UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

ESCUELA DE GRADUADOS

I** ***I
1* *1

OBTENCION DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO ARISTOTELIA

DESDE Aristotelia chilensis (Mol) Stunz, (Maqui).

Tesis para optar al grado

de Doctor en ciencias
con mención en química

Carlos Leonardo Armando Céspedes Acuña

- 1996 -
 UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
PROGRAMA DE GRADUADOS EN QUIMICA

EXAMEN DE GRADO

El día ¿ 44 de 1996, el Sr. Carlos Leonardo Armando

Céspedes Acuña rindía su examen de grado presentando su tesis titulada
"Obtención de Alcaloides Indólicos tipo aristotelia desde Aristotelia chi/ensis (Mol)
Stuntz"

La comisión de examen de grado constituida de acuerdo al Art. 59

del reglamento normativo de la Escuela de Graduados, acordó este
examen con ificaci' C..O'J ITC O j)Ç )

Dr.Mariv
Prof.Pa inante
Dr.
Mie
Iné rres G.
Comisión
Universidad de Santiago
de Chile

Baez
Pres' íente Çorián

DfíSara Gnecco D.
Miembro Comisión

Dr. Galo Cárdenas T.

Jefe de programas
Graduados en Química.

Concepción, Julio de 1996.

 A ti mi Dios

"Tengan mi enseñanza antes que adquirir plata y busquen

el saber antes que el oro, porque la sabiduría es más preciosa que
cualquier joya y nada se le ¡gua/a de lo que desean los hombres."

Prov. 8,10-11.

1 Mirza,

a ti mi amor, gracias por todo tu

apoyo y esfuerzo.

A mis hijos,
María José, Paz Francisca
y Leonardo Andrés,
Que Dios los bendiga.
 AGRADECIMIENTOS

Mi mas sincero y afectuoso agradecimiento al Prof. Dr. Mario Silva O.,

patrocinante de esta Tesis, por haberme permitido tener el privilegio de trabajar bajo
su dirección, contar con sus numerosos y valiosisimos consejos, discusiones y
sugerencias, tanto profesionales como humanas.

Vaya mi agradecimiento a los profesores que completan el equipo del

laboratorio de química de productos naturales, Dra. Magalis Bittner B., Prof. Maritza
Hoeneisen F., y Prof. José Becerra A., por sus valiosos consejos, ayuda y amistad.
Así tambiém al Prof. Pedro Mancinelli, del laboratorio de fisiología vegetal, por toda
la ayuda otorgada.

También agradezco al Prof. Dr. Jasmin Jakupovic, por la determinación

de los espectros de RMN- 1 H, RMN- 13 C y de masas de alta resolución y a la Srta.
Silvia Fernandez por los espectros de RMN-'H.

No puedo dejar de expresar mi gratitud hacia el personal auxiliar y al

laborante técnico Sr. Zenon Rosas y., por su constante ayuda y estimable
cooperación y a todos los que de una u otra forma contribuyeron al feliz término de
esta Tesis.

En forma muy especial agradezco a la Escuela de Graduados y a la

Dirección de Investigación de la U. de Concepción el apoyo financiero otorgado en el
transcurso de mi formación como doctorado en química. Así también debo
agradecer a la Dirección de Perfeccionamiento y pos grado de la U. de La Frontera el
financiamiento de la escritura final de esta Tesis y al Departamento de Ciencias
Químicas de esta Universidad, por las facilidades otorgadas.

Se agradece el apoyo financiero de CONICYT, beca doctorado 1989-

1992. y a FONDECYT proyecto de tesis de doctorado No.: 92-0018.
 INDICE GENERAL
pagina.
i
INDICE DE FIGURAS iv
INDICE DE TABLAS y
INDICE DE ESQUEMAS vi
RESUMEN viii
ABSTRACT 1
1.- INTRODUCCION 1
1.1.- ANTECEDENTES DE LA ESPECIE EN ESTUDIO
1.2.- BIOSINTESIS, QUIMICA Y SINTESIS DE ALCALOIDES 10
INDOLICOS TIPO ARISTOTELIA.
- BIOSINTESIS. 10
- DESARROLLO DE LA QUIMICA DE ALCALOIDES. 25
1.3.- APLICACIONES DE ALCALOIDES INDOLICOS 28
1.4.- BIOSINTESIS DE PRECURSORES MONOTERPENICOS 33
1.5.- LA TECNICA DE LA BIOTECNOLOGIA. 37
1.6.- QUIMICA DE FITOHORMONAS 44
1.7.- OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION 53
53
1.7.1.- OBJETIVOS GENERALES. 54
1.7.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS.
55
2.- MATERIALES Y METODOS 55
2.1.- MATERIALES 55
2.2.- METODOLOGIA GENERAL. 55
1.- OBTENCION DE LOS ALCALOIDES DESDE LA PLANTA.
II.- PREPARACION DEL MATERIAL BIOLOGICO 58
III.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 58
lIla.- Sales Inorgánicas. 61
III.b.- Reguladores de Crecimiento. 62
lIl.c.- Vitaminas. 63
III.d.- Aminoácidos y Amidas. 64
III.e.- Fuentes de Carbón. 64
64
HI.f.- Agua. 65
IIl.g.- Soporte.
III.h.- Preparación de Soluciones "stock". 65
IV.- OBTENCION DE LOS CALLOS. 66
2.3.- PREPARACION DE LAS SERIES CON MEDIOS DE
CULTIVO Y FITOHORMONAS. 67
 ti]

2.4.-
PREPARACION DE LAS SERIES CON PRECURSORES
MONOTERPENICOS DE ALCALOIDES INDOLICOS. 76
2.5.- PREPARACION DE SERIES DE COMBINACION CON
PRECURSORES AMINOACIDO. 78
2.6- DETERMINACION DE HUMEDAD PROMEDIO TOTAL. 80
2.7.- EXTRACCION DE ALCALOIDES DESDE LOS CALLOS. 80
2.8.- CARACTERIZACION DE LOS ALCALOIDES 83
2.9.- PRODUCCION DE ALCALOIDES, A TRAVES DE UN
AGITADOR ORBITAL. 85
2.10.- SINTESIS QUIMICA DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO
ARISTOTELIA. 86
2.11.- ACTIVIDAD BIOLOGICA. 89
3.- RESULTADOS Y DISCUSION 90
3.1 .-CARACTERIZACION DE ALCALOIDES Y OTROS COMPUESTOS
AISLADOS DESDE LA PLANTA Y DE LOS CALLOS. 90
3.2.- DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 104
3.3.- DE LAS SERIES FITOHORMONALES. 105
3.4.- DE LOS PRECURSORES MONOTERPENICOS. 107
3.5.- DE LOS PRECURSORES AMINOACIDOS. 110
3.6.- DE LA PRODUCCION DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO
ARISTOTELIA POR CULTIVOS EN MEDIOS ESTACIONARIOS. 113
3.7.- DE LA PRODUCCION DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO
ARISTOTELIA POR CULTIVOS EN MEDIOS EN SUSPENSION. 114
3.8.- SELECCION DE CALLOGENESIS Y ANALISIS DEL
PROCESO. 115
3.9.- SINTESIS QUIMICA DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO
ARISTOTELIA. 119
3.10.- ACTIVIDAD BIOLOGICA. 124
4.- CONCLUSIONES 126
5.- REFERENCIAS 128
6.-ANEXOS. 136
6.1.- FOTOS 137
6.2.- ANEXO 1: RESUMEN DE DATOS FISICOS Y
ESPECTROSCO PICOS. 139
6.3.- ANEXO 2: CROMATOGRAMAS Y ESPECTROS. 147
 ff

INDICE DE FIGURAS

3
FIGURA 1. - PRIMEROS ALCALOIDES AISLADOS DESDE A.chllensis. chilensis.4
FIGURA 2.- NUEVOS ALCALOIDES Y OTROS METABOLITOS EN A.
FIGURA 3.- ESTRUCTURAS DE LOS ALCALOIDES INDOLICOS 7
AISLADOS EN EL GENERO.
FIGURA 4.- INTERRELACION DE LAS RUTAS BIOSINTETICAS DE 11
METABOLITOS SECUNDARIOS.
33
FIGURA 5.- ACIDO (R)-MEVALONICO.
FIGURA 6.- ESQUEMA GENERAL DE LA BIOSINTESIS DE LOS 34
TERPENOS. 36
FIGURA 7.- ESTRUCTURAS QUIMICAS DE ALGUNOS MONOTERPENOS.
FIGURA 8.- PRECIOS Y VOLUMEN DE COMERCIALIZACION DE 40
ALCALOIDES INDOLICOS.
44
FIGURA 9.- FORMULAS ESTRUCTURALES DE AUXINAS Y CITOMINAS. 50
FIGURA 10.- METABOLITOS CON ACTIVIDAD AUXINA. 52
FIGURA 11.- OTROS METABOLITOS DE CITOMINAS.
 1

INDICE DE TABLAS.-

TABLA 1.- ALCALOIDES AISLADOS DEL GENERO Aristotelia. 6

TABLA 2.- PRODUCTOS SELECCIONADOS DE INTERES INDUSTRIAL. 38
TABLA 3.- COMPUESTOS AISLADOS DESDE EXTRACTO n-HEXANICO. 56
TABLA 4.- COMPUESTOS AISLADOS DESDE OTROS EXTRACTOS. 57
TABLA 5.- MEDIOS DE CULTIVOS UTILIZADOS. 60
TABLA 6.- MATRIZ FACTORIAL 2,4-D Y BAP MEDIO MS. 68
TABLA 7.- MATRIZ FACTORIAL BAP, ANA, Y GA-3 MEDIO MS. 69
TABLA 8.- MATRIZ FACTORIAL AlA, BAP MEDIO MS. 70
TABLA 9.- MATRIZ FACTORIAL AlA, BAP MEDIO MZ. 71
TABLA 10.- MATRIZ FACTORIAL 2,4-D, ZEATINA MEDIO MZ. 72
TABLA 11.- MATRIZ FACTORIAL AlA, ZEATINA MEDIO MZ. 73
TABLA 12.- MATRIZ FACTORIAL AlA, BAP MEDIO HH. 74
TABLA 13.- MATRIZ FACTORIAL AlA ZEATINA MEDIO HH. 75
TABLA 14.- ALCALOIDES OBTENIDOS DESDE CULTIVOS DE TEJIDOS. 83
TABLA 15.- RESULTADOS DE TRATAMIENTOS CON REGULADORES
HORMONALES DE CRECIMIENTO. 106
TABLA 16.- RESULTADOS DE COMBINACION DE FITOHORMONAS. 107
TABLA 17.- RESULTADOS EN MG DE EXTRACTO ALCALOIDEO TOTAL. 108
TABLA 18.- RESULTADOS SERIE N° 15. 110
TABLA 19.- RESULTADOS SERIE N° 16. 110
TABLA 20.- RESULTADOS SERIE N°17. 111
TABLA 21.- RESULTADOS SERIE N° 22. 111
TABLA 22.- ACTIVIDAD CITOTOXICA DE ALCALOIDES DE Aristotelia. 125
 INDICE DE ESQUEMAS.

ESQUEMA 1.- ESQUEMA GENERAL DE BIOS INTESIS DE

ALCALOIDES INDOLICOS.- 12
ESQUEMA 2.- ESQUEMA DE BIOSINTESIS DE ALCALOIDES
INDOLICOS DEL GENERO ARISTOTELIA. 13
ESQUEMA 3.- FORMACION DE SISTEMAS -CARBOLINOS. 13
ESQUEMA 4.- REORDENAMIENTO A POSICION a. 14
ESQUEMA 5.- FORMACION DE ALCALOIDES -CARBOLINOS. 14
ESQUEMA 6.- POSIBLE RUTA HACIA ARISTONA. 15
ESQUEMA 7.- RUTAS BIOSINTETICAS DE LOS ALCALOIDES TIPO
ARISTOTELIA. 17
ESQUEMA 8.- RUTAS BIOSINTETICAS DEL GENERO. 18
ESQUEMA 9.- REORDENAMIENTO HACIA ARISTOTELONA. 23
ESQUEMA 10.- CICLACION DE HOBARTINA A ARISTOTELINA. 23
ESQUEMA 11.- REACCION DE MANNICH DE ARISTOMAKININA. 24
ESQUEMA 12.- ESQUEMA DE SINTESIS DE ARISTOTELINA. 25
ESQUEMA 13.- DIVERSAS APLICACIONES Y USOS FARMACOLOGICOS
DE ALCALOIDES INDOLICOS. 29
ESQUEMA 14.- FORMACION DE 3 A-IPP A PARTIR DE ACETIL-00A. 34
ESQUEMA 15.- FORMACION DE 2AISOPENTENILPIROFOSFATO(IPP). 35
ESQUEMA 16.- BIOSINTESIS DE AUXINAS NATURALES. 49
ESQUEMA 17.- SECUENCIA DE EXTRACCION DE ALCALOIDES. 82
ESQUEMA 18.- SINTESIS DE 2,2,4,6TETRAMETIL3-AZABICICLO[3.3.11-N0N
3,6-DIENO, 50. 86
ESQUEMA 19.- FORMACION DE INTERMEDIARIOS ORGANO-MERCURIALES
EN LA SINTESIS DEL COMPUESTO 50 120
ESQUEMA 20.- ESQUEMA GENERAL DE LA SINTESIS 121
 1

RESUMEN

Arístotelia chilensis (Mol) Stunz. forma parte de las

Elaeocarpaceae, una familia representada en nuestro país por dos
géneros (Aristotelia y Crinodendron).
Estudios anteriores de extractos totales de Aristotelia chilensis,
muestran la existencia de un gran número de alcaloides, de estos se han
aislado e identificado: aristotelina, aristotelinina, aristotelona, aristona,
makonina, aristotelinona, 8-oxo-9-dehidrohobartifla y 8-oxo-9-
dehidromakomakina, junto a otros compuestos como terpenos,
flavonoides, cumarinas y antraquinonas.
Estos alcaloides, todos de tipo indólico, son muy semejantes a
otros alcaloides indóUcos conocidos, con importante actividad biológica.
Ellos poseen un gran interés químico y farmacológico por su potencial
actividad citotóxica y antineoplásica.
Esta tesis informa en primer término el aislamiento desde
extractos de planta de un nuevo alcaloide de tipo quinolínico,
aristoquinolina y además los alcaloides tipo aristotelia, hobartina,
serratolina, makomakina, sorrelina, aristona, aristotelinona, makonina y
aristotelina, junto con una cumarina, la escopoletina, y otros compuestos
conocidos como flavonoides y terpenos.
Algunos de estos alcaloides son totalmente nuevos para la
planta; pero ya han sido informados para el género, los rendimientos son
muy bajos, hecho que dificulta los estudios de actividad biológica..
Para aumentar los rendimientos se intentaron dos rutas, una fue
la síntesis química de estos compuestos, vía que resultó muy difícil, lenta
y costosa; realizándose un intento de síntesis de aristotelina. La otra es
mediante la biotecnología de cultivos de tejidos in vitro, que permitió
incrementar los rendimientos, manipulando la maquinaria bioquímica de
las células.
 mí

Esta ruta tiene una potencialidad enorme, dado que

antecedentes de otras especies muestran que se ha logrado a través de
ella, aumentar los rendimientos de alcaloides en forma considerable.
El cultivo de tejidos vegetales es la técnica, utilizada hoy en dia,
para la producción de nuevos prototipos de moléculas biológicamente
activas, sin destruir los recursos naturales.
Esta tesis, muestra los resultados de los procesos para la
obtención de alcaloides indólicos tipo aristotelia, y describe la técnica de
cultivo de tejidos in vitro, disponible para la investigación de los
procedimientos de producción de metabolitos secundarios
biológicamente activos, a gran escala.
Este proceso biotecnológico se desarrolló para la obtención de
los alcaloides de la especie endémica de Chile, Aristotelia chilensis (Mal)
Stunz, conocida con el nombre vernáculo "Maqui". El aislamiento de
estos alcaloides directamente desde la planta, produce muy bajos
rendimientos, mientras que mediante esta tecnología se logró obtener un
rendimiento promedio del orden de 0,5% de extracto alcaloídeo total.
Desde los cultivos de tejidos, a través, de diferentes técnicas
cromatográficas y espectroscópicas, se determinó la presencia de 6
alcaloides, aristotelina, aristotelinona, aristona, makonina. 8-oxo-9-
dehidrohobartina, y 8-oxo-9-dehidromakomakina.
 VIII

ABSTRACT

Aristotelia chilensis (Mol) Stuntz, is a member of the

Elaeocarpaceae family, represented in Chile by two genera: Aristotelia
and Crinodendron.
Previous reports of A.chilensís has informed about a large
number of interesting indolic alkaloids. They are: aristoteline,
aristotelinine, aristotelone, aristone, makonine, aristotelinone, 8-oxo-9-
dehidrohobartine, and 8-oxo-9-dehidromakofllakifle. Together to other
compounds as terpenes, flavonoids, coumarines and antraquinones.
These alkaloids of aristotelia types are very similar to other
indole alkaloids of important biological activity as citotoxic and anticancer.
This thesis report the isolation of a new quinoline alkaloid:
aristoquinoline, in addittion to: hobartine, serratoline, makomakine,
sorreline, aristone, aristotelinone, makonine and aristoteline, together with
escopoletine and other cornpounds as flavonoids and terpenes from the
plant extract. Sorne of these alkaloids are new for this plant, but they
have been informed previously in the genera. The yields of these
alkaloids are very poor. Therefore this situation make difficult the
biological activity studies.
In arder to improve the amount of these compounds it was
attempted unsuccessfully the synthesis of them. In arder to solve this yield
problem was designed a biotechnological procedure with callus culture,
which permitted to increase the yields to 0,5%.
This procedure has potentiality because sorne reports shown
that is possible to increase the yield of secondary metabolites throught
this technique.
 lx

The tissue culture is very useful today for production of

biologically active molecules to avoid destruction of the natural resources.

Therefore using this biotechnological procedure it was

obtained, from tissue culture of A.chilensis, severa¡ alkaloids: aristoteline,
aristotelinone, aristone, makonine, 8-oxo-9-dehidrohobartine and 8-oxo-9-
dehidromakomakine, in a better yield compared with the plant extract.
 ABREVIATURAS USADAS EN EL TEXTO

MS/.. Notación usada por el grupo de trabajo, para denominar

los compuestos aislados.

m/e 6 mlz razón masa/carga en el espectro de masas.

h hombro presente en el espectro UV.

f señal fuerte en el espectro ir.

v-f señal fuerte a variable en el espectro ir.

y señal variable en el espectro ir.

br.s singlete ancho en el espectro RMN-H'

S singlete en el espectro RMN-H'.

m multiplete en el espectro RMN-H'.

d doblete en el espectro RMN-H'.

dd doble doblete en el espectro RMN-H'.

ddd doble doblete de doblete en el espectro RMN-H'.

t triplete en el espectro RMN-H'.

 1.- INTRODUCCION

1.1.- ANTECEDENTES DE LA ESPECIE EN ESTUDIO.

Actualmente existe gran interés en los alcaloides indólicos
producidos por plantas de origen chileno, con estructuras muy
semejantes a los comercializados y que poseen un amplio uso
farmacológico como por ejemplo: estricnina, fisostigmina, reserpina,
ajmalicina, vincristina, vinblastina, etc. (5).
Sobre la base de lo anterior, es que se ha hecho tan importante
obtener los alcaloides indólicos desde la especie chilena Aristotelia
chilensis, "maqui", ya que como se muestra mas adelante estos poseen
características químicas y estructurales muy interesantes y de una
potencialidad farmacológica muy prometedora.
Dentro de un programa de "screening" de la flora chilena
realizado en el Laboratorio de Química de Productos Naturales de la
Universidad de Concepción, se determinó que extractos obtenidos de A.
chilensis presentan actividad antibacteriana frente a StaphylocoCCuS
aureus y Sarcina tutea, y actividad antitumoral frente a Carcinoma
nasofaríngeo. (1, 2)
Aristotelia chilensis pertenece a la familia Elaeocarpaceae, que
es relativamente pequeña, mundialmente está representada por 12
géneros y aproximadamente 400 especies, que crecen en regiones
subtropicales y templadas.
Antecedentes bibliográficos del estudio químico de la familia
muestran que muchos de sus géneros presentan compuestos
interesantes de tipo alcaloide. Por ejemplo Eleocarpus presenta
alcaloides de tipo indolizidinicos; Peripentadeflia de tipo pirrolizidínicos y
Aristotelia indólicos. Muchos de estos alcaloides tienen una importante
actividad biológica (3).
 En Chile la familia ElaeocarpaCeae está representada por sólo
dos géneros y tres especies, Aristotelia chilensis (maqui), Crinodendron
hookerianum (chaquihue) y CrinodendrOfl pata gua
(patagua) y se
encuentran distribuidas entre la IV y la Xl región del país.

A. chilensis ha sido muy utilizada en medicina popular

especialmente por el pueblo Mapuche, para curar úlceras intestinales y
de la boca, como potente febrífugo y antitumoral. Ya en 1889 Murillo cita
su uso en el tratamiento de tumores, además se cita como astringente y
muy eficaz en disenterías y diarreas. (4, 6).
Sobre la base de estos antecedentes se han hecho estudios
químicos de Aristotella chilensis y se han aislado desde la planta, 8
interesantes alcaloides de tipo indólico, hasta hoy, en muy pequeña
concentración, como es típico en el trabajo fitoquímicO. Así no ha sido
posible realizar estudios de tipo biológico completos, muy importantes
para determinar la actividad biológica de estos compuestos-(7, 8 a y b).
La utilización de cultivos de tejidos, en A. chilensiS, ha permitido
detectar la presencia de alcaloides, cuantificarlos y comparar su
rendimiento con los obtenidos de la planta.
Estudios previos sobre la actividad biológica indican que algunos
alcaloides tipo aristotelia, por ejemplo, aristotelina es inactiva frente a la
inducción de interferón en ratas y decrece el flujo sanguíneo y el pulso en
ratas. (9).
Los primeros estudios realizados por Torres R. y Comin J.(10),
informan la presencia de -sitosterol, quercetina y una compleja mezcla
del alcaloides. Posteriormente, Bittner M. y col.(11), aislaron e
identificaron las primeras cuatro estructuras de alcaloides indólicos,
aristotelina 1, aristotelona 2, aristoteliflifla 3 y aristona 4, (fig .1).
 o

EZIIJLiiiN CN
1
H

3
Figura 1.- Primeros Alcaloides Aislados desde Aristotelia chílensis
Dentro de una nueva investigación química de la planta realizado
por Céspedes y col. (12, 13 a y b), se identificó otras cuatro nuevas
estructuras de alcaloides indólicos, 8-oxo-9-dehidrOhObartifla 5,
makonina 6, aristotelinona 7 y 8-oxo-9-dehidromakOmakifla 8, junto
con una quinona la 2metoxi-4,8-dihidrOXi-6-metil antraquinona 9 y un
flavonoide conocido, la quercetina jQ, (fig.2).
 4

Es

5 W.
o

8
7
OH

OH O

OMe
HO

OH
O OH w
_ un o
OH

lo
9
Figura 2.- Nuevos alcaloides y otros metabolitos en A.chilensis
 5

Investigaciones realizadas en otras especies del género

Aristotelia, presentes en Australia y Nueva Zelanda(3, 14), informan la
presencia de un número importante de alcaloides indólicos (fig. 3, y
Tabla 1).
 6

Tabla 1. Alcaloides aislados del género Aristotelia. (3, 7, 8, 9, 13, 83)

Especie
ALCALOIDE 1 2 3 4 5
Opeduncutaria +(15-30)
isopeduncutaria +(0-10) +(20) +(53)
aristoserratina +05) +00)
'sorrelina +(0,5)
serratolina + (=) +(20)
tasmanina +(0,5) +(15}
makonina + (6) +(8)
makomakina +(14)
aristomakomakiria +(6)
aristoserratenifla +(9)
aristomakina + (11)
hobartina +(0.07)
isohobartina +(6) +(2)
serratenofla +(7)
isorrelina + (11) +(2)
aristofruticosina +08)
fruticosonina +(20)
aristotetinona +(27) + (6)#
aristotelina +(15) +(700 +(17)
aristotelona + (1)
aristotelinina +(0,7)
aristona +(0,4)
peduncularistina +(0,18)
triabunina +(0,15)
aristolaria +(0,11)
bis-aristona + (=)
anstolasicona ± ()
17- hidroxihobartina +(35)
hobartidiol +(496)
aristolasol + (=)
aristotasene + ()
fruticosotine + ()

(#) recién determinada N° de especies

(=) cantidad indeterminada 1 A. peduncu/arís (Labiti) Hook F.
(+) presente en la especie (mg aislados) 2 A. serrata (J.B. & G. Forst) W.R.B.
Oliver
3 A. fruticosa Hook F.
4 A chi/ensis (Mol). Stunz
5 A. austra/asica F.v.M.
 7
Ari1omnkifl8 Hobrtina

Il1 UNH H

Se rra le nona
sohobMtir

Isosorrelina Aristofruticosina

QN -

Arictotelinona
Fruicoson ¡na

17 7

Figura 3.- Estructuras de Alcaloides indolicos aislados en el género.

 8

Peduncularistina Triabunina

Aristolasicona
Aris tota rina

jO
21
20

Hobartiniol
1 7-hidroxihobartjna

OW OH
OH

22 23

Continuación Fig. 3.- Estructuras de alcaloides indólicos aislados en el

género.
 9

Peduncularina Isopeduricularina

24

Yb 25

Aristoserrtina Sorrelina

WN

27 -

Serratolina Tasmanina

OH H

MI
Makonina
Ma k orn ak 1 n a

Oj N

WN-
6
Aristomakinina
Aristo6erratefllfla

OZ' ME
32

Continuación Fig.3.- Estructuras de alcaloides Indólicos aislados en el

género.
1.2.- BIOSINTESIS , QUIMICA Y SINTESIS DE ALCALOIDES
INDOLICOS

Biosíntesis.
La ruta biosintética que origina a la mayoría de los alcaloides
indólicos, se relaciona con las vías metabólicas de los compuestos
fenólicos, flavonoides y terpenos, lo que involucra la vía del ácido
shiquímicO, (ver fig. 4, y esquema 1), (18).
En el esquema 1 se muestra la ruta general de biosíntesis de los
alcaloides en los vegetales.
Prácticamente todos los esqueletos de los alcaloides se originan
a partir de los aminoácidos: L-ornitina, ácido nicotínico, L-Iisina, L-fenil
alanina, ácido antranílico, L-histidina, L-triptofano, L-triptamina y otros.
En el caso particular de los alcaloides indólicos de Aristotelia,
estos se formarían a partir de una condensación entre una unidad
triptamina 33 ó triptofano y una unidad monoterpenoide no reordenada tal
como geranio 1, o nerol 34, (ver esquema 7), (19).
La condensación inicial da lugar a un intermediario 35, el cual
puede ser transformado en fruticosonina ji, makomakina 30, aristotelina
1, aristoserrateflifla 32, tasmanina 29, aristotelinona 7, makonina 6,
aristotelona 2, y serratolina 28, mediante oxidaciones, ciclaciones y
etapas de reordenamientoS. Como se muestra en el esquema 2 en
particular y en el esquema 7 en general.
La mayoría de los alcaloides indólicos son formalmente derivados
desde una condensación de Mannich de triptamina con un aldehido
alifático (que tenga 9 ó 10 átomos de carbono) en las posiciones a Ó 13
del núcleo indol. (20).
 'a O
4) a:
4)
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11
H

LIIIDIIII::;
30 36H
Esquema 2.- Esquema de biosíntesis de alcaloides indólicos del
género Arístotelia.

Triptofano 55 o triptamina 33 pueden condensarse con un

aldehído apropiado para formar una base de Schiff la que puede se
atacada intramolecularmente por la posición a del núcleo indol para dar
a correspondiente indolamina 37, (ver esquema 3):
NH2
JH

Z
I n -9

H+

EILJIIiflH c:rç3 (

H39-
ESQUEMA 3.- FORMACION DE SISTEMAS -CARBOLINOS.-
R
 14

La formación de sistemas fi-carbolinos o (productos de a-

condensación1 lo que es falso) pasa por una indolenina 40 desde una fi-
condensación, la que reordena por migración del grupo R 2 a la posición
a. (ver esquema 4):

R1 R

+H+
R2
CIZ
I.-"t
IR2
ESQUEMA 4.- REORDENAMIENTO A POSICION a.-
Entonces la formación de alcaloides fi-carbolinos propuesto
corresponde a: (21)
^ cio
c:::IIIIIJIIIIII-:IIIIII------•----- -
H

ESQUEMA 5.- FORMACION DE ALCALOIDES -CARBOLINOS.

 15

Una secuencia de reordenamiento oxidativo de una

hidroxiaristotelina (hidroxilo unido al C-19, marcado en el esquema 7), es
la secuencia 1 - 43 - 2, la que muestra cómo se podría llegar hasta
aristotelona, similar a esta secuencia es la mostrada en el esquema 6,
donde desde aristotelinina 3 se llega a un indoxilo 41 (el cual es una
hidroxiaristotelona) seguido por la interacción del N-10 con el grupo
carbonilo-indoxilo y la transferencia intramolecular de un hidruro en el ión
carbonio 42 así generado (11, 8b). Con lo cual se puede generar aristona
4 como se muestra en el esquema 6.

H
(I.-4

HO

3 41 '1

o HO

4 42

ESQUEMA 6.- POSIBLE RUTA HACIA ARISTONA.-

La isomerización de makomakina da hobartina mientras que la

oxidación produce sorrelina 27 y la formación de un enlace entre el N-10
y el C-16 en sorrelina puede dar origen al esqueleto de aristofruticosina
16. En el esquema 8 se muestra que la oxidación de uno de los grupos
metilos geminales en sorrelina produce un intermediario 47 la
fragmentación de lo cual da el esqueleto de peduncularina 24. Un camino
 16

más aceptable hacia peduncularina, sin embargo, consiste en la

biosíntesis de 41 desde 10-hidroxinerol 46 un precursor conocido de
alcaloides indólicos derivados de secologanina en Catharantus roseus
(23), por una ruta análoga a la postulada para sorrelina. El grupo
isopropilo sobre el N-10 en peduncularina se puede predecir así que
viene desde isopropilideno de geranio¡ o nerol, vía el apropiado 10-
hidroxiderivado (19). (Ver esquemas 7 y 8)
Todos estos antecedentes muestran la conveniencia y la
necesidad de conocer suficientemente las interrelaciones químicas que
se producen, antes de trabajar en la inducción de biosíntesis de
alcaloides en los cultivos de tejidos.
Los informes sobre la producción de otros alcaloides indólicos
con actividad biológica por medio de cultivo de tejidos muestran la
conveniencia de usar los monoterpenos hidroxilados como 10-
hidroxigeraniol, 10-hidroxinerol y secologanina en conjunto con los
aminoácidos triptamina 33 L-triptofano (24). La utilización de este
tipo de compuestos en los medios de cultivo es muy importante ya que
todos los esfuerzos apuntan a la obtención de alcaloides indólicos
eficientemente sintetizados.
Existen otros antecedentes sobre el uso de enzimas acopladas
en los procesos anteriores dentro de la secuencia biosintética de este
tipo de alcaloides y será probablemente la principal línea de
investigación en este campo de la biotecnología en el futuro cercano en
nuestro país. Diversos investigadores ya tienen antecedentes sobre la
inducción de la producción de alcaloides mediante el trabajo con enzimas
(25).
Sobre la base de lo anterior, se puede predecir entonces, que
tipo de estructura podria ser generada, al manejar artificialmente la
presencia de diversos monoterpenos y aminoácidos dentro de la
maquinaria bioquímica de la célula vegetal.


17

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Ma}onifla T..ri stornakina AristotelOna

1
Aristomakinlna 31

Esquema 7.- Rutas biosintéticas de los alcaloides presentes en el

género.


Me
cIC.7
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7 1 7
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44
Hobartina12 R=H2
Se rra ten p hd =0

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H
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Sorrelina

Taanina -
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Peduncuiarifla
1 19
4

Esquema 8.- Rutas biosintéticas de los alcaloides del género.

Desarrollo de la química de alcaloides.
Desde 1818, año del descubrimiento de la estricnina, a partir de
el Strichnos flux vomica, hasta el año 1947 (año en que la estructura de
la estricnina fué definitivamente establecida), el progreso y el desarrollo
de la química de los alcaloides fué muy lento (129 años). Durante este
tiempo los químicos lograron grandes avances, a veces en forma
brillante, como la microcombustión de PREGL, con la que se logró
empezar a formar los llamados "bancos de material". Aún así los
investigadores químicos trabajaron por intuición, y se necesitó una gran
dosis de creatividad de química.
Un paralelo entre las ventajas y desventajas entre la química de
entonces y la de hoy, puede resumirse en:
1.-Si bien fué un excelente creador, por lo mismo, no vió las ventajas
de una correlación de datos.
2.- No fué posible si no hasta la década de los 60 utilizar los avances de
la espectroscopía.
La metodología empleada hasta ese entonces y hoy se puede
resumir como sigue:
1.- Se trató de establecer la naturaleza de la estructura molecular, por
conversión de ésta en fragmentos identificables (usualmente compuestos
aromáticos). A menudo, mediante oxidaciones vigorosas,
deshidrogenación o pirólisis bajo condiciones básicas.

2.-Se detectó y estimó los grupos funcionales.

3.- Se buscó por interrelaciones entre los grupos funcionales sus
ubicaciones sobre la molecula.
4.- Se trabajó, si era posible, otros alcaloides relacionados.
 20

5.- Se intentó utilizar una ó mas funcionalidades como punto de partida

para una etapa de degradación.
Durante todo este período se desarrolló en forma paralela las
distintas técnicas basadas en las propiedades físicas de la materia. (IR,
Uy , RMN-H, RPE, RAMAN, rayos X, etc.)
No fué sino hasta 1962, cuando la estereoquímica absoluta de la
estricnina, quedó totalmente confirmada mediante difracción de rayos- X.
Sobre la base de lo anterior entonces es posible distinguir
algunos tipos de reacciones típicas para los alcaloides, como:

1.- Oxidación: Con Hg(OAc) 2 , este oxida a las aminas terciarias, que
tengan un H-a, convirtiendolas en iones ¡MINIO los que pueden perder
rapidamente un H en R y dar enaminas.
Esta reacción es diagnóstico para la estereoquímica al C-3,
procede si el H es trans al par de electrones del N (alcaloides tetrahidro-
I'-carbolinos).
Como por ejemplo los alcaloides indólicos tipo aristotelia,
aristotelinona y makonina.
Un ejemplo general es la oximercuración de la quinolizidina:
H

Hg(OAc)2

HOAc/H20 CNO 60%

2.- Reacciones genéricas: Estas se realizan en solución o sobre una

placa cromatográfica.


21

Dentro de las primeras se tiene el test de Meyer, que consiste en

la precipitación del alcaloide mediante una sal de mercurio, cuya reacción
tomando como ejemplo a la estricnina:

KHgl3 ]+ HCI + KCl

El precipitado es de color amarillo claro.

Con respecto a las que se realizan sobre una placa

cromatográfica, estas se denominan reacciones de coloración, y las mas
comunmente utilizadas son las correspondientes al reactivo de
Dragenndorff y al reactivo de Ehrlich.

El test de Dragenndorff consiste en la precipitación del alcaloide

como un complejo de bismuto, que muestra coloraciones anaranjadas de
intensidad variable, la reacción tomando como ejemplo la oxiquinolina es:

1 + K[BIL] + H2SO4 + KHSO4

OH N}
0

Con respecto al test de Ehrlich para alcaloides este consiste en

una reacción entre un alcaloide y p-dimetilaminObeflZaldehídO1
produciéndose un compuesto altamente coloreado (púrpura), la reacción
tomando como ejemplo un pirrol (86) es:
 2
R R3
R2 R3^
R iO OHCN( RC/

R2 R3
R 2 R3

Esta reacción se utiliza para determinar si está o no sustituida la

posición alfa del núcleo indólico.
Además existen diversas reacciones para determinar estructuras
de los alcaloides como por ejemplo la degradación de Hofmann (o
metilación exhaustiva), la degradación de Von Braun y la degradación de
Emde. Aparte de las de degradación están las de deshidrogenación con
paladio, las de oxidación tanto con permanganato de potasio como con
acetato mercurico, la fusión alcalina con hidróxido de sodio y las de
reducción tanto con LIAIH 4 , como con NaBH4.
Con respecto al caso particular de los alcaloides presentes en
Arístotelia, estos han mostrado un comportamiento bien definido (26). Es
así como el principal alcaloide del género aristotelina 1, presente en
hojas de A. chilensis, raíces de A. Serrata y A. peduncularis, posee la
estructura básica y en torno a la cual estan relacionadas la mayoría de
los alcaloides del género y sus derivados. La aristotelina se convierte en
serratolina 2, por oxidación con peróxido de benzoilo (PhCOO) 2 y
seguido por reducción con ditionito. A su vez la serratolina se reordena
en medio ácido a aristotelona 2.
 23

OH H

:::::2

1
/
W

Esquema 9: Esquema de reodenamiento hacia aristotelona.

Otro tipo de estructura presente en el género Aristotelia, es la
que corresponde a las 2,11-secoaristoteliflaS, como horbatina 12,
sorrelina 27, makomakina 30, isohorbatina 13, 8-oxo-9-dehidrohobaítifla
5, 8-oxo-9-dehidromakomakina 8
Makomakina y horbatina, por ciclación en medio ácido a
temperatura ambiente, se convierten ambas en aristotelina 1.(ver
esquema 10):
H

12 ó'30
Esquema 10: Reacción de ciclación de hobartina a aristotelina.
 24

Un alcaloide obtenido desde la especie A. serrata,

aristomakinina 31 tiene la particularidad de poseer 17 átomos de carbono
en lugar de 20, sin embargo al someter a este alcaloide a una reacción
tipo Mannich, seguida por reducción con borohidruro de sodio, se
produce aristomakina 11.(ver esquema 11):

NH
1 Me2CO

i_i
Esquema 11: Reacción de Man nich de aristomakinina.
Dada la enorme importancia de los alcaloides, se han descrito
muchos métodos y reacciones para obtenerlos e identificarlos. Sin
embargo, como es común en el estudio de la química de los productos
naturales, a veces no es posible realizar estas últimas reacciones ya que
las cantidades obtenidas son muy pequeñas.
En estos casos se recurre a la ayuda de las tecnicas de
absorción electromagnéticas, debido a que estos tipos de compuestos se
relacionan estrechamente entre sí por poseer estructuras casi idénticas,
ello nos permite, a la vez, establecer correlaciones estructurales
espectroscó picas, tanto U.V.;l.R; RMN-H'; RMN-C 13 y espectrometría de
masas, situación que se utiliza para elucidar nuevas estructuras de
alcaloides.
 25

Síntesis Química de Alcaloides Indólicos -

Los antecedentes muestran la posibilidad de realizar síntesis
química de alcaloides tipo aristotelia a partir de a. y 0 pinenos.(27) Así por
ejemplo se ha realizado en totalidad la síntesis de aristotelina a partir
principalmente de (+)-a-pineno 49 (28), monoterpeno que se hace
reaccionar con acetonitrilo (CH 3 CN) en presencia de nitrato de mercurio
II, el que actúa tanto como agente catalizador, como agente inductor de
la estereoselectividad de la reacción formando un complejo con el a.-
pineno, hecho conocido por la oxidación alílica de olefinas (29), a través
del doble enlace monoterpénico, dejando así la posibilidad de que el
nucleáfilo del acetonitrilo ataque al carbono cuaternario del pineno,
mediante una reacción de tipo Ritter(30). El producto a obtener en esta
primera fase, es racémico debido al rápido equilibrio organo-mercurial
(29).

CH3CN

Hg(NO3)2

49 50
satina

1. KBH.
2. LAH
3.HCIL\

1 51

Esquema 12: Esquema de síntesis de aristotelina

 26

El compuesto 50 se condensa con isatina (EtOH, piperidina,

reflujo, 30 minutos) para producir el oxindol 51, el que contiene todos los
requisitos para proseguir posteriormente con la proxima etapa de
reducción débil con KBH 4 , donde se reducen los carbonos C-3', C-4 y C-
12, la reducción con KBH 4 de la ¡mina procede este reoespecificamente,
que es el resultado de un ataque axial sobre un anillo de seis miembros.
Luego en una etapa posterior es posible lograr la reducción del grupo
carbonilo con LAH en fase eterea, para obtener tanto hobartina 12 como
makomakina 30. Finalmente la transformación de estas secoaristotelinas
en aristotelina 1, se logra al someter a estas a un reflujo por 8 horas en
una solución de HCI concentrado, obteniendose una ciclación con un
60% de rendimiento (esquema 12).
Además desde 3-pineno se obtiene makomakina y hobartina (28),
pero los productos son racémicos debido al rápido equilibrio del
intermediario organo-mercurial, también se ha obtenido hobartina y
aristotelina a partir de (-)-3-pineno(27).
Se ha sintetizado también (-)-Alloaristotelina, (-)-Serratolina y ( 4-)
Aristotelona, a través del procedimiento de Stevens y Kenney, mediante
una reacción de acoplamiento entre (1S)-(-)-3-pineno y 3-
indolilacetonitrilo(31).
Antecedentes de sintesis de alcaloides tipo aristotelia, a través de
otros materiales de partida , muestran la sintesis total estereocontrolada
de (-)-hobartina y (+)-aristotelina, a través de indol y (S)-(1-p-menten-8-
il)amina en 11 etapas y 19% de rendimiento (32).
El grupo de Borschberg y Burkard ha postulado una serie de
síntesis de alcaloides tipo aristotelia utilizando diversos monoterpenos y
compuestos indol sustituidos(33); es posible mencionar además que se
ha sintetizado completamente peduncularina y 7-epi-peduncularina, a
través de ácido (S)-malico utilizando la asistencia de un ión N-
aciliminio.(34)
 MM

Existen además diversas síntesis biomimeticas de distintos

alcaloides tipo aristotelia, las cuales han mostrado buenos
rendimientos. (35, 36).
 2

1.3.- APLICACIONES DE ALCALOIDES INDOLICOS

Diversos alcaloides de tipo indólicos poseen una marcada
actividad biológica, por ejemplo: ácido lisérgico (alucinógeno), reserpina
(hipotensor), estricnina (actividad sobre sistema nervioso central,
además un potente veneno), vincristina-sulfato (Oncovin, leucemia),
vinbtastina-su¡fato (Velban-leucemia), fisostigmina (oftalmologia), y
muchos otros. (5, 41, 42). En el esquema 13 se puede apreciar la amplia
variedad de fuentes y usos farmacológicos de alcaloides de tipo indólico.
Un gran número de alcaloides son utilizados no sólo como
potentes fármacos, sino que también, como un medio para resolver
mezclas racémicas, ya que la mayoría de estos compuestos son
producidos por las plantas en sólo una de dos formas enantioméricas
posibles.
 29
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 33

1.4.- BIOSINTESIS DE PRECURSORES MONOTERPENICOS

El ácido acético es uno de los compuestos orgánicos mas

importantes dentro de los seres vivos, pues se utiliza como punto de
partida para la elaboración de un gran número de compuestos químicos.
Para poder utilizar el ácido acético, es necesario primero activarlo y
para ello ocurre una esterificación con un grupo tiol de una molecula
conocida como coenzima A (abreviadamente HS-CoA), produciendo una
molecula conocida como acetil-00A o acetato activado, que es el
precursor básico del ácido mevalónico, que a su vez es el precursor
universal de los terpenos, estereoespecíficameflte es el ácido-(+)-R-
mevalónico 52.(fig.5).(37).

H9 CH3 Hs H

COOH
52
Figura 5.- Acido-(+)-R-mevalonicO.

El metilo del acetil-00A resultante es muy reactivo y se

carbonata fácilmente con dioxido de carbono dando una molécula más
reactiva, el malonil-CoA. La biotina desempeña un papel esencial en esta
reacción de carbonatación. Luego se produce una fosforilación del
malonil-00A, dando origen al isopentenil-pirofosfato 53, que es el
precursor principal de los monoterpenos y de los terpenos en general
(ver esquema 14)
 34

HO

C SCoA
H3C SCoA H2 OH

COOH
H+

H2C o PP

53

Esquema 14.- Formación del ¿- IPP a partir de acetil-CoA.

A partir de IPP se forman posteriormente la mayoría de los terpenos,

como es de conocimiento general (ver fig.6)
MV#i
A
HEMITERPENOS(C)

ipp-. DMAPP

. MONOTERPENOS (C10)
GERANILPIROFOSFATO(GPP)
E
SESQUITERPENOS (C15)

FARNESILPIROFOSFATO(FPP)
• TRITERPENOS (Cx)
F
DITERPENOS (C)
GERANILGERANILPIROFOSFATO(GGPP
TETRATERPENOS (C40)

HI H______
GERANILFARNESILPIROFOSFATO(GFPP) SESTERTERPENOS (C25)

POLIPRENOLES
K
(e.gCASTAPRENOLES) Y
POLIPRENILPIROFOSFATO POLITERPENOS (eg.: GOMAS Y
CAUCHO
Figura.6.- Esquema general de la biosíntesis de los terpenos.


35

El IPP es primero isomerizado por la sulfidril enzima, IPP

¡somerasa para formar el dimetilalilpirofoSfatO (DMA-PP), también
conocido como A 2 -isopentenilpirofoSfatO 54. (Ver esquema 15).
ataque electrofilico HdeI medio

HJC}±OPP L,CI420PP
H\)CH2P
H H Hs H(HÍ Hs
-H2 pro R del IPP
54
Esquema 15.- Formación de A 2 -isopentenilpirofosfatO.-

Los hemiterpenos se pueden originar del IPP o DMAPP (A

fig.6).
DMAPP, también actúa para producir la elongación de la cadena
bajo la influencia de la enzima preniltransferasa que se condensa con
una molécula de IPP para formar el C-10 geranilpirofosfato GPP (B, fig
6).
El GPP, puede formar por un lado monoterpenos (C, Fig 6) o
condensarse con otra molecula de IPP para formar el C-15
farnesilpirofosfato, FPP (D, fig. 6).
A partir de GPP, se producen, en la mas variada gama de
especies vegetales, un sinnumero de monoterpenos, entre los mas
conocidos se pueden visualizar: geranio!, nerol, terpineol, limoneno,
etc.etc. Diversas estructura químicas de algunos de los monoterpenos
mas conocidos se muestran en la fig. 7. (38).
 Abiertos

Cftronelol
Geraniol
Citral

Monociclicos

Timo¡
Mentol
Limoneno

Biciclicos

í-pneno alcanfor
u—pineno

Figura. 7.- Estructuras químicas de algunos Monoterpenos.

La producción de alcaloides indólicos, por cultivo de tejidos,

generalmente se realiza con la incorporación de monoterpenos, los que
se utilizan como precursores. En la biosintesis de los alcaloides indólicos
monoterpénicos uno de los aspectos que requiere una aclaración es la
vía de incorporación de 10-hidroxigeraniol/nerOl y loganina. Se ha
propuesto un número aproximado de 10 derivados oxigenados de
geraniol y nerol como intermediarios en la biosíntesis de estos
alcaloides.(39, 40).
 37

1.5.- LA TECNICA DE LA BIOTECNOLOGIA.

Sobre la base de los antecedentes químicos y biológicos previos
es interesante realizar los estudios sobre la obtención de alcaloides
indólicos tipo aristotelia, mediante la manipulación de cultivos de tejidos
de la especie chilena Aristotelia chilensis, ya que estos no han sido
realizados hasta hoy.
Desde que en los años 40 James Bonner (43) informó que
cultivos celulares de especies de "guayule" producen gomas, se
comenzó con investigaciones para la obtención y producción de
metabolitos secundarios desde cultivos de tejidos. Esto, apoyado por el
incentivo de la industria farmacéutica, condujo a los científicos a
desarrollar procesos biotecnológicos a escala industrial. Se han
investigado no menos de 50 categorías de productos, incluyendo
metabolitos secundarios con variada actividad biológica y enzimas
específicas; lo que ha conducido a la identificación de más de 200
productos. Las categorías más estudiadas han sido alcaloides, enzimas,
pigmentos, esteroides, terpenos, glicósidos y flavonoides. Algunas de
estas categorías seleccionadas por su alto potencial de interés industrial
se muestran en la tabla 2.
TABLA 2.- PRODUCTOS SELECCIONADOS DE INTERES
INDUSTRIAL.-
USOS PROCESOS Y/O FUENTES
ANTIMICROBIANOS Argostemma spp./Phytolacca spp (virus),
Catharantus spp (protozoa) , Lithospermum
(bacterias), Ruta spp. (fungus).
ANTITUMORALES Camptotheca, Catharantus, Maytenus,
Vinca, Podophyllum, Tryptergium.

ANTI ESPASMO DICOS Chamomille, Isodon, Valeriana.

ENZIMAS BIOTRANSFORMACION:
Cannabis, Digitalis, Lupinus, Mentha, Papaver.

PROTEOLITICAS: Carica, Ananas, Scopolía.

AROMAS DE ALIMENTOS Asparagus, Apium, AIIium, Capsicum,
Sinapis.

HIDROCARBUROS Asclepias, Euphorbia, Gua yule.

EDULCORANTES Glycyrrhiza, Hidran gea, Stevia.

TONICOS Blupleurum, Cínchona,

Coptis/Phellodendron, Panax.

VITAMINAS Biotina, 136.

INSECTICIDAS Derris, Pyrethrum.

De alto interés industrial es la producción del compuesto

antimicrobiano Shikonina desde Lithospermum, los alcaloides
antitumorales desde Catharantus y/o Vinca; la hidroxilación de metil-
 39

digitoxina a metil-digoxina; los aromas de alimentos; la producción de

berberina desde Coptis; la producción de biomasa de tabaco
corrientemente con ubiquinona-1 O y últimamente taxol y taraxerano
desde Taxus.
De todos los metabolitos secundarios conocidos como productos
naturales, más del 20% (es decir, cerca 16.000),estan clasificados como
alcaloides, muchos de estos poseen actividad biológica, pero
actualmente menos de 30 de estos son los que se comercializan (44).
Muchos de estos son usados como medicinas, pero algunos son
utilizados como aromas, venenos, y compuestos modelos para estudios
farmacológicos. Estos compuestos suelen ser clasificados como
especialidades quimicas, ya que el volumen de producción mundial es
muy limitado; alcaloides tales como quinina y quinidina tienen una
producción anual de 300-500 tons. metricas; ajmalicina cerca de 3.600
Kg, y compuestos semejantes a vinblastina y vincristina solo en el rango
del kilógramo (17), (ver figura 8).
El interés en la producción de metabolitos secundarios por medio
de biotecnología, esta dirigido en un alto porcentaje a la producción de
estructuras de alcaloides de tipo indólico, para los estudios de actividad
biológica, específicamente actividad antineoplásica y citotóxica. Estos
compuestos deben obtenerse en cantidades suficientemente adecuadas
para estos estudios y deben ser altamente purificadas para poder
obtener buenos resultados.
La biotecnología de cultivo de tejidos in vitro es un campo
altamente competitivo, donde algunas estructuras similares, se pueden
estar estudiando en varios laboratorios simultáneamente, luego el éxito
de la investigación sobre el proceso de obtención y producción de
alcaloides mediante esta tecnología, podrá contribuir a desarrollar
proyectos exitosos en esta área de investigación.
En el caso de los alcaloides de tipo indólico de Aristotelia
chilensis, se inició la micropropagación clonal de tejidos meristemáticos,
 40

preci

la

enina

Volumen (ton/año)
Figura 8 .- Precios y volumen de mercado de algunos productos
naturales, a través de la producción por biotecnologia
de cultivos celulares.
 41

para intentar obtener una mayor concentración de este tipo de

compuestos y así, hacer posibles los estudios sobre actividad biológica
de éstos, que son una fuente importante de nuevas moléculas con
potencial actividad biológica.
Los principios del cultivo de tejidos vegetales, como
biotecnología propiamente tal, contenidos en la teoría celular fueron
expresados por Schleiden y Schwann en 1838-1839 (45).
Esta teoría postula que, implícitamente la célula está dotada de
autonomía y de toti potencialidad.
Posteriormente numerosos científicos trabajaron arduamente
para llegar finalmente a la conclusión de que si la célula contaba con un
medio adecuado con suficientes sales minerales (macro y micro
nutrientes), algunos compuestos orgánicos y vitaminas, ésta podría
expresar plenamente su totipotencialidad y regenerar nuevas células
mediante mitosis que es lo que se conoce como regenaración clonal.
Continuas investigaciones, produjeron numerosas interrogantes
las que se fueron respondiendo paulatinamente, el principal problema fué
resuelto por Skoog y colaboradores, al descubrir en la leche de coco la
presencia de citominas (kinetina y zeatina) y auxinas que son
fitohormonas. (46).
Finalmente una combinación de auxinas, citominas y nuevas
combinaciones de minerales propuestas por Murashige y Skoog,
condujeron al desarrollo de lo que se conoce hoy día como la
biotecnología del cultivo de tejidos vegetales.(47).
Es esencial el conocimiento de todos los pasos y procesos que
implica el desarrollo de ésta técnica, tanto para la comprensión total de
las funciones de cada etapa, como para posibilitar la obtención de
metabolitos secundarios mediante inducción a través de precusores. De
este modo se altera la función natural de la célula vegetal de producir
determinado metabolito específico en concentraciones muy pequeñas.
(48).
 42

El uso de fitohormonas y aminoácidos esenciales; requiere de un

estudio minucioso del efecto que tiene cada componente, ya sea en
forma aislada como en combinación. Como así también, sus
concentraciones o relaciones molares.
El proceso para producir determinado tipo de metabolito se
realiza en cinco etapas consecutivas:
1.- Elección de los medios de cultivo.
2.- De las combinaciones de fitohormonas.
3.- De las combinaciones de precursores monoterpéricos y
aminoácidos conocidos por los mecanismos biosintéticos.
4.- Cultivo y selección de una línea (cepa) celular.
5.- Selección de la forma de producción o cultivo (agitada
o estacionaria).
De estos cinco pasos, dos son las etapas que constituyen un real
problema; en primera instancia la determinación de las combinaciones
de fitohormonas y sus concentraciones milimolares, y posteriormente el
cultivo y selección de una línea o cepa de cultivo celular. En menor
medida influye la selección de la forma de producción mediante cultivos
líquidos.
La determinación de las combinaciones de fitohormonas sigue
constituyendo un paso importante en el desarrollo de cualquier
investigación en esta área.
En las combinaciones de fitohormonas, se debe tener presente
dos variables al conformar una matriz factorial de combinaciones, que
son el tipo de fitohormona, auxina o citomina, sus características
estructurales químicas y sus concentraciones milimolares, cuyo fin es
lograr un crecimiento celular (callo) significativo, para alcanzar un
tamaño adecuado que permita manipularlos. Lo anterior es muy
importante, pues se debe llegar a producir callos que tengan una
consistencia adecuada (friable), esto se logra determinando la
combinación y características de las fitohormonas y eligiendo el medio de
cultivo apropiado.
 43

Este crecimiento celular puede ser dividido a su vez en las

siguientes etapas:
1.- Obtención de explantes estériles.
2.- Incubación del material vegetal en el medio del cultivo.
3.- Absorción de los nutrientes desde el medio de cultivo a la celula.
4.- Inducción de la mitosis con inductores del crecimiento
(citominas).
5.- Diferenciación celular, a través de inductores diferenciales:
elongación, diferenciación y formación de órganos, (auxinas).

6.- Obtención de metabolitos secundarios por las técnicas

adecuadas.
El procedimiento general para inducir crecimiento en cultivos
celulares in vitro se hace a través de una matriz factorial de
combinaciones de fitohormonas sobre un medio de cultivo fijo,
descartando aquellas combinaciones no significativas o que no son
propicias.
El establecimiento de las condiciones adecuadas para el
crecimiento de grandes aglomerados celulares (callos), aptos para
producir los metabolitos, constituye aún hoy día, una de las más
importantes etapas en esta área de investigación. Puesto que las
condiciones pueden establecerse sólo en forma empírica, debido a las
numerosas variables que es necesario considerar, cada una puede ser
alterada en pequeños incrementos, entonces el número de posibles
combinaciones parece ser en principio infinito.
 44

1.6.- QUIMICA DE FITOHORMONAS.

Los procesos de mitosis, crecimiento celular, diferenciación y
organogénesis, están regulados por la proporción de diversos
compuestos químicos llamados citokininas y auxinas que son hormonas
vegetales. Estas se pueden diferenciar y clasificar según la acción que
tengan sobre los tejidos vegetales, ya que estos promueven la mitosis, la
elongación y diferenciación celular.
La mitosis es promovida principalmente por las citokininas estas
son derivados de aminopurinas N6-sustituídos, aunque existen algunas
excepciones. La elongación celular es promovida por las auxinas, que
estan formadas por diversas estructuras aromáticas y que corresponden
principalmente a ácidos orgánicos aromaticos.
En la figura 9 se muestran las estructuras químicas de algunas
de las citominas y auxinas más frecuentemente usadas (48).
CH 2COOH
CH 2CQOH

LL T1

ACIDO NAFTALENACETICO
ACIDO INDOLACETICO

OCH 2COOH NH 2

J
CI

24-D

C ____
ADENINA

-Co
NI-1CH 21L
II HN-CH2-CHC
<H 20H

(IIIII
KINETINA
N
CH

ZEATI NA
H

Figura 9.- FORMULAS ESTRUCTURALES DE ALGUNAS AUXINAS

Y CITOMINAS.
 45

El término fitohormona no tiene la misma significación que el

término hormona ya que este último implica la necesidad de un sistema
circulatorio sanguíneo y requiere además de celulas productoras y de
celulas receptoras; en cambio el primero no necesita de un sistema
circulatorio como el anterior para su distribución y su investigación
responde a las siguientes preguntas:

1.-¿Qué estimulo externo o interno estimula su producción?

(síntesis o secreción).
2.- ¿En qué organelo, en qué tipo de célula y en qué parte de la planta
es sintetizada?
3.-¿Cuál es su célula objetivo o cuál es su producción?
4.- ¿Cómo es transportada?
5.-¿Cuál es su acción fisiológica?
6.- ¿Cómo es su acción fisiológica, cómo se lleva a cabo a nivel
molecular?
Todas estas preguntas se deben tener en cuenta al realizar una
investigación que implique el uso de fitohormonas.
Se reconoce para las plantas dos tipos de fitohormonas cada
una con efectos distintos muy notorios sobre el crecimiento:

a) Fitohormonas promotoras del crecimiento.

- Auxinas.
- Giberelinas.
- Citominas (o citoquininas).
b) Fitohormonas inhibidoras del crecimiento.
- Acido absícico.
- Etileno.
- Acido salicílico.
- Acido jasmónico.
- Acido brassinólico.
A continuación, se entregan antecedentes de fitohormonas
promotoras del crecimiento, las mas usadas en este trabajo.
 46

AUXINAS

El primero en descubrirla fué C. Darwin en 1880, luego Baysen y

Jensen en 1913 descubrieron la influencia química y posteriormente Paal
en 1919 descubrió el efecto sobre el crecimiento.

Went en 1928 nombra a la hormona como auxina del griego

'auxem", primera prueba de la presencia de auxina en plantas.

La identificación fué facilitada por el descubrimiento de 3

compuestos con actividad auxina en orina humana en 1934, una de ellas,
una hetero auxina, fué el ácido 3-indolacético 58 .. (AlA) (49). (Ver fig.9 y
esquema 16).

El porcentaje de AlA en plantas es del orden de 1-100 mg/kg

peso neto de tejido. El AlA no es la única auxina, si no que es la
principal.

Otras auxinas son derivados del indol y estrechamente

relacionado al AlA por ejemplo: 3 indol acetonitrilo (lAN) 61 (ver
esquema 16) y otros como el ácido fenilacético (50).

BIOSINTESIS:(51)

Las auxinas son sintetizadas principalmente en tejidos

meristemáticos. La principal AlA, a partir del L-triptófano, que se
encuentra en las plantas en la forma libre o combinada en proteínas. La
cantidad de L-triptófano libre es 100 veces mayor que AlA, siendo del
orden de 20-40 mg/g peso neto.

Muchas plantas convierten L-triptófano 55 en AlA por el camino

del ácido 3-indolpirúvico (compuestos muy inestables, particularmente en
medio básico), catalizado por la triptofano aminotransferasa. Esta enzima
esta ampliamente distribuida y cataliza la transaminación de todos los
aminoácidos aromáticos encontrados en proteínas y de los ácidos L-
aspártico y L-Glutámico, la que requiere de piridoxal fosfato para
activarse.
 47

La conversión de ácido-3 indol pirúvico 56 (ver esquema 16) en

indol-3-acetaldehido es catalizada por indol piruvato decarboxilasa y por
un NAD-dependiente indolacetaldehido-deshidrogenasa (demostrado en
semillas de maíz) o un oxígeno-requirente una indolacetaldehido oxidasa
(demostrada en semillas de avena), ambas son semillas citosorbicas.
Los brotes de tabaco, tomate y otras plantas y los coleóptilos de
semillas de avena son capaces de convertir L-tnptofano 55 a AlA via
triptamina , catalizado,por una piridoxal fosfato requirente L-aromático
aminoacido decarboxilasa, la cual es particularmente activa con L-
tnptófano. La triptamina resultante, luego es oxidativamente desaminada
a indol-3-acetaldehido, bajo la influencia catalítica de una triptamina
oxido reductasa.
Algunas Cruciferae forman AlA desde indol-3-acetonitrilo el que
se forma casi directamente de la indol-3 acetaldoxina o indirectamente
vía glucobrassicina.
lndol-3-acetaldoxima ha mostrado ser promotor del crecimiento
de tejidos de coleóptilos e hipocotílos, de todas las plantas capaces de
convertir este en ¡ndol-3-acetonitrilo (lAN).
Glucobrassicina es un promotor del crecimiento en bioensayos
en coleoptilos.
La enzima tio-glucosidasa (también conocida como myrosinasa),
que cataliza la conversión de glucobrassicina en lAN, se encuentra
principalmente en Cruciferas.
La enzima nitrilasa, que cataliza la conversión de lAN en AlA, se
encuentra en plantas de las familias gramíneas y musaceae, así como
cruciferae.
Acido indol-3-lactico 65 y triptafol 64 (esquema 16), son
constituyentes naturales de algunas plantas y tienen actividad auxina
débil y fuerte respectivamente en los bioensayos de coleoptilos.
 48

Las plantas son colonizadas por muchas especies de bacterias,

las que son capaces de convertir L-triptófano y triptamina en IAA, ya que
grandes cantidades de AlA se encuentran en plantas no estériles
(sugerencia hecha en los años 60).
El ¡AA es destrozado apenas es dejado en los tejidos. Esto es
principalmente acompañado por enzimas oxidasas de las que hay de dos
tipos:
a) peroxidasas con actividad AlA oxidasa y
b) oxidasas AlA con actividad no peroxidasas.
La localización intracelular de estas enzimas no está claro.
Hinman y Cang en 1965 proponen que AlA está catabolizado por la ruta
mostrada en el esquema 16.
AlA en solución acuosa es rapidamente descompuesta por la luz,
ya que esta es acelerada por ambos pigmentos sintéticos y naturales,
esto ha sugerido que la fotooxidación puede ocurrir en las plantas.
OTROS METABOLITOS DE AUXINA: (50, 51)
Cuando AlA marcado es suplementado a las plantas, otros
metabolitos marcados se pueden detectar, que se forman por los
caminos discutidos en el esquema 16. Otros metabolitos, por ejemplo
1(indol3-acetil)--D-gluCOSa 66 se forma en cebada , garbanzos y en
tallos de habas, ácido indolacetil-L-aspartiCO 67 se forma en numerosas
especies, derivados de AA se han encontrado en semillas de garbanzos
inmaduros, los que muestran un interesante set de derivados AlA
dorados, ácido-4-cloroindolil-3-aCeticO 18 y su metil ester 69 y ácido-
monometit-4-cloroindolil-3-aCeti-L-aSParticO 70. Semillas de maíz
contienen un set de AIA-mio-inositol derivados, AlA mio-inositol
arabinósidos y AlA mio-inositol galactósidos. Ellos también contienen una
serie de componentes en los cuales AlA es un ester unido a un P-1,4-
glucan de longitud variable (ver fig. 10).


4()

H
R-CI--C-COOH R-CI--Cft-OH
65
4 64t _
RI-C ClCOcL4-1 - R-CF-k-j-COOH -'- R-CI4-H - R-C}k--OH

R- aChir Mi

H
R-CH 2 -c' ' R-CH 2 — C N
61
60 N-OH

1R=

S -- GIc S
/ /
RCH2C\\ - R-CH2-C%
N-OSO
N-OH 63
62

Esquema 16.- Biosíntesis propuesta para la formación de diversas

auxinas naturales.
 50

EFECTOS FISIOLOGICOS DE AUXINAS.

Los efectos fisiológicos de auxinas son complejos.
Diferentes tejidos responden en forma muy distinta y las razones
de ello aún no estan lo suficientemente claras, además es muy dificil
distinguir los efectos primarios de los secundarios.
El clásico efecto de una auxina es promover el crecimiento por
estimulación de la elongación de las células constituyentes de un tejido
dado. No obstante, este efecto, no está del todo claro, por los resultados
de los experimentos dosis-respuesta.

COOH

o COOH

67

H OH
COOR
CI CI

COOR

CIC N
^---

R=CH 3=69 RyR"HyCH370

RH68 óCH 3 yH

Figura 10.- Metabolitos con actividad auxina.

 51

CITOMINAS.
De los estudios realizados por Skoog y colaboradores sobre el
control quimico de la diferenciación, se determinó que ciertos
compuestos químicos estimulaban específicamente esta fase del
desarrollo.
El primer compuesto activo en ser aislado y caracterizado desde
una fuente natural fué kinetina extraído por Miller (86) y colaboradores
desde ADN autoclavado. La estructura fué confirmada por síntesis
química.
El material sintético estimula la division celular en tabaco,
kinetina no es un producto natural ya que es extraído de la
desnaturalización que sufre el ADN durante el autoclavado.
Existen otras moleculas que tienen el mismo efecto y que
poseen estructuras similares a kinetina. Uno de los mas conocidos es
zeatina aislado desde semillas de maíz Zea mays, este compuesto es
mucho mas activo que la kinetina.
Tanto los isómeros cis y trans se encuentran en la naturaleza,
sin embargo el isómero cs es siempre obtenido desde hidrólisis de ARN,
mientras que la citomina libre normalmente es más activa que el isómero
trans.
Se han descubierto desde variadas fuentes naturales, otras
estructuras con actividad citomina, que se muestran en la figura 11.
 52

BIOSINTESIS.
La biosíntesis de las citominas esta estrechamente relacionada
al metabolismo del ARN específicamente del ARN-t. Esto se concluye
por los siguientes hechos:
a) La principal estructura es una base adenina; tanto ARN como las
citominas tienen la misma base estructural: purina. Existiendo en la
naturaleza como una base púrica, el ribonucleósido y el
ribonucleótido.(ver fig.1 1).
b) Se ha demostrado que los ARN-t contienen derivados de citominas y
adeninas semejantes, ubicados siempre en una posición adyacente a el
anticodón triplete.
Las citominas sufren un número de reacciones metabolicas que
conducen a nuevas citominas (interconversión), o a productos de
degradación o a formas conjugadas. Comparándolas con las auxinas y
otras fitohormonas, el metabolismo de las citominas muestra algunas
peculiaridades que resultan del hecho de que estas se encuentran en la
naturaleza, tanto en el estado libre como formando parte de un ARN-t.
- OH OH

HN HO OH
HN

D-GlucosildihidrozeaHna
Dihidrozeatina
(R=H)

HO OH
(

HN
HO -
j_j: ^ OH

NH

N N
OH

N-6-Adenina
N
Rafanatina(glucopira
nosilzeatina)

Figura 11.- Otros metabofitos con actividad citomina

1.7.- OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
1.7.1.- OBJETIVOS GENERALES.
La presente investigación tiene como objetivo fundamental
realizar un estudio de la producción de alcaloides indólicos tipo aristotelia
mediante cultivo de tejidos de Aristotelia chilensis (Mol) Stunz y mediante
sintesis química.
De acuerdo a los antecedentes mostrados, los alcaloides que
contiene la especie Aristotelia chilensis, son de gran interés. Los que
sin embargo se encuentran en muy bajas cantidades en la planta. Por
esta razón, se hace necesario acceder a estos alcaloides, de una forma
diferente, para obtenerlos en cantidades suficientes y razonables, y poder
realizar los estudios respectivos sobre actividad biológica.
El estudio fué enfocado en cinco etapas:
1. Continuación del estudio químico de la planta.
H. Determinación de un protocolo para cultivos de tejidos in vitro de A.
Chilensis.
M. Obtención , caracterización y cuantificación de alcaloides desde los
cultivos, con y sin utilización de precursores.

IV.Síntesis química de Aristotelina.

V. Estudios de actividad biológica de los alcaloides aislados.
 54

1.7.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS.-

Los objetivos específicos de este trabajo fueron:
1. Aislar, cuantificar y caracterizar alcaloides desde extractos naturales
de A. Chilensis.

H. Obtener callos a partir de cultivo de tejidos de A. Chilensis.

III. Producir callos de A. chilensis en forma masiva.

W. Inducir la biosíntesis de alcaloides indólicos tipo aristotelia en callos
de A. Chilensis con y sin precursores.
V. Aislamiento y caracterización de los alcaloides presentes en los
callos.
VI. Diseñar una linea de producción masiva de alcaloides.
VII.Realizar una síntesis química de aristotelina.
VIII.Realizar los estudios de actividad biológica de los alcaloides
aislados.
 55

2.- MATERIALES Y METODOS

2.1.- MATERIALES
Todos los materiales y reactivos fueron de la mayor pureza
diponible en los proveedores habituales: SIGMA, ALDRICH, FLUKA,
MERCK, RIEDEL de HAEN.
2.2.- MET000LOGIA GENERAL
1.- Obtención de los alcaloides desde la planta.
La planta fué recolectada en el camino Santa Juana en la
Octava Región durante la primavera de 1989, secada, triturada, y
pesada.
Fué extraída con metano¡ como extracto total y éste luego fue
solubilizado en agua y extraído bajo cambios de pH sucesivamente con
solventes de polaridad creciente como n-hexano, diclorometano y acetato
de etilo, a continuación los solventes fueron removidos mediante
rotavapor a presión reducida, (12).
Los extractos de alcaloides se extraen mediante los
procedimientos típicos para este tipo de compuestos en la química de
productos naturales.
Los alcaloides fueron aislados, purificados y caracterizados
mediante cromatografía en capa fina, cromatografía en columna de alta
presion (HPLC), y en fase gaseosa acoplada con un detector selectivo de
espectrometría de masa. Además se utilizó espectroscopía de absorción
ultravioleta, infraroja, resonancia magnética nuclear de protones y de
carbono-13, y difracción de rayos-X.
Como parte del trabajo que correspondió a la tesis de grado
de Magister en química (12), se logró aislar cuatro alcaloides indólicos,
nuevos para la planta, todos desde la fracción hexánica a pH=9,5 que
 56

provino de una "Flash-Column" realizada al extracto hAH29 (extracto n-

hexano).

flash-colum n
hAH29 ----------------F-1; F-2; F-3; F-4; F-5 ........ ... F-9.
Extracto hexánico a pH=9,5.-

Hasta 1988 solo se completó el estudio de la F-2, de la que

se aislaron los alcaloides informados en tesis de Magister, la F-3 mostró
por CCF-analítica muy poca intensidad de alcaloides frente al revelado
con reactivo pulverizable de Dragendorif (modificado según Münier y
Macheboeauf) (52).

Continuando con el estudio químico de las fracciones

hexánicas, durante el desarrollo de esta tesis,se realizó el análisis de las
fracciónes F-4 a F-9, de las que se logró aislar alcaloides y otros
compuestos no detectados en el trabajo anterior, que se indican con la
denominación del grupo de trabajo. Estos se analizaron mediante
estudios espectroscópicos, y mediante CC F-com parativa con muestras
auténticas:

Tihhi % Cnmnuestos aislados desde extracto n-hexánico.

Denominación Test Drg., mg, % nombre

MS/988 + (1) <0,001 aristona

MS/ 995 + (1) <0,001 makonina
MS/1 071 + (2) 0,001 ftalato
MS/1072 - (2,5) 0,0015 escopoletina
MS/1073 + (1) <0,001 aristotelina
MS/1 074 + (1,2) <0,001 serratolina
MS/1 075 + (2) 0,0015 makonina

Test Drg.=Test de Dragendorif. mg.=miligramos

%= porcentaje de rendimiento con respecto a masa de planta seca.
 57

Los extractos generales restantes: hAC29 (extracto

clorofórmico a pH =9,5), hAA29(extracto acetato de etilo a pH=9.5),
hAH212(extracto n-hexánico a pH=12), hAC212(extracto clorofórmico a
pH=1 2) y hAA2I 2(extracto acetato de etilo a pH=1 2); se juntaron,
realizandose también una "flash column", rindiendo ocho agrupaciones:
O, A, B, C, D, E, F, y G.(12).
Además desde diversas fracciones de estas agrupaciones,
se aislaron otros compuestos que resultaron ser terpenos, cumarinas,
flavonoides y acidos grasos ya conocidos, como: taedol, sakuretina,
eritrodiol, padmatina, estigmasterol, taraxerol, vainillina, acidos grasos
insaturados y otros compuestos muy conocidos.

Tabla 4: Compuestos aislados desde otros extractos.

Denominación 1 Test Drg. mg. % nombre

MS/1088 + (3) 0,005 aristoquinolina

MS/1089 + (2) 0,001 makomakina
MS/1136 + (8) 0,004 aristotelinona
MS/1 137 + (5) 0,0025 hobartina
MS/1 138 + (7) 0,0035 sorrelina
MS/1144 + (9) 0,0045 serratolina

Test Drg.=Test de Dragendorif. mg.=milig ramos

%= porcentaje de rendimiento con respecto a masa de planta seca.
 58

It.- Preparación del material biológico.

La planta, tiene sobre sus hojas y tallos, un sinnúmero de
microorganismos, que obstaculizan el trabajo en esta biotecnología por lo
tanto es imprescindible tratar de eliminarlos.
Para esto, esquejes de plantas jóvenes de A. chilensis
(maqui), se plantaron en camas de arena húmeda desinfectada bajo
invernadero. La apertura de yemas que al crecer proporcionan hojas
nuevas, son las que se recolectan y se lavan con agua destilada y luego
se desinfectan superficialmente con hipoclorito al 5% durante 5 minutos,
lavando a continuación varias veces con agua estéril, y que se utilizan
como explantes para ser incubados en los distintos medios de cultivo.
III.- Preparación de los medios de cultivo.-
Los medios de cultivo utilizados fueron los formulados por
Murashige-Skoog, (en adelante MS)(46, 55, 56), Meinhardt Zenk (en
adelante MZ)(54), e Hiroshi Harada (en adelante HH)(53).

Medios según Murashige & Skoog, Meinhard Zenk e Hiroshi Harada.

(La formulación de los medios de cultivo está dada en la tabla 6)

A) Medio según Murashige- Skoog: (MS)

El medio MS (46). Es el mas usado y es fabricado por la
compañía SIGMA-ALDRICH contiene los micro y macronutrientes
necesarios y suficientes para que los cultivos puedan desarrollarse.

B) Medio según Meinhard Zenk: (MZ)

Este medio, fabricado por la compañia SIGMA-ALDRICH,
contiene los mismos compuestos del MS pero reducido a la mitad de sus
 59

concentraciones, se complementa con vitaminas y aminoacidos: glicina,

ácido nicotínico, piridoxina, biotina y ácido fálico (54).
C) Medio según Hiroshi Harada: (HH)
Es un medio, que debe ser preparado al momento de su uso,
mas rico que los anteriores, que posee las mismas cantidades de micro y
macronutrientes que el indicado por MS. Sin embargo, contiene además:
adenina, myo-inositol, glutamina e hidrolizado de caseina, componentes
que hacen de este medio mas rico en vitaminas y aminoácidos (53).
 60

TABLA 5.- MEDIOS DE CULTIVOS CELULARES UTILIZADOS PARA

Aristotelia chilensis

MEDIOS: MS HH MZ
COMPONENTES:
INORGANICOS:
(en mg/L)
KNO 3 1.900,000 1.900,000 950,000
M9SO4 X7H2 0 370,000 370,000 185,000
NH4NO3 1.650,000 1.650,000 720,000
CaC12 X21-1 2 0 440,000 440,000 220,000
KH2PO4 170,000 170,000 68,000
MnSO4 X4H2 0 22,300 25,000 11,100
1-131303 6,200 10,000 3,100
ZnSO4 X71-1 2 0 8,600 10,000 4,300
Na2Mo04 X 2H20 0,250 0,250 0,125
CuSO 4 X5H2 0 0,025 0,025 0,0125
CoC13 X 61-120 0,025 0,025 0,0125
EDTA Na2 37,260 37,260 18,630
FeSO4 X71-12 0 27,800 27,800 13,900
Kl 0,830 0,830 0,500

ORGANICOS:(mg/L)
MYO-INOSITOL 100,000 500,000 100,000
TIAMINA HCI 0,400 0,500 0,500
HID. CASEINA 500,000
L-GLUTAMINA 500,000
ADENINA 40,000
GLICINA 2,000 2,000
Ac.NICOTINICO 5,000 5,000
PIRIDOXINA 0,500 0,500
BIOTINA 0,050 0,025
Ac. FOLICO 0,500 0,250
SACAROSA (gIL) 30,000 20,000 50,000
 61

Los componentes de los medios de cultivo indicados incluyen

soluciones de:
a) Sales Inorgánicas.
b) Reguladores del crecimiento
c) Vitaminas.
d)Aminoacidos.
e) Fuentes de Carbon.
f)Agua. y
g)Agar.
llI.a) Sales inorganicas.
Los tejidos celulares incubados requieren una contínua
adición de ciertos elementos y compuestos químicos inorgánicos.. Los
elementos esenciales que se requieren en cantidades relativamente
mayores se denominan elementos macronutrientes e incluyen nitrógeno,
fósforo, potasio, calcio, magnesio y azufre. El nitrógeno, agregado en una
cantidad mayor, está presente como ión amonio o nitrato o una
combinación de éstos. El sulfato de magnesio heptahidratado, satisface
tanto las necesidades de magnesio como de azufre. El fósforo puede
estar representado por NaH 2 PO4 H2 0 ó KH2PO4 . El potasio se encuentra
como catión en gran cantidad en KCl, KNO 3, ó KH2PO4 y el calcio está
dado por CaC12 2H20 ó Ca (NO3)2 . 4H20 ó la forma anhidra de la misma
sal.
Además de los macronutrientes, la célula necesita trazas de
otros elementos llamados micronutrientes. Debido a que las cantidades
son extremadamente pequeñas para algunos de estos elementos, se
utilizan soluciones "stock" previamente preparadas, con las
concentraciones milimolares requeridas para preparar cada medio. Los
elementos micronutrientes que todas las células vegetales necesitan
incluyen hierro, manganeso, zinc, boro, cobre, molibdeno , cobalto, yodo
y cloruro.
El hierro se prepara como una solución stock en forma
separada debido al problema de la solubilidad de éste. Comunmente
 (>2

se prepara en la forma quelada como la sal de sodica de etilendiamina

tetraacetato ferrico (Na-FeEDTA). Además de los micronutrientes
mencionados, algunos medios incluyen trazas de cobalto. La posible
esenciabilidad de niquel, titanio, berilio y aluminio es muy cuestionable y
depende de la especie vegetal a investigar. Uno de los problemas no
resueltos es aún la pureza de los reactivos químicos ya que la mayoría
contiene trazas de contaminantes inorgánicos y aquellos elementos
contaminantes constituyen una fuente oculta de micronutrientes (57). El
Agar-Agar es también una fuente de numerosos elementos minerales.
tILb) Reguladores del crecimiento (fitohormonas).
Los reguladores de crecimiento requeridos para muchos
cultivos de tejidos son las auxinas y citominas (ver fig. 12). Las auxinas,
un tipo de compuesto bioquímico que estimula la elongación celular,
actividad mostrada por el ácido indolacético(AIA). Las citominas,
promueven la división celular (mitosis), bajo ciertas condiciones de
cultivo, regulan el crecimiento y desarrollo como por ejemplo kinetina (6-
furfurilaminopurina). Las citominas son principalmente derivados
ami nopurinas-N6-sustituídas. La combinación de estos dos tipos de
fitohormonas se utiliza muy a menudo en la regulación de la división
celular, elongación celular, diferenciación celular y organogénesis.
Las giberelinas son muy poco usadas, aunque ácido
Giberelico (GA3) se utiliza en cultivos de meristemas apicales (58).
Las auxinas mas utilizadas son ácido indolacético (AlA),
ácido naftalenacético (ANA) y acido 2,4-diclorofenoxiacétiCo (2,4-D).
También se utilizan como auxinas acido indol-3-butirico (IBA) y acido p-
clorofenoxiacético (4-CPA). IBA se utiliza a menudo como un eficiente
agente de enraizamiento.
El AlA, es una auxina natural, pero es rápidamente
degradada por la luz y por oxidaciones enzimáticas. Debido a la
presencia en los cultivos de AlA-oxidasa, el AlA es agregado a los
medios en concentraciones relativamente altas (1-30 mg./L).
 (>3

Como ANA es una hormona sintetizada quimicamente, esta

no se vé afectada de igual forma a la oxidación enzimática como AlA;
esta fitohormona puede ser aplicada en bajas concentraciones (0,1-2,0
mg./L).
La auxina mas efectiva usada para la proliferación de callos
es el 2,4-D, que se utiliza en concentraciones del orden de 10-7 a 10-5 M,
a menudo en ausencia de cualquier citomina exógena, este herbicida es
un poderoso agente inhibidor de la organogénesis y por tanto no se
puede ocupar en experimentos que involucran crecimiento de raíces e
iniciación de yemas.(59).
Las citominas mas usadas son kinetina, benciladenina,
bencilaminopurina(BAP) y zeatina; los dos primeros son compuestos
sintéticos y zeatina se encuentra en forma natural. Kinetina se utiliza en
concentraciones que son del orden de 0,1 mg./L para la inducción de
callos.
Ill.c) Vitaminas.
Estos compuestos poseen una función catalítica en el
sistema enzimático y sólo se requieren en cantidades trazas. Se
considera que tiamina (vitamina 13 1 ), sería la única vitamina esencial para
el comienzo de los cultivos, mientras que ácido nicotínico (niacina) y
piridoxina (vitamina B 6 ),podrian estimular el crecimiento (59, 60),.
Tiamina se usa como tiamina-HCI en cantidades que oscilan entre 0,1 a
30 mg/L. Se hace necesaria la presencia de tiamina cuando las
cantidades de citokininas son muy bajas.
Algunas otras vitaminas que tambien se ocupan como parte
del medio, incluyen a ácido p-aminobenzoico (PABA; vitamina B), ácido
ascórbico (vitamina C), biotina (vitamina H), ácido fólico (vitamina Bc),

pantotenato de calcio, cloruro de colina, cianocobalamina (vitamina B12),

y riboflavina (vitamina B 2). (61, 62).

El ácido áscorbico puede ser usado con otros ácidos
orgánicos y se emplea como un antioxidante (63).
 64

Algunas vitaminas son muy lábiles a altas temperaturas, por

esto es que algunas de ellas se adicionan al medio después de la
esterilización, mediante pipetas ó jeringas estériles.
Ilid) Aminoacidos y amidas.
Con la excepción de glicina (ácido aminoacético), que es
parte del medio de cultivo, generalmente otros aminoacidos no se usan.
Algunos autores como H. Harada recomiendan el uso de
hidrolizado de caseina, para poder enriquecer el medio, el que se
adiciona en concentraciones del orden de 0,05 - 0,1% p/v; el hidrolizado
consiste en una mezcla de aproximadamente 18 aminoacidos diferentes
(64).
Los aminoacidos más usados como complementos son ácido
L-aspártico, L-aspargina, ácido L-glumático, L-glutamina y L-arginina.

lII.e) Fuentes de carbon.

Todos lo medios requieren de una fuente de carbon, con
fines energéticos y estructurales.
Sacarosa 6 D-glucosa, comunmente se usa en
concentraciones de 20.000 a 30.000 mg/L. El ciclitol myo-inositol, es
incorporado al medio de cultivo, como un factor de crecimiento a
concentraciones del orden de 100 mg/L.
Los carbohidratos no solo actuan como fuente de carbon,
sino que tambien lo hacen como reguladores del potencial osmótico
sobre los cultivos celulares.
IlI.f) Agua.
El agua utilizada en todos los medios de cultivo, incluida al
agua durante la preparación de las soluciones de los macro y
 65

micronutrientes que son incorporados, debe ser agua bidestilada o

desmineralizada redestilada.
111.9) Soporte.
El soporte medio matriz, mas utilizado es una base de Agar-
Agar (Difco Bacto-Agar), en un rango de concentración del orden de 0,6
a 1,0% p/v; aunque algunos preparados comerciales poseen una amplia
variedad de contaminantes orgánicos e inorgánicos.
Actualmente, se dispone de otros tipos de soporte, los que
han desplazado casi completamente el uso de Agar, que son las balsas
de Polipropileno esterilizables fabricadas por la Compañía SIGMA-
ALDRICH.
llI.h) Preparación de soluciones "stock"
La formulación base que se utilizó fue la dada por MS. y
proporcionada por SIGMA. Esta formulación se prepara desde las
siguientes soluciones Stock.
Stock de vitaminas.
Se pesan las cantidades indicadas de cada vitamina y se
diluye con Agua Bidestilada y esterilizada, luego se almacena bajo
refrigeración para evitar la degradación de las vitaminas.
Stock de Citominas
Se pesa 10 mg. de kinetina y se disuelve con alicuota de HCI
1 N., se adiciona agua bidestilada y se transfiere la solución a frasco
volumetrico de 100 ml. se afora y se almacena bajo refrigeración. Se
pipetea 1 cc. de citomina Stock para obtener en un litro la concentración
final de 0,1 mg/L.
 66

IV.- Obtención de los callos.

Explantes gemulares y foliares de A. chilensis, provenientes
de ejemplares del Campus Universitario, o de plantas pequeñas (30 - 50
cm), recolectadas en el camino de Concepción a Santa Juana, Km. 12,
durante abril de 1991, se desinfectaron superficialmente con hipoclorito
de sodio al 5% durante 5 minutos, lavando a continuación varias veces
con agua estéril.
Los explantes se incubaron en frascos de vidrio de 80 x 30
mm de diámetro, con 7 ml de medio MS, HH (53), o medio MZ (54),
gelificados con Bacto Agar al 0,8 % o en cajas Magenta (Sigma), de 70 x
70 x 70 mm, provistas de balsas de polipropileno con 35 ml de medio sin
gelificar.
A los medios de cultivo se les agregó como auxinas ácido
indolacético (AlA) y ácido 2,4 - dicloro - fenoxiacético (2,4-D), a
concentraciones que varían desde 0.1 a 5 mg/L. Como citominas se
utilizaron 6-bencilaminopurina y zeatina a concentraciones que oscilaron
desde 0.1 a 0.5 mg/L.
Los medios se esterilizaron en autoclave a 121°C y 103 KPa
durante 15 minutos.
Los explantes se incubaron en una cámara de luces bajo una
intensidad de 11.6 Watt/m2, con un régimen lumínico de 16:8 horas y a
una temperatura de 21°C ± 0,5 . Los explantes se cambiaron a medio
fresco cada 30 dias.
 67

2.3.- PREPARACION DE LAS SERIES CON MEDIOS DE

CULTIVO Y FITOHORMONAS.
Todas las series de la N° 1 a la N° 18, se realizaron sobre
medios de cultivos agarizados, introducidos en frascos de vidrio de 3,0
cm de diámetro por 8,0 cm de alto; o bien en balsas de pvc inmersas en
medios de cultivo líquidos. Se mantuvieron bajo régimen lumínico
(fotoperíodo) de 12 horas bajo luz y 12 horas en oscuridad, el material
vegetal se incubó según las condiciones dadas en la sección W.
2.3.1.- Preparación del ensayo N° 1. (serie N° 1).

El primer ensayo se realizó mediante una matriz de

combinaciones utilizando 2,4-D como auxina y BAP como citomina,
sobre medio MS, se realizaron ensayos a la completa oscuridad y a la luz
el rango de concentraciones de las fitohormonas osciló entre 0.1 - 15
mg/L.
 68

TABLA 6.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION 2,4-1) Y BAP,

MEDIO BASE MURASHIGE-SKOOG.-

Las concentraciones de las fitohormonas estan dadas en

mg / L.

1 4-D 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0 1,2 1,3 1,4 1,5
3AP
0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,4 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,5 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
0,75 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
1,2 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
1,3 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
1,4 99 100 101 102 103 104 105 106 107108 109
1,5 ,10 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
1
En total 121 tratamientos.

2.3.2.- Preparación serie N° 2 (GA3, ANA, BAP).

Posteriormente el establecimiento de explantes de A.
chilensis, se realizó con medio de cultivo según MS con BAP, ANA y
GA3 en concentraciones que variaron en el rango de 0,1 a 1,5 mg/L, esta
terapia se realizó sobre un medio base MS, la matriz de combinaciones
se muestra en la tabla .
 (>9

TABLA 7.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION BAP, ANA Y

GA3 MEDIO BASE MURASHIGE-SKOOG.-

Las concentraciones estan dadas en mg / L.

-% -
y 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0 1,2 1,3 1,4 1,5
ANA

3AP
0 ,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 ,2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,4 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,5 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
0,75 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
1,2 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
1,3 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
1,4 99 100 101 102103 104 105 106 107 108 109
1,5 1110 111 112 113114 115 116 117 118 119 120

En total 121 tratamientos.

2.3.3- Preparación serie N° 3.

Luego se estableció la serie No 3, una matriz sobre una base

de MS con AlA y BAP en concentraciones que variaron en el rango de
0,1 a 1,5 mg/1t.. Esta serie de matriz de combinaciones se muestra en la
tabla b.
 70

TABLA 8.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION AlA Y BAP, MEDIO

BASE MURASHIGE-SKOOG.-

\IA 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0 1,2 1,3 1,4 1,5

3AP
0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,4 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,5 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
0,75 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
1,2 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
1,3 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
1,4 99100 101 102 103 104 105 106 107108109
1,5 1 110111 112 113 114 115 116 117 118 119 120

En total 121 tratamientos.

2.3.4.- Preparación de serie N° 4.

La serie N° 4 correspondió a una matriz de combinaciones de

AlA y BAP en concentraciones que variaron en el rango de 0,1 a 1,5
mg/It, y de O a 5 mg/1t. Esta matriz se estableció sobre una base del
medio de cultivo según MZ, se muestra en la tabla 9
 71

TABLA 9.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION AlA Y BAP,

MEDIO BASE MEINHARD ZENK.-

AlA 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0 1,2 1,3 1,4 1,5

BAP
0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,4 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,5 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
0,75 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
1,2 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
1,3 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
1,4 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109
1,5 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120

En total 121 tratamientos.

2.3.5.- Preparación de serie N° 5.

La serie N° 5 correspondió a una matriz de combinaciones de

2,4-D con concentraciones desde 0,5 a 5,0 mg/It, y zeatina en
concentraciones que oscilaron desde 0,01 a 5 mg/It. Esta matriz se
estableció sobre una base de Medio de cultivo según MZ y se muestra en
la tabla 10.-
 72

TABLA 10.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION 2,4-D Y

ZEATINA, MEDIO BASE MEINHARD ZENK.-

,4-D 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 415 5,0

EAT
0,01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,5 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,75 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
1,0 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,5 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
2,0 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
3,0 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
4,0 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109
5,0 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
En total 121 tratamientos.

2.3.6.- Preparación de serie N° 6.

La serie N° 6 correspondió a una matriz de combinaciones de

AlA y zeatina en concentraciones que oscilaron desde O a 7 mg/1t. Esta
matriz se estableció sob re una base de medio de cultivo según M. Zenk y
se muestra en la tabla 11.
 73

TABLA 11.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION AlA Y

ZEATINA, MEDIO BASE MEINHARD ZENK.-

AlA 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

ZEAT
0,01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,5 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,75 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
1,0 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,5 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
2,0 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
3,0 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
4,0 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109
5,0 110 111 112 113114115 116117 118 119 120
6,0 121 122 123 124125126 127128 129 130 131
7,0 132 133 134 134135136 137138 139 140 141

En total 142 tratamientos.

2.3.7.- Preparación de serie N° 7.

La serie No 7 correspondió a una matriz de combinaciones

de AlA y BAP en concentraciones que oscilaron desde 0,1 a 1,5 mg/1t.,
sobre una base de medio de cultivo HH y se muestra en la tabla 12
 74

TABLA 12.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION AlA Y BAP,

MEDIO BASE HIROSHI HARADA.-

AlA 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0 1,2 1,3 1,4 1,5

BAP
0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,4 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,5 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
0,75 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
1,2 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
1,3 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
1,4 99100 101 102 103 104 105 106 107 108 109
1,5 110111 112113 114 115 116 117 118 119 120

En total 121 tratamientos.

2.3.8.- Preparación de serie N° 8.

La serie No 8 correspondió a una matriz de combinaciones

de AlA y zeatina en concentraciones que oscilaron entre 0,5 a 6,5
mg/lt.de AlA y 0,01 a 7,0 mg/1t. de Zeatina, sobre un base de medio de
cultivo HH y que se muestra en la tabla 19.
 75

TABLA 13.- MATRIZ FACTORIAL COMBINACION AlA Y ZEATINA,

MEDIO BASE HIROSHI HARADA.-

AlA 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 6,5

EA1
0101 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0,3 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,5 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
0,75 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
1,0 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
1,5 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
2,0 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
3,0 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
4,0 99100 101 102 103 104 105 106 107 108 109
5,0 110111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
6,0 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131
7,0 132133 134 134 135 136 137 138 139 140 141

En total 142 tratamientos.

 76

2.4.- PREPARACION DE LAS SERIES CON PRECURSORES

MONOTERPENICOS DE ALCALOIDES INDOLICOS.
La preparación de las series con precursores monoterpénicos
se realizó en forma posterior a las series con fitohormonas, y sobre la
base de los resultados anteriores, se optó por conformar estas series
sobre la base de dos Medios de cultivos, según HH (Medio A) y según
MZ (Medio B). El objetivo de estas combinaciones fue determinar en cual
de ellos se lograba una mayor producción de alcaloides.
En esta etapa, en forma paralela se mantuvo un cultivo
control; es decir; una cepa de callos que se cultivó sin agregar
precursores. Los callos en esta etapa fueron cultivados , en la gran
mayoria de los tratamientos, en balsas de membranas hidrofilicas de
polipropileno, introducidas en cajas "Magenta" proporcionadas por la
firma "SIGMA".
2.4.1.- Medio A con geranio¡ serie N° 9.
La serie N° 9 correspondió a una matriz de combinaciones de
distintas concentraciones de geranio¡ sobre una base de medio de
Cultivo HH.
El rango de concentraciones fué desde 1 mg/It, hasta 150
mg/It, en intervalos de 10 en 10 mg., con un total de 15 tratamientos, y
cada tratamiento contó con 5 repeticiones.
2.4.2.- Medio A con nerol serie N° 10.
La serie No 10, correspondió a una matriz de combinaciones
de distintas concentraciones de nerol sobre una base de medio de cultivo
HH.
El rango de concentraciones fué desde 1 mg/It. hasta 150
mg/It. en intervalos de 10 en 10 mg., con un total de 15 tratamientos y 5
repeticiones.
 wri

2.4.3.- Medio A con terpineol serie N° 11.

La serie N° 11, correspondió a una matriz de combinaciones

de distintas concentraciones de Terpineol, sobre una base de medio de
cultivo HH.
El rango de concentraciones utilizadas fué desde 1 mg/1t.
hasta 150 mg/It, en intervalos de 10 en 10 mg., con un total de 15
tratamientos y 5 repeticiones.
2.4.4.- Medio B con geraniol serie N° 12.
La serie N° 12 correspondió a una matriz de combinaciones
de distintas concentraciones de geranio¡ sobre una base de medio de
cultivo MZ. El rango de concentraciones utilizadas fué desde 1 mg/1t.
hasta 150 mg/It, en intervalos de 10 e 1 10 mg., con untotal de 15
tratamientos y 5 repeticiones.
2.4.5.- Medio B con nerol serie N° 13.
La serie N° 13 correspondió a una matriz de combinaciones
de distintas concentraciones de nerol sobre una base de medio de cultivo
MZ. El rango de concentraciones utilizadas fué desde 1 mg/It, hasta 150
mg/It, en intervalos de 10 en 10 mg., con un total de 15 tratamientos y 5
repeticiones.
2.4.6.- Medio B con terpineol serie N° 14.
La serie N° 14 , correspondió a una matriz de combinaciones
de distintas concentraciones de terpineol sobre una base de medio de
cultivo MZ. El rango de concentraciones utilizadas fué desde 1 mg/1t.
hasta 150 mg/It. en intervalos de 10 en 10 mg., con un total de 15
tratamientos y 5 repeticiones.
 7

2.5.- PREPARACION DE SERIES DE COMBINACION CON

PRECURSORES AMINOACIDO.
La preparación de las series con precursores aminoacido, se
realizó en forma posterior a las series anteriores y sobre la base de los
resultados anteriores. Se optó con conformar estas series sobre una
base de medios de cultivos HH y MZ.
El objetivo en esta experiencia también fué determinar en
cuál de ellas se lograba una mayor produccción de alcaloides.
El aminoácido utilizado para estos efectos fué L-triptófano y
se realizaron dos series, una sobre medio de cultivo HH y otra sobre
medio de cultivo MZ. El rango de concentraciones estudiadas fué desde
0,1 mg/1t. hasta 500 mg/It., en intervalos de 50 en 50 mg.
De gran importancia, en los estudios de bioinducción de
alcaloides son las variables que dependen de la manipulación de los
tejidos y almacenaje de los mismos. Las muestras de estos cultivos
fueron tomadas en el mismo lugar de los cultivos y se sumergían en
metanol puro, para evitar cualquier influencia externa y comenzar así de
inmediato su extracción.
2.5.1.- Serie N° 15 medio B con L-triptófano.
Matriz de combinaciones de L-triptófano, sobre una base de
medio de cultivo MZ, con geranio¡ (100 mg/L). El rango de
concentraciones fué 10 1 50, 100, 200, 300, 400, y 500 mg/L., cada una
con 5 repeticiones.
2.5.2.- Serie N° 16 medio B con L-triptamina.
Matriz de combinaciones de L-triptamina sobre una base de
medio de cultivo MZ con geraniol (100 mg/L). El rango de
concentraciones fué 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500 mg/L, cada una con
5 repeticiones.
 79

2.5.3.- Serie N° 17 medio A con L-triptófano.

Matriz de combinaciones de L-triptófano sobre una base de
medio de cultivo HH con geranio¡ (100 mg/L), el rango de
concentraciones fué 10, 50, 100, 200, 300, 400, y 500 mg/L, cada una
con 5 repeticiones.
2.5.4.- Serie N° 18 medio A con L-triptamina.
Matriz de combinaciones de L-triptamina sobre una base de
mediode cultivo Harada con geranio¡ (100 mg/L). El rango de
concentraciones fué 10, 50, 100, 200, 300, 400, y 500 mg/L., cada una
con 5 repeticiones.
 8()

2.6.- DETERMINACION DE HUMEDAD PROMEDIO TOTAL.

Para determinar los rendimientos porcentuales de alcaloides
de cada extracto, se realizó una cuantificación relativa de la humedad
que contienen los callos en estudio. Para esto se tomaron muestras de
callos del tratamiento control, se pesaron los callos frescos, luego fueron
llevados a sequedad en una estufa a 40°C por dos dias y posteriormente
fueron pesados. Así se logró determinar una humedad promedio del
95%, procedimiento de rutina para la determinación de rendimientos (78,
80).

2.7v- EXTRACCION DE ALCALOIDES.

Cada muestra fué recolectada según procedimientos ya
descritos en la literatura (68, 69, 70).
Cada muestra fué sometida a un riguroso trituramiento y a
una exhaustiva extracción con metano¡, según el esquema 17.
2.7.1.- Obtención de los alcaloides desde callos.
Los callos obtenidos para analisis, fueron pesados y
triturados , luego extraídos con metanol, el solvente fué removido
mediante rotavapor a presión reducida.
Los extractos alcaloídeos fueron obtenidos mediante el
procedimiento típico para la extracción de alcaloides en la química de
productos naturales, desde las series que se indican.
Se analizó por cromatografía en capa fina la presencia de
alcaloides en todas las baterias y en las que mostraron una respuesta
positiva, se continuó con el aislamiento de los alcaloides.
Los alcaloides fueron aislados y caracterizados de la misma
forma como se indicó en punto anterior, desde distintos tratamiento de
las series 9, 10, 11, 12, 13, y 14, que se indican en la discusión. En
éstas la identificación de los alcaloides, se realizó por comparación con
muestras patrones,de este analisis se pudo detectar la presencia y
repitencia de algunos alcaloides en las distintas series
Posteriormente, los extractos de las distintas series fueron
separados por columna y aquellos que contenian alcaloides con Rf
identicos o similares fueron agrupados. Desde estas agrupaciones se
logró aislar los compuestos que se muestran en la tabla 14.
En la tabla 14 se muestran los alcaloides aislados e
identificados y la cantidad obtenida. En la discusión la tabla 17 muestra
la cantidad de extracto alcaloideo total obtenido y el porcentaje de
rendimiento.
 ESQUEMA 11
CALLOS (TRITURACION)

EXTRACCION CON METANOL

FASE ALCOHOLICA CONCENTRADA

1
DILUCION CON ACIDO CLORHIDRICO 1 M.

FILTRACION
ALCALINIZACION HASTA pH = 10

EXTRACCION CHCI 3 ( EXTRACTO ALCALOIDEO BRUTO 1)

(FASE ACUOSA BASICA)

NEUTRALIZACION CON HCL 1 M HASTA pH =7

1
ALCALINIZACI N HASTA pH = 12

EXTRACCIONES SUCESIVAS CON CHCI3

EXTRACTO ALCALOIDEO BRUTO 2

 Tabla 14: Alcaloides obtenidos desde cultivos de tejidos
Denominación Test Drg. mg. nombre.

MS/1 133 + (3 mg) aristona

MS/1 134 + (5 mg) makonina
MS/1 135 + (9 mg) aristotelinona
MS/1 145 - (7 mg) friedelina
MS/1146 + (15 mg) 8-oxo-9-dehidro-
makomakina
MS/1147 + (8 mg) 8-oxo-9-dehidro-
hobartina
MS/1148 + (10 mg) aristotelina

Test Drg. =Test de Dragendortí. mg.=miligramos

2.8.- CARACTERIZACION DE LOS ALCALOIDES

Todos los extractos fueron concentrados a presion reducida,
mediante un rota-vapor hasta remover completamente el solvente, y
luego fueron pesados.
Cada extracto fué sometido a un análisis mediante diferentes
técnicas cromatográficas.
Como fase estacionaria se utilizó para CCF. analítica, Sílica-
Gel tipo 60 según Stahl, en placas de vidrio de 20 x 20 y de 10 x 20 cm,
con un espesor de 0,20 mm, activadas durante 2 horas a 100°C. Ademas
se utilizaron cromatofolios de soporte de aluminio de Silica-gel 60 F 254
de 20 x 20 cm, de un espesor de caja de 0,2 mm proporcionados por
MERCK.
Para la cromatografía preparativa se utilizó Silica-gel 60 PF
254 + 366, en placas de Al. de 20 x 20 con un espesor de caja de 0,25
mm, (MERCK).
 Se utilizó además para analizar y purificar muestras
cromatografía líquida de alta presión (HPCL) y cromatografía gaseosa.
Para cromatografía gaseosa se utilizó columnas de Silica
fundida en un Equipo Hewlett-Packard modelo HP-3500, con detectores
FID Y ECO, este equipo está acoplado con un Espectómetro de masas,
de 170 eV, con procesador de Transformada de Fourier.
En cromatografía líquida de alta presión (HPLC), los análisis
y separaciones preparativas se realizaron con un equipo HPLC Water
510 , con programador de carga ternario, además se utilizó un equipo
Waters modelo M - 1515 con detector U y, se utilizó columnas
Bondapack RP-18 Waters, con distintos eluyentes, los que son indicados
al pie de cada cromatograma.
Los alcaloides aislados y purificados, fueron caracterizados a
traves de las siguientes tecnicas analíticas:
a) Puntos de Fusión: Se utilizó un microscopio Kofler con platina
calefactora.
b)Espectros infrarojos l.R.:
Se determinaron en un espectro fotómetro SHIMADZU,
modelo IR-408, los disolventes empleados se indican en cada caso y la
frecuencia de oscilación(v) es expresada en cm`.
c) Espectros Ultravioleta U.V.:
Se determinaron en un espectrómetro SHIMADZU modelo
UV-160. Los disolventes empleados se indican en cada caso, la longitud
de onda (X) se expresa en nanómetros (nm).
d) Espectros de Resonancia Magnética Nuclear Protones RMN-H':
 Se registraron en un espectrómetro BRUKER AM-400 (de
300 MHz), utilizando tetrametilsilano como estandard de referencia
interna.
Los desplazamientos químicos se expresan en escala delta
(S) (ppm). Los disolventes se indican en el texto.
e) Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-
C1).

Se registraron en un espectrómetro BRUKER AM-400 de 270

Mhz de potencia. Los desplazamientos químicos se expresan en escala
Delta () (ppm).
t) Espectros de masa ( E.M.)
Los espectros de desorción de campo fueron registrados en
un equipo SHIMADZU modelo EM 360 (70 ev.). Las señales de carga!
masa (m/e), se expresan en intensidades relativas de abundancia.
2.9.- PRODUCCION DE ALCALOIDES, A TRAVES DE UN
AGITADOR ORBITAL.
Los callos obtenidos y seleccionados como friables fueron
incubados por su crecimiento en matraces de 300 ml. con un medio de
cultivo líquido, sobre un agitador giratorio a 180 r.p.m., bajo una luz
contínua a 25 oc.
Los callos fueron incubados durante 8, 12, 18, 24, y 30 días,
al cabo de estos períodos fueron sacados de los medios líquidos,
macerados y extraídos con metano¡, luego de lo cual los extractos fueron
sometidos a la secuencia típica para la extracción de alcaloides.
Los medios utilizados fueron los de HH y según MZ, en dos
cultivos contínuos y en paralelo y los callos fueron extraídos en forma
simultánea.
 86

2.10.- SINTESIS QUIMICA DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO

ARISTOTELIA.
Los espectros de absorción ir, U.V., y RMN-H', fueron obtenidos
con los equipos indicados anteriormente, salvo los casos que se indican.
Antes de realizar las reacciones se sometió a una cromatografía
gaseosa, a ambos tipos de pinenos, para verificar su pureza.

A) Primera fase.:
La reacción se realizó bajo campana, y en las condiciones
conocidas para una reacción de este tipo (71). Una mezcla de nitrato de
mercurio II anhidro (2,5 gr, 7,7 mmol) con acetonitrilo (50 mi) en
presencia de tamiz molecular, fué depositada en matraz erlenmeyer de
250 mi, y agitado a través de placa magnética, llevado a 0°C, luego se
adicionó a esta solución 1 g (7,3 mmol) de a-pineno 49. La mezcla se
mantuvo en agitación durante toda una noche a temperatura ambiente,
luego al detener este proceso la mezcla fue llevada a 0°C, se filtró y el
filtrado fué extraído con eter (4x5Oml). La fase etérea se lavó con agua
bidestilada, luego secada con Na 2SO4 anhidro, y evaporada a presión
reducida. El residuo fué redisuelto en n-hexano (p.a. Merck), la parte
insoluble eliminada.

Esquema 18: Sintesis de 2,2,4,6-tetrametil-3-azabiciclot3.3.11-

non-3,6-dieno.
 El producto que obtenido (un residuo aceitoso), resultó ser una
mezcla que, analizada cromatograficamente muestra la presencia de un
sólo compuesto que forma complejo de bismuto (reactivo de
Dragendorff). Luego, este compuesto fue purificado mediante sucesivas
cromatografias en capa fina preparativa.

Sus datos ir: ( y , cm'): 2850 y 2950 (f), 1660 ( y); 1640 , 1610-
1100 varias bandas.
Su espectro U.V. :(X, nm): 287
Su espectro RMN-'H,: (60 Mhz) (utilizando CDCI 3 con 1% de TMS):
(valores 8, ppm):1,4 (s), 1,65(s), 2,0-2,5 (m), 3,8(m), 5,0(m), 5,3(m),
5,5(m).
Se obtuvo un 28% de rendimiento.

B) Segunda fase.:
La condensación del compuesto 50 con isatina, se realizó mediante
un reflujo de 30 minutos , en EtOH y piperidina, luego se filtro y el filtrado
extraído con éter, se lava con agua bidestilada y secada con Na2SO4
anhidro, el solvente fue evaporado bajo presión reducida.
En esta reacción se obtuvo un producto aceitoso pardo-amarillento,
que luego fué extraído con cloroformo, produciendose un residuo que, al
ser analizado mediante CCF-analítica, mostró la presencia de varias
manchas anaranjadas al ser revelado con el reactivo de Dragendorif.
La mezcla muestra en su espectro de RMN-'H :(CDCI 3 , TMS, 60
MHz, valores 8, ppm): 6.8 y 7.2 (m), 5,2(m), 4,8 (m), 2,8 (m), 2,1 (m),
1,6 (,ancho) y 1,0 (s,ancho).
Luego, mediante CCF-preparativa desarrollada con CHCI 3 al
100%, como sistema eluyente, se logró aislar un compuesto de la
mezcla ( el de mayor Rf), que mostró un revelado positivo mas intenso
frente al test de Dragendorff.
 Sus datos de RMN-'H a 60 MHz (CDCI3, TMS, valores S): 8,5(s),
7,5(m), 7,2 (m), 6,2-6,8(m), 5,2 (m), 3,3-3,8(m), 1,5-1,9 (s,ancho) y
1,3(m).
Se obtuvo un 3,17% (20 mg) de rendimiento de este compuesto.
2.11.- ACTIVIDAD BIOLOGICA.
a)Actividad antibacteriana.

La actividad antibacteriana se ensayó con extractos totales y

con compuestos puros obtenidos en cantidad suficiente.
Los ensayos antibacterianos se realizaron sobre bacterias
gram positivas: Staphylococcus aureus y Bacillus subtílis; y sobre gram
negativos: Escherichia coli y Sarcina tutea. Estos fueron realizados por
el Departamento de Microbiología de la Universidad de Concepción.
b)Actividad Anticancer.
Los ensayos anticncer fueron realizados en el Instituto
Nacional del Cancer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de
Norteamerica.
Los test que se usaron fueron PS=P388 leucemia Iinfocítica,
KB= Carcinoma epidermoide humano de la nasofaringe (cultivo celular),
y LE= L-1210 leucemia linfoide. Además se evaluó la actividad anti-sida.
Para actividad citotoxica (test de inhibición), se enviaron
muestras al Instituto de Biotecnología de la Universidad de
Kaiserslautern, Kaiserslautern, Alemania.
Los compuestos enviados tanto a Estados Unidos como a
Alemania, fueron: aristotelina, aristotelinona, aristona, makonina,
makomakina, 8-oxo-9-dehidrohobartina y 8-oxo-9-dehidromakomakina.
 90

3.- RESULTADOS Y DISCUSION

3.1.- CARACTERIZACION DE ALCALOIDES Y OTROS

COMPUESTOS AISLADOS DE LA PLANTA Y DE LOS CALLOS.
La continuación del estudio químico de extractos de la planta,
condujo en primer lugar a la determinación de nuevos alcaloides con
distintos tipos de estructuras, diferentes a las encontradas anteriormente
en la especie, y luego a nuevas estructuras las que fueron determinadas
por técnicas espectroscópicas de alta resolución.
Además se pudo identificar otras moleculas, no aisladas hasta
ahora en los extractos de A. chilensis.
1.- Determinación de la estructura de los compuestos:
ARISTONA: MS/988 (planta) y MS/1 133 (callos)

El compuesto MS/988, fue aislado por cromatografía en capa fina,

su punto de fusión concuerda perfectamente con los datos de la
literatura.
Su espectro U.V.resultó ser típico de una anilina sustituida (73) y
los datos del infrarojo muestran la presencia de una cetona ( y max. 1695
cm 1 , fuerte), con vibraciones C-H aromáticos y alifaticos.(74).
 91

El test de Erlich negativo, indica que se trata de un indol 2,3-

disustituido (82).
Del cromatograma gaseoso y espectro de masas se obtiene su
fórmula molecular C20H24N2 0, de ésta se desprende que el compuesto
posee dos hidrógenos menos que aristotelina, pero de igual fórmula que
aristoserratina y aristotelinona, esta última en su espectro i.r. muestra
una absorción a 1610 cm 1 , característico para aristoserratina,
correspondiente al al carbonilo enlazado al C-13, unión que es muy
similar en aristona (74, 3).
Su espectro de RMN-'H (400 MHz), muestra las señales típicas
para los dos grupos metilos superiores y el tercero comprometido con un
acoplamiento similar que en aristotelina. La ausencia de señales típicas
para protones alifáticos de una estructura aristotelina, junto con los
patrones de fragmentación del espectro de masas nos indicó que se
trataba de aristona.
Lo anterior fue confirmado, al desarrollar una cromatografia
GAS/MASA con una muestra autentica, que resultó idéntica.
MAKONINA: MS/995 y MS/1 075 (planta), MS/li 34(callos)

De una cromatografía por HPLC se aisló este compuesto y se

purificó por capa fina, recristalizandose con una mezcla de CH 2Cl21n-
hexano (90:10), sus cristales son incoloros en forma de agujas y su punto
de fusión osciló entre los 310 y 31 2°C,
El test de Erlich negativo nos indicó un indol 2,3-disustituido.
 92

Sus datos U.V., muestran las absorciones características para un

cromóforo indol (73), que corresponden a un 3-carbonilindol. El test de
Erlich negativo muestra la ausencia de una seco-aristotelina.
Su i.r. demuestra que el N-10 no tiene hidrógeno (ausencia de
absorciones a 3.200-3.300 cm-1 ). Este muestra fuertes señales a j650
cm-1 para una vibración C=O y a 1520 cm para una vibración C=N no
aromática.
De su espectro RMN-'H m se deduce la presencia de tres grupos
metilos, los desplazamientos a campo bajo son típicos para el núcleo
indol. La comparación de este espectro y del cromatograma GAS/MASA
con una muestra auténtica de makonina mostró una correlación perfecta
y clara.
Las instancias anteriores fueron confirmadas por las
fragmentaciones de su espectro de masas, que resultaron idénticas a las
obtenidas en trabajo previo para el MS/955-6 (12).
El cromatograma GAS/MASA muestra una pequeña cantidad de
otro compuesto alcaloide (aproximadamente 10%), que resultó ser
serratolina, discutida mas adelante.
ESCOPOLETINA: MS/1 072 (planta).
5 4

H3CO

HO

8
El compuesto MS/1 072 (que es el mismo que MS/1007), resultó
ser una cumarina, la escopoletina, hecho que se logró elucidar luego de
obtener su espectro de RMN-'H de alta resolución (400 MHz). Este
compuesto ya había sido aislado en el laboratorio de química de
productos naturales de la Universidad de Concepción por Marambio O.
(72), desde la especie Haplopappus velutinus Remy.
La cumarina fue aislada desde una columna cromatográfica y
purificada por cromatografía en placa fina, con soporte de sílica-gel tipo
GF-254 según Sthal, utilizando como fase móvil, una mezcla de 1:25 de
metano¡ y diclorometano. Presentó un punto de fusión de 175°C sin
corregir.
Su espectro ultravioleta, muestra dos absorciones a Xmáx.
(MeOH),(nm) a 229,0 y a 345,0 y otros hombros, que es típico para este
tipo de compuestos. (73).
El espectro infrarrojo muestra absorciones intensas a 3050 (cm-1)
correspondiente a un -OH, a 1720 (cm' ) para un -C =O y otras, como a
1610, 1580, 1520, 930 y 880, señales típicas para uniones C-H de tipo
aromáticas, y para C-O.(74)
El espectro de RMN-'H a 60 MHz, salvo algunas señales, no
entrega mayor información, lo que no sucede con el espectro de RMN-'H
de alta resolución (400 MHz), que presenta dos señales dobletes a 6 6,27
y a 6 7,60, que integran cada una para un proton, relacionadas entre sí,
por una constante de acoplamiento (J ) de 10 Hz para protones AB, que
son asignadas a los H-3 y H-4 de la cumarina. Además presenta dos
señales singletes a 6 6,85 y a 6 6,92 , para protones aromáticos de una
cumarina; asignadas a las posiciones 5 y 8.
Los grupos funcionales aparecen como un singlete a 8 3,96
atribuído a un grupo metoxilo en posición 6 y otro singlete ancho a 8 6,13
atribuído a un grupo hidroxilo en posición 7.
Así entonces es posible asignar correctamente las señales y
determinar la estructura en estudio, cuyo espectro de RMN-'H obtenido,
resultó ser idéntico al obtenido de la escopoletina, cumarina aislada
desde Haplopappus velutinus R. , lo que comprueba la estructura
propuesta.
 94

ARISTOTELINA: MS/1073 (planta), MS/1148 (callos)

I:çii:ç
Este compuesto se aisló a través de una cromatografía HPLC y se
purificó por una cromatografía en capa fina, se recnstalizó desde una
mezcla cloroformo/metano¡ (3:1), se obtuvieron cristales incoloros.
Fue analizado por cromatografía GAS/MASA y se pudo establecer
la presencia de un compuesto de fórmula molecular C20H26N2.
El espectro RMN-'H de la muestra purificada, fue idéntico para
una muestra patrón de aristotelina.
Las señales U.V típicas para un indol 2,3-disustituído y el test de
Erlich negativo lo confirma.
El cromatograma GAS/MASA se realizó con una muestra
auténtica de aristotelina y tanto los Rf como las fragmentaciones (peak
ion molecular y base) fueron idénticos.
SERRATOLINA: MS/1 074 (planta) y MS/1144 (planta).

MS/1 074 se obtuvo como residuo aceitoso de una fracción con un

Rf menor que el de MS/995, que se explica por la mayor polaridad de
esta molécula con respecto a makonina. A través del análisis por
cromatografía GAS/MASA, se demuestra un porcentaje menor de
 95

presencia de makonina(10%), y una mayor presencia de

serratolina(90%). En éste, los patrones de fragmentación se
correlacionan perfectamente con una muestra auténtica de serratolina.
El espectro U:V. muestra señales para un núcleo indol, con una
absorción típica para una indolenina a 262 nm(73). Las fuertes señales
del i.r.(a 3750 cm-) y del RMN-'H (a 3 7,5 ancha), típicas para un grupo
hidroxilo, junto con un test de Erlich negativo nos indica que se trata de
un indol 2,3-disustituido hidroxilado.
El espectro RMN-'H mostró desplazamientos muy similares a
aristotelina, salvo la ausencia a campo bajo de la señal para el hidrógeno
unido al nitrógeno del del heterociclo; pero si aparece en este sector una
señal característica para un grupo hidroxilo.
Su espectro de masas nos proporciona la fórmula molecular
C20HN20, de ésto se desprende que posee igual cantidad de
hidrógenos que aristotelina y dos hidrógenos mas que aristotelinona, con
un pico ion molecular a m/e 295 (M) , los patrones de fragmentación y
los datos de absorción espectroscópica se correlacionan perfectamente
con los aportados por la literatura. Además la correlación de las
fragmentaciones de masas de este compuesto con una muestra
auténtica de serratolina fue perfecta.
El espectro infrarrojo fue muy similar con el de aristotelinina,
muestran la presencia de un grupo hidroxilo y de igual forma sus
desplazamientos en el RMN-'H, las señales fueron atribuidas a todos los
hidrógenos y la correlación GAS/MASA con una muestra autentica de
serratolina resultó perfecta.
ARISTOQUINOLINA: MS/1 088.- (planta) (83).

MS/1088 se aisló desde el extracto E-4, que corresponde a

extractos obtenidos a pH=1 2; se purificó mediante cromatografía en capa
fina preparativa. Recristalizado desde una mezcla de
metanol/diclorometano (15:85), su punto de fusión no está determinado
por la escasez de compuesto.
Las evidencias espectroscópicas del ultravioleta muestra tres
absorciones a máx.(MeOH)(nm): 315,4 ; 289,2 y 235,6 ; un espectro
diferente al esperado para un alcaloide de tipo indólico, pero sí muy
cercano a los típicos espectros de compuestos quinolínicos, con un
hombro a 300,0 nm de la banda principal a 315,4 nm, espectro
ultravioleta muy común de compuestos de tipo quinolínicos (73).
El espectro infrarrojo mostró absorciones a y 2950 (cm -') (N-H),
2400 (cm 1), 1600 (cm-') y otras, que junto a los datos del ultravioleta,
nos hace pensar que puede tratarse de un compuesto quinolínico (74).
Los datos proporcionados por los espectros de RMN-'H y de
fragmentación de masas corrobora que se trata de un alcaloide de tipo
quinolínico.
Desde su espectro de masas se determinó su fórmula molecular,
que corresponde a C20 H24 N20, lo que implica un peso molecular igual a
292,19 (M=292).
 97

El espectro de RMN-'H muestra los desplazamientos a campo

bajo típicos de señales aromáticas, para un núcleo quinolínico de seis
protones (75). El resto de las agrupaciones de señales corresponde a
una agrupación olefínica típica de los alcaloides tipo aristotelia (13a), con
la gran excepción del desplazamiento a 6 0,71 , que es muy inusual y que
probablemente se deben a la corriente del anillo del sistema aromático.
Los desplazamientos observados a campo bajo, indican la
presencia de dos protones acoplados entre sí, por dos dobletes a 6 8,63
y a 6 8,1 , que integran cada una para un protón, relacionados entre sí
por una constante de acoplamiento (J =3) de 10 hz para protones orto,
que son asignados a los protones H-2 y H-3 respectivamente del anillo
heterociclo. La señal doblete a 8 8,12 fue asignada al protón H-5 del
anillo bencénico y las agrupaciones de señales a 6 7,73 ; 6 7,63 y 6 7,31
fueron asignadas a los protones H-7 H-6 y H-8 respectivamente del
anillo bencénico (76).
Todas las apreciaciones anteriores, fueron corroboradas con los
patrones de fragmentación, obtenidos de su espectro de masas. Las
fragmentaciones a míe = 277 (M-Me), 197 (M-C7H1O), 157 (Quinolin-
CH-NH2), 93 (C7H9) y 59 (C3H9N) (100%)(pico base) y otros a
distintas m/e (77).
Tanto el espectro de masas como el RMN-'H, fueron
correlacionados con el banco de datos, que se tiene acumulado a la
fecha de tos alcaloides tipo aristotelia (12).
MAKOMAKINA: MS/1 089 (planta)

Este compuesto al mostrar un test de Erlich positivo y las señales

U.V. típicas para un indol, nos indicó que se trataba de una aristotelina
con sustitución sólo en la posición 3 (o).
El i.r. resultó típico para un indol sin sustituciones oxigenadas.
Se hizo un análisis comparativo de su RMN-'H con los espectros
de hobartina y 8-oxo-9-dehid roma komakina, resultando casi idéntico, con
hobartina, salvo las señales para el tercer grupo metilo que en este caso
no aparecen. En su lugar aparece un doblete típico para un par de
protones metilénicos, acoplados con protones alifáticos, esta parte del
espectro fue idéntica a la de 8-oxo-9-dehid roma komakina (MS/954).
Sin embargo, la zona para los protones H-8 y H-9 de hobartina
resultó idéntica para este compuesto. El desplazamiento de una señal
ancha a campo bajo se atribuye al H-1 (del nitrógeno indol), y un singlete
cercano (8 8,2) se atribuye al H-2 del heterociclo (al igual que en 8-oxo-9-
dehidromakomakina), lo que demuestra que esta posición posee un
hidrógeno.
Los datos obtenidos desde la cromatografía GAS/MASA, muestra
los patrones de fragmentación típicos para hobartina y makomakina,
compuestos aislados previamente en las otras especies del género.
Estos datos corroboran su fórmula molecular C 20H26N2, con un pico para
el ión molecular a m/e 294 (M t) y un pico base a m/e 164, a diferencia de
sorrelina cuyo ion molecular aparece a m/e 292 y con un pico base a
m/e 162.
 99

Todo lo anterior nos llevó a concluir que este compuesto se

trataba del alcaloide makomakina.

ARISTOTELINONA: MS/1 136 (planta) y MS/1 135 (callos).

Estos compuestos se cristalizaron desde CHCI 3/Acetato de etilo

(80:20), sus cristales mostraron un punto de fusión aproximado de
320°C.

El espectro U.V. típico para un 3-carbonil indol, el test de Erlich

resultó negativo, que nos demuestra que se trata de un compuesto tipo
aristotelina, es decir, un mdcl 2,3-disustituido.
Del espectro de masa obtenido de una cromatografía GAS/MASA,
se muestra que la fórmula molecular es C 20H24N20, con un ión
molecular a m/e 308 (M f), y con un pico base a m/e 294.

Tanto el espectro de masas como el RMN-'H, resultaron con una

correlación idéntica a los obtenidos para aristotelinona, en trabajo
anterior(1 2); lo anterior y la cromatografía GAS/MASA realizada con una
muestra auténtica nos corroboraron que se trataba de aristotelinona.
HOBARTINA: MS/1 137 (planta)

Este compuesto se recristalizó desde CHCI 31n-hexano (10:1), su

punto de fusión concuerda con los datos de la literatura para hobartina.
Mostró un test de Erlich positivo y un espectro U.V. típico para un indol,
lo que indica que se trata de una seco-aristotelina, es decir, la posición a
o 3 sustituida por un hidrógeno.
El i.r. mostró las absorciones típicas para indoles sin sustituciones
oxigenadas..

Al comparar su espectro RMN-'H con el del compuesto MS/1 089

(makomakina), resulto ser casi idéntico, salvo por los desplazamientos
observados para los metilos, uno de ellos acoplado a un protón a través
de un doble enlace; además no se aprecian las señales a 8 4,8 - 4,9
dos tripletes típicos para protones olefínicos, como en el caso de
makomakina, el resto del espectro es igual a este último alcaloide.
El análisis por cromatografía GAS/MASA, nos permitió acceder a
la fórmula molecular C 20H26N2 , el pico del lón molecular a m/e 294 (M),
nos confirma ésto y su pico base a m/e 164, más los datos discutidos
anteriormente, nos indica que este compuesto se trata del alcaloide
hobartina.

Todos los datos obtenidos concuerdan perfectamente con los de

la literatura.
SORRELINA: MS/1 138 (planta)

Este compuesto al igual que MS/1 137 se recristalizó desde

CHCI31n-hexano (10:1), su punto de fusión concuerda con los datos de la
literatura para sorrelina, el resultado positivo al test de Erlich, y su
espectro U.V. típico para un indol, nos indica que se trata de una seco-
aristotelina.

El i.r. muestra las absorciones características para indoles sin

sustituciones oxigenadas.

De su espectro RMN-'H es posible deducir que este compuesto

presenta señales muy parecidas a makomakina, salvo que además es
posible observar entre 6 6,34 y 5,93 dos dobletes acoplados entre sí, lo
que corresponde a hidrógenos unidos a través de un doble enlace extra
en esta molécula. Las demás señales son características para alcaloides
tipo seco-aristotelina.

Su espectro de masas nos entrega la fórmula molecular,

C20H24N2, que posee 2 hidrógenos menos que hobartina y makomakina,
su pico para el ¡ón molecular a m/e 292 lo confirma. Las demás
fragmentaciones son similares con las de hobartina y makomakina, salvo
el pico base que para makomakina y hobartina es a m/e 164, en cambio
para el presente compuesto es a m/e 162.
Todos los datos se correlacionan perfectamente con los aportados
por la literatura para el alcaloide sorrelina.
 102

8-OXO-9-DEHIDROMAKOMAKINA: MS/1 146 (callos).

Este compuesto fue aislado al igual que los anteriores por una
cromatografia HPLC y luego purificado por cromatografía en capa fina, se
recristalizó desde una mezcla CHCI3/MeOH (1:1), el resultado positivo
del test de Erlich y el espectro U y ., característico de un 3-carbonil indol,
nos indica que se trata de un alcaloide indólico sustituido en la posición
3.
Los espectros i.r. y el RMN-'H resultaron idénticos a los de
MS/958 y 998, como así también una cromatografía GAS/MASA, la que
se realizó con una muestra autentica.
Por lo anterior este compuesto resultó ser 8-oxo-9-
deh id roma koma ki na.
8-OXO-9-DEHIDROHOBARTINA: MS/1 147 (callos)

Este compuesto fue aislado al igual que el anterior a través de

una cromatografía HPLC y purificado por una cromatografía en capa fina;
se recristalizó desde una mezcla n-hexano/cloroformo (3:7). El resultado
positivo del test de Erlich y su espectro U.V. , muestra que se trata de un
indol 3 sustituido.
 Los espectro i.r. y el RMN-'H resultaron idénticos a los de MS/954,
como así también una cromatografía GAS/MASA la que se realizó con
una muestra auténtica.
Por lo anterior este compuesto resultó ser 8-oxo-9-
deh Id rohoba rti na.
 104

3.2.- DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Inicialmente, el establecimiento de explantes de Aristotelia
chllensis, se realizó en medio MS, cuyas formulaciones no dieron buenos
resultados.
Luego, se utilizó el medio MZ con algunas series de tratamientos
con reguladores de crecimiento (auxinas y citominas), en este caso si
hubo respuestas positivas a la inducción de callogénesis.
La prueba con medio HH se realizó para ver un mayor crecimiento
de los callos obtenidos y ésto se logró en varios tratamientos,
especialmente el medio HH con una relación auxina-citomina alta.
Los explantes de A. Chilensis, muestran un comportamiento frente
a los tratamientos inductores, que difieren de acuerdo a la zona de su
procedencia y de la naturaleza de los reguladores de crecimiento
agregados a los medios de cultivo.
Los explantes provenientes de hojas forman callos al incubarlos
sobre un medio MZ con AlA y BAP a las concentraciones de 0,5 y 0,1
mg/L respectivamente, tanto en la superficie de la lámina, como en el
extremo dista¡ del pecíolo, en un lapso aproximado de 7 dias. Los callos
"laminares" diferencian yemas al someterlos a tratamientos adecuados,
sin embargo, al callo formado en el pecíolo diferencia raíces
directamente. Este comportamiento ya se ha observado en otra especie
autóctona Euphorbia Iactiflua. En relación con esta situación se puede
argumentar que en la alfalfa se ha informado sobre respuestas diferentes
en callos del mismo origen: si éstos se incuban con una relación
citomina-auxina alta el callo diferencia raíces al colocarlos a continuación
en un medio libre de fitohormonas, por el contrario, si la incubación se
efectúa con una relación auxina-citomina alta, el callo diferencia tallos en
un medio libre de fitohormonas.
No sólo la respuesta de callo es diferente, sino que además, su
reacción a la relación de los reguladores es diametralmente opuesta.
 1(15

3.3.- DE LAS SERIES FITOHORMONALES.

La serie inicial de explantes foliares cultivados en medio
Murashige-Skoog, no mostró mayores resultados, más que algunas
formaciones de pelos radiculares desde pequeños callos, formados en
los costados de las láminas incubadas. Los demás tratamientos o bien
sufrieron necrosis (muerte del tejido) o produjeron callos de modo
diferente al esperado. Tanto la serie 1 como la 2 y la 3 sólo condujeron a
la obtención de una linea celular de callos que mostraron la presencia de
alcaloides en los análisis respectivos sólo en cantidades trazas.
Con respecto a las series 4, 5 y 6 se logró determinar que en la
serie 4 los callos obtenidos en el tratamiento 4 fué el óptimo para los
fines de esta investigación. Se formaron callos friables de color verde
claro, cerca de 7 dias despues de iniciadas las incubaciones en
presencia de AlA y BAP a las concentraciones de 0,5 y 0,1 mg/l.
respectivamente. La actividad callogénica se observó en los cortes de
trozos de las láminas incubadas o en la base del pecíolo en las hojas
intactas. Desde éstos además se diferenciaron raíces en el mismo lapso
que la detección de callos y que reorganizaron una planta nueva de
Aristotelia chilensis.
Otra serie de explantes foliares y de yemas ap ¡ca les
diferenciaron callos a los 30 dias, al incubarlos en medio MZ con relación
AlA y BAP alta y en el mismo medio con una relación AlA y zeatina alta,
respectivamente, las que además presentaron yemación múltiple (ver
Fig. 1 B en anexo).
Los explantes foliares de las series 5 y 6 diferenciaron raíces
directamente en presencia de AlA, 2,4-D y zeatina, según tablas 12 y 13
respectivamente, especialmente en los tratamientos con concentraciones
de AlA de 2 y 3 mg/1t.
Las yemas ap ica les mostraron actividad a los 7 dias en los
tratamientos 5, 14 y 15 de la serie 4 que presentan una concentración de
0,75 y 0,1; 0,4 y 0,2; y 0,5 y 0,2 mg/L. de AlA y BAP respectivamente.
 106

Con respecto a las series 7 y 8, donde se incubaron callos

provenientes de la serie inicial (de hojas), inducidas con AlA y BAP a las
concentraciones de 0,5 y 0,1 mg/1t en medio MZ, que al ser incubados en
medio HH con AlA y zeatina, se multiplicaron con rapidez y en un lapso
aproximado de 14 días.
En este período alcanzaron el doble de su tamaño inicial,
presentando un color verde claro, de aspecto compacto y no se
diferenciaron yemas. Los tratamientos hormonales que provocaron la
mayor proliferación celular corresponden al 7, 16, 17 y 19 de la serie 8.
La relación de los reguladores de crecimiento se puede observar en las
tablas 15 y 16.

TABLA 15.- TRATAMIENTOS REALIZADOS CON

REGULADORES HORMONALES DE CRECIMIENTO:
(en mg/L)
AUXINA(AIA) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0
CITOMINA.
BAP.
0,0 0,0 0.5 1,0 1.5 2,0 3.0 4,0 5,0
0,1 6,0 6.5 7,0 7.5 8,0 9,010,0 11,0
0,50 12,0 13,0 14 15 -
1,00 18 19 20 21 22 -
 IUYA

TABLA 16.-COMBINACION DE FITOHORMONAS PARA LOS

TRATAMIENTOS Hz-1,5 Y Z-695.

HORMONAS: mg/L.

TRATAMIENTOS: Hz-1,5 Z-6,5

AlA (Acido ¡ndol acético) 1,5 0,5

BAP (Bencil aminopurina) 0,1
zeatina 0,1

Hz-1,5=tratamiento en medio HH, con 1,5 mg/L de AlA y 0,1 mg/L

de zeatina.
Z-6,5 = tratamiento en medio MZ, con 0,5 mg/1- de AlA y 0,1 mg/1-
de BAP.

3.4.- DE LOS PRECURSORES MONOTERPENICOS.

Una vez seleccionado el medio de cultivo y las combinaciones
fitohormonales, se realizó el estudio de la influencia de precursores
monoterpénicos en la producción de alcaloides de estos cultivos, a través
de distintas series con 15 tratamientos cada una.
La serie más interesante de todas resultó ser la serie N° 12 con
geraniol y medio base MZ. También la serie con nerol y medio base MZ
resultó interesante.
Los resultados totales se muestran en la tabla 17.
Con respecto a las series sobre medio base según HH, sólo los
callos cultivados con geranio¡ mostraron diferencias significativas con
respecto al resto (serie N° 9).
 TABLA 17.- RESULTADOS EN MG. DE EXTRACTO
ALCALOIDEO TOTAL.

MASA TOTAL EXTRAC. Al-C. % RENDIM.

DE CALLOS TOTAL

SERIE 9 3,4 Kg 15,30 grs 0,45

SERIE 10 2,3 Kg 2,07 grs 0,09
SERIE 11 2,5 Kg 2,50 grs 0,10
SERIE 12 3,2 Kg 18,44 grs 0,576
SERIE 13 3,1 Kg 12,71 grs 0,41
SERIE 14 2,8 Kg 10,64 grs 0,38

De la serie N° 9 los tratamientos mas notables fueron los Nos. 6,

10, 12 y 14
De la serie N° 12, los tratamientos mas notables fueron los Nos. 7,
9, 11, 12y14.
De la serie N° 13, los tratamientos mas notables fueron los Nos. 8,
10,12, y 14.
Estos resultados demuestran que en la producción de estos
alcaloides , es obvia la influencia de geranio¡, lo que demuestra la
acertada incorporación de este monoterpeno a los medios.
Además, los porcentajes de producción demuestran la
incorporación de este monoterpeno en las estructuras moleculares
alcaloídeas, aunque la literatura hace mención a la incorporación de
loganina o secologanina
Los rendimientos obtenidos en las series indicadas en la tabla 18,
siempre fueron aumentando en forma exponencial hasta llegar a una
 109

concentración límite, después de la cual la producción alcaloídea baja

abruptamente, lo que es característico en este tipo de estudios(24, 78).
En todos los tratamientos no se vió afectado en forma negativa el
crecimiento celular.
El tiempo considerado para tomar las muestras y hacer las
extracciones osciló entre los 8 y 10 días después de cada incubación. No
se hizo un estudio de la relación de la producción en el tiempo, factor que
es necesario estudiar.
 3.5.- DE LOS PRECURSORES AMINOACIDOS.

Tabla 18.- Resultados Serie N° 15.(MZ + L-triptófaflo).

ratamiento mg/L. Masa total Callos Masa Extr.Alc.* % Rendim.
1 (10) 0,39 N.D. N.D.
2 (50) 0,41 7,3x1 09 0,187
3 (100) 0,43 9,3x10g 0,216
4 (200) 0,42 1,47x103 0,35
5 (300) 0,39 1,44x103 0,37
6 (400) 0,41 1,68x103 0,41
7 (500) 0,45 2,03x103 0,45
Totales: 2,9g 8,28x10 x 0,33

*) Extr.Alc.=extracto alcaloídeo total, en gramos

%Rendim. = % de rendimiento con respecto a callos secos.

Tabla 19.- Resultados Serie N° 16 (MZ + triptamina).

Tratamiento mg/L Masa total callos Masa Extr. .Alc. % Rendim.

1 (10) 0,31 N. D. N. D.
2 (50) 0,30 5,4x10-4g 0,18
3 (100) 0,32 8,Ox10-4g 0,25
4 (200) 0,33 1,023x10-3g 0,31
5 (300) 0,33 1,22x10-3g 0,37
6 (400) 0,34 1,36x10-3g 0,40
7 (500) 0,37 1,52x10-3 g 0,41

Totales 2,3 6,43x10-3 x0,32

Tabla 20.- Resultados Serie N° 17 (HH + L-triptÓfano)

Tratamiento mg/1- Masa total callos Masa Extrc.Alc. % Rendim.

1 (10) 0,48 N. D. N. D.
2 (50) 0,37 N. D. N. D.
3 (100) 0,41 1,27x10-3g 0.31
4 (200) 0,39 1,13x10-3 g 0,29
5 (300) 0,40 1,40x1 0-3 g 0,35
6 (400) 0,41 1,353x10-3g 0,33
7 (500) 0,45 1,80x10-3 g 0,40

Totales 2,91 g 6,59x10-3 x=0,336

Tabla 21.- Resultados Serie N° 18 (HH + triptamina)

Tratamiento mg/1- Masa total callos Masa Extrc.Alc. % Rendim.

1 (10) 0,55 N.D. N. D.

2 (50) 0,49 N. D. N. D.
3 (100) 0,50 1,55x10-3g 0,31
4 (200) 0,45 1,485x10-3 g 0,33
5 (300) 0,48 1,39x10-3 g 0,29
6 (400) 0,52 1,40x10-3g 0,27
7 (500) 0,61 1,525x10-3g 0,25

Totales 3,6 7,35x10-3 x=0,29

Aquí de las series realizadas la N° 15, mostró notables resultados,

ya que de un rendimiento de extracto alcaloídeo total sin aminoácido de
un 0,1% se aumentó a un 0,45 % de rendimiento alcaloideo total.
 "pl

Los callos fueron estudiados en las condiciones que

anteriormente habian permitido la obtención de extractos de alcaloides
en bajos rendimientos (menores a un 0,1%), aún inadecuados para los
estudios de actividades biológicas. A pesar de ello, se intentó además la
adición de otros aminoacidos como L-triptamina, cuyos resultados no
mostraron los rendimientos obtenidos con L-triptófano.
Por otra parte, las muestras obtenidas del tratamiento original con
L-triptófano siempre presentaron irreproducibilidad de los resultados,
aunque fueron las que presentaron mayores rendimientos en los
experimentos de determinación de las concentraciones óptimas , lo que
sería un indicador de la inestabilidad de este aminoácido. A la vez, las
muestras obtenidas de los tratamientos con L-triptamina, presentaron
una mejor reproducibilidad, ésto posibilitó un estudio de las distintas
concentraciones milimolares. Sin embargo el contenido de alcaloides fue
menor en este caso.
Es importante destacar que las series realizadas en medio HH, si
bien no mostraron buenos rendimientos, ellas muestran valores muy
significativos, pues algunos tratamientos mostraron rendimientos
bastante mayores que el 0,001% (rendimiento planta). Además, se debe
destacar que las cantidades de callos utilizadas fueron del orden del
gramo, a diferencia de los tratamientos con monoterpenos, donde las
cantidades estuvieron en el orden del kilogramo.
Con respecto a los tratamientos en medio HH, se puede decir
que, en la serie N° 18, el tratamiento N° 7 (con la mayor cantidad de L-
triptamina), mostró un crecimiento celular considerable.
 113

3.6.- DE LA PRODUCCION DE ALCALOIDES POR CULTIVO EN

MEDIOS ESTACIONARIOS.
La producción de alcaloides por los callos se indujo mediante
fitohormonas y por precursores biosintéticos, como monoterpenos y
aminoácidos, procedimientos elaborados, por diversos investigadores en
el área de la obtención de alcaloides por biotecnología de cultivo de
tejidos. (24, 78, 54).
Los callos se obtuvieron a partir de explantes de hojas de A.
chilensis, inicialmente en un medio de cultivo agarizado según MZ. (24),
con fitohormonas, especialmente auxinas ( por ejemplo: ácido indol
acético (AlA)) y citominas (por ejemplo: 6-bencil amino purina (BAP)).
Una vez obtenido los callos en cantidad suficiente se trasladaron
a un medio de cultivo HH (53) más rico en nutrientes y que contiene
precursores de alcaloides indólicos tipo aristotelia, L-triptofano, junto al
monoterpeno geraniol, con el propósito de inducir a los callos para que
biosintetizen alcaloides.
Los resultados muestran que tanto los niveles de carbono como
de nitrógeno, deben ser ajustados a ¡os ordenes de magnitud contenidos
en el medio de cultivo MZ; ya que éstos mostraron ser importantes
factores en la inducción de la producción de este tipo de alcaloides; la
literatura muestra la importancia de este detalle en otros cultivos (78).
Durante el transcurso de este trabajo, se determinó los
tratamientos hormonales necesarios para inducir la formación de callos y
la producción de alcaloides indólicos a partir de éstos, a través, de la
introducción en los medios de cultivo, de precursores de conocida
capacidad para inducir alcaloides indólicos en medios de cultivo, como
son L-triptofano y los monoterpenos nerol y geraniol.
 114

3.7.- DE LA PRODUCCION DE ALCALOIDES POR CULTIVOS EN

MEDIOS EN SUSPENSION.
Luego de haber determinado el protocolo anterior, se entró en la
fase de introducción de los cultivos en bioreactor, para lo cual se
realizaron ensayos previos en un agitador circular de oscilación (800
rpm), Debido a problemas surgidos de la introducción directa de los
callos al bioreactor (contaminación y necrosis ) y en condiciones de
temperatura constante con cultivos en suspensión, se realizó una prueba
durante el año 1993. Los resultados definitivos con este procedimiento
mostraron que los callos muestran una respuesta que parece depender
del tejido o de la posición que estos ocupan en el órgano, lo que podría
corresponder a un caso de perífisis (79), los callos provenientes de la
incubación de explantes con AlA y BAP en medio HH, muestran una
mejor repuesta en cuanto a permanencia en la suspensión, pero luego
degeneran ostensiblemente.
Los efectos de los nutrientes, de igual forma que en los cultivos
estacionarios, juegan un papel decisivo, el medio MZ mostró buena
respuesta en cuanto a cantidad de alcaloides producidos, pero no así la
permanencia del callo en el medio.
En cuanto a los precursores adicionados es posible que estos
degeneren y no sean absorbidos con igual eficacia por los tejidos, en
todo caso los cultivos en medio MZ con L-triptófano mostraron una buena
producción a diferencia de lo ocurrido en el medio HH, lo que se puede
deber a la deficiencia de aireación de los cultivos (80, 81).
Por lo anterior no fué posible mantener un cultivo en el tiempo y
luego este procedimiento se abandonó, para continuar con los cultivos en
balsas de polipropileno SIGMA.
La extracción de alcaloides de los callos obtenidos de los
tratamientos anteriores, resultó positiva.
 115

Además, es necesario hacer mención que se detectó la

presencia, (por CCF analítica), de otros metabolitos, junto con pequeñas
cantidades de los precursores incorporados previamente al medio de
cultivo.
3.8.- SELECCION DE CALLOGENESIS Y ANALISIS DEL ,PROCESO.
En la propagación vegetativa de plantas autóctonas, usando la
biotecnología del cultivo de tejidos, pueden presentarse dificultades que
provienen de la inoperancia de los medios de incubación, junto a la
naturaleza y concentración de las auxinas y citominas, establecidas en
primera instancia por Murashige (55, 56), para las distintas fases de la
organogénesis.
Existe información que muestra que la naturaleza de los
reguladores de crecimiento y la relación molar de algunos de los
componentes de los medios de cultivo, influyen notablemente en las
respuestas de los explantes (65). El efecto de las fitohormonas no sólo
varía entre las especies, si no que también, se expresan en forma distinta
entre explantes de la misma planta provenientes de diferentes órganos
(66). Una auxina, el ácido indolacético, puede inducir la formación de
embriones en Digitalis oscura, mientras que en otras especies sólo
forman callos (67).
Las respuestas de los explantes de A.chilensis varían de acuerdo
a su origen, frente a las características químicas de los reguladores de
crecimiento, de sus combinaciones y de los medios de cultivo.(84).
Los explantes provenientes de hojas, forman callos al incubarlos
con AlA y BAP a las concentraciones de 0,5 y 0,1 mg/1- respectivamente,
tanto en la superficie abaxial, como en el extremo dista¡ del pecíolo (Fig.1
A del anexo), en un lapso aproximado de 7 días. los callos laminares
diferencian yemas de acuerdo a los tratamientos señalados en la serie 4.
Sin embargo, el callo formado en el pecíolo diferencia raíces
directamente (Fig. 1 A, del anexo).
 ¡16

Los explantes provenientes de ápices caulinares reiniciaron su

actividad (crecimiento), al incubarlos con AlA y zeatina a las
concentraciones de 0,5 y 0,1 mg/L respectivamente en medio base HH.
Estos resultados señalan que los reguladores de crecimiento y el medio
de cultivo son adecuados para este propósito, indicando también que no
existe latencia en estos órganos en la época en que comenzaron las
experiencias (abril-mayo), puesto que se reactivaron aproximadamente
una semana después de iniciadas las incubaciones (Fig. 1 0, del anexo).
En cambio, las yemas de plantas mantenidas en invernadero, en
condiciones no controladas, provenientes del camino a Santa Juana
(Octava Región), se reactivaron a fines de agosto, siguiendo el curso
natural de la estacionalidad (Fig.1 E, del anexo).
El comportamiento de los ápices caulinares que se incubaron bajo
un diseño factorial de 141 tratamientos, que corresponde a la serie 4 con
distintas relaciones de concentración auxina y citomina en medio MZ,
señala reactivación gemular sólo en los tratamientos 10, 51, y 52, pero
en los dos últimos se eliminó la dominancia apical, forzando el
crecimiento de las yemas axilares presentes en el ápice (yemación
múltiple), (Fig.1.C, del anexo).
Los callos provenientes de la incubación de explantes en medio
MZ a las concentraciones ya indicadas, se reincubaron en medio HH bajo
distintos tratamientos con diferentes concentraciones y combinaciones
de AlA, zeatina, BAP y 2,4-D. De éstos sólo proliferaron en forma util los
callos de los tratamientos con AlA y zeatina. Esto en razón a que fueron
estos callos los que posteriormente producian alcaloides en los
tratamientos con los precursores tanto monoterpénicos como
aminoácido. Estos callos en un inicio eran friables, pero luego de unos
dias comenzaron a formar en su interior callosidades duras de
características leñosas, por esto es que se tomaron las muestras en
lapsos cortos de tiempo (7, 8, y lOdias).
En cambio los callos incubados en el mismo medio, pero con las
combinaciones de 2,4-D y zeatina aumentaron de igual forma su
volumen, dando masas de color verde claro y de aspecto compacto, no
 117

friables, esta característica de "dureza", puede atribuirse a la formación

de lignina, debido a la acción del 2,4-D (48). Este compuesto puede,
también, inhibir la formación de metabolitos secundarios (85), lo que
podría explicar porque no se detectó la presencia de alcaloides indólicos
en los callos provenientes de estos tratamientos. En cambio, en pruebas
preliminares sí se detectaron alcaloides, en todos los ensayos sin esta
auxina sintética.
Con todo, este trabajo permite establecer un protocolo para
reorganizar, multiplicar plántulas de maqui, y producir alcaloides.
 11

PROTOCOLO PARA CULTIVOS DE A. chilensis

1.-Inducción de formación de callos en tejido foliar.

Medio MZ + 0,5 mg/L de AlA. + 0,1 mgIL de BAP

2.-Inducción del crecimiento de callos.

Medio HH + 1,5 mg/1- de AlA. + 0,1 mgIL de zeatina.

3.- Evaluación de la producción de alcaloides.

Determinación cuantitativa de presencia de alcaloides.
en los callos obtenidos del tratamiento Hz-1 ,5.:
- pesar los callos.
- chequear presencia de alcaloides.
- determinación cuantitativa de éstos.

4.- Producción inducida de alcaloides. indólicos.

- Ensayos con triptófano
- Ensayos con geranio¡
- Ensayos con triptamina

5.- Ensayos con triptófano/geraniol.

6.- Ensayos con triptamina/geraniol.
 119

3.9.- SINTESIS QUIMICA DE ALCALOIDES INDOLICOS TIPO

ARISTOTELIA.
Se realizó la primera etapa de la síntesis propuesta, a partir de
(+)-cc-pineno, monoterpeno que se hace reaccionar con acetonitrilo
(CH3 CN) en presencia de nitrato de mercurio H. Este último actúa como
agente catalizador, y como agente inductor de la este reoselectividad de
la reacción formando un complejo con el c-pineno, hecho conocido por la
oxidación alílica de olefinas (29), a través del doble enlace
monoterpénico, dejando así la posibilidad de que el nucleófilo del
acetonitrilo ataque al carbono cuaternario del pineno, mediante una
reacción de tipo Ritter(30).
En esta reacción se utiliza la solvomercu ración -demercUración de
olefinas en presencia de aceto nitrilo, y proporciona una técnica
conveniente para la amidación alilica Sin embargo, el tratamiento de cx-
pineno 49 con acetonitrilo en presencia de nitrato de mercurio no produce
la amida esperada, sino que en su lugar el azabiciclo[3.3.1]flOneflo 50,
este compuesto es un producto racémico, que aparentemente proviene
del rápido equilibrio de los intermediarios organomercuriales alílicos B y
B' (29 y 71), (ver esquema 19).
El compuesto a obtener en esta primera etapa es el : 2,2,4,6-
tetrametil3AzabiCiClO-(3,3,1)-fl0fl36die fl 0 50.
En el esquema 19 se muestra, en secuencia, el procedimiento
utilizado y algunos mecanismos y fenómenos que es posible que se
formen durante el curso de la reacción. La formación del
azabiciclononeno 50, resulta de una ciclación intramolecular via un ión
azocarbonio (B y B'), un hecho similar se ha observado cuando la
reacción de Ritter se lleva a cabo sobre una hidroxiolefina (71).
En esta etapa se obtuvo una mezcla que analizada
cromatograficamente con reactivo de Dragendorif, muestra la presencia
de sólo una sustancia que forma complejo de bismuto. Posteriormente
mediante cromatografia en capa fina preparativa, se aisló y purificó el
 1 2()

compuesto SO, en una cantidad equivalente a un 28% de rendimiento

(0,339 grs) de esta etapa de la síntesis.
A través de la reactividad positiva frente al reactivo de
Dragendorif, es posible inferir la presencia de nitrógeno en la estructura
aislada.

NO3

--ONO2
49 w

Hg-ONO2

Hg-ONO2
B B'

ESQUEMA 19.-Formación de intemediarios organo-mercuriales en la

síntesis de 2,2,4,6-Tetrameti1-3-AZabiCiCtO-3.3.1 -non -3,6-dieno 50
(19).
 121

Hg(NO )

ISATINA
PIPERIDINA

H
N
H51

ESQUEMA 20.- ESQUEMA GENERAL DE LA SINTESIS.Y DEL

OXINDOL 51 (19).

Su espectro infrarrojo, muestra dos absorciones fuertes a

V= 2850 y 2950 cm -' (C-H), una banda variable a y = 1660 cm 1 ( CN-)
para compuestos alquílicos, a y = 1640 cm~ 1 señal mediana ( CC
monosustituido), a y = 1610-1100 cm -1 varias bandas (C-N) alifático, no
se observan bandas de absorción sobre los 3000 cm 1 , lo que indica la
presencia de un átomo de nitrógeno enlazado sin hidrógeno, es decir,
C=N-C-, que es lo que se esperaba. (74).
Su espectro ultravioleta, muestra una fuerte absorción a los 287
nm, que corresponde a una transición del doble enlace -C=N- , (el
doble enlace -C=C- absorbe bajo los 180 nm, (74).).
 122

Su espectro de RMN-H'; muestra una agrupación de señales

entre 6 = 1-2 ppm , que corresponde a cuatro grupos metílicos, entre 6 =
2 y 3 ppm. , varios multipletes que pueden ser asignados a protones de
tipo alifáticos ciclicos, entre 6 = 3,5 y 4,0 ppm. un multiplete que
corresponde a los protones alílicos laterales del azabiciclo, por último
otro multiplete entre 6 = 5.0 y 5.5 ppm. que seguramente debe
corresponder a la resonancia del protón vinílico del azabiciclo. (76).
Luego del análisis de los datos espectrocópicos y
cromatográficos, considerando que se trataba del compuesto correcto, se
dió comienzo a la segunda etapa de reacciones, la que en su primera
parte; la más importante; contempla la condensación del compuesto 50
con isatina, reacción que se realizó según las recomendaciones dadas
en bibliografía (29).
De la reacción anterior se obtuvo una mezcla, la que muestra en
su espectro de RMN-'H, tomado a 60 MHz, un multiplete entre 8 = 6.8 y
7.2 ppm., que corresponden a protones de tipo aromático, otro multiplete
asociado a un singlete entre 6 = 5,2 y 4,8 ppm. que corresponde a
resonancias de protones alílicos; además una amplia banda donde se
puede observar varios multipletes asociados entre 6 = 2,8 y 2,1 ppm. que
se debe a la presencia de protones metilénicos; por último otra banda
ancha entre 6 = 1,6 y 1,0 ppm. que corresponde a protones metílicos.
Mediante CCF-preparativa desarrollada con CHCI 3 al 100%,
como sistema eluyente, se logró aislar un compuesto de esta mezcla (el
de mayor Rf), del que se logró obtener solo datos parciales, debido a que
se obtuvo una pequeña cantidad; su espectro de RMN-'H a 60 MHz (ver
anexo), muestra señales a 6 = 7,5 y 7,2 ppm. un multiplete (protones
aromáticos), a 6 = 5,2 un multiplete y a 8 = 4,8 ppm multiplete (protones
unidos a C=C), a 8 = 3,8 y 3,2 ppm multiplete señales que deben
corresponder a protones metínicos y entre 8 = 2,0 y 1,4 ppm un
multiplete correspondiente a grupos metilos. Los valores coinciden con
los aportados por la literatura para el compuesto 51(27).
 123

En esta etapa se obtuvo un rendimiento de un 3,17% (aprox.

20 mg); y en relación a la cantidad inicial de o-pineno el porcentaje
obtenido es de 0,88%; este bajo rendimiento podria deberse, en primer
término al bajo rendimiento de la primera etapa (28%), luego en el
proceso de aislamiento, donde es importante destacar que se puede
detectar la presencia de otros productos durante la reacción, los que
fueron detectados a través del análisis cromatográfico, pero no fueron
identificados, junto a lo anterior se debe mencionar que en la separación
por cromatografía en capa fina, siempre se pierde una cantidad de
producto.
Sobre la base de lo anterior y considerando los
antecedentes sobre cultivos de tejidos, que muestran que el tiempo
necesario para estudios previos a la producción de metabolitos
secundarios mediante cultivo de tejidos es considerable, pero donde las
cantidades de alcaloide a obtener, son mucho mayores y el tiempo
utilizado para obtener un resultado positivo, luego de tener establecido el
protocolo a seguir, es mucho menor, se optó por descontinuar el trabajo
de síntesis y todos los esfuerzos se abocaron a la investigación sobre
obtención de alcaloides por cultivo de tejidos,
 124

3.10.- ACTIVIDAD BIOLOGICA.

a) Actividad Antibacteriana.
La actividad antibacteriana de los extractos totales confirmó
los resultados obtenidos anteriormente, mostrando actividad frente a
cepas de Sta phylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escheríchia coli y
Sarcina lutea.

Con respecto a los compuestos puros ninguno, de los que

se envió para análisis, mostró una actividad significativa.

b) Actividad Anticancer.

De los compuestos enviados al Instituto Nacional del Cancer

de los Estados Unidos, sólo mostraron una muy débil actividad, tanto
aristotelina como 8-oxo-9-dehid roma komakina.
Con respecto a actividad antisida, ningún compuesto resultó
activo.
Con respecto a actividad citotóxica, los compuestos
enviados al Instituto de Biotecnología de la Universidad de
Kaiserslautern, sólo 8-oxo-9-dehidromakomakina, makonina y aristona
mostraron efectos citotóxicos modestos.
 125

Los resultados anteriores permiten inferir, tomando en

cuenta los antecedentes sobre el uso de extractos acuosos en medicina
popular, que los efectos antibacterianos y posiblemente anticancer,
estarían actuando como posibles principios activos, sólo en forma de una
mezcla de los metabolitos constituyentes de Arístotelia chilensis.
Tabla 22 : Actividad citotoxica de algunos alcaloides de Aristate//a
Compuesto concentración inhibición de la inducción de la
[jig/ml] expresión SEAP expresión SEAP

1 10 - -
1 50 - -
2 10 - -
2 50 - -
3 10 - -
3 50 - -

SEAP= Sigla inglesa para denominar la inhibición o inducción de señales

de transducción dependientes de glucocorticoides medidas como
expresión de fosfatasa alkalina secretable en células transfectadas COS-
7. (S EAP =secreta ble alkaline phosphatase).
Compuesto 1 = 8-oxo-9-dehidromakomakina +
8-oxo-9-dehidrohobartina.
Compuesto 2 = makonina.
Compuesto 3 = aristona.
 126

4.- CONCLUSIONES

1. A través de la aplicación de técnicas convencionales de un

estudio fitoquímico. Se describen por primera vez en Aristotelia
chilensis (Mol) Stuntz los alcaloides : arístoquinolina, hobartina,
serratolina, sorrelina y makomakina.
2. El alcaloide aristoquinolina, es totalmente nuevo para esta planta
y el género.
3. Los medios para una rápida inducción de callogénesis y
posterior crecimiento fueron MZ y HH respectivamente.
El medio MS mostró bajos rendimientos.
4. La combinación y concentración de fitohormonas para:
- inducción fué 0,5 mg/L de AlA y 0,1 mg/1- de BAP.
- crecimiento fué 0,5 mg/L de AlA y 0,1 mg/L de zeatina.
5. Los precursores mas adecuados son tnptofano y geranio¡.
6. Los alcaloides obtenidos por cultivos fueron:
anstotelina, 8-oxo-9-dehidrohobartína, anstotelinona,
makonina, 8-oxo-9-dehidromakomakina y aristona.
7. El rendimiento promedio alcanzado fue 0,45 %.
8. Se detectó actividad biológica frente a Sthaphylococcus aureus
y Sarcína lutea en extractos totales. Los metabolitos puros no
mostraron actividad frente a las cepas bacterianas evaluadas.
9. Se detectó débil actividad antitumoral, en los alcaloides
evaluados: 8-oxo-9-dehidromakomakina y aristotelina. Además 8-
oxo-9-dehidromakomakina, makonina y aristona, mostraron una
débil actividad citotóxica.
 127

10.Se realizó la síntesis química del compuesto intermedio para

acceder a hobartina y posteriormente a aristotelina.
11.Se estableció un protocolo que permitirá establecer a futuro un
diseño para ampliar los estudios de producción de estos alcaloides.
 1 2l

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 136

ANEXOS
 137

FIGURA 1.-FOTOS

CALLOS DE Aristotelia chilensis.

 138

r.

=-

-
41
T4
Ijfr.

-v% y -

- - =
-r

>
-
rl
 139

ANEXO 1.

Resumen de parámetros físicos y espectroscópicos

 ANEXO 1.
Resumen de parámetros físicos y espectroscópicos
De cada uno de los compuestos se indica el nombre y la
denominación del grupo de trabajo, según se obtuvo desde planta o por
cultivo de tejidos.
ARISTONA: MS/988 y MS/1 133
Cristales incoloros, P.F. aproximado de 240-242°C, su conducta en
cromatografía en capa fina, sobre silica-gel mostró un Rf: 0,45, eluida
con n-hexano/acetato de etilo (3:1).Mostró un test de Erlich negativo.

U.V. (MeOH)(?. max.,nm): 212, 230, y 290 (c 5000).

Ir: (vmax., cm - '): 3350, 1690(v-9, 1680(9, 1615, 1285, 1230, 1165, 1150,
1075, 995, 975, y 760.
MS., (mlz): 55, 73, 115, 130, 143, 157, 182, 194, 223, 237, 251, 293,
308(M).
Cromatográficos (Gas/masa): Rt: 15,1 mm
MAKONINA: MS/995, MS/1 075 Y MS/1 134:
MS/995 resultó ser una mezcla con un 10% de serratolina y un 90% de
makonina, se obtuvo un residuo aceitoso, su conducta en cromatografía
en capa fina, sobre silica-gel mostró un Rf comprendido entre 0,65 y
0,70, eluído con CHCI 3/Acetato de etilo/Metanol (35:55:10). Mostró un
test de Erlich negativo.
MS/1 075 y MS/1 134 se obtuvieron como cristales incoloros en forma de
ajuga, de P.f. aproximado de 310-312°C. Su conducta en cromatografía
en capa fina, sobre silica-gel mostró un Rf de 0,65, eluído con
CHCI3/Acetato de etilo/Metanol (35:55:10). Mostró un test de Erlich
negativo.
U.V. : (MeOH)(X max.,nm): 310, 270, y 248.
 141

Ir (y , cm-1 ): 3250(ancha), 2970, 2950, 2930, 2910, 1610, 1585,

1570(hombro), 1460, 1440-1450 (hombro), 1380, 1350, 1310, 1290,
1250, 1170, 800, 755, 640.
RMN-'H:(8 valores, ppm): 0,9(s); 1,1(s); 1,6(ddd); 1,95(ddd); 2,05(d);
2,25(ddd); 2,5(m); 3,6(ddd); 4,2(ddd); 5,3(ddd); 6,9(ddd); 7,05(ddd);
7,42(ddd); 7,6(ddd), 8,2 (dd), 8,8 (br.$).
MS:(m/z): 57, 118, 125, 167, 236(1VI-70), 251(1VI-55), 291(M-Me),
306(M).
ARISTOTELINONA: MS/1 136y MS/1 135.
Cristales incoloros tipo aguja, de P.F. aproximado de 320°C. Conducta
en cromatografía en capa fina, sobre silica-gel, mostró un Rf de 0,21
eluído con CHCI 3/Acetato de etilo/Metanol (35:55:10), test de Erlich
negativo.
U.V.:(X max): 301, 267, 245, 216.
lr:(cm'): 3250(ancho), 1610(s), 1632(s), 1469(s), 1250, 1180, 1105, 800,
750(9, 700, 640.
RMN-'H:(8 valores, ppm): 0,87(ddd); 1,25(s); 1,48(m), 1 ,56(dd), 1,75-
1,61(m), 1,97-1,8(m), 2,06(dddd), 2,69(ddd), 3,75(d); 4,2(dd); 7,5-7,6(m);
7,65-7,72(m), 8,24(dd) y 8,43(br.$).
M.S.:(m/z): 55, 73, 84, 96, 103, 130, 143, 167, 182, 184, 194, 209, 236,
251, 253, 293, 294, 308(M).
ARISTOTELINA: MS/1073 y MS/1 148
MS/1 073 se obtuvo como residuo aceitoso, que resultó ser aristotelina
contaminada con ftalato, fué purificada por cromatografía en capa fina,
sobre silica-gel, eluído con CHCI 3/Metanol (80:20), con un Rf de 0,75.
Mostró un test de Erlich negativo. MS/1 148 se obtuvo desde callos como
cristales incoloros, de P.f. :164°C. Conducta cromatográfica sobre placa
 142

de silica-gel, Rf:0,85, eluído con n-hexano/CHCI3/Acetato de

etilo(30:50:20). Test de Erlich negativo.

U.V. :(X max): 310, 283(con hombro), 270 248,

Ir: (y máx.) (cm-1 ): 3700, 3650, 3250 (ancha, N-H), 2965 , 2940, 2930,
2910 (C-H), 1610 (C=O), 1580 a 1560 (ancho con hombro, C=N), 1460,
14501430 (hombro. Aromat.), 1380, 1350, 1310, 1290, 1250, 1170,
1105, 800, 750, 700, 650.
RMN-'H:(8 valores, ppm): 0,9(ddd); 1,15(d); 1,25(s); 1,4(t); 1,65(m);
2,05(d); 2,3(m); 2,75(d); 3,1(dd); 3,65(ddd); 3,7(dd); 3,75(dd); 3,85(s);
6,95(ddd); 7,1(ddd); 7,75(ddd); 7,93(dd).
M.S.-.(m/z): 58, 70, 94, 108, 130, 143, 167, 180, 182, 194, 211, 222, 237,
251, 279, 294(M).
8-OXO-9-DEHIDROMAKOMAKINA: MS/1 146:
Se obtuvieron cristales amarillo-pálidos, desde una mezcla n-
MeOH/CHCI 3 (1:1). Mostrando un punto de fusión aproximado a 269-
271°C, conducta cromatográfica sobre sílica-gel Rf=0,80 (eluído con
Et2 0), mostró un test de Erlich positivo.
U.V.:(Xmax. nm): 318, 267, 254.
lr:(vmax., cm): 3410, 3390(hombro), 3380, 3370, 3060, 2970, 2950,
2920, 2890, 1620, 1510, 1450(hombro), 1430, 1380, 1240, 1180, 1110,
910, 895, 890, 750, y 620.
RMN-H':( valores, ppm)(CDCI3 , 400 Mhz.):1,31(s), 1,51(s), 1,6(m),
1 ,75(ddd), 1 ,85(ddd), 2,10(m), 2,1 5(ddd), 3.94(dd), 4,69(br.$), 4,86(br.$),
7,27(ddd), 7,30(ddd), 7,38(dd), 8,32(d), 8,48(dd), 8,59(br.$).
E.M.(mle): 53, 77, 91, 93, 107, 116, 136, 144, 170, 207, 222, 235, 250,
265, 291, 306 (Mf).
8-OXO-9-DEHIDROHOBARTINA: MS/1 147.
 143

Se obtuvieron cristales amarillo-pardos, desde una mezcla n-

Hexano/CHCI 3 (3:7). Mostrando un punto de fusión aproximado a 273-
274°C ,conducta cromatográfica sobre sílica-gel Rf=0,85 (eluído con
Et20), mostró un test de Erlich positivo.
U.V.:(?, max., nm): 318, 267, 254,
ir:(v max., cm-1 ): 3250, 3150, 2970, 2949, 2860, 1590, 1510, 1495, 1435,
1385, 1360, 1320, 1285, 1255, 1245, 1239, 1200, 1180, 1130, 1105,
1065, 1015, 910, 905, 805, 750, y 650.
RMN-H': (8 valores,ppm) (CDCI 3 , 400 mHz): 1,31(s), 1,36(s), 1,60(dd),
1,76(ddd), 1,91(ddd), 2,0(dd), 2,28(ddd), 2,31(ddd), 3,63(dd), 5,36(ddd),
7,27(ddd), 7,30(ddd), 7,39(dd), 8,19(d), 8,48(dd), 8,55(br.$).
E.M.(m/e): 57, 144, 291, 306(M).
SERRATOLINA: MS/1 074 Y MS/1 144
MS/1 074 resultó ser una mezcla con un 90% de serratolina y un 10% de
makonina, se obtuvo como un residuo aceitoso, su conducta en
cromatografía en capa fina, sobre silica-gel mostró un Rf comprendido
entre 0,55 y 0,65 eluído con CHCI3/Acetato de etilolMetanol (35:55:10).
Mostró un test de Erlich negativo.
MS/1 144 se obtuvo como cristales incoloros, de P.f.: aproximado de 157-
160°C, su conducta en cromatografía en capa fina, sobre silica-gel eluída
con CHCI 3/MeOH (3:1), Rf.: 0,35. Mostró un test de Erlich negativo.
UV:(?máx)(nm): 315, 290, 281, 235.

ir : (y máx)(cm) : 3750, 3650 (f), 3500, 3320, 2550, 1670 (f), 1620,
1550, 1420, 1400, 1200-1100, 1020, 980, 890, 790.
RMN-'H:(S valores, ppm): 0,8(dd); 1,1(s); 1,5(dd); 1,6(m); 1,95(d);
2 , 0(d)(*); 2,25(m); 2,5(m); 2,7(d); 3,22(dd); 3,6(s), 4,15(ddd); 4,25(ddd);
6,0(d); 6,3(s); 6,6(ddd); 6,7(ddd); 7,27(m); 7,37(m); 7,45(m); 7,65(m).
 144

MS:(m/z): 58, 73, 84, 96, 117, 130, 159, 180,181, 207, 227, 237, 253,
277, 295 (100%), 310 (M).
MAKOMAKINA: MS/1 089.
Se obtuvieron cristales amarillo-pálidos, desde una mezcla MeOH/CHCI3
(1:1). Mostrando un punto de fusión aproximado a : 166-167°C (sin
corregir).
Conducta cromatográfica sobre sílica-gel Rf=0,30 (eluído con EtO),
mostró un test de Erlich positivo.
UV:(Xmáx)(nm): 315, 290, 281, 235.

Ir-(v máx)(cm- l ): 2.900(f), 1.730(9, 1.600(v), 1.520(f-v), 1.420-

1 .470(ancha), 1.380(f-v), 1.250- 1.1 50(ancha), 1.030-1.050(9, 930, 880.
RMN-'H: (8 valores. ppm): 8,35(br s), 7,2-7,6(m), 4,8(t); 4,6(t), 3.75(s),
3,62(m), 3,0-3,1(m), 2,1-2,3(m), 2,1(m, ancho), 2,0(m), 1,55(s), 1,4(s),
1,27(s), 1,05(s).
E.M.(mlz): 164,180,199,222,237,279,294(M").

ARISTOQUINOLINA: MS/1 088

Cristales incoloros de forma rombica, de P.F.: indeterminado, se purificó

por cromatografía en capa fina, cristalizando desde una mezcla
MeOH/CH2Cl2 (15:85). Test de Erlich positivo.
UV: (?. máx)(nm): 315, 300, 289, 236.

ir: (y máx)(cm i ): 2.950(v-9, 2.400(v), 1.600(v), 1.510(v), 1.420(v),

!.200(f-ancha), 1.050(v-f), 930, 880.
 '45

RMN-H': (8 valores, ppm): 7,9- 8,1(m), 7,5-7,7(m), 4,8- 5,0(m), 2,4 -

2,6(m), 2,1 - 2,3(m), 1,63 - 1,9(m), 1,3(s), 1,2(s), 0,71(s)
MS:(m/e): 55, 59(100%), 74, 91, 93, 142, 155, 157, 183, 197, 199, 235,
248, 277, 290, 292(M).
HOBARTINA: MS/1 137
Se obtuvieron cristales amarillo-pálidos, desde una mezcla CHCI3/MeOH
(10:1), su conducta cromatográfica en placa fina, sobre silica-gel, eluída
con CHCI 3/MeOH (4:1) tuvo un Rf=0,45, mostró un punto de fusión
aproximado de 149-151°C y un test de Erlich positivo.

U.V.: (X max, nm): 223, 283, 291.

i.r.: (y max., cm-1 ): 3480, 2920, 1451, 1377, 1330, 1080, 1010, 654.
RMN-'H: (8 valores, ppm): 8,01(s), 7,63(ddd), 7,34(ddd), 7,18(ddd),
7,09(ddd), 7,08(t), 5,62(m), 3,49(ddd), 2,84(ddd), 2,69(ddd), 2,28(m),
2,17(m), 2,07(ddd), 2,06 (ddd), 1,81(ddd), 1,65-1,7(s, ancho), 1,61(dxt),
1,46(q), 1,17(s), 1,1(s).
MS:(m/e): 294 (M)(C20H26N2), 281, 279, 253, 207, 199, 174,165,
164(100%), 159, 147, 146, 144, 132, 131, 130, 117, 105, 94, 93, 91, 81,
77, 71, 57.
SORRELINA: MS/1 138
Se obtuvieron cristales amarillo-pálidos, desde una mezcla CHCI3/MeOH
(10:1), su conducta cromatográfica en capa fina, sobre sílica-gel, eluída
con CHCI3IMeOH (4:1), fue de Rf=0,30, mostró un punto de fusión
aproximado de 167-168°C y un test de Erlich positivo.
U.V.:(X max., nm): 224, 282, 291.
i.r.:(v max., cm-1): 3480, 2940, 1615, 1590, 1550, 1450, 1410, 1380,
1330, 1090, 1010, 990, 890.
 146

RMN-'H:(3 valores,ppm): 8,23(s), 7,62(ddd), 7,28(ddd), 7,1 5(ddd),

7,08(ddd), 6,97(dd), 6,34(d), 5,93(ddd), 5,07(d), 4,74(dd), 3,78(ddd),
2,81(ddd), 2,73(ddd), 2,38(dt), 2,04(dt), 2,01(ddd), 1,76(ddd), 1-
2(s,ancho), 1,27(s), 1,0(s).
MS:(m/e): 292(M), (C 20H24N2), 199, 163, 162(100%), 161, 159, 145, 133,
130, 117,105,92, 91, 77, 43, 41.
ESCOPOLETINA: MS/1 072
Cristales amorfos, de P:F: 175°C sin corregir, purificado por
cromatografía en capa fina, sobre silica-gel, eluído con MeOH/CH2Cl2
(1:25).
UV: (X máx)(nm)(ABS): 345 (1,247), 260 (0,466), 300 (0,525),
229 (1,443).
ir: (y máx)(cm 1 ): 3.700(v-9, 3.650(9, 3.050(9, 2.420(9, 1.720(v-9,
1.610(9, 1 .580(f) ; 1.520(f), 1.430(9, 930, 880.
RMN-H': (8 valores, ppm): 3 =(7,5 - 7,8)(H'-aromáticos), 6,75(s), 5,5(dd),
(3,5- 3,9)(m), 1,6(q), 1,32(s), 1,22(s), 1,1(s).
 147

ANEXO 2

Se indica en cada tapa el compuesto al cual se refieren los

cromatogramas y espectros respectivos.
 14

CROMATOGRAMAS HPLC DE EXTRACTOS ALCALOIDEOS DE

CALLOS Y EXTRACTOS DE PLANTA.
 149

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Cromatograma 1-IPLC. de Extracto alcaloideo de callos de hoja.

Vel.Fluio: 1.5m1/min. Vel.papel: 0.5cm/mm.
Detector U.V.: 280 nm. Fase Mcvii: CH3CN:H20:1% Et3N(38:62).
Columna : Bondapack RP-18 Waters.
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Cromatograma HPLC. de Extracto 1lcaloideo de callos de Tallos.

Vel.flujo:1.3 mi/mm. Vel.papel: 0.5 cm/mm.
Detector U.V. : 280 nm. Fase Movil :CH3CN:H20:Et3N. (38:62).
Columna: Bondapack RP-18. Waters.
 151

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Cromatograma HPLC, de Extracto 1 de FRc.2 de E-4 de Planta.

Vel.Flujo:1,5m1/rflifl. Vel.Papel: 0.5 cm/mm.
Detector U.V. : 280 nm. Columna: .Bondapack RP-18. Waters.
Fase Movil: CH3CN:H20 (38:62)+196 Et3N. Prog.Fluio:ISOCratiCO.
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Cromatograma HPLC, de Extracto 2 de Frc.2 de E-4 de planta.

Vel.de Flujo: 1.5m1/min. Vel.papel: 0.5 cm/min.
Detector U.V. 280 nm. Columna Bondapack—Waters.RP-18.
Fase Movil: CH3CN:H20: 196 Et3N. (38:62).
 153

CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

8-OXO-9-DEHIDROHOBARTINA (MS/1 147)
 154

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

8-OXO-9-DEHIDROMAKOMAKINA, (MS/1 146)
 159

bu ndanci TIC: TUB09.
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Cromatograma de 8-oxo-9-dehidromakomakina.
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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

ARISTOTELINA. (MS/1 148 y MS/1 073)
 166

Cromatograma de aristotelina.
 ¡67

ounaancia Scan 1381 (15.849 mm):

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Espectro de masas de aristotelina.

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

ARISTONA (MS/1 133 y MS/988)
 171

¡Abundancia TIC: MS988-1.D

35000

30000

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Cromatograma de aristona.
 172

¡3: Aristona

Espectro de masas de aristona.

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 174

CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

MAKONINA (MS/995, MS/1 075 y MS/1 134)
 175

bunclanCi a TIC: TUBO10.D

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Cromatograma de makontna
 176

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DEL COMPUESTO

ARISTOTELINONA (MS/1 135 y MS/1 136)
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Cromatograma de aristotelinona.
 183

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DE

ARISTOQUINOLINA.
(MS/1 088)
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Cromatograma de aristoquinolina.
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Espectro U.V. de aristoquinolina. (MeOH, nm).

 195

CROMATOGRAMA GAS/MASA Y ESPECTROS DE HOBARTINA

(MS/1 137)
 196

TIC.: PL7.D
undanci a

120000

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80000

60000

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Cromatograma de hobartina
 197

bund.nci Scan 1302 (15.115 mm): PL7.D

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MS/1 137: (hobartina)
5000
294

4000 174

57
3000

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2000 146
81
207
1000 130
105 10 253 281

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Espectro de masas de hobartina.

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DE SERRATOLINA

(MS/1 074 Y MS/1 144)
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TIC: MS-1001.D
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Cromatograma de serratolifla.
 202

undanci a 1: Serratolina (*)

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6000

4000

2000 310

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Espectro de masas de serratolina.

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 204

CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DE SORRELINA

(MS/1 138)
 205

Cromatograma de sorrelina.
 206

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 207

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CROMATOGRAMAS GAS/MASA Y ESPECTROS DE MAKOMAKINA

(MS/1 089)
 209

Cromatograma de makomakina.
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Espectro de masas de makomakina.

 211

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