• Suspensión inicial (dilución base): Suspensión. disolución o emulsión obtenida
cuando un peso o volumen determinados del producto en examen (o de una
muestra de ensayo preparada a partir del producto) ha sido mezclado con una
cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las partículas grandes, si
las hubiera, queden sedimentadas.
• Diluciones decimales sucesivas: Suspensiones o disoluciones obtenidas al
mezclar un volumen determinado de la suspensión inicial con un volumen nueve
veces superior de disolvente, y repitiendo esta operación con diluciones decimales
sucesivas hasta llegar a un nivel de dilución adecuado para la inoculación del
medio de cultivo.
• Frascos de dilución autoclavables.
• Tubos de dilución de vidrio, estériles.
• Gradillas autoclavables.
• Puntas desechables 1 mL y 10 mL. Estériles.
• Pipeta automática de 1 a 10 mL.
• Pipeta Automática 1 mL.

• Cajas de Petri de vidrio o plástico y de 90 mm a 100 mm de diámetro.
• Refrigerador para medios de cultivo y reactivos a 0 – 6º C.
• Refrigerador para muestras a 0 – 6º C.
• Cabina de flujo laminar.
• Incubadora programada a 30±1 ºC.
• Potenciómetro.
• Autoclave para material limpio.
• Autoclave para material sucio.
• Cuenta Colonias.
• Vortex agitador
4. Reactivos
• Agar para recuento en placa SPC: Digerido enzimático de caseína 5,0 g;
Extracto de levadura; 2,5 g Glucosa 1,0 g; agar de 9 a 18 g; Agua 1000 mL
(Cuando se examinan productos lácteos: añádase 0.1 g de leche en polvo
desnatada por litro de medio de cultivo.)
• Disolución Salina de Peptona: (peptona 1,0 g; Cloruro Sódico 8,5; 1000 mL
agua).
• Solución de Alcohol Etílico al 70%.
4.1 Principio de método

este método es utilizado para determinar el número de unidades formadoras de
colonias (UFC) de microorganismos por mililitro o gramo que tienen su temperatura
optima de crecimiento entre 15 – 35 ºC, este recuento es considerado un indicador de
calidad higiénica ya que incluye todos los géneros aerobios y facultativos que crecen en
medios simples.
El método consiste en sembrar en profundidad dos placas empleando un medio de
cultivo determinado y una cantidad determinada de la muestra para análisis si el
producto es líquido; o empleando una cantidad determinada de una suspensión inicial
en el caso de otros productos.
Se preparan otros pares de placas en profundidad, bajo las mismas condiciones,
empleando diluciones decimales de la muestra para análisis o de la suspensión inicial. Las
placas se incuban aeróbicamente a 30 °C durante 72 h. El número de microorganismos
por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir del número de colonias obtenidas
en placas seleccionadas
• En la cabina de flujo laminar desinfectar la tapa del frasco y sus alrededores con
solución de alcohol etílico al 70%.
• Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogenización antes de
preparar las diluciones.
• Abrir asépticamente y adecuadamente la muestra.

6. METODOLOGÍA
6.1 Porción para análisis, suspensión inicial y diluciones
Pesar o medir en un recipiente estéril una masa (m) de 10g o un volumen (v) de Volumen
de 10 ml que sean representativos de la muestra de ensayo precisión de la medida será
del 5%.
Añadir una cantidad de disolvente igual a 9 x (m) g ó a 9 x (v) ml. Esta cantidad con una
precisión del 5%.
Para evitar que los microorganismos resulten dañados por cambios bruscos de
temperatura, la temperatura el disolvente durante las operaciones indicadas más
adelante deberá ser aproximadamente la misma que la temperatura de entorno.
6.2 Diluciones decimales sucesivas:

• Introducir en un tubo que contenga 4.5 mL de disolvente estéril, 0.5 mL de suspensión
inicial con una pipeta equipada con una punta estéril. Mezclar exhaustivamente,
preferiblemente haciendo uso del agitador ente 5 s y 10 s, para obtener una dilución 10-2.
Nota: Para conseguir una precisión óptima, no deberán introducirse las pipetas
más de 1 cm dentro de la suspensión inicial.
Evitar todo tipo de contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el
disolvente estéril.
• Si es necesario repetir estas operaciones utilizando la dilución de 10-2 y las diluciones

sucesivas utilizando una pipeta estéril en cada paso de dilución, obteniéndose las
diluciones 10-3, 10-4, etc., hasta que el número de microorganismos que se obtenga
fuese el adecuado.
Nota: Para restringir el rango de recuento a un intervalo definido, o si se previera
la presencia de un gran numero de microorganismos es posible solo inocular las
diluciones decimales adecuadas necesarias (al menos dos diluciones sucesivas)
que se necesitan par la determinación del numero de microorganismos)
• El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el

momento en el que el inóculo esta en contacto con el medio de cultivo no deberá
ser superior a 45 min, limitándose a 30 min el tiempo entre la preparación de la
suspensión inicial (10.1) y el comienzo de la preparación de las siguientes diluciones
decimales (10.2).
6.3 Siembra e incubación

• Se toman dos cajas de Petri estériles y mediante una pipeta estéril, se transfieren a
cada caja 1 ml de la suspensión inicial (dilución 10-1).
• Se toman otras dos cajas Petri estériles y mediante otra pipeta o punta estéril, se
transfieren a cada caja 1 ml de la dilución 10-2.
• Si es necesario, se repite el procedimiento con mas diluciones, empleando una
nueva pipeta para cada dilución decimal.

• Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas
(por [o menos dos diluciones decimales consecutivas para la siembra de las caja
Petri que den recuentos de colonias ente 15 y 300 colonias por caja.
• Se vierten aproximadamente de 12 ml a 15 ml de agar para recuento en caja ente 44
°C y 47 °C en cada una de las cajas de Petri. El tiempo transcurrido ente el final de la
preparación de la suspensión inicial (o de la dilución 10-1) y el momento en el que el
medio se vierte en las cajas no debe superarlos 45 min.
• Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio mediante rotación de las cajas
Petri y se permite solidificar la mezcla dejando reposar las placas Petri en una
superficie horizontal fresca.
• Después de que se haya completado la solidificación y, sólo en el caso en el que
se sospeche que el producto que se esté examinando contiene microorganismos
cuyas colonias sobrecrecerán en la superficie del medio. Se vierten unos 4 ml del
medio de recubrimiento entre 44°C y 47 °C en la superficie del medio inoculado. Se
deja solidificar como se describió anteriormente.
• Las cajas de Petri preparadas se invierten y se sitúan en la estufa a 30°C ± 1 °C
durante 72h ± 3h. No se deben apilar más de seis placas una encima de la otra. Es
conveniente que las pilas de placas estén separadas una de otra y de las paredes y
parte superior de la estufa.
6.4 Recuento de colonias

• Después del periodo de incubación especificado, se cuentan las colonias de
las placas Empleando si fuera necesario el equipo de recuento de colonias. Se
examinan las placas bajo luz tenue. Seria importante que las colonias en punta
de alfiler sean incluidas en el recuento, pero es esencial que la persona que
realiza la lectura evite confundir las partículas no disueltas o precipitadas con
colonias en punta de alfiler. Se examina con atención los elementos dudosos,
empleando una lupa cuando sea necesario, con el objeto de diferenciar las
colonias de partículas extrañas.
• Las colonias invasoras deben ser consideradas como una sola colonia. Si menos de
un cuarto de la placa está invadida por dichas colonias, se cuentan las colonias de
la parte no afectada de la placa y se calcula el número correspondiente a la placa
entera. Si está invadido más de un cuarto de la placa, se desecha el recuento.
6.5 Expresión de los resultados

Método de cálculo
Los casos considerados en este apartado son casos generales:
• Inoculación de una placa de Petri de 90 mm de diámetro por cada dilución

• Recuento máximo de colonias totales presentes: 300 por placa,
• Número mínimo total de colonias (típicas y atípicas) de una placa cuando se
recuentan colonias típicas y colonias sospechosas: preferiblemente 300 por placa.

Los métodos de cálculo indicados a continuación corresponden a los casos que se
presentan con mayor frecuencia cuando los análisis se realizan siguiendo unas buenas
prácticas de laboratorio. Ocasionalmente, pueden producirse excepciones (por ejemplo,
que los factores de dilución de dos diluciones consecutivas sean diferentes), por lo que
resulta necesario que los resultados del recuento sean examinados e interpretados por
un microbiólogo cualificado, y en su caso, rechazados.
Método de cálculo: caso general (recuento de colonias totales o colonias típicas)
Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de
colonias se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10 colonias
[colonias totales, colonias típicas o colonias que cumplan los criterios de identificación.
El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula como
la media corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la ecuación:
Σc = Es la suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones
consecutivas, de la cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias:
V = es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
d = Es la dilución correspondiente a La primera dilución escogida [d = 1 cuando se
utiliza en el producto liquido sin diluir (para muestras liquidas).
El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta

operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior; si la tercera cifra
es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad preferiblemente.
El resultado se expresa como un número ente 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de
10 adecuada, o como un número entero con dos cifras significativas.
El resultado se expresa como número de microorganismos N por mililitro (para los
productos líquidos) o por gramo (para el resto de productos).
EJEMPLO el recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
• Para la primera dilución escogida (10-2): 168 colonias;
• Para la segunda dilución escogida (10-3): 14 colonias
Redondeando el resultado como se indico anteriormente, el número de microorganismos

es de 17 17000 o 1.7 x 104 por mililitro o por gramos de producto.
Precisión
• Generalidades. Los datos de precisión han sido calculados para placas que contienen
más de 15 y menos de 300 colonias. Los datos de precisión dependen de la flora en

asociación y de la matiz de la muestra. Los datos presentados se derivan de estudios
en colaboración y son válidos para leche cruda y pasterizada. Pueden utilizarse como
estimación en el caso de recuentos en otros productos.
• Repetitibilidad. La diferencia absoluta ente dos resultados analíticos individuales
independientes, obtenidos empleando el mismo método sobre material analítico
idéntico, en el mismo laboratorio, por el mismo analista y empleando el mismo
equipo en un intervalo de tiempo corto, no debería ser mayor que el limite de
repetitibilidad .r =0,25, en log10 microorganismos por mililitro correspondiente a 1,8
en la escala normal de microorganismos por mililitro).
• Reproducibilidad. La diferencia absoluta ente dos resultados analíticos individuales,
obtenidos empleando el mismo método sobre material analítico idéntico. En diferentes
laboratorios, por analistas diferentes y empleando equipos diferentes, no debería ser
mayor que el limite de reproducibilidad. r =0,45 en log10 microorganismos por mililitro
(correspondiente a 2,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro).
Interpretación de los resultados analíticos

En los siguientes ejemplos, se consideran los datos promedio de Ia precisión, un nivel de
probabilidad del 95% y el análisis de una muestra. Se debería tener en cuenta que, en la
práctica, se emplea a menudo el promedio de varias muestras Las cifras se expresan en
microorganismos por mililitro
a)Condiciones de repetitibilidad
Primer resultado: 10-5 100.000
La diferencia ente el primer y segundo resultado no debería ser superior a 0,25
unidades log10.
Segundo resultado: Log 104,75 = 56.000 ó
Log 10 5,25= 178.000
La diferencia ente el primer y segundo resultado es aceptable si el segundo
resultado no menor a 56.000 o no es superior a 178.000.
b) Condiciones de reproducibilidad
Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinación
duplicada): 10-5 = 100.000
La diferencia ente el primer y segundo resultado obtenido en el segundo

laboratorio no debería ser superior a 0,45 unidades log10.
Segundo resultado: Log 104,55 = 36 000, ó

Log 105,45 = 280 000
La diferencia ente los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es

aceptable, si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 36
000 y no es superior a 280 000.

UNE-EN ISO 4833:2003: Microbiología de los alimentos para consumo humano y

animal. Método horizontal para el recuento de microorganismos: Técnica de
recuento de colonias a 30 °C.
UNE-EN ISO 7218:2008: Microbiología de los alimentos para consumo humano y
animal. Requisitos generales y guía para el examen microbiológico.

Protocolo recuento de bacterias mesofilas
aerobias. Método de Citometría de Flujo
CÓDIGO: _______ • VERSIÓN: 00 • FECHA APROBACIÓN: _________
1. OBJETIVO
Determinar el conteo de microorganismos Mesófilos Aerobios presentes en muestras
de leche cruda empleando un equipo con tecnología de citometría de flujo.
2. DEFINICIONES
Citometría de Flujo: técnica de análisis celular multiparamétrico que se fundamente en
hacer pasar una suspensión de partículas alineadas una en una por delante de un haz
de laser focalizado. (3)
Bromuro de Etidio: Bromuro de 2,7-Diamino-10-etil-6-fenilfenantridinio es un agente

intercalante comunmente empleado para teñir ácidos nucleicos en diversas técnicas
moleculares y citogenéticas. Es un compuesto mutagénico conocido. (4)
3.1. Materiales
• Paño seco.
• Bidones plásticos de 20L para la recolección de residuos.
• Plancha de calentamiento
• Balón aforado
• Frascos schott
• Agitador magnético
• Probeta
• Micropipeta
• Guantes de Nitrilo
3.2. Equipos
• Equipo automatizado con principio de citometría de flujo.

4. REACTIVOS
• Alcohol 70%.
• Los especificados por el fabricante
El equipo utiliza la tecnología de citometría de flujo que permite analizar de forma
rápida y precisa las bacterias presentes en la leche. Este equipo fue diseñado para la
determinación rápida, fiable y completamente automatizado de la calidad higiénica de
la leche cruda. El analizador cuenta el número total de Células Bacterianas Individuales
( IBC) en una muestra láctea.
El equipo tiñe las bacterias con un colorante fluorescente (bromuro de etidio) reduce
y dispersa los componentes lácteos, de modo que es posible contar las bacterias.
Un detector detecta la luz emitida por las bacterias, cuando un hilo fino de muestra
atraviesa una célula de flujo pasando bajo el detector. Los pulsos de luz se convertirán
en pulsos electrónicos y se contarán y se visualizan en un PC.
Para evitar la interferencia de otras partículas, tales como glóbulos grasos, micelas de
proteína y células somáticas, la muestra será sujetada a un tratamiento químico para
destruir estas partículas. Además, el analizador rompe la agrupación de bacterias. El
analizador ejecutará automáticamente este tratamiento. (2) La lectura se reporta como
el número individual de bacterias IBC/µl y por medio de una relación de conversión el
equipo convierte este recuento a UFC/mL.
• Manipular adecuada y asépticamente la muestra.
• Garantizar que se mantenga la cadena de frio de la muestra de 0 a 6°C
• Mezclar homogéneamente la muestra antes de realizar la medición.
7. METODOLOGÍA
• Limpiar la superficie del recipiente de la muestra con un paño impregnado con
alcohol al 70%.
• Mezclar homogéneamente la muestra.
• Destapar y Disponer la muestra bajo la pipeta de succión del equipo para el análisis.
• Seguir las instrucciones de operación del equipo de acuerdo al instructivo.

8. REPORTE DE RESULTADOS
Teniendo en cuenta que la normatividad existente sobre calidad higiénica de la leche
reporta en Unidades Formadoras de Colonia sobre mililitro, se hace necesario realizar
una relación de conversión que permita transformar las IBC/µl arrojadas por el equipo
en UFC/ml.
9. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO
Repetibilidad: Cada control de repetibilidad consiste de dos o más (hasta 20) recuentos
repetidos del mismo frasco con la desviación estándar computada. La repetibilidad
deberá ser calculada sobre muestras dentro de la misma gama de medición más o
menos, ya que esta varía mucho a los diferentes niveles de recuento. Las especificaciones
de repetibilidad para el equipo se dan a 3 gamas diferentes:
Gama (IBC/µl) Desviación estándar (unidades log) Valores típicos

10 - 50 0,08 0,06
51 - 200 0,06 0,05
> 200 0,05 0,03
La cantidad mínima de muestras en cada gama de recuento deberá ser de 10, y la

formula que se deberá emplear es la siguiente:
Donde X = resultado y n =aspiraciones
Para llevar a cabo el control de Repetibilidad se deberán seguir las instrucciones del
fabricante del equipo.
Reproducibilidad: Es una medida de la variación entre determinaciones efectuadas

en laboratorios diferentes sobre la misma muestra. Para esto el laboratorio participa en
pruebas Interlaboratorios, en donde se analizan las mismas muestras de leche.
Desviaciones: para determinar las desviaciones del recuento que se producen en el

laboratorio se deben disponer materiales de referencia.

Producción editorial:
Diagramación, impresión y encuadernación
Tel: 893 7710 Bogotá, DC, Colombia

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hacen análisis de leche cruda

VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

© Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Corpoica

Línea de atención al cliente: 018000121515

Determinación de proteína. Método Kjeldahl 10

Determinación de proteína. Método Kjeldahl (método manual) 15

Determinación de sólidos totales. Método secado con

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 3

Recuento de microorganismos mesófilos aerobios (ac).

Recuento de microorganismos aerobios mesófilos.

Protocolo recuento de bacterias mesofilas aerobias.

4 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

Este documento hace parte de la actividad que tiene

Esta actividad se halla dentro del convenio 20120289 del

Además se busca asegurar una oferta de laboratorios que

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 5

6 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

4.2 Medidas de Aseguramiento de la Calidad

• Llevar el frasco con la muestra de leche a un baño de agua a 20 ºC aproximadamente,

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 7

Tabla 2000.18B. Velocidad de centrifugado

8 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

5.4 Cálculos y Resultados

% Grasa (p/p) = (Lectura Superior - Lectura Inferior)

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 9

• Tubos de digestión de 250 mL de capacidad.

• Balanza analítica con precisión de 0,001 g.

10 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

(Nota: Tome 2 g de ftalato de potasio y colóquelos en el horno de convección de aire

• Sulfato de amonio (NH4)2SO4 99,9 %.

El método para determinar la proteína se basa en la medición de la cantidad de

5.1. Medidas de Seguridad

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 11

• Llevar el frasco con la muestra de leche a un baño de agua a 20 ºC aproximadamente,

6.2 Digestión de la Muestra

12 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

6.3. Destilación de la Muestra

6.4 Titulación de la Muestra

6.5 Verificación de la Recuperación del Nitrógeno

a. Pérdida de nitrógeno. Pesar 0,12 g de sulfato de amonio y 0,85 g de sacarosa en

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 13

N = Normalidad de la solución de ácido clorhídrico previamente estandarizado.

El resultado se debe presentar en porcentaje con aproximación de 0,1 g de nitrógeno /

C2 = Concentración real de ácido clorhídrico.

14 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

• Balanza analítica con precisión de 0,001 g.

• Ácido sulfúrico 95 % – 98 % (densidad 1,84 g/mL, libre de nitrógeno).

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 15

(NOTA: Tome 2 g de ftalato de potasio y colóquelo en el horno de convección de aire

• Sulfato de amonio (NH4)2SO4 99,9 %

La cantidad de proteína en la leche es un indicativo de su valor nutricional, así como de

El método para determinar la proteína se basa en la medición de la cantidad de

• Utilizar siempre los elementos de protección personal adecuados (bata de

16 VINCULACIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TECNOLOGÍA

6.2 Digestión de la Muestra

Metodologías de análisis normalizadas para la red de laboratorios lácteos 17

Verificación de recuperación: Cada vez que se realice una determinación de proteína

6.3 Destilación de la Muestra:

6.4 Titulación de la Muestra

6.5 Verificación de la Recuperación del Nitrógeno

Ejecutar la recuperación de nitrógeno para comprobar la exactitud de los procedimientos