TÉCNICAS DE ANÁLISIS HEMATOLÓGICO

UD 1. TÉCNICAS DE TINCIÓN.

1. INTRODUCCIÓN.
La hematología abarca el diagnóstico, tratamiento, estudio e investigación de la sangre y los
órganos hematopoyéticos (productores de sangre). La observación con el microscopio de
las células de la sangre y de las que las originan, localizadas en el interior de los huesos
(médula ósea), son el pilar fundamental de la hematología, ya que permite detectar de
forma rápida y fácil un enorme número de enfermedades. Para ello, es fundamental la
correcta extracción, procesado y tinción de las muestras, así como el conocimiento del
aspecto (morfología) de las células normales.

Junto con el examen morfológico de las células, el diagnóstico de las enfermedades de la

sangre se apoya en una técnica que permite conocer datos de miles de células, una a una,
en un tiempo muy breve, esta técnica se denomina citometría de flujo. Un tercer pilar
necesario, y de importancia creciente para estudiar las enfermedades de las células de la
sangre, es la genética, tanto a nivel cromosómico como molecular.

2. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA SANGRE.

2.1. Funciones.
La sangre es un vehículo líquido de comunicación vital entre los distintos tejidos del
organismo. Entre sus funciones, destacan:
- Respiratoria: transporte de oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos y de
dióxido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones.
- Nutritiva: mediante el aporte de sustancias procedentes de la digestión.
- Inmunitaria o defensiva: protegiendo el organismo gracias a la presencia de
leucocitos o glóbulos blancos.
- Excretora: recogiendo los residuos y desechos para ser eliminados.
- Transportadora: de las secreciones y hormonas producidas por las distintas
glándulas.
- Reguladora: manteniendo en equilibrio el agua del organismo, la temperatura
corporal, etc.

2.2. Composición.
La sangre es un tejido líquido que circula por las arterias, venas y capilares del organismo.
La sangre es roja brillante o escarlata cuando ha sido oxigenada en los pulmones y pasa a
las arterias y adquiere una tonalidad más azulada cuando ha cedido su oxígeno para nutrir
los tejidos del organismo y regresa a los pulmones a través de las venas y de los pequeños
vasos denominados capilares. En los pulmones, la sangre cede el dióxido de carbono que
ha captado procedente de los tejidos y recibe un nuevo aporte de oxígeno, iniciando un
nuevo ciclo. Este movimiento circulatorio de sangre tiene lugar gracias a la actividad
coordinada del corazón, los pulmones y las paredes de los vasos sanguíneos.

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La sangre tiene un olor característico y una densidad relativa que oscila entre 1,056 y 1,066
(relacionada con la cantidad de eritrocitos). En un adulto sano el volumen de sangre
(volemia) representa aproximadamente el 7-8% del peso corporal. Así, se considera, que
un adulto tiene un volumen de sangre de aproximadamente 5 litros.

La sangre consta de una parte líquida, el plasma sanguíneo, que representa el 55%, y una
fracción celular (elementos formes), que incluye a los eritrocitos, los leucocitos y las
plaquetas, que constituyen alrededor del 45%.

2.2.1. Plasma.
El plasma sanguíneo es la porción líquida de la sangre, en la que están inmersas las
células. Es un líquido amarillento, cuyo principal componente es el agua (91%). También
contiene proteínas plasmáticas, sustancias inorgánicas (sodio, potasio, cloruro de calcio,
carbonato y bicarbonato), azúcares, hormonas, enzimas, lípidos, aminoácidos y productos
de degradación como urea y creatinina, todas estas sustancias aparecen en pequeñas
cantidades.

En condiciones normales, las proteínas del plasma constituyen el 7-9% del plasma,
podemos distinguir:
- Las albúminas son las más pequeñas y abundantes y representan
aproximadamente el 60% de las proteínas del plasma. Son las responsables de la
mayor parte de la presión osmótica (presión oncótica) que regula el paso de agua y
solutos a través de los capilares. Por consiguiente, controla su tendencia a
difundirse a través de las paredes de los vasos sanguíneos
- Las globulinas representan aproximadamente el 40% de las proteínas del plasma.
Hay muchos tipos, entre los que encontramos las gammaglobulinas, los anticuerpos,
que resultan fundamentales en la defensa del organismo frente a las infecciones.
- El fibrinógeno y la protrombina, participan en la coagulación.
- Las aglutininas, que producen las reacciones de aglutinación entre muestras de
sangre de tipos distintos y la reacción conocida como anafilaxis, una forma de shock
alérgico.
- Otras proteínas plasmáticas importantes actúan como transportadores de nutrientes
esenciales como el cobre, el hierro, otros metales y diversas hormonas, hasta los
tejidos.

Los componentes del plasma se forman en varios órganos del cuerpo, incluido el hígado,
responsable de la síntesis de albúmina y fibrinógeno, que libera sustancias tan importantes
como el sodio, el potasio y el calcio. Las glándulas endocrinas producen las hormonas
transportadas en el plasma. Los linfocitos y las células plasmáticas sintetizan ciertas
proteínas y otros componentes proceden de la absorción que tiene lugar en el tracto
intestinal.

Distinguimos entre plasma y suero: el plasma es la parte líquida de la sangre sin coagular;
y el suero es el líquido sobrenadante que queda cuando la sangre total se coagula, por lo
que tiene una composición similar a la del plasma, aunque sin fibrinógeno ni otros factores
de la coagulación.

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2.2.2. Eritrocitos.
Los eritrocitos, también llamados glóbulos rojos o hematíes, son las células más
numerosas de la sangre, constituyen aproximadamente el 96% de los elementos formes de
la sangre, existiendo de 4,5 a 6 millones/mm3 en hombres y entre 4 a 5,5 millones/mm3
en mujeres.

Tienen forma de discos redondeados, bicóncavos, con un

diámetro aproximado de 7,5 micras. Se forman y maduran en la
médula ósea. En el proceso de maduración pierden su núcleo
y una buena parte de los orgánulos (en el ser humano y la
mayoría de mamíferos), a fin de que su citoplasma pueda estar
ocupado, casi en su totalidad, por la hemoglobina, una proteína
especializada en transportar oxígeno. Además, su forma
bicóncava también contribuye a aumentar la superficie efectiva de membrana favoreciendo
una mayor difusión de oxígeno.

La principal función de los eritrocitos es la de transportar la hemoglobina, y en

consecuencia, llevar oxígeno desde los pulmones a los tejidos. La hemoglobina cuando
está saturada de oxígeno adquiere un color rojo intenso, el mismo que otorga a los
eritrocitos que la contienen, esta coloración se va tornando más oscura conforme va
disminuyendo el número de moléculas de O2 unidas a ella.

Desde su formación en la médula ósea, los glóbulos rojos tienen una vida media de 120
días, y finalmente, se destruyen en el bazo y en el hígado.

2.2.3. Leucocitos.
Los leucocitos, o glóbulos blancos de la sangre, se generan en la médula. Estas células
son las principales responsables del control de las infecciones, ya que atacan de manera
directa a los antígenos, o sustancias extrañas al organismo. Cuando se trasplanta un
órgano, los linfocitos suelen atacar a los tejidos trasplantados, causando el rechazo del
trasplante.

La formación y destrucción de los leucocitos es continua y su concentración en la sangre

depende del equilibrio entre formación y destrucción. Hay variaciones normales a lo largo de
la vida en cuanto al número y porcentaje de leucocitos. El conteo normal de leucocitos está
entre 4.500 y 11.500 células/mm3 de sangre, aunque puede variar en función de las
condiciones fisiológicas del individuo (embarazo, estrés, edad…) y su estado patológico
(infección, cáncer, inmunosupresión…).

Existen diferentes tipos de leucocitos, según las características de tinción de su citoplasma

y la morfología de su núcleo, se dividen en:
- Granulocitos o células polimorfonucleares: poseen un núcleo polimorfo
(multilobulado) y numerosos gránulos en su citoplasma, los cuales se tiñen de
diferente coloración en los distintos subtipos. Incluye a los neutrófilos, basófilos y
eosinófilos.
- Los neutrófilos: representan el 60 % del total de los leucocitos circulantes.
Deben su nombre a que su citoplasma no se tiñe con colorantes acidófilos
como la eosina ni con colorantes basófilos como el azul de metileno, por lo

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que su citoplasma al microscopio óptico aparece de color rosa suave (rosa-

morado). Posee un núcleo compacto segmentado, presenta de 2 a 5
lobulaciones conectadas por puentes citoplasmáticos. Las células en
cayado o en banda, llamadas así por la característica forma en herradura de
su núcleo, son los neutrófilos más inmaduros que pueden encontrarse en la
sangre periférica. Su principal función es fagocitar células extrañas. Son de
los primeros leucocitos en actuar, por lo que el aumento de la proporción de
neutrófilos en sangre es indicativo de la presencia de una infección.

- Los basófilos: segregan sustancias como la heparina, de propiedades

anticoagulantes, y la histamina que estimula el proceso de la inflamación.
Solo representan el 0.5% de los leucocitos circulantes. Son células en las
que la granulación específica posee sustancias de carácter ácido que fijan
los colorantes básicos, como el azul de metileno, y se tiñen de color azul
oscuro.

- Los eosinófilos: representan el 2% del total de leucocitos circulantes. Se

activan y aumentan su número en presencia de ciertas infecciones y
alergias. Son células en las que la granulación específica contiene
sustancias de carácter básico que fijan los colorantes ácidos, como la
eosina, y se tiñen de un intenso color entre anaranjado-rojizo y rojo. El
núcleo es bilobulado.

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- No granulosos o agranulocitos o células monomorfonucleares: tienen un

núcleo redondeado y carecen de gránulos en su citoplasma. Incluye a los
linfocitos y monocitos.
- Los linfocitos: representan aproximadamente el 30% de los leucocitos
circulantes. Desempeñan un papel importante en la producción de
anticuerpos y en la inmunidad celular. Los linfocitos se producen en la
médula ósea y completan su desarrollo en el timo, en los ganglios linfáticos y
en otros tejidos linfáticos. Los linfocitos maduros son células con gran
variedad de tamaños. Se clasifican morfológicamente en linfocitos pequeños
y linfocitos grandes.
- Linfocitos pequeños: constituyen la mayor parte de la población
linfocitaria. El núcleo de estos linfocitos está muy condensado y
ocupa la mayor parte de la célula, se tiñe de color púrpura
intenso y puede tener nucléolos. El citoplasma es de color claro.
(6-9 micras).
- Linfocitos grandes: son de tamaño muy heterogéneo. El núcleo
puede ser un poco mayor que el de los linfocitos pequeños, pero la
diferencia de tamaño celular es debida a la mayor cantidad de
citoplasma. Pueden tener pequeños gránulos. El núcleo puede
presentar una pequeña depresión que les asemeja a los monocitos.
(10-14 micras).

- Los monocitos: representan un 5% de los leucocitos circulantes. Digieren

sustancias extrañas no bacterianas, por lo general durante el transcurso
de infecciones crónicas. Son las células con mayor tamaño de la sangre
periférica. Tienen forma variable: muchos son redondeados o alargados y
otros presentan salientes. Son células de
núcleo grande, central ovalado o
endentado, con abundante citoplasma de
color azul grisáceo, generalmente con
vacuolas o vesículas en su interior. Tras
pasar unas horas en la sangre, los
monocitos pasan a los tejidos en los que
maduran dando lugar a los macrófagos,
unas células que se encargan de destruir
desechos celulares o sustancias ajenas al
organismo.

El recuento porcentual de los diferentes tipos de leucocitos en la sangre se conoce como

“fórmula leucocitaria”.

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2.2.4. Plaquetas.
Las plaquetas, también llamadas trombocitos, no son realmente células, sino pequeños
fragmentos celulares (2-3 micras de diámetro), ovales y sin núcleo. También se
producen en la médula ósea. El número normal de plaquetas en sangre se encuentra entre
150.00 y 400.000/mm3 de sangre. Duran unos 8-12 días y después son eliminadas de la
circulación principalmente por los macrófagos, sobre todo a nivel del bazo.

Las plaquetas participan en el proceso de coagulación de la sangre, contribuyendo a la

formación de coágulos y al cierre de las heridas vasculares. Cuando una lesión rompe las
paredes de un vaso sanguíneo, se produce una activación de las plaquetas, las cuales
dejan de tener una forma circular, adoptando una forma espinosa, se aglutinan en la pared
del vaso roto y comienzan a sellar la herida. Simultáneamente, por un mecanismo
enzimático, en el que intervienen los factores de coagulación, el fibrinógeno presente en el
plasma sanguíneo se transforma en fibrina y las hebras de fibrina forman una red que
atrapa a más plaquetas y células sanguíneas, formando un gran coágulo que sella
definitivamente la rotura. La coagulación comienza pocos segundos después de la lesión. El
mismo proceso puede producir coágulos indeseables en vasos sanguíneos no dañados.

3. TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE ELEMENTOS CELULARES

EN SANGRE PERIFÉRICA Y DE CÉLULAS NORMALES EN MÉDULA ÓSEA.
3.1. Preparación de los frotis sanguíneos.
En el campo hematológico, los frotis pueden ser sanguíneos o medulares, para efectos de
la práctica analizaremos únicamente el frotis sanguíneo el cual nos proporciona una
descripción estática, morfológica y cromática de los eritrocitos; así como la cantidad de
reticulocitos en proporción a los eritrocitos y la cuenta diferencial de leucocitos.

3.1.1. Realización de los frotis.

1) Coloque una pequeña gota de sangre (la muestra podría haberse obtenido por punción
o extraída del tubo de ensayo que contiene sangre con anticoagulante), en un extremo del
portaobjetos, previamente limpio y desengrasado.
2) Una vez colocada la gota, utilice el borde de un segundo portaobjetos, colocado encima
del primero con un ángulo aproximado de 45º y se procede a extender la gota de sangre a
todo lo largo del primer portaobjetos, procurando que el movimiento sea uniforme y de
una sola intención.
3) Es conveniente realizar dos o tres extensiones, con el fin de seleccionar para la tinción la
mejor lograda.

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4) Posteriormente el frotis se deja secar a temperatura ambiente. La desecación se facilita

con movimiento en forma de abanico, nunca soplando o por calor. La rápida desecación
evita la deformación de los glóbulos sanguíneos.

3.2. Estructura de la tinción.

En la extensión se distinguen las siguientes zonas:
- Cabeza: es la zona inicial de la extensión, suele ser la zona más gruesa y en ella se
encuentra una mayor proporción de linfocitos y los hematíes forman aglomerados
en pilas de monedas.
- Cuerpo: es la zona media del frotis, en ella existe una adecuada proporción entre
los distintos tipos de leucocitos. Contiene la zona ideal de observación que
corresponde a la porción que limita con la cola.
- Cola o barbas: es la zona final de la extensión, suele tener un aspecto redondeado,
es por otro lado la región más fina. En ella se encuentra una mayor proporción de
leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), los hematíes están deformados y
presentan una tonalidad uniforme. En su porción terminal suelen ser más
abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes.
- Bordes: contienen una mayor proporción de leucocitos grandes. En ellos las
células pueden ser difíciles de reconocer por estar deformadas o destruidas.

3.3. Artefactos.
El término artefacto hace referencia a errores o distorsiones que pueden causar una
mala interpretación de los datos o resultados erróneos. En la extensión de sangre
periférica se pueden producir diversos artefactos que deben ser evitados en lo posible o
identificados como tales en cada de estar presentes. Entre ellos destacan:

3.3.1. Defectos de la extensión.

- Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor: se
debe a un inadecuado tamaño de la gota de sangre y/o a un error en la velocidad y/o

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a un fallo en un ángulo de extensión de la misma. Si la extensión es muy fina o

irregular, más de la mitad de las células se puede ir hacia la cola y los bordes,
afectando a su morfología. En pacientes con anemia las extensiones suelen quedar
muy finas, por lo que es convenientes corregir el hematocrito de la muestra, bien
dejando sedimentar los hematíes o centrifugando la muestra y retirando un poco de
plasma para dejar un hematocrito próximo al 50%.

- Presencia de escalones o estrías: Se produce por una falta de uniformidad en el

deslizamiento de la gota.

- Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre: Se

produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el portaobjetos.

- Extremo final excesivamente dentado: puede que el portaobjetos que utilicemos

para extender la gota de sangre esté mellado, o que la presión ejercida no es la
adecuada.

3.3.2. Efectos producidos por el anticoagulante.

Las sales sódicas o potásicas de EDTA son potentes anticoagulantes, por lo que son
muy utilizadas en los exámenes hematológicos de rutina, si bien no es recomendable su
uso para los estudios de hemostasia. En determinadas persona el EDTA puede inducir la
agregación de las plaquetas, falseando el número de las mismas.

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3.3.3. Defectos ocasionados por la conservación de la extensión.

Las extensiones realizadas con sangre que no ha permanecido más de 1 hora a
temperatura ambiente en el laboratorio no presentan cambios morfológicos significativos.

A las 3 horas los cambios pueden ser visibles con facilidad y pasadas 12-18 horas resultan
muy llamativos. Estos cambios consisten en: lobulaciones y picnosis nuclear (el núcleo se
vuelve homogéneo, redondo, pequeño y oscuro), vacuolización con desflecamiento y
fragmentación citoplasmática de los leucocitos, crenación y esferificación de los hematíes y
aumento de tamaño y vacuolización de las plaquetas.

3.3.4. Artefactos provocados por una fijación o coloración defectuosa.

Los más frecuentes son debidos a la precipitación del colorante, si ocurre sobre los
hematíes puede ser confundida con anomalías de los glóbulos rojos, como el punteado
basófilo o los cuerpos de inclusión.

3.3.5. Agentes extraños.

Entre ellos pueden destacarse la contaminación por polvo, talco, células de la piel del
paciente arrastradas con la aguja de punción, células de la boca o la nariz.

4. CITOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA.

El examen de la médula ósea como “fábrica” de la hemopoyesis es una de las herramientas
diagnósticas más antiguas y útiles en el estudio de las enfermedades hematológicas. Su
objetivo principal es el diagnóstico, la confirmación y el estadiaje de éstas, así como
informar sobre el estado de la celularidad, morfología y maduración de las células
hematopoyéticas.

La médula ósea se obtiene para su estudio citológico por aspirado o biopsia. La cresta ilíaca
posterosuperior es el sitio preferido para el aspirado y para la biopsia tanto en adultos como
en niños, aunque también puede extraerse del esternón.

La punción-aspiración es la extracción de una pequeña cantidad de este tejido en forma

líquida para su análisis. En el aspirado se puede ver a simple vista unos grumos que
corresponden a la médula ósea inmersos en
una cantidad muy superior de sangre. Para
realizar extensiones de un aspirado de médula
ósea se pone parte de la suspensión de médula
en sangre sobre un portaobjetos y se separan
unos cuantos grumos con ayuda de otro porta
que se sitúa en el centro de un tercer porta.
Esos grumos se extienden deslizando
horizontalmente un cuarto porta sobre los
grumos de médula ósea.

La biopsia es la extracción de la médula del

interior de un hueso, se extrae un cilindro de hueso. También se pueden hacer improntas
poniendo el cilindro sobre un portaobjetos y dejándolo que algunas células se depositen
sobre el cristal.

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El aspirado y la biopsia son técnicas complementarias. El estudio citológico de las

extensiones es más adecuado para el recuento diferencial y la morfología celular, mientras
que la biopsia es el método de elección para valorar celularidad, arquitectura, fibrosis,
depósitos de hierro y lesiones focales.

4.1. Examen de la extensión de grumo medular.

Se debe realizar con un aumento progresivo de magnificación.
- Objetivo de poco aumento (10x) . Se evalúan los siguientes aspectos:
- Celularidad global.
- Lagunas grasas.
- Relación mieloide-eritroide (normal 3:1).
- Cantidad de megacariocitos.
- Presencia de células extrañas, metástasis.
- Objetivo de mayor aumento (40x). Se define la morfología de las células.
- Objetivo de inmersión (100x). Requiere un líquido que rellene el espacio entre el
objetivo que porta la lente y el objeto que se va a observar:
- Detalles de morfología de las células.
- Búsqueda de parásitos (sobre todo VIH positivos).

5. CITOLOGÍA DE LÍQUIDOS BIOLÓGICOS. CITOCENTRIFUGADO.

En el laboratorio de hematología se estudian también otros líquidos. Para ver al microscopio
las posibles células que pueden aparecer en estos líquidos hay que concentrarlas mediante
una citocentrífuga. Se trata de un aparato de menor tamaño que la centrífuga de
decantación, y que se utiliza para aglutinar las células de un líquido con un volumen no
superior a 2 ml sobre un portaobjetos. Este tipo de centrífuga emplea unos recipientes
especiales llamados citocámaras, en los cuales se coloca un portaobjetos. Estas
citocámaras poseen una abertura por donde se introduce el líquido. Acto seguido se coloca
el molde cerrado con el portaobjetos y la muestra líquida en el aparato y se centrifuga; así
se obtendrá un portaobjetos con una muestra de las células que porta el líquido adheridas a
él. El material sobrante y las citocámaras se desechan. Tras secarse, la película de células
resultantes se tiñe de la forma habitual.

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Para contar la cantidad de células por unidad de volumen

se utiliza una cámara de contaje. La más habitual es la
cámara de Neubauer que es un portaobjetos grueso con
dos zonas deprimidas en las que se han marcado unas
líneas perpendiculares que delimitan unas cuadrículas de
dimensiones conocidas. Sobre la cámara se coloca un
cubreobjetos, el líquido se introduce entre la cámara y el
cubre. El volumen que cabe en la zona delimitada por las
cuadrículas de la cámara se conoce previamente, por lo
que el número de las células que se cuentan en ellas
permite extrapolar la concentración de las células en el
líquido. El líquido se puede observar sin teñir o
añadiendo un colorante vital.

6. TINCIONES HEMATOLÓGICAS.
Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de
las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto aumentar el
contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las
células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad.

6.1. Tipos de tinciones.

Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios, atendiendo al nivel
de vitalidad de las células que se pretenden colorear, se dividen en tinciones vitales,
supravitales y no vitales; o atendiendo a su frecuencia de realización en el diagnóstico
hematológico cotidiano, se dividen en tinciones habituales o especiales.

6.1.1. Tinciones vitales y no vitales.

Las tinciones hematológicas se pueden clasificar según la vitalidad de las células que se
quieren teñir:
- Vitales: Las tinciones vitales son tinciones hematológicas que se realizan sobre
células vivas, manteniéndolas en dicho estado. La técnica se basa en la introducción
de un colorante en la circulación de un organismo vivo. El verde Jano, las sales de
tetrazolio o el azul de metileno son ejemplos de colorantes vitales.
- Supravitales: Las tinciones supravitales son idénticas a las vitales, con la diferencia
de que la técnica se realiza sobre células o tejidos vivos que están aislados del
organismo del que proceden. Los colorantes vitales se usan tanto para técnicas
vitales como para supravitales.
- No vitales: Las tinciones no vitales son tinciones hematológicas que se realizan
sobre células muertas. Estas técnicas requieren un paso previo, que es la fijación
de dichas células al portaobjetos haciendo uso de calor, etanol o metanol, con la
particularidad de mantener inalteradas las estructuras de los diferentes componentes
celulares.

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6.1.2. Tinciones habituales

Las tinciones habituales se logran generalmente mediante el uso de colorantes derivados
de la anilina. Estos se reúnen en 4 grupos:
- Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad con las estructuras alcalinas de las
células, como por ejemplo la hemoglobina. El principio de ellos es la eosina.
- Colorantes básicos: tienen una especial afinidad con las estructuras ácidas de las
células, por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.
- Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el
núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de
metileno.
- Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad con estructuras ácidas o
básicas. Son insolubles en el agua y tiñen aquellas sustancias que tienen un poder
de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.
Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas.

También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una
coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes y es
pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes juntas. El primero que tuvo
la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes
hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó. Los colorantes
de tipo Romanowsky consta de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos,
(azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilación oxidativa (colorante tipo
azur)). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más
frecuentemente se emplean, son la de Wright y la de Giemsa (utilizadas solas o en
combinación con la de May-Grünwald). También hay tinciones panópticas rápidas que
producen una coloración fácil y rápida de las estructuras celulares, se pueden realizar con
técnicas de inundación-decantación o por inmersión.

6.1.3. Tinciones especiales. Citoquímica.

Las tinciones especiales solo se usan en circunstancias específicas. Hacen uso de
colorantes para determinar la existencia y localización de diversas sustancias químicas en
los componentes celulares sanguíneos. Un tipo de estas técnicas son las denominadas
tinciones citoquímicas. Otra técnica especial, con la misma finalidad que las tinciones
citoquímicas, son las tinciones fluorescentes, cuyos colorantes son fluorocromos.

Las tinciones fluorescentes emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y
que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un
color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el
naranja de acridina y el rojo neutro.

La citoquímica combina la morfología y el estudio de la composición química de la célula,

de modo que permite precisar la localización topográfica de diversas sustancias. Los
compuestos químicos se ponen de manifiesto al teñirse y visualizarse al microscopio óptico.
La tinción resulta de la reacción química producida entre el compuesto químico buscado y el
reactivo utilizado en la técnica. Las técnicas citoquímicas más importantes en hematología
son las que se exponen a continuación:
- La reacción de la peroxidasa: La técnica de la mieloperoxidasa es una tinción
citoquímica que pone de manifiesto la enzima a la que debe su nombre. Se pone de

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manifiesto como un precipitado amarillo ocre al reaccionar con la bencidina en

presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2). La mieloperoxidasa se encuentra en el
citoplasma de todos los leucocitos, en cantidad variable, excepto en los linfocitos.
Estas características hace que se utilice la reacción química de la peroxidasa para
distinguir los cánceres producidos por células derivadas de los granulocitos, de las
de origen linfocitario, ya que las primeras suelen presentar positividad con las
tinciones de mieloperoxidasas y las segundas son negativas.
- Esterasas: Las esterasas son enzimas que hidrolizan los ésteres de cadena corta
de los ácidos grasos. Existen muchas de ellas y se diferencian por el tipo de sustrato
sobre el que actúan y el pH al que lo hacen. Estas tinciones permiten identificar las
serie monocitaria y sus precursores, ya que son positivos a la tinción de esterasa,
con la particularidad de que la incubación con el fluoruro sódico produce una
inhibición prácticamente total de la actividad esterasa de los elementos monocíticos,
por lo que la tinción no aparece al añadir fluoruro. Esta característica hace esta
tinción útil para el estudio de las leucemias de estirpe monocítica.
- Tinción de hierro. Reacción del azul de Prusia o de Perls: Se emplea en la
evaluación de las anemias. Detecta solo el hierro de los depósitos insolubles en
agua (hemosiderina), que produce un precipitado azul-verdoso, y no el hidrosoluble
(depósito de hierro soluble en agua o ferritina). Las partículas de hemosiderina se
observan dentro de algunas células inmaduras que dan origen a los glóbulos rojos
(sideroblastos), en algunos eritrocitos (siderocitos) y en los macrófagos medulares y
extramedulares donde este metal constituye el hierro de depósito. El número de
sideroblastos, su posible aspecto patológico y la presencia o ausencia de
hemosiderina en los macrófagos de la médula ósea son de gran importancia en el
diagnóstico de las anemias.

7. DENOMINACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS.

Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de la
siguiente forma:
- Estructura acidófila: poseen componentes básicos, por lo que fijan colorantes de
naturaleza ácida. Si el colorante ácido que capta es la eosina, se dice que son
eosinófilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado.
- Estructuras basófilas: poseen componentes ácidos, por lo que fijan colorantes de
naturaleza alcalina. Con las tinciones habituales adquieren un color azulado. Si se
tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófilas.

8. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES.

La calidad de una tinción depende del tipo, calidad y características del colorante
empleado y del método de tinción que se ha llevado a cabo. Los defectos más frecuentes
que nos podemos encontrar en las tinciones hematológicas, y sus posibles causas, son:
- Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente se
daba a:
- Un pH bajo del colorante, muy ácido.
- Un tiempo de coloración insuficiente.
- Un lavado excesivamente prolongado.

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TÉCNICAS DE ANÁLISIS HEMATOLÓGICO

- Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esté causado por:

- Un grosor excesivo de la extensión.
- Un pH alto del colorante, muy básico.
- Una coloración excesivamente prolongada.
- Un lavado insuficiente.
- Puede ocurrir cuando la tinción se realiza sobre un frotis con una antigüedad
superior a 24 horas.
- Si tras la tinción, aparecen artefactos y precipitados en la extensión,
probablemente, se deba a:
- Un empleo de portas sucios.
- Una falta de filtración de colorante.
- Secado del colorante durante la tinción, antes del lavado.
- Una coloración excesivamente prolongada.
- Un lavado insuficiente.

9. CITOMETRÍA DE FLUJO.
Otra forma de estudiar las células, imprescindible en hematología, es la citometría de flujo.
La citometría de flujo es una tecnología que permite analizar y cuantificar de manera
simultánea múltiples características celulares a
medida que son transportadas en un fluido e
incididas por un haz de luz. El citómetro de flujo
mide el tamaño y la granularidad de la célula,
así como la fluorescencia relativa de la misma.
Estas características se determinan usando un
sistema óptico acoplado a un procedimiento
electrónico que graba la manera en que la célula
dispersa el haz de luz y emite fluorescencia.

Un citómetro de flujo se encuentra compuesto por tres principales sistemas, el de fluidos, el

óptico, y el electrónico.
- Sistema de fluidos: su principal función es alinear y transportar a las células dentro
de una cámara de flujo hacia el haz de luz; por tanto, es necesario que la muestra se
encuentre suspendida en un fluido. Gracias a este sistema, las células pueden ser
alineadas en “fila india”, y de esta manera se asegura que el haz de luz incida sobre
una célula a la vez.
- Sistema óptico: El sistema óptico está compuesto por láseres y filtros, que se
encargan de iluminar a las células y dirigir las señales resultantes hacia los
detectores apropiados. Las células, al ser incididas por el láser, tendrán la capacidad
de dispersar la luz de acuerdo con su tamaño y su granularidad. En caso de que la
luz se disperse frontalmente, se obtendrá un parámetro denominado FSC (forward
scatter), que indica el tamaño de la célula . Por tal motivo, aquellas células marcadas
con fluorocromos serán excitadas por el láser y la luz será dirigida hacia un detector,
el cual recibirá la longitud de onda emitida por la excitación del fluorocromo. Gracias
a este sistema, se puede conocer el tamaño y la granularidad de la célula, así como
las proteínas que se expresan (marcadores), permitiendo así la identificación de

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TÉCNICAS DE ANÁLISIS HEMATOLÓGICO

diferentes tipos celulares. A medida que el citómetro posea más detectores, mayor
será su capacidad para identificar poblaciones celulares.
- Sistema electrónico: una vez que la señal luminosa es generada cuando el haz de
luz incide en la célula, ésta debe traducirse en señales electrónicas. El sistema
electrónico consta de sensores luminosos, que tienen la finalidad de convertir los
fotones en electrones y éstos, a su vez, en corriente eléctrica. De este modo, la
señal eléctrica es recibida por la computadora y traducida en gráficos e histogramas.

Como se mencionó anteriormente, el marcaje celular con anticuerpos monoclonales

acoplados a fluorocromos, representa un paso crucial para la identificación de subtipos
celulares mediante el uso de la técnica de citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales
permiten detectar y “etiquetar” poblaciones específicas de células. Esta tecnología consiste
en la creación de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una estructura específica
(antígeno) que se expresa en el tipo celular que se requiere identificar. Adicionalmente, este
anticuerpo debe contener una unión covalente a un fluorocromo, que emitirá luz
fluorescente cuando sea excitado por el láser; de este modo, la célula se “tiñe” y facilitará la
identificación de las células que se unieron al anticuerpo o marcador.

Los resultados obtenidos pueden ser representados mediante diferentes estilos, desde una
gráfica de puntos hasta una figura tridimensional; la clave se centra en seleccionar los
gráficos que reflejen los resultados con precisión y sin generar confusiones.

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