Merlo Ortega Aimee Aketzalli Práctica “Reacciones enzimáticas de Óxido – Reducción”

Ramírez García Ruth Marbella. Sección 2

INTRODUCCIÓN La deshidrogenación del succinato
Una oxidorreductasa es una enzima que produce FADH2 que debe reoxidarse
cataliza la transferencia de electrones antes que la succinato deshidrogenasa
desde una molécula donadora (agente puede emprender otro ciclo catalítico.
reductor) a otra aceptora (agente La reoxidación del FADH2 se produce
oxidante) algunas enzimas necesitan de cuando sus electrones se pasan a la
coenzimas (compuestos orgánicos no cadena transportadora de electrones
proteicos que requieren las enzimas mitocondrial.
para su actividad y pueden unirse
temporal o permanentemente). La citocromo C oxidasa cataliza las
oxidaciones de un electrón de cuatro
Funciones de las coenzimas: moléculas de citocromo C reducidas
✓ Ayudar en las reacciones de consecutivas y la reducción simultánea
acoplamiento energético de cuatro electrones de una molécula
intracelular. de O2. El núcleo de complejo IV se
✓ Actúan como transportadores de compone de sus tres subunidades
átomos de hidrógeno, electrones o mayores y más hidrófobas, I, II, III, que
grupos químicos (por ejemplo, el están codificados por el DNA
NADH actúa como transportador mitocondrial.
de hidrógenos).
✓ Facilitar las reacciones asociándose OBJETIVOS
con los sustratos enzimáticos en los o Obtener un extracto crudo con LDH
sitios activos de la enzima. y otro con la coenzima NAD+
o Observar la relación que existe
La deshidrogenasa láctica (DHL) es una entre la reducción del azul de
proteína enzimática que actúa sobre metileno y la actividad enzimática.
piruvatos y lactatos en conjunto con el o Realizar los experimentos en
dinucleótido de adenina-nicotinamida, condiciones anaeróbicas utilizando
la NAD es un derivado de la vitamina B3 aceite vegetal.
que actúa como coenzima o Analizar las propiedades de un
transportando átomos de hidrógeno, extracto crudo de corazón sobre la
esta enzima que se encuentra en actividad enzimática
prácticamente todos los tejidos del o Modificar el equilibrio de la
cuerpo humano. reacción utilizando KCN.
RESULTADOS
La succinato deshidrogenasa cataliza la Tabla 1. Determinación de la actividad
deshidrogenación estereoespecífica de de la Deshidrogenasa Láctica
succinato a fumarato. Esta enzima es Tubo 1 2 3 4 5
Tiempo
inhibida fuertemente por el malonato, 0 min. +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
un análogo estructural del succinato y 2 min. +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
un ejemplo de un inhibidor competitivo. 5 min. +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
7 min. ++++ +++++ +++++ +++++ +++++
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10 ++++ +++++ +++++ +++++ +++++ Tabla 3. Determinación de la actividad
min.
15 +++ +++++ +++++ +++++ +++++
del sistema de citocromos
1 2 3 4 5 6 7 8
min. 0 Dur Transp Dur Dur Dur Transp Dur Transp
20 ++ ++++ ++++ +++++ ++++ azn arent azn azn azn arent azn arent
o e o o o e o e
min. 1 Caf Transp Dur Dur Sal Transp am Transp
30 + ++ +++ +++++ ++++ é arent azn azn mó arent arill arent
e o o n e o e
min. 2 Caf Transp Dur Dur Sal Transp am Transp
é arent azn azn mó arent arill arent
e o o n e o e
4 Caf Transp Dur Dur Sal Transp am Rosa
é arent azn azn mó arent arill
e o o n e o

1 2 3 4 5 6 Caf
é
Transp
arent
Dur
azn
Dur
azn
Sal
mó
Transp
arent
am
arill
Rosa

e o o n e o
8 Caf Transp Dur Dur Sal Transp am Rosa
é arent azn azn mó arent arill
e o o n e o
osc
uro
1 Caf Transp Dur Dur Sal Anara am Rosa
0 é arent azn azn mó njado arill
e o o n claro o
osc
uro

Figura 1. Actividad de la
Deshidrogenasa Láctica

Tabla 2. Determinación de la actividad

de deshidrogenasa succínica
1 2 3 4 5 6 7
0 ++ +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
2 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
4 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
6 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
8 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++ Figura 3. Actividad del sistema de
10 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
citocromos
15 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++
20 + +++++ ++++ +++ +++ ++ ++ DISCUSIÓN
Actividad de la Deshidrogenasa
Láctica
Tubo 1: Su contenido está diseñado para
ser el control positivo de esta prueba.
La enzima Lactato deshidrogenasa está
llevando a cabo una reacción de óxido-
reducción, donde el lactato actúa
como sustrato sufriendo una oxidación
para formar el piruvato, durante esta
reacción se está llevando a cabo
Figura 2. Actividad de la deshidrogenasa simultáneamente la reducción del NAD
succínica
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en NADH, esté último es el que lleva a
cabo la reducción del Azul de Metileno.
El cambio de coloración en el azul de
metileno evidencia la formación de
NADH en la reacción enzimática de la
LDH, debido a que este presenta una
coloración azul intenso en su forma
oxidada y es incoloro en su forma
reducida.
La disminución de coloración es
directamente proporcional a la
formación de NADH, por lo que al tener
un producto incoloro hubo gran
actividad enzimática.
Fue necesario utilizar el aceite vegetal
para llevar en condiciones anaeróbicas
la reacción, ya que la presencia de
oxígeno mantendría al azul de metileno
en su forma oxidada y no se notarían los
cambios en la coloración. El cianuro de
potasio también fue indispensable al
reaccionar con el piruvato para formar
la clanhidrina de piruvato y desplazar el
equilibrio hacia la formación de piruvato
y por lo tanto de NADH.
Tubo 2: Aquí se observa la ausencia del
extracto de Coenzima NAD obtenido en
el laboratorio, la reacción se está
llevando a cabo debido a que en
nuestro extracto crudo de lactato
deshidrogenasa es muy probable que
haya restos de NAD, por lo que, si se va
a reducir el azul de metileno, aunque no
tan rápido como en la prueba positiva al
agregarse el extracto de la coenzima.
La coloración más baja en el fondo del
tubo indica una mayor eficiencia en el
proceso de reducción del azul de
metileno, debido a que es la parte
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Sección 2
donde se tienen las condiciones más
anaeróbicas posibles.
Tubo 3: En este se tiene una ausencia de
sustrato.
La reacción se está llevando a cabo de
igual manera que el tubo 2 al tratarse de
ser un extracto crudo. Se ve más
avanzada la reacción al ser más
abundante la presencia de lactato en el
extracto en crudo.
Tubo 4: El tubo 4 no cuenta con
presencia del extracto de enzima, por lo
que este sería nuestro control negativo
Se tiene un nulo cambio en la coloración
debido a que no hay formación de
NADH) capaz de reducir el azul de
metileno. A diferencia del extracto
crudo de enzima el extracto de
coenzima NAD no va a contar con restos
de enzima al someterse a un proceso de
ebullición, perdiendo su actividad
enzimática a precipitándose con los
restos celulares durante la
centrifugación.
Tubo 5: En este tubo no se cuenta con
cianuro de potasio siendo este el
responsable de desplazar el equilibrio de
la reacción.
Debido a que la reacción con la enzima
Lactato deshidrogenasa es reversible
una vez que se llegó al punto de
equilibrio no se observaron cambios al
no aumentar la concentración de NADH
por lo que después de transcurridos 15
minutos la coloración permanece
constante.
Actividad de la Deshidrogenasa
Succínica
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Ramírez García Ruth Marbella.
Tubo 1: Al minuto cero no se observa
cambio alguno en el tubo de reacción.
A los dos minutos podemos observar una
ligera decoloración en el tubo de
reacción. En el minuto cinco se observa
una decoloración casi total. El resultado
que se obtuvo era el que se esperaba,
ya que el sistema estaba completo, por
ende, se sabía que el tubo tendría una
decoloración, lo que nos indica que se sí
se llevó a cabo la reacción, en donde el
FAD, pasa de FAD -> FADH, (hay una
transferencia de electrones del
succinato al azul de metileno).
Tubo 2 (Testigo negativo): Ya que el tubo
no posee un sistema completo porque le
falta la enzima y el grupo prostético
(SDH-FAD), se esperaba que no hubiera
reacción, ya que no habría una
transferencia de electrones del
succinato al azul de metileno porque no
hay enzima. Así fue. no se observó
reacción en ninguno de los distinto
tiempos, por lo que el tubo permaneció
de color azul, color proporcionado por el
indicador azul de metileno.
Tubo 3: El sistema en este tubo también
está incompleto porque falta el sustrato
que es el succinato de Na al 0.1 M, por
lo que se espera una reacción parcial ya
que al sí contener la enzima que es
nuestra muestra, está puede llegar a
tener al succinato, pero de manera
endógena, por lo que la reacción si se
llevara a cabo, pero está sería poco
notoria por la poca cantidad de sustrato
contenido en la muestra, por ello se dice
que el tubo presenta una reacción
parcial. La poca decoloración del tubo
se observa hasta los 5 min de reacción.
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Sección 2
Tubo 4: Tenemos un sistema completo,
más aparte la presencia de un inhibidor
como lo es el Malonato de Na al 0.01 M,
por ende en esté tubo no se lleva a cabo
la reacción, ya que el Malonato al ser un
inhibidor competitivo y estar presente en
gran cantidad en presencia de inhibidor
como lo es el Malonato de Na al 0.01 M,
por ende en esté tubo no se lleva a cabo
la reacción, ya que el Malonato al ser un
inhibidor competitivo y estar presente en
gran cantidad en comparación con el
Succinato de Na al 0.1 M en este tubo,
provoca que la reacción no se lleve a
cabo. Dado a que el inhibidor logra
ocupar la gran mayoría de los sitios
activos de la enzima impidiendo que el
sustrato se una a la misma para que la
reacción ocurra, nuestro tubo no logra
tener un cambio de color en ninguno de
los distintos tiempos de reacción,
permaneciendo con el color adquirido
por el indicador azul de metileno.
Tubo 5: Tenemos un sistema completo,
más aparte la presencia de un inhibidor
competitivo como lo es el Malonato de
Na al 0.01 M, por ende, en esté tubo no
se lleva a cabo la reacción, sin
embargo, en este tubo se tiene la misma
proporción de sustrato que de inhibidor,
pero este al ser competitivo no deja que
el sustrato pueda llevar a cabo la
reacción por lo que el tubo permanece
de color azul en los distintos tiempos de
reacción.
Tubo 6: Tenemos un sistema completo,
más aparte la presencia de un inhibidor
competitivo como lo es el Malonato de
Na al 0.01 M, pero esté se encuentra en
menor proporción en comparación con
el sustrato, por lo que la reacción si se
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lleva a cabo, observándose en un
cambio de coloración del tubo en el
minuto 5 de reacción.
Tubo 7: Tenemos un sistema completo,
más aparte la presencia de un inhibidor
competitivo como lo es el Malonato de
Na al 0.01 M, pero esté se encuentra en
mucho menor proporción en
comparación con el sustrato, por lo que
la reacción si se lleva a cabo, esto
sucede porque el inhibidor al
encontrarse en baja concentración no
puede encontrar sitios activos libres a los
cuales unirse dado que el sustrato
ocupa la mayor parte de los mismos y
esto se puede observar en un cambio de
coloración del tubo hasta el minuto 5 de
la reacción.
Actividad del sistema de
citocromos
Tubo 1: No contiene el KCN ni el a-naftol,
como no está este último, no se puede
formar el azul de indofenol, pero el
citocromo c si va a oxidar la diamina a-
dimina, y a medida que aumenta la
concentración de la P-fenilendiimina el
color se vuelve más oscuro, esto ocurre
porque se originan polímeros de P-
fenilendiimina que pueden presentar
diferentes colores, por eso se observa
que pasa rojo a un color café.
Tubo 02: En este tubo solo se adiciono la
P-fenilendiamina, entonces como no
está presente el citocromo c, se lleva a
cabo una oxidación no enzimática, que
es más lenta, esta oxidación se lleva a
cabo gracias al oxígeno que está en el
aire, no se puede producir el azul de
indofenol porque no hay presencia de
a-naftol.
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Sección 2
Tubo 3: Se inhibe la reacción enzimática
con el cianuro, se inhibe el cit a3, pero
esto ocasiona que los demás citocromos
detengan su actividad también, esto
impide la formación de la diimina y por
eso se observa el color café claro. No
contiene el a-naftol, pero no afecta ya
que no se forma la diimina.
Tubo 4: Solo se adiciona la preparación
mitocondrial, por eso solo se observa el
color de la preparación: Durazno.
Tubo 5: En este tubo se tiene el sistema
de reacción completo, el cit c acepta
los electrones de la P-fenilendiamina, se
forma la P-fenilendiimina, esta
reacciona con el a-naftol, por lo que si
se forma el azul de indofenol y se
observa el color salmón oscuro.
Tubo 6: En este caso no se adicionaron
los citocromos, pero si el a-naftol y la P-
fenilendiamina, entonces la reacción
para formar el azul de indofenol es
mucho más lenta, ya que es una
reacción no enzimática (la P-fenilendi
amina se oxida con el 0, que está en el
aire). No contiene el KCN, pero esto no
afecta en nada al no estar presente el
complejo, se observa un color naranja
claro.
Tubo 7: Se tiene el sistema completo de
reacción junto con el inhibidor, la
reacción del cit c no se lleva a cabo,
inhibe la formación del azul de indofenol
y el color observado es amarillo.
Tubo 8: A este tubo no se le adicionó
extracto de SDH-CIT en donde se
encuentra la enzima citocromo c
oxidasa, por lo que no se observó ningún
cambio de color (sin reacción),
solamente se apreciaba color rosa
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Ramírez García Ruth Marbella. Sección 2

grisáceo por la combinación de la p- Interamericana. México. Pág. (200-

fenilendiamina con el KCN. 207,211,217).
Pregunta extra ❖ Horton H. Robert. (2008). “Principios
Estructura del succinato y malonato de bioquímica” 4ª edición, editorial
Pearson educación, México. Pág.
(226,231-236).
❖ Mathews K. Christopher. (2002).
“Bioquímica” 3ª edición, editorial
Pearson Addison Wesley, México D.
pág. (313, 324- 327).
❖ Rodwell W. Víctor. (2016). “Harper
Bioquímica Ilustrada” 30ª edición,
editorial Mc Graw Hill education
Lange. México. D. pág. (58, 68-75,
82- 85 ).
Figura 4. Estructura de malonato y
succinato.
CONCLUSIONES
➢ La reacción que obtenemos con la
enzima LDH es de tipo reversible
puesto que se da la formación de
piruvato a partir de lactato.
➢ La enzima deshidrogenasa láctica
(LDH) permite que se lleve a cabo
la reacción de oxido-reducción,
oxidando el lactato a piruvato y
reduciendo de manera
concomitante el NAD+ a NADH.
➢ El azul de metileno oxidado
presenta una coloración azul y
reducido una coloración blanca
(leucobase) debido a que es el
último aceptor de electrones en la
reacción provenientes del lactato.
➢ El aceite vegetal impide la entrada
de oxígeno al tubo evitando que se
reoxide el azul de metileno.

BIBLIOGRAFÍA
❖ McKee T. y McKee J, R. (2003).
“Bioquímica”. La base molecular
para la vida”. Ed. McGraw Hill-