Efecto del Cambio de Escala en el Proceso de Obtención de

Yogurt Natural Probiótico e Influencia de la Adición de Insulina

Sobre Prevalencia de Bifidobacterium Infantis en el Producto
Fermentado-Edición Única

Title Efecto del Cambio de Escala en el Proceso de Obtención

de Yogurt Natural Probiótico e Influencia de la Adición de
Insulina Sobre Prevalencia de Bifidobacterium Infantis en
el Producto Fermentado-Edición Única

Authors Verónica Carmelina Díaz Avilés

Afiliación Itesm

Fecha de 2005-05-01
publicación

Resumen Tesis Presentada para obtener el grado de Maestro en

ciencias especialidad en Biotecnología

Downloaded 13-jul-2016 14:36:44

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 INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

EFECTO DEL CAMBIO DE ESCALA EN EL PROCESO DE OBTENCIÓN DE

YOGURT NATURAL PROBIÓTICO E INFLUENCIA DE LA ADICIÓN DE
INULINA SOBRE LA PREVALENCIA DE Bifidobacterium infantis EN EL
PRODUCTO FERMENTADO

TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS
ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

POR:
VERÓNICA CARMELINA DÍAZ AVILÉS

MONTERREY, NUEVO LEÓN MAYO DE 2005

 INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

Los miembros del Comité de Tesis recomendamos que la presente Tesis presentada por la Licenciada en
Química y Farmacia Verónica Carmelina Díaz Avilés, sea aceptada como requisito parcial para obtener el
grado académico de:
MAESTRA EN CIENCIAS
ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

Comité de Tesis:

_____________________________
Cecilia Rojas de Gante, Ph.D.
Asesora

__________________________ __________________________
Sergio Serna Saldívar, Ph.D. Manuel Zertuche Guerra, Ph.D.
Sinodal Sinodal

APROBADO

____________________________________________
Federico Viramontes Brown Ph.D.
Director del Programa de Graduados en Ingeniería

MAYO, 2005
 I. AGRADECIMIENTOS

...Su gratitud no se limita al mundo espiritual; él jamás olvida a sus amigos, porque
la sangre de ellos se mezcló con la suya en el campo de batalla.
P. C.

Mis más sinceros agradecimientos a la Dra. Cecilia Rojas de Gante por su apoyo en el desarrollo de esta
investigación, ya que sin sus enseñanzas y sugerencias hubiera sido más largo el camino hacia la culminación
de la misma.

A la Organización de Estados Americanos, OEA, por haberme brindado la beca que hizo posible en gran
medida la realización de mis estudios de Maestría en Ciencia con Especialidad en Biotecnología en el
Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Monterrey.

A Fundación Produce Nuevo León A.C. por el financiamiento para la realización de esta investigación
como parte del proyecto denominado ‘‘Desarrollo y validación de alimentos probióticos obtenidos con
bifidobacterias y bacterias ácido lácticas a partir de leche de cabra y sus subproductos’’.

A Yajaira Lomas de León por sus valiosas críticas y apoyo. Pero sobre todo brindarme su amistad.

A la Q.B.P. María Isabel García por su apoyo técnico al inicio del desarrollo experimental de este trabajo.

Al M. en C. Juan Gerardo Cantú por su valiosa ayuda en la implementación del método de biología
molecular utilizado para la identificación de Bifidobacterium infantis.

Al M. en C. Jorge Benavides por la colaboración en el procesamiento de datos para el análisis estadístico de

resultados.

Al Dr. Sergio Serna Saldívar y al Dr. Manuel Zertuche Guerra por su participación en la evaluación de este
trabajo de investigación.

A Edna y Felipe por hacerme sentir en casa. Por su compañía, sus consejos y su calidez.

A todos mis amigos (que no los nombro porque ustedes saben quienes son…los de aquí y los de mi país)
por hacerme sentir la suavidad de los momentos en los que a veces parecía faltar. Por todos los buenos
momentos compartidos, por estar siempre al pendiente de mi, pero sobre todo por creer en mi.

De manera especial agradezco a mi familia: Carolina, Manuel, Vladi, Roque, Rodri, Martín, Are, Silvia,
Mamá Lita, Tía Meli, Teté, Lidia María, Papá Beto y Mamá Conchita por su amor y apoyo en todo
momento.

A Francisco Peña por hacerme sentir que podíamos lograrlo. Gracias por eso y más…

i
A mis padres con todo mi amor.

ii
 III. ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico

AOAC Association of Official Analytical Chemist
ATCC American Type Culture Collection
BMJ Bristish Medical Journal
c.b.p. ‘‘cuanto basta para’’
CA California
CAE Campo Agrícola Experimental
DEQ Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V.
DF Distrito Federal
DIA División de Ingeniería y Arquitectura
D.O. densidad óptica
EDTA Ácido etilen diamino tetracético
FAO Organización de las Naciones Unidad para la Agricultura y la Alimentación
g gramo
GRAS Generally recognized as safe
h horas
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IDF International Dairy Federation
Ig A Inmunoglobulina A
INEGI Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática
ITESM Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
kb kilobases
kcal kilocalorías
kg kilogramos
L litro
ln logaritmo natural
log logaritmo base 10
MBGA Modified bifid glucose agar
MGRCA Maltose-galactose reinforced clostridial agar
min minutos
mL mililitro
mM milimolar
MRS Man Rogose Sharpe
ng nanogramos
nm nanómetros
NMP Número más probable
NNLP Nalidixic acid-neomycin sulfate-lithium chloride-paramomycin sulfate
NR No reportado
No. Número
pb pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction
pH Potencial de hidrógeno
pp. Páginas
P/P peso sobre peso

iii
P/V peso sobre volumen
rpm revoluciones por minuto
rRNA Ribosomal ribonucleic acid (ácido ribonucleico ribosomal)
SAGARPA Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
SIAP Sistema de Información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera
TAE Tris-acetate buffer
td Tiempo de duplicación
TPY Trypticase phytone yeast
U Unidad de actividad enzimática
UFC Unidades formadoras de colonia
UHT Ultra-high temperature
USA United States of America
USD Dólares americanos
UV Ultravioleta
Vol Volume
°C grados Celsius
µ Velocidad específica de crecimiento
µL microlitro
® Marca registrada
™ Marca comercial

iv
 IV. ÍNDICE GENERAL

I. Agradecimientos i
II. Dedicatoria ii
III. Abreviaturas iii
IV. Índice General v
V. Índice de Figuras viii
VI. Índice de Tablas x
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. Marco referencial. 1
1.1.1. Probióticos. 1
1.1.2. Funciones de las bacterias probióticas en el intestino humano
y su importancia. 2
1.1.3. Bacterias probióticas. 3
1.1.4. Efectos benéficos en la salud y mecanismos de acción
de las bacterias probióticas. 5
1.1.5. Dosis terapéutica de las bacterias probióticas. 8
1.1.6. Productos probióticos. 8
1.1.7. Productos lácteos fermentados como vehículos para la incorporación
de bacterias probióticas. 9
1.1.8. Bacterias utilizadas en la investigación. 11
1.1.8.1. Bifidobacterium infantis. 12
1.1.8.2. Lactobacillus delbrueckii. 13
1.1.8.3. Streptococcus thermophilus. 14
1.1.9. Importancia de la leche de cabra y sus derivados como vehículos
para la incorporación de bacterias probióticas. 17
1.1.10. Composición química de la leche de cabra. 19
1.1.11. Situación de la caprinocultura en Nuevo León. 22
1.1.12. Fermentaciones ácido lácticas. 24
1.1.13. El yogurt como vehículo de bacterias probióticas. 25
1.1.13.1. Generalidades acerca del yogurt. 25
1.1.13.2. Proceso de elaboración del yogurt. 26
1.1.13.3. Cultivos iniciadores utilizados para la producción de yogurt. 29
1.1.13.4. Situación del yogurt en el mercado en México. 31
1.1.13.5. Características idóneas del yogurt para ser vehículo
de cepas probióticas. 32
1.1.13.6. Factores que deben considerarse al incorporar bacterias
probióticas al yogurt. 33
1.1.14. Identificación de bacterias probióticas en productos fermentados. 34
1.1.14.1. Métodos microbiológicos para la identificación de bacterias
probióticas en productos fermentados. 35
1.1.14.2. Métodos de biología molecular para la identificación
de bacterias probióticas en productos fermentados. 36
1.1.15. Prebióticos. 38

v
 1.1.16. Prebiótico estudiado en esta investigación. 40
1.1.16.1. Inulina. 40
1.2. Antecedentes. 43
1.2.1. Trabajos previos. 43
1.2.2. Problemática. 45

2. OBJETIVOS 48
2.1. Objetivo general. 48
2.2. Objetivos específicos 48

3. HIPÓTESIS 50

4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 51

5. MATERIALES Y MÉTODOS 58
5.1. Procedencia y suministro de la leche de cabra. 58
5.2. Pruebas de plataforma. 58
5.3. Caracterización de la leche de cabra. 59
5.4. Tratamiento térmico de la leche de cabra. 59
5.5. Control microbiológico de la leche de cabra esterilizada. 60
5.6. Cepas en estudio. 60
5.7. Reactivación y resguardo de las cepas objeto de estudio. 60
5.7.1. Cinéticas de crecimiento de las cepas. 61
5.7.2. Reducción de la fase de adaptación de las cepas. 63
5.7.3. Criopreservación de cepas adaptadas. 64
5.8. Preparación de cultivos madre. 65
5.9. Determinación de la concentración de bacterias en los cultivos madre. 66
5.10. Identificación morfológica de las bacterias en estudio. 66
5.11. Obtención de los inóculos de trabajo. 67
5.12. Estudio del efecto del cambio de escala en el proceso de obtención de yogurt
natural probiótico utilizando leche de cabra como sustrato. 67
5.13. Determinación de cinéticas durante la fermentación en reactor de 4.0 L. 70
5.14. Identificación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 a través de PCR
y electroforesis. 71
5.14.1. Lisis enzimática. 71
5.14.2. Extracción de ADN. 72
5.14.3. Amplificación de la región 16S rRNA de Bifidobacterium infantis
ATCC 17930 por medio de PCR. 73
5.14.4. Detección de productos de amplificación por medio de electroforesis
en gel de agarosa. 74
5.15. Efecto de la incorporación de la inulina sobre la prevalencia de Bifidobacterium
infantis en el producto fermentado. 75

vi
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 77
6.1. Pruebas de plataforma. 77
6.2. Caracterización de la leche de cabra. 78
6.3. Control microbiológico de la leche de cabra esterilizada. 82
6.4. Determinación de las cinéticas de crecimiento y de los parámetros de µ y td
de las cepas en estudio. 84
6.5. Determinación de la concentración de bacterias en los cultivos madre. 91
6.6. Identificación morfológica de las bacterias en estudio. 93
6.7. Condiciones del proceso de fermentación para la obtención yogurt natural
probiótico utilizando leche de cabra como sustrato. 94
6.8. Estudio del efecto del cambio de escala en el proceso de obtención de yogurt
natural probiótico utilizando leche de cabra como sustrato. 96
6.9. Determinación de cinéticas durante la fermentación en reactor de 4.0 L. 102
6.9.1. Variación del pH. 102
6.9.2. Formación de ácido láctico. 104
6.9.3. Consumo de lactosa como sustrato. 105
6.9.4. Desarrollo de UFC de Bifidobacterium infantis durante la fermentación. 107
6.10. Identificación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 a través de PCR
y electroforesis. 108
6.10.1. Extracción del ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930. 108
6.10.2. Amplificación de la región 16S rRNA de Bifidobacterium infantis
ATCC 1730 por medio de PCR. 109
6.10.3. Detección de productos de amplificación por medio de electroforesis
en gel de agarosa. 110
6.11. Efecto de la incorporación de la inulina sobre la prevalencia de Bifidobacterium
infantis en el producto fermentado. 113

7. CONCLUSIONES 118
8. RECOMENDACIONES 120
9. RESUMEN 121
10. REFERENCIAS 124

vii
 V. ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.- Estructura química de la lactosa. 21

Figura 2.- Operaciones unitarias de los procesos de elaboración del yogurt. 27
Figura 3.- Consumo de yogurt en México. 31
Figura 4.- Operaciones unitarias susceptibles de modificarse en el proceso
de elaboración de yogurt probiótico. 33
Figura 5.- Etapa I: Caracterización y tratamiento térmico de la leche de cabra
utilizada en la elaboración de yogurt probiótico. 52
Figura 6.- Etapa II: Reactivación de cepas utilizadas para la preparación de yogurt
probiótico de leche de cabra, reducción de la fase lag de las mismas y
criopreservación. 53
Figura 7.- Etapa III: Preparación de cultivos madre y de inóculos de trabajo necesarios
para la elaboración de yogurt de leche de cabra probiótico. 54
Figura 8.- Etapa IV: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 500 mL
utilizando leche de cabra como sustrato para la obtención de yogurt
probiótico. 55
Figura 9.- Etapa V: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 3.5 L
utilizando leche de cabra como sustrato para la obtención de yogurt
probiótico. 56
Figura 10.- Etapa VI: Estudio del efecto de la incorporación de inulina en la
viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento refrigerado
del yogurt de leche de cabra probiótico. 57
Figura 11.- Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Bifidobacterium
infantis ATCC 17930 al reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b). 86
Figura 12.- Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Lactobacillus delbrueckii
ATCC 11842 al reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b). 88
Figura 13.- Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Streptococcus thermophilus
ATCC BAA250 al reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b). 89

viii
Figura 14.- Análisis estadístico de la variación del pH en yogurt de leche de cabra
al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación. 98
Figura 15.- Análisis estadístico de los valores de acidez titulable en yogurt de leche
de cabra al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación. 99
Figura 16.- Análisis estadístico de la concentración de lactosa disponible en yogurt de
leche de cabra al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación. 100
Figura 17.- Análisis estadístico de las UFC/mL de Bifidobacterium infantis en yogurt de
leche de cabra al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación. 101
Figura 18.- Cinética del pH durante la fermentación en un reactor de 4.0 L. 103
Figura 19.- Cinética de la formación de ácido láctico durante la fermentación en un
reactor de 4.0 L. 104
Figura 20.- Cinética del consumo de lactosa durante la fermentación en un reactor
de 4.0 L. 106
Figura 21.- Cinética de la viabilidad de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 durante
la fermentación en un reactor de 4.0L. 107
Figura 22.- Especificaciones y patrón de las bandas del marcador de peso molecular
Hyper Ladder I utilizado para la identificación de Bifidobacterium infantis. 111
Figura 23.- Electroforesis en gel de agarosa al 2% de la amplificación de la secuencia
16S rRNA de Bifidobacterium infantis ATCC 17930. 112
Figura 24.- Electroforesis en gel de agarosa al 2% de la amplificación de la secuencia
16S rRNA de Bifidobacterium infantis ATCC 17930. 113
Figura 25.- Cinética de la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el estudio
del efecto de la incorporación de la inulina como prebiótico en los
productos fermentados. 114
Figura 26.- Análisis estadístico de los resultados del estudio del efecto de la adición
de inulina sobre la prevalencia de Bifidobacterium infantis en el yogurt de
de leche de cabra. 116

ix
 VI. ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.- Efectos benéficos de algunas bacterias probióticas. 9

Tabla 2.- Productos probióticos comercializados en México. 11
Tabla 3.- Características principales de las bacterias utilizadas para la elaboración
del yogurt natural probiótico. 16
Tabla 4.- Composición media de la leche de varios mamíferos. 18
Tabla 5.- Producción Nacional de leche de cabra y en el Estado de Nuevo León. 22
Tabla 6.- Leches fermentadas clasificadas de acuerdo al tipo de microorganismo
iniciador utilizado en el proceso de elaboración. 25
Tabla 7.- Medios de cultivo utilizados para la detección y enumeración selectiva del
género Bifidobacterium spp. 35
Tabla 8.- Secuencia de oligos específicos para la identificación de Bifidobacterium
infantis diseñados por Takahiro et al (1999). 38
Tabla 9.- Características de la inulina. 41
Tabla 10.- Variables en los procesos de obtención de yogurt probiótico de leche de
cabra al cambiar de escala. 69
Tabla 11.- Reactivos para la amplificación del gen 16S rRNA de Bifidobacterium
infantis mediante PCR. 73
Tabla 12.- Pruebas de plataforma realizadas a la leche de cabra producida por
el hato del CAE del ITESM en el período comprendido entre abril
de 2004 y febrero de 2005. 77
Tabla 13.- Caracterización de la leche de cabra producida por el hato del CAE del
ITESM en el período comprendido entre abril de 2004 y febrero de 2005. 78
Tabla 14.- Resultados de los análisis microbiológicos para determinar la presencia
de coliformes en leche de cabra. 82
Tabla 15.- Resultados de las cuentas en placa de mesófilos aerobios totales
en leche de cabra. 83
Tabla 16.- Parámetros establecidos para el crecimiento de las bacterias en estudio. 84
Tabla 17.- Transferencias sucesivas realizadas en medio cultivo para obtener
µ y td óptimos. 85

x
Tabla 18.- Resultados de la determinación de las cinéticas de crecimiento de las
bacterias en estudio después de realizar su adaptación al medio de cultivo. 90
Tabla 19.- Concentración de las UFC/mL en los cultivos madre. 92
Tabla 20.- Características morfológicas de las bacterias utilizadas para la obtención
de yogurt probiótico de leche de cabra. 93
Tabla 21.- Condiciones del proceso de fermentación para la elaboración de yogurt
natural probiótico. 94
Tabla 22.- Caracterización de productos fermentados obtenidos. 97
Tabla 23.- Absorbancias de las muestras de extracción de ADN de Bifidobacterium
infantis ATCC 17930 utilizando el kit Perfect gDNA Blood Mini Isolation. 109
Tabla 24.- Cantidades de muestra de ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930
utilizadas para tener una concentración de 262 ng de dicho componente
en las mezclas de reacción de PCR. 110

xi
 Introducción

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Marco referencial.

1.1.1. Probióticos.
Probablemente los primeros alimentos que contuvieron microorganismos vivos son las leches fermentadas
a las que se hace referencia en el Antiguo Testamento (Génesis 18:8). Sin embargo, el consumo de éstas en
diferentes formas continúa en la actualidad. Las bases científicas de los efectos benéficos del yogurt fueron
establecidas a principios del siglo XX (1908) por Elie Metchnikoff, quien a través de sus estudios mostró la
conexión entre las leches fermentadas y la longevidad de los habitantes de Bulgaria. Desde entonces y hasta
hoy en día ha crecido el interés por estos alimentos con microorganismos beneficiosos para la salud, y más
concretamente por los productos lácteos fermentados (Fuller, 1992; Fioramonti et al, 2003).

La palabra ‘‘probiótico’’ se deriva del griego ‘‘para la vida’’ y ha tenido muchos significados a través de los
años (Fuller, 1992).

En 1965 el término era utilizado para describir sustancias que eran secretadas por un microorganismo, las
cuales estimulaban el crecimiento de otros (Fuller, 1992; Robinson et al, 2000; Fioramonti et al, 2003).

En los 70’s se utilizó para describir extractos de tejidos que tenían la capacidad de estimular el crecimiento
microbiano. En esa misma década, en 1974, se utilizó para describir microorganismos y sustancias que
contribuían en el balance de la flora microbiana intestinal (Fuller, 1992; Robinson et al, 2000).

En 1989, Fuller redefinió a los probióticos como un microorganismo vivo que se introduce en la dieta, y
que tras ser ingerido en cantidad suficiente ejerce un efecto positivo en la salud, más allá de los efectos
nutricionales tradicionales (Fuller, 1992).

La definición actual fue establecida por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO por sus siglas en inglés) en el 2001: ‘‘Microorganismos vivos que al ser administrados
en dosis adecuadas confieren beneficios fisiológicos en el hospedero’’ (Reid, G. et al, 2003).

1
 Introducción

1.1.2. Funciones de las bacterias probióticas en el intestino humano y su

importancia.
El tracto gastrointestinal humano constituye un microecosistema con la capacidad de realizar las funciones
fisiológicas normales en el hospedero a menos que bacterias dañinas o potencialmente patogénicas sean las
dominantes. De la microflora natural del hospedero dependerá la respuesta de la cepa probiótica en cuanto
a supervivencia, colonización y mecanismo de acción (Robinson et al, 2000; Bielecka et al, 2002).

Las cepas probióticas deben ser capaces de sobrevivir en el tracto gastrointestinal, de resistir condiciones de
acidez durante el tránsito gástrico y digestión biliar. Deben poder establecerse al menos de forma temporal
entre la microflora natural y finalmente ejercer los efectos benéficos en el hospedero (Robinson et al,
2000; Reig y Anesto, 2002).

Normalmente el estómago vacío tiene un pH de 3.0, el cual efectivamente elimina a la mayoría de los
microorganismos. Durante la ingesta de alimentos se da un efecto amortiguador en el lumen gástrico
permitiendo la supervivencia tanto de bacterias salivares como de bacterias presentes en los alimentos. En
el duodeno el contenido gástrico es neutralizado por las secreciones pancreáticas, favoreciendo la
supervivencia bacteriana. Sin embargo, la presencia de bilis y de enzimas pancreáticas constituyen un estrés
para las bacterias. Como consecuencia y por el corto tiempo de tránsito luminal en el intestino delgado, el
número total de bacterias en el íleo delgado es menor de 1.0x106 células por gramo de lumen (Robinson et
al, 2000).

A diferencia de la gran cantidad de bacterias que se encuentran en el colon (arriba de 1.0x1011 células por
gramo de lumen). Bacterias anaerobias como Eubacterium, Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium y
Fusobacterium constituyen la mayor parte de la masa bacterial (Robinson et al, 2000).

Aparentemente, durante el curso de la evolución se estableció un balance entre el hospedero y la

microflora intestinal. A pesar de que el tracto intestinal forma un hábitat ecológico ideal para un gran
número de especies de bacterias, su presencia y actividades metabólicas tienen importantes consecuencias,
algunas benéficas y otras potencialmente dañinas para el hospedero (Robinson et al, 2000).

2
 Introducción

Una de las funciones más positivas es la prevención de infecciones bacterianas y virales. La presencia de
bacterias residentes previene del establecimiento de patógenos, ya que las primeras se establecen y
colonizan el tracto intestinal. La microflora también juega un rol importante en la respuesta inmunológica
del hospedero al evitar la colonización de patógenos en las células epiteliales del intestino (Robinson et al,
2000; Reig y Anesto, 2002; Fioramonti et al, 2003; Harsharnjit, 2003; Servin, 2003, Hamilton-Miller,
2003).

Adicionalmente, las bacterias intestinales están involucradas en el metabolismo de ácidos biliares y

xenobióticos, es ahí donde el balance entre lo benéfico y lo potencialmente dañino es delicado, pues el
metabolismo de los ácidos biliares está relacionado con la formación de factores de cáncer colorectal.
Bacterias azoreductasas y nitroreductasas conducen a la formación de aminas aromáticas carcinogénicas, o
las bacterias puede producir glucosidasas y glucuronidasas que liberan compuestos tóxicos, mutágenos y
carcinógenos (Robinson et al, 2000; Reig y Anesto, 2002; Fioramonti, et al, 2003; Harsharnjit, 2003;
Servin, 2003, Hamilton-Miller, 2003).

Un fenómeno importante es la formación de butirato y otros ácidos grasos de cadena corta como producto
de la fermentación de carbohidratos por los microorganismos anaerobios estrictos que habitan el intestino.
Tanto estudios epidemiológicos como pruebas de laboratorio en diferentes líneas celulares indican que el
butirato previene del crecimiento de células cancerosas (Robinson et al, 2000; Reig y Anesto, 2002).

1.1.3. Bacterias probióticas.

Las cepas probióticas más reconocidas pertenecen al grupo de bacterias ácido lácticas. Este grupo de
bacterias se definen como bacterias homofermentativas o heterofermentativas anaeróbicas, microaerofílicas
o anaerobias facultativas que producen ácido láctico en condiciones mesofílicas o termofílicas. Por su
capacidad de fermentar glúcidos se utilizan ampliamente en la producción de productos lácteos
fermentados (Robinson et al, 2000; Hartley et al, 2001; Torres, 2002; Ostlie et al, 2002).

3
 Introducción

Originalmente sólo cuatro géneros (Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus) eran considerados
como bacterias ácido lácticas. Sin embargo, en la actualidad también se incluyen otros géneros
(Carnobacterium, Aerococcus, Enterococcus y Bifidobacterium), aunque no se encuentren relacionados unos con
otros filogenéticamente. Los efectos probióticos en humanos se han observado principalmente en ciertas
especies de lactobacilos, bifidobacterias, enterococos y lactococos (Robinson et al, 2000).

Los criterios de selección para obtener cepas funcionales de probióticos son muy estrictos. Entre los
requisitos que deben satisfacerse para que un microorganismo sea utilizado como probiótico están los
siguientes (Robinson et al, 2000; Hartley et al, 2001; Ostlie et al, 2002; Fioramonti et al, 2003; Marteu y
Sanan, 2003):
ƒ Que sea de origen humano (cuando sean utilizadas en productos de uso humano).
ƒ Que brinde seguridad total al hospedero. Deben estar dentro de la categoría de generalmente
reconocidos como seguros (GRAS por sus siglas en inglés). Su apatogenicidad y atoxicidad deben estar
probadas.
ƒ Que sea resistente a la acidez gástrica y a las secreciones pancreáticas para facilitar su paso a los
segmentos deseados en el intestino.
ƒ Que tenga la capacidad de adherirse a las células epiteliales intestinales.
ƒ Que posea actividad antimicrobiana.
ƒ Que produzca inhibición a la adhesión de bacterias patógenas.
ƒ Que sea resistente a antibióticos. Debe contarse con un antibiograma patrón.
ƒ Que sea tolerante a aditivos alimentarios y que posea estabilidad en la matriz del alimento.

Es necesaria información adicional acerca de la dosis y las evidencias de su efectividad para utilizarse como
probióticos. Con frecuencia se combinan estudios in vitro e in vivo para lograr parámetros de investigación y
pruebas clínicas requeridas. Las bacterias ácido lácticas generalmente se han reconocido como seguras en
términos de su patogenicidad potencial y riesgo para el individuo hospedero (Torres, 2002).

4
 Introducción

Sin embargo, aunque la mayoría de las publicaciones acerca de microorganismos probióticos se enfoca hacia
la seguridad y los aspectos benéficos que aportan en la salud humana, en la elaboración de productos que
contienen bacterias probióticas es importante tomar en cuenta las características organolépticas del
producto. El éxito del consumo de productos probióticos, depende de que la industria alimentaria satisfaga
las demandas de los consumidores. Todos los productos probióticos deben ser seguros y tener propiedades
sensoriales idóneas (Torres, 2002).

1.1.4. Efectos benéficos en la salud y mecanismos de acción de las bacterias

probióticas.
Conociendo las funciones de la microflora intestinal, el mantenimiento y restablecimiento de una
composición microbiana óptima, ésta puede asegurarse por el consumo sistemático a través de la dieta de
productos que contienen bacterias probióticas, ya que se cuenta con datos clínicos que confirman los
efectos atribuidos a este grupo de bacterias (Wright et al, 2001; Bielecka et al, 2002; Harsharnjit, 2003).

A continuación se presentan algunos mecanismos de acción relacionados a los efectos benéficos que se le
atribuyen a los probióticos de acuerdo a estudios que se han realizado:
Reducción de la intolerancia a la lactosa. La intolerancia a la lactosa es un problema que padece
entre el 50 y el 70% de la población mundial en distinto grado (Marquina y Santos, 2000).

Este problema de intolerancia se debe a la ingesta de productos que contienen lactosa (principalmente
leche no fermentada) y los bajos niveles de β-galactosidasa intestinal (Marquina y Santos, 2000; Hartley et
al, 2001; Ostlie et al, 2002; Torres, 2002; Fioramonti et al, 2003; Marteu y Shanahan, 2003).

El consumo de probióticos ha permitido reducir considerablemente la mala absorción de la lactosa. Este

efecto parece deberse al aporte de β-galactosidasa exógena proporcionada por Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus bulgaricus, con lo que se da una mejor hidrólisis de la lactosa y la posterior adsorción de sus
componentes (Marquina y Santos, 2000; Robinson et al, 2000).

5
 Introducción

Efecto protector ante infecciones. La microflora intestinal ejerce un papel importante en el efecto
barrera de la mucosa intestinal frente a infecciones. Sus mecanismos de acción son muy variados:
modificación de los niveles de adhesión celular de patógenos a los receptores, producción de sustancias
antimicrobianas, estimulación de la producción de mucina y estimulación de órganos linfoides asociados al
intestino, entre otros (Harsharnjit, 2003).

La mayoría de las infecciones son iniciadas por la adhesión de patógenos a las células y a la superficie de la
mucosa del hospedero. La habilidad de las bacterias probióticas de inhibir la adherencia e invasión de
microorganismos patógenos ha sido reportado por Bernet et al (1993), quien demostró en un estudio in
vitro la acción de Bifidobacterium en la inhibición de la adherencia de Escherichia coli enterotoxigénica y
enteropatogénica y de Salmonella typhimurium a células Caco-2 (Harsharnjit, 2003).

La producción de sustancias antimicrobianas como las bacteriocinas por parte de los probióticos ha
mostrado tener un efecto positivo frente a las gastroenteritis producidas por cepas de Escherichia. coli y
Campylobacter (Marquina y Santos, 2000).

Adicionalmente, Harsharnjit (2003) reportó que varias bacterias ácido lácticas producen ácidos orgánicos
(ácido láctico y acético), peróxido de hidrógeno y dióxido de carbono, que son también sustancias
antimicrobianas que actúan in vitro sobre patógenos como Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Shigella,
Vibrio y Clostridium.

La secreción de la mucina, que es el gel mucoso que recubre el epitelio del intestino, actúa como una
barrera protectora evitando la adherencia e invasión de organismos patógenos como Entamoeba histolytica,
Yersinia enterocolítica, enterohemorrágica y entoropatogénica, Escherichia coli y Trichinella spiralis. Además, con el
recubrimiento de la mucina se evita el contacto directo del epitelio con el contenido luminal (Harsharnjit,
2003).

En un estudio realizado a niños, Lactobacillus casei mostró su eficacia frente a infecciones intestinales
producidas por rotavirus. Se sugiere que este efecto se debe a las glicoproteínas secretadas por las bacterias
(Marquina y Santos, 2000).

6
 Introducción

Otro aspecto interesante es la reducción de candidiasis y la restauración de la microflora vaginal mediante

la ingestión de probióticos. En la flora vaginal predominan los lactobacilos, y más concretamente
Lactobacillus acidophilus. Los cambios hormonales que suceden durante la menopausia producen cambios en
la microflora, facilitando las infecciones oportunistas por Cándida y Escherichia coli. Se ha comprobado que
la ingesta de yogurt probiótico reduce significativamente el riesgo del padecimiento de estas infecciones
(Marquina y Santos, 2000; Servin, 2003).

Reducción de actividad enzimática en la masa fecal. En un estudio realizado con animales de

experimentación se observó que el consumo de probióticos reduce en la masa fecal la cantidad de enzimas
microbianas como la β-glucoronidasa, nitroreductasa y ureasa, las cuales parecen estar involucradas en la
producción de sustancias cancerígenas y mutagénicas (Marquina y Santos, 2000; Robinson et al, 2000).

Estimulación del sistema inmune. Mediante la inmunomodulación protegen al huésped de las

infecciones, induciendo a un aumento en la producción de inmunoglobulinas, de células mononucleares y
de linfocitos (Marquina y Santos, 2000; Reig y Anesto, 2002; Dubeuf et al, 2003).

En un estudio realizado se observó que en niños tratados con Lactobacillus casei la cantidad de
inmunoglobulina A (Ig A) circulante era más elevada que en los no tratados y que su respuesta ante
infecciones del tracto digestivo era mucho mejor (Marquina y Santos, 2000; Reig y Anesto, 2002; Dubeuf
et al, 2003).

Reducción del riesgo de cáncer de colon. Los malos hábitos alimentarios inducen a la microflora
intestinal a producir sustancias con actividad carcinogénica. Estudios epidemiológicos recientes (1998)
encontraron que dietas suplementadas con Lactobacillus y Bifidobacterium reducen el riesgo de contraer
cáncer de colon (Marquina y Santos, 2000; Torres, 2002).

Producción de vitaminas. Una aportación importante del género Bifidobacterium en el huésped es la

síntesis de vitaminas del complejo B, tales como la vitamina B6, B12, ácido fólico, riboflavina, niacina,
biotina y ácido pantoténico (Torres, 2002).

7
 Introducción

Disminución de los niveles de colesterol en suero. Se han llevado a cabo ensayos en los que se
menciona una disminución de los niveles de colesterol en suero durante el consumo de dosis muy grandes
de productos lácteos fermentados (Marquina y Santos, 2000; Torres, 2002).

Resultados de investigaciones han demostrado que cepas de Bifidobacterium cultivadas en presencia de

colesterol marcado o esterificado son capaces de asimilarlo; concluyendo que la remoción del colesterol del
medio de cultivo se debió tanto a la asimilación de las bacterias como a la precipitación del colesterol por la
disminución del pH (Torres, M., 2002; Marteau y Shanahan, 2003).

1.1.5. Dosis terapéutica de las bacterias probióticas.

De acuerdo a estudios realizados para garantizar que el hospedero obtenga los beneficios a la salud que se
les atribuyen a las cepas probióticas, la dosis de consumo mínima diaria debe ser de 1.0x108 bacterias
viables por mililitro (Reid et al, 2001; Shimakawa et al, 2002; Marteau, 2003).

1.1.6. Productos probióticos.

De acuerdo a Stanton et al (2001) el éxito del desarrollo de productos probióticos se logra al contar con los
resultados de estudios acerca de las habilidades de los microorganismos para sobrevivir el proceso de
manufactura y almacenamiento al que sean sometidos. Adicionalmente, debe considerarse la capacidad de
sobrevivencia de los microorganismos probióticos durante su paso por el estómago hasta llegar al tracto
gastrointestinal, ya que es vital para que ejerza sus funciones benéficas en el hospedero.

Existe variedad de productos disponibles comercialmente en los que se han incorporado bacterias
probióticas. Se encuentran en alimentos fermentados o productos lácteos fermentados y en preparaciones
farmacéuticas en forma de cápsulas, polvos, tabletas y suspensiones (Robinson et al, 2000).

Las bacterias probióticas más utilizadas para la elaboración de productos pertenecen al género Lactobacillus y
Bifidobacterium (Heller, K., 2001). En la tabla 1 se presentan algunas bacterias probióticas utilizadas en
productos comerciales y los efectos benéficos a la salud que se les adjudican.

8
 Introducción

Tabla 1. Efectos benéficos de algunas bacterias probióticas.

Cepa
Lactobacillus acidophilus
LA1
Lactobacillus acidophilus
NCFB 1748
Lactobacillus rhamnosus GG
ATCC 53013
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus reuteri
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium lactis BB12
Bifidobacterium longum
BB536
Efectos y beneficios reportados
Estimula el sistema inmune.
Se adhiere a las células del intestino humano.
Crea balance en la microflora intestinal.
Disminuye la actividad enzimática y mutagenicidad fecal.
Previene de diarreas provocadas por radioterapia.
Para el tratamiento de la constipación intestinal.
Previene de diarreas ocasionadas por rotavirus y el uso de antibióticos .
Para el tratamiento de diarreas recurrentes por Clostridium difficile.
Antagonista contra bacterias que producen caries.
Reduce la actividad enzimática fecal.
Coloniza el tracto gastrointestinal.
Para el tratamiento de diarreas ocasionadas por rotavirus y otras de
origen viral.
Equilibra la microflora intestinal.
Previene del Síndrome del viajero.
Coloniza el tracto gastrointestinal.
Disminuye los niveles de productos putrefactivos intraintestinales.
Previene de diarreas.
Mejora la constipación.
Fuente: Robinson et al, 2000.

1.1.7. Productos lácteos fermentados como vehículos para la incorporación de

bacterias probióticas.
Las bacterias probióticas en su mayoría son comercializadas en productos lácteos fermentados. Siendo las
leches fermentadas y el yogurt los vehículos más utilizados, ya que permiten la supervivencia de las mismas
en el producto y favorecen que después de su consumo se alcance la llegada al tracto gastrointestinal de un
número significativo de bacterias viables en el hospedero (Stanton et al, 2001).

Es en la década de los 90’s que se generó un desarrollo significativo de productos lácteos fermentados
probióticos en Europa, Norte América, Japón y México entre otros. En Europa el área más activa dentro
del mercado de los alimentos funcionales corresponde a los productos lácteos probióticos, particularmente
a las leches fermentadas y al yogurt (Stanton et al, 2001).

9
 Introducción

En 1997 Leatherhead Food RA realizó un estudio de mercado acerca del yogurt probiótico en el Reino
Unido, Francia, Alemania, España, Bélgica, Holanda, Dinamarca, Finlandia y Suecia. Los resultados
mostraron que la producción de yogurt probiótico en los 9 países sobrepasó los 250 millones de kilogramos
(kg) en 1997, siendo Francia el mercado más grande con ventas de aproximadamente 90 millones de kg,
que equivalen a 219 millones de dólares (Stanton et al, 2001).

De acuerdo a Stanton et al (2001) en promedio los yogurt probióticos constituyen aproximadamente el

10% de todos los yogurt vendidos en los 9 países en estudio. Entre los productos líder en el mercado
europeo en los que se han incorporado cepas probióticas se encuentran: LC1 (Lactobacillus acidophilus,
Nestlé), Vifit (Lactobacillus rhamnosus, Campina), Actimel (Lactobacillus casei Imunitass, Danone) y Yakult
(Lactobacillus casei Shirota, Yakult).

El mercado japonés todavía se encuentra dominado por las bebidas fermentadas, que fueron los alimentos
funcionales pioneros en este mercado. En estos productos las fibras dietéticas y las cepas probióticas son los
ingredientes funcionales significativos. Bikkle, es la bebida funcional representativa, fue desarrollada y
comercializada en 1993 por la compañía Suntory; esta bebida contiene bifidobacterias, xilooligosacáridos y
fibra dietética (Stanton et al, 2001).

En Estados Unidos el mercado de los alimentos funcionales está comparativamente por debajo de los
estándares europeos. Los productos lácteos fortificados, particularmente los que contienen cepas activas,
han ganado popularidad recientemente. En contraste con la situación en Europa, hay un escaso desarrollo
de prebióticos en Estados Unidos, en donde los productos enriquecidos con vitaminas y minerales
continúan siendo los alimentos funcionales de éxito en el mercado. Un aspecto importante en este
contexto es el desarrollo, estudios y legislación relacionada con los beneficios a la salud que se les atribuyen
a los productos probióticos para lograr un mayor desarrollo de los mismos (Stanton et al, 2001).

10
 Introducción

En México las alternativas para el consumo de productos lácteos fermentados con cepas probióticas es
reducido, pudiendo seleccionarse entre los productos que se muestran en la tabla 2.

Tabla 2. Productos probióticos comercializados en México.

Producto Marca Cepa probiótica que contiene
Activia® Danone Bifidus essensis
Yakult® Yakult Lactobacillus casei Shirota
LC1® Nestlé Lactobacillus johnsoni
Actimel® Danone Lactobacillus casei defensis
Sofúl® Yakult Lactobacillus casei Shirota
Chamito® Nestlé Lactobacillus johnsoni
Bio4® Lala Lactobacillus casei
Yoplus® Yoplait Bificápsulas
Vivendi® Alpura Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium

Los 9 productos que se muestran son elaborados utilizando leche de vaca como sustrato y en su mayoría la
cepa probiótica incorporada pertenece al género Lactobacillus. Activia®, LC1®, Yoplus® y Vivendi® se
presentan en forma de yogurt; Yakult®, Actimel® y Bio4® en forma de bebidas fermentadas y Sofúl®
como gelatina.

1.1.8. Bacterias utilizadas en la investigación.

En esta investigación se trabajó con 3 especies de microorganismos: Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
delbrueckii y Streptococcus thermophilus.

Bifidobacterium infantis es una especie probiótica, del género que constituye la mayor parte de la microflora
intestinal de los humanos (Akahn et al, 2004).

Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus aunque no son parte de la flora normal del tracto
gastrointestinal son consideradas probióticas ya que al ser consumidas pueden ejercer cambios sobre el
balance normal microbiano (Solís, 2004).

11
 Introducción

Hace algunos años los microorganismos probióticos más utilizados para la elaboración yogurt eran:
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Tamine y Robinson,
1991; Hui, 1993; Heller, 2001). Sin embargo, en la actualidad se han sumado a los cultivos iniciadores de
fermentaciones ácido lácticas algunas especies del género Bifidobacterium, como en el caso de los productos
Vivendi®, Yoplus® y Activia® que se comercializan en México.

El uso de Bifidobacterium en productos lácteos no se ha generalizado debido a sus exigencias nutricionales

pero principalmente a las condiciones de anaerobiosis estrictas que necesita para su crecimiento.

1.1.8.1. Bifidobacterium infantis.

Bifidobacterium infantis es una especie representante de un género con características probióticas notables.
Ha sido utilizada para la elaboración de productos fermentados en combinación con otras bacterias ácido
lácticas (Robinson et al, 2000; Laine et al, 2002; Akahn et al, 2004).

Morfológicamente Bifidobacterium infantis se visualiza al microscopio como bacilos Gram (+), cortos,
regulares, ligeramente bifurcados y con apariencia segmentada. Es inmóvil y no esporulado. Se caracteriza
por ser un microorganismo anaerobio estricto; aunque es menos sensible al oxígeno si se compara con
Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium breve (Robinson et al, 2000).

Se desarrolla de manera óptima a una temperatura de 37°C, siendo capaz de crecer en un rango de
temperatura entre los 22-48°C. El pH óptimo de crecimiento es entre 6.5-7.0, pudiendo crecer en
entornos con pH menores (Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

Es un tipo de bacteria heterofermentativa. Los principales compuestos que se forman del metabolismo de
la lactosa son el ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético y ácido succínico. (Tamine y Robinson,
1991; Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

12
 Introducción

Bifidobacterium utiliza la glucosa por la vía de la fructosa-6-fosfato, que es una vía fermentativa para la
degradación de las hexosas. La glucosa se convierte en fructosa-6-fosfato bajo la acción de la hexoquinasa y
de la glucosa-6-fosfato isomerasa. La fructosa-6-fosfato se transforma en eritrosa-6-fosfato cuando la
fructosa-6-fosfato cetolasa está presente como catalizador. La reacción prosigue a gliceraldehído-3-fosfato.
La transformación del gliceraldehído-3-fosfato en piruvato y posteriormente a ácido láctico, se realiza por
la ruta hexosa difosfato (Embdem-Meyerhoff-Parnas) La reacción continúa hasta la formación de 3 moles
de acetato y 2 moles de lactato (Leveau y Bouix, 2000; Walstra et al, 2001; Solís, 2004)

Entre los beneficios que se le atribuyen a Bifidobacterium infantis se encuentran los siguientes (Marquina y
Santos, 2000; Robinson et al, 2000; Akahn et al, 2004):
ƒ Mantenimiento de la flora intestinal normal.
ƒ Disminución de la intolerancia a la lactosa.
ƒ Inhibición de microorganismos patógenos.
ƒ Estimulación y modulación del sistema inmunológico.
ƒ Favorecimiento de la absorción de calcio.

1.1.8.2. Lactobacillus delbrueckii.

Lactobacillus delbrueckii es un microorganismo muy utilizado en las fermentaciones de la leche, de ahí que su
aislamiento sea de la leche y de productos lácteos. Su uso como cultivo iniciador en la manufactura de
productos lácteos fermentados es muy conocido (Tamine y Robinson, 1991).

Una propiedad importante de Lactobacillus delbrueckii es su capacidad de producción de la bacteriocina

Lacticina A, que actúa evitando el desarrollo de patógenos (Robinson et al, 2000).

Morfológicamente se caracteriza por su forma bacilar Gram (+). Es un microorganismo no esporulado. Su

respiración es de tipo anaerobia facultativa (Robinson et al, 2000; Heller, 2001, Solís, 2004).

13
 Introducción

La temperatura óptima de crecimiento es a 45°C, siendo capaz de desarrollarse entre los 22-52°C. El pH
óptimo de crecimiento es entre 5.5-5.8, pudiendo resistir pH más ácidos y sobrevivir a concentraciones de
ácido láctico menores a 27 g/L (Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

Es un tipo de bacteria homofermentativa, es decir, que sigue la ruta hexosa difosfato (Embdem-Meyerhoff-
Parnas) para la degradación de lactosa, hasta ácido láctico (Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al,
2000; Heller, 2001).

En la ruta hexosa difosfato la galactosa-6-fosfato sigue la ruta de la tagatosa. Las principales enzimas en el
proceso de fermentación son las aldolasas, necesarias para hidrolizar las hexosas difosfato a gliceraldehído-
3-fosfato; la piruvato quinasa, esencial para la formación de piruvato y la lactatodeshidrogenasa,
fundamental para la producción de ácido láctico a partir de piruvato (Walstra et al, 2001).

Una molécula del disacárido produce dos moléculas de hexosa. A partir de una molécula de hexosa, se
forman dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato. En estas condiciones, la fermentación de la lactosa se
produce al reaccionar con el ácido fosfórico y el adenosín difosfato, produciendo ácido láctico, adenosín
trifosfato y agua (Walstra et al, 2001; Robinson et al, 2000).

1.1.8.3. Streptococcus thermophilus.

Esta especie pertenece al género de Streptococcus. Se distingue básicamente de las otras especies de su
género por su crecimiento termófilo, su termorresistencia, por su actividad fermentativa con frecuencia
reducida a algunos azúcares y una gran sensibilidad al cloruro de sodio (Leveau y Bouix, 2000).

Los beneficios de Streptococcus thermophilus como cultivo iniciador en el producto probiótico fermentado
elaborado se deben principalmente a su habilidad para fermentar la lactosa de forma homoláctica y causar la
rápida reducción de pH en el producto (Robinson et al, 2000).

14
 Introducción

El consumo de células viables de Streptococcus thermophilus puede favorecer a la digestión de la lactosa en

pacientes lactosa intolerantes, ya que las células de este microorganismo al lisarse liberan β-galactosidasa
intracelular, que hidroliza la lactosa evitando que ésta alcance el intestino grueso ocasionando los síntomas
asociados a la intolerancia a la lactosa (Robinson et al, 2000).

Su morfología se caracteriza por ser cocoide, esférica u ovoide, que se agrupan en cadenas. Es un tipo de
microorganismo Gram (+) que carece de motilidad. Su respiración es de tipo anaerobia facultativa. La
temperatura óptima de crecimiento es a 40°C pudiendo desarrollarse en un rango de temperatura entre los
22-60°C. El pH óptimo de crecimiento es entre 6.5-6.8 (Robinson et al, 2000; Heller, 2001, Solís, 2004).

Es un tipo de bacteria homofermentativa al igual que Lactobacillus delbrueckii, por lo que también sigue la
ruta metabólica hexosa difosfato (Embdem-Meyerhoff-Parnas) para la degradación de la lactosa hasta la
formación de ácido láctico (Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

En la tabla 3 se resumen las principales características de cada una de las bacterias que se utilizaron en esta
investigación.

15
 Introducción

Tabla 3. Características principales de las bacterias utilizadas para la elaboración del yogurt natural
probiótico.
Bacteria
Característica
Bifidobacterium infantis Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus
Bacilos Gram (+)
cortos, regulares, Cocos Gram (+)
ligeramente bifurcados, Bacilos Gram (+) no esféricos u ovoides que
Morfología
con apariencia esporulados se agrupan en cadenas y
segmentada; inmóviles y que carecen de motilidad
no esporulados
Tipo de respiración Anaerobio estricto Anaerobio facultativo Anaerobio facultativo
Temperatura óptima
37 (22-48) 45 (22-52) 40 (22-60)
(°C)
pH óptimo 6.5-7.0 5.5-5.8 6.5-6.8
Carbohidratos capaz de Glucosa, galactosa, Fructosa, glucosa y Lactosa, sucrosa, glucosa
fermentar lactosa y lactulosa lactosa y fructosa
Tipo de fermentación Heterofermentativa Homofermentativa Homofermentativa
Ruta metabólica Fructosa-6-fosfato Hexosa difosfato Hexosa difosfato
Ácido láctico, acético,
Principales metabolitos Ácido láctico Ácido láctico
propiónico y succínico
Fuente: Leveau y Bouix, 2000; Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al, 2000; Heller, 2001.

Las 3 especies en estudio son bacterias Gram (+), pero difieren en su morfología. Bifidobacterium infantis
tiene forma de bacilos al igual que Lactobacillus delbrueckii, pero se diferencian en que Bifidobacterium infantis
es ligeramente bifurcado y con apariencia segmentada. Streptococcus thermophilus tiene forma de cocos, que
se caracterizan por agruparse en cadenas cortas.

En cuanto al tipo de respiración, Bifidobacterium infantis tiene un tipo de respiración anaeróbica estricto a
diferencia de Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus que son anaerobios facultativos, es decir, que
la necesidad de condiciones anaeróbicas son más estrictas para el desarrollo de Bifidobacterium infantis que
para las otras 2 bacterias en estudio.

El pH óptimo de crecimiento difiere entre una y otra bacteria, siendo muy parecido para Bifidobacterium
infantis (6.5-7.0) y Streptococcus thermophilus (6.5-6.8); para Lactobacillus delbrueckii el pH óptimo de
crecimiento es entre valores de 5.5-5.8.

16
 Introducción

Las 3 bacterias son capaces de fermentar diferentes carbohidratos, siendo el común denominar, la
capacidad para degradar la lactosa. Bifidobacterium infantis por ser una bacteria heterofermentativa, lo hace a
través de la ruta pentosa fosfato obteniendo como principales metabolitos ácido láctico, ácido acético,
ácido propiónico y ácido succínico; a diferencia de Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus que son
bacterias homofermentativas, la degradación de la lactosa la llevan a cabo siguiendo la ruta hexosa difosfato,
obteniendo como metabolito principal el ácido láctico.

1.1.9. Importancia de la leche de cabra y sus derivados como vehículo para la

incorporación de bacterias probióticas.
La leche se define como la secreción de pH neutro, de 6.4 a 6.8, de la glándula mamaria de los mamíferos.
Se trata de una emulsión de grasas en agua, estabilizada por una dispersión coloidal de proteínas en una
solución de sales, vitaminas, péptidos, lactosa, oligosacáridos, caseína y otras proteínas. La leche también
contiene enzimas, anticuerpos, hormonas, pigmentos (carotenos, xantofilas, riboflavina), células
(epiteliales, leucocitos, bacterias y levaduras), dióxido de carbono, oxígeno y nitrógeno (Keating y Gaona,
1986; Brito, 1997).

La leche de algunas especies (vaca, búfalo y cabra), se utiliza como un alimento de importancia para los
humanos en períodos de crecimiento y desarrollo (infancia y adolescencia), en situaciones fisiológicas
concretas (embarazo y lactancia) y en el adulto y anciano contribuye al buen mantenimiento de la masa
ósea. La importancia del uso de la leche se basa en su valor nutrimental ya que sus componentes se
encuentran en forma y proporciones adecuadas, de tal manera que puede considerarse como un alimento
balanceado. Pero cada animal produce una leche con un perfil nutricional diferente como se muestra en la
tabla 4 que corresponde a la composición de la leche de diversos mamíferos (Vicente, 1990; Brito, 1997).

17
 Introducción

Tabla 4. Composición media de la leche de varios mamíferos.

COMPOSICIÓN NUTRICIONAL DE LA LECHE (EN 100 mL)
COMPONENTE
HUMANO VACA CABRA
Humedad (%) 87.0 86.9 87.0
Energía (kcal) 69.0 66.0 71.0
Proteínas totales (g) 1.63 3.5 (3.3 – 4.0) 3.5 (2.9 – 5.6)
Grasa (g) 3.8 3.7 (3.6 – 5.2) 4.2 (2.4 – 7.8)
Carbohidratos (g) 7.0 4.9 (4.8 -5.0) 4.3 (4.0 – 6.3)
Minerales (g) 0.21 0.70 0.86
Fuente: FAO, 1990; Brito, 1997.

El agua es el componente más abundante en los tres tipos de leche, encontrándose en igual proporción en
la leche humana y de cabra (87.0%). En la leche de vaca el agua corresponde al 86.9%.

El valor energético varía ligeramente de una especie a otra, siendo mayor en la leche de cabra (71 kcal),
seguido por el valor de la leche humana (69 kcal). El valor más bajo (66 kcal) corresponde a la leche de
vaca.

El contenido proteico de la leche de vaca y cabra es el mismo en promedio (3.5 g); valor que es
significativamente más alto que el de la leche humana (1.63 g).

El contenido de grasa más alto corresponde a la leche de cabra (4.3 g), seguido por el de la leche humana
(3.8 g). El contenido de grasa más bajo (3.7 g) es el de la leche de vaca.

En cuanto a los carbohidratos, la lactosa es el componente casi exclusivo en los tres tipos de leche
encontrándose en mayor cantidad en la leche humana (7.0 g), el cual es significativamente más alto que el
valor en el que se encuentra en la leche de vaca (4.9 g) y en la leche de cabra (4.3 g).

Los rangos en los valores en cuanto al contenido de proteínas, grasa y carbohidratos en la leche de vaca y de
cabra se deben a los cambios que se originan por factores como la raza, edad, alimentación y época de
ordeño entre otros.

18
 Introducción

La leche de vaca y cabra son consideradas como productos funcionales, son un factor determinante en el
crecimiento, ya que cubren los requerimientos esenciales en una etapa crítica del desarrollo. Sin embargo,
a pesar de las similitudes que presentan en cuanto a su composición, la leche de vaca es ampliamente
utilizada, conocida y aceptada en una gran variedad de productos a diferencia de la poca explotación de la
leche de cabra y sus derivados.

Tradicionalmente para la elaboración productos lácteos fermentados se utiliza leche de vaca. En el

producto probiótico que se elaboró se cambió el sustrato tradicional por leche de cabra ya que de acuerdo
la investigación realizada por Solís (2004) la leche de cabra es un buen sustrato para el desarrollo de
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus. El común denominador para
utilizar la leche de cabra y sus derivados como sustrato en la elaboración productos lácteos fermentados con
probióticos es la lactosa, principal carbohidrato presente en estos alimentos.

1.1.10. Composición química de la leche de cabra.

La composición química de la leche influye mucho sobre la calidad de los productos obtenidos a partir de
ella. La influencia del estado de salud de los animales, del manejo y de la alimentación son otros factores
que deben tomarse en cuenta (Scholz, 1997). La leche de cabra está compuesta por grasa láctea, proteínas,
lactosa, sales, minerales y vitaminas.

Grasa láctea. De acuerdo a Keating y Gaona (1986) la grasa de la leche de cabra está formada por la
combinación física de triglicéridos, y éstos a su vez son el resultado de la reacción entre el glicerol y ácidos
grasos. De estos ácidos grasos la mayor parte son del tipo saturado; sin embargo, es el ácido oleico (no
saturado) el que existe en mayor cantidad, y es la combinación de éste con el ácido linoleico, el ácido
butírico y el ácido caproico lo que influye en el bajo punto de fusión de la grasa de la leche (29-34°C).

En la grasa pueden distinguirse dos grupos de compuestos (Keating y Gaona, 1986):

ƒ Lípidos. Entre los que se encuentran triglicéridos, monoglicéridos, lecitinas, cefalinas, esfingomielina y
cerebrósidos.
ƒ Grasas no saponificables. Entre los cuales se encuentran betacarotenos, neobetacarotenos, xantofilas,
colesteroles, dehidrocolesteroles, ergosteroles y las vitaminas liposolubles A, D, E y K.

19
 Introducción

La grasa láctea se encuentra en forma de diminutos glóbulos grasos rodeados por una envoltura proteica. El
tamaño medio de estos glóbulos es 5 µ, oscilando normalmente entre 1 y 20 µ. Por ser más pequeños, los
glóbulos de grasa de la leche cabra no necesitan de las sales biliares para su digestión y absorción como en el
caso de los glóbulos de la leche de vaca (Scholz, 1997; Walstra et al, 2001; Solís, 2004).

Proteínas. La proteína de la leche está constituida por una gran cantidad de aminoácidos esenciales, lo que
la hace más valiosa que la proteína vegetal que carece de los aminoácidos: cistina, cisteína y metionina.
Muchos de los aminoácidos se unen para formar péptidos y luego proteínas, las cuales son a su vez, los
componentes principales de la materia nitrogenada (Scholz, 1997).

Las sustancias nitrogenadas de la leche se encuentran en forma de micelas dispersas en suspensión coloidal.

En la leche de cabra existen dos tipos de proteínas (Keating y Gaona, 1986; Scholz, 1997; Solís, 2004):
ƒ Proteínas hidrosolubles, termosensibles y no coagulables: β-lactoalbúmina, α-lactoalbúmina y
globulinas. Sus características principales son: proteínas compactas, globulares, con un peso molecular
que varía entre 14,000-1,000,000 dalton, son solubles en un intervalo de pH muy amplio y muy
sensibles a altas temperaturas. Representan el 25% de las proteínas totales.
La lactoalbúmina es rica en lisina y triptófano. Tiene un punto isoeléctrico de 4.5. No coagula por
acción de enzimas como la renina o por la presencia de ácidos, pero si por efecto del calor. Esto se
debe a que su estabilidad depende del agua de hidratación y no de las cargas eléctricas que caracterizan
a las micelas de la caseína. La lactoglobulina precipita a 70°C o temperaturas mayores.
ƒ Proteínas coagulables, termoresistentes o caseínas, de éstas se distinguen tres tipos: α-caseína, β-
caseína y κ-caseína. Representan el 75% de las proteínas totales. Tienen un punto isoeléctrico de 4.6
.Las caseínas α y β son sensibles al calcio, por lo que en presencia de este elemento reaccionan
formando compuestos que provocan la coagulación de la leche. Sin embargo, la estabilidad de la
proteína de la leche se mantiene porque la κ-caseína que es insensible al calcio protege a las caseínas α
y β formando una especie de revestimiento protector en torno a ellas.

20
 Introducción

Lactosa. La lactosa es el carbohidrato característico de la leche y se encuentra en dispersión molecular.

Como se muestra en la figura 1 es un disacárido compuesto de galactosa y glucosa, en donde las moléculas
se encuentran unidas por enlaces β-1,4-glucosídico.

Figura 1. Estructura química de la lactosa.

La lactosa es el nutriente necesario para las bacterias ácido lácticas que participan en la transformación de la
leche. En la fermentación de la lactosa por bacterias lácticas, éstas actúan hidrolizándola en glucosa y
galactosa hasta convertirse en ácido láctico; el ácido láctico a su vez puede ser transformado por algunas
bacterias a ácido propiónico, ácido acético y dióxido de carbono o a ácido butírico (Keating y Gaona, 1986;
Walstra et al, 2001).

Sales y minerales. Las sales y minerales se encuentran en dispersión iónica y representan del 0.6-1.0%.
Las sales más importantes son el calcio, fósforo, magnesio, potasio, sodio y cloro. Y los minerales
presentes en la leche que se encuentran en como trazas son el hierro, cobre molibdeno, zinc, magnesio,
yodo y flúor. Las sales y minerales en unión con los otros componentes son los responsables del alto valor
nutritivo de la leche (Keating y Gaona, 1986; Scholz, 1997).

Vitaminas. La leche de cabra contiene las siguientes vitaminas: A, B1, B2, B6, B12, niacina, ácido fólico,
ácido pantoténico, C, D y E (Scholz, 1997).

21
 Introducción

1.1.11. Situación de la caprinocultura en Nuevo León.

Conociendo la composición química de la leche de cabra y su valor nutrimental, es evidente la oportunidad
de aprovechamiento de este recurso.

Aunque el uso de leche de cabra no esté generalizado es importante apreciar en la tabla 5 que el volumen
de producción de leche de cabra en el Estado de Nuevo León se ha incrementado en los últimos años. La
producción nacional de leche de cabra en el 2003 fue de 150.3 millones de litros. Mientras que Nuevo
León, contribuyó en el 2001, con una producción de 5.6 millones de litros, que representa un crecimiento
del 180% en la producción de leche de cabra de 1995 al 2001 (Secretaría de Agricultura, Ganadería,
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, SAGARPA, 2004).

Tabla 5. Producción Nacional de leche de cabra y en el estado de Nuevo León.

Producción de leche de cabra en el estado de
Producción Nacional de leche de cabra
Año Nuevo León
(millones de litros)
(millones de litros)
1995 139.1 2.0
1996 122.9 0.6
1997 120.5 3.7
1998 127.7 5.0
1999 131.0 5.5
2000 131.2 5.5
2001 139.9 5.6
2002 146.5 NR
2003 150.3 NR
Fuente: Sistema de Información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera (SIAP), SAGARPA 2004.
NR: No reportado.

A pesar del incremento en la producción de leche de cabra en el estado y su respectivo impacto económico
el aprovechamiento para procesamiento y comercialización de productos derivados de la leche de cabra es
escaso. Limitándose la utilización de leche de cabra a su comercialización como tal o en productos como
quesos de cabra y dulces típicos regionales.

22
 Introducción

Aunque existen unidades caprinas en las cuales se aplica tecnología avanzada, el común denominador de
este sector pecuario es la escasa o nula tecnificación aplicada en los procesos productivos. Siendo necesaria
la creación de iniciativas que tengan como fin, la elaboración de productos de valor agregado (SAGARPA,
1998; Cervantes, 2000).

El éxito de estas iniciativas es variado y depende de muchas variables, entre las cuales se pueden mencionar
(Dubeuf et al, 2003):
ƒ Las necesidades del mercado deben ser abiertas para el desarrollo de la producción de acuerdo al
estándar de vida de la población.
ƒ Los caprinocultores deben ser capaces de producir leche de excelente calidad sanitaria.
ƒ Los productos que se obtengan deben ser elaborados de acuerdo a los hábitos culturales y al sabor
acostumbrado, cuando no existan diferencias significativas al comparar el costo con productos que se
consumen de manera tradicional.

Ejemplo de estas iniciativas es la alianza estratégica del estado de Nuevo León con el Instituto Tecnológico
y de Estudios Superiores de Monterrey (ITESM) a través del Área de Agricultura y Tecnología de
Alimentos de la División de Ingeniería y Arquitectura (DIA), ya que en septiembre de 2003 firmaron un
proyecto en el cual se acordó que el Estado de Nuevo León apoyaría al sector caprino organizado, con
veinte millones de pesos para la construcción de una Planta Industrializadora de Ganado Caprino en el
campo experimental con el que cuenta el ITESM en Hualahuises, Nuevo León.

La aportación del ITESM aparte de proporcionar el lugar donde estará ubicada la planta es el de la
transferencia de tecnología y del ‘‘Know how’’, es decir, asistencia técnica y capacitación, para que además
de la producción de leche pasteurizada y carne se elaboren productos de valor agregado. De manera que al
implementarse una producción a escala industrial, disminuyan los costos y se incrementen los ingresos de
los productores.

De acuerdo a fuentes de información consultadas, hasta el momento no existe en el mercado mexicano un

producto probiótico fermentado en el que se utilice leche de cabra como sustrato.

23
 Introducción

1.1.12. Fermentaciones ácido lácticas.

Una fermentación ácido láctica es el proceso en el que se da la oxidación parcial de los átomos de carbono
de un azúcar y la reducción de un compuesto orgánico generado, ácido láctico principalmente, a partir del
catabolismo del sustrato inicial por las enzimas de un microorganismo (Quintero Ramírez, 1981).

Las diferencias que se producen entre fermentaciones ácido lácticas se deben a la especie de la que
provenga la leche utilizada como materia prima, al tratamiento térmico utilizado para la misma y a las
condiciones de fermentación tales como temperatura y concentración del inóculo. El inóculo utilizado
puede ser un cultivo puro o mixto. El cultivo puro es el que está constituido por una sola cepa, en cambio
en el cultivo mixto, hay una mezcla de cepas de distintas especies de bacterias. De acuerdo a las
condiciones de fermentación que se establezcan, predomina una especie u otra del inóculo (si se trata de un
cultivo mixto), generando distintos componentes aromáticos que le proporcionan el sabor y aroma
característico al producto de fermentación (Walstra et al, 2001).

Las bacterias ácido lácticas son capaces de llevar a cabo la transformación bioquímica de los componentes
de la leche de cabra, por la presencia de lactosa en ésta. Ya que las bacterias la utilizan como fuente de
carbono para su desarrollo (Walstra et al, 2001).

Las transformaciones bioquímicas principales que se llevan a cabo por la fermentación son las siguientes
(Walstra et al, 2001):
ƒ Producción de ácido láctico a partir de lactosa.
ƒ Formación de compuestos componentes del sabor, dióxido de carbono y exopolisacáridos bacterianos.
ƒ Proteolisis.
ƒ Lipolisis.

La leche fue uno de los primeros productos pecuarios utilizados por el hombre e incluso, uno de los
primeros alimentos sometidos a procesos fermentativos debido a la factibilidad con que sufre invasiones
microbianas que la acidifican; de esta manera el hombre de la antigüedad aprendió el arte de elaborar leches
fermentadas (García et al, 2002).

24
 Introducción

Existe en el mercado una gran variedad de leches fermentadas que se obtienen a través de una fermentación
ácido láctica. Algunos de estos productos se muestran en la tabla 6, en donde se encuentran clasificados por
grupos dependiendo del tipo de microorganismo que se utilice en la fermentación como cultivo iniciador.

Tabla 6. Leches fermentadas clasificadas de acuerdo al tipo microorganismo iniciador utilizado en

el proceso de elaboración.
Grupo Producto Microorganismo iniciador Características
Jocoque Lactococcus y en algunos
I Buttermilk Leuconostoc (bacterias Acidez baja a moderada
Leches escandinavas mesofílicas)
Leche ‘‘búlgara’’
II Leche acidófila Lactobacillus Acidez moderada a alta
Yakult
Yogurt
Dahi
Lactobacillus
Labneh
III Streptococcus (bacterias Acidez moderada a alta
Bioghurt
termofílicas)
Prostokvasha
Gioddu
Kefir
IV Koumiss Bacterias lácticas y levaduras Acidez y alcohol
‘‘Búlgaros’’
Fuente: García et al, 2002.

En algunos países el consumo de estos productos es superior al de leche fresca, y se utilizan leches de
diferentes especies. En ocasiones es difícil definir algunos de estos productos debido a su gran número y a
que se elaboran de diferentes formas y con distintos tipos de materias primas; este puede ser el caso del
jocoque en México. Es también difícil la clasificación de estos productos ya que sus características pueden
cambiar de un fabricante a otro. El proceso de elaboración del yogurt es la fermentación ácido láctica más
conocida (García et al 2002).

1.1.13. El yogurt como vehículo de bacterias probióticas.

1.1.13.1. Generalidades acerca del yogurt.
Hui (1993) define el yogurt como un producto fermentado semisólido elaborado a partir de leche
estandarizada que se inocula con una mezcla de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus y Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus. De esta fermentación debe resultar un gel suave y delicado o un líquido suave y
viscoso, en ambos casos de textura firme, uniforme y con sabor característico (García et al, 2002)

25
 Introducción

El yogurt según norma NMX-F-444-1983 se define como un producto lácteo preparado a partir de leche
entera, parcial o totalmente descremada, que puede ser enriquecida en extractos secos por medio de la
concentración de la leche o agregando leche en polvo, tratada térmicamente y gelificada biológicamente
por la fermentación obtenida de la siembra en simbiosis de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus
thermophilus.

Los tipos de yogurt comerciales pueden englobarse en 3 categorías principales: tradicional, con frutas y
aromatizados o de sabores, pudiendo presentarse como yogurt natural y yogurt batido (Tamine y
Robinson, 1991).

1.1.13.2. Proceso de elaboración del yogurt.

El proceso de elaboración del yogurt es un arte muy antiguo que data de hace miles de años. No obstante,
en las últimas décadas este proceso se ha racionalizado mucho, principalmente debido a los
descubrimientos y avances en diversas disciplinas, como por ejemplo, microbiología, enzimología,
ingeniería y bioquímica (Tamine y Robinson, 1991).

Es importante resaltar que el proceso de elaboración del yogurt ha evolucionado en lo que se refiere a la
escala de producción, desde la simple preparación en casa hasta la elaboración industrial a gran escala. Sin
embargo, independientemente de la escala de producción las operaciones unitarias básicas son las mismas
(Tamine y Robinson, 1991). En la figura 2 se muestran las operaciones unitarias de los procesos de
elaboración del yogurt batido y del natural.

26
 Introducción

Tratamiento preliminar de la leche (estandarización)

Tratamiento térmico de la leche

Propagación del cultivo iniciador Enfriamiento hasta la temperatura de incubación

Inoculación con el cultivo iniciador

Yogurt batido
Incubación a 40-45°C por 2.5-6.0 horas
Yogurt natural

Agitar Adición de saborizantes, edulcorantes, frutas, etc.

Enfriamiento a 4-8°C
Incubación a 40-45°C por 2.5-6.0 horas

Adición de saborizantes, edulcorantes, frutas, etc.

Enfriamiento y almacenamiento a 4-8°C
Envasado y almacenamiento a 4-8°C FUENTE: Tamine y Robinson, 1991; Heller, K. 2001.

Figura 2. Operaciones unitarias de los procesos de elaboración del yogurt.

Para la producción del yogurt se ha utilizado leche de distintas especies animales. Aunque la más utilizada
es la leche de vaca, también se utiliza la de ovejas, camellas, búfalas y cabras (Robinson et al, 2000).

En función del tipo de leche, se pueden presentar variaciones en la calidad del yogurt. Por ejemplo, leches
con un elevado contenido en grasa dan lugar a un yogurt cremoso, con un excelente cuerpo, en
comparación con el yogurt que se elabora a partir de leches de bajo contenido en grasa o de leches
desnatadas. La lactosa de la leche es la fuente de energía para los microorganismos iniciadores del yogurt,
pero las proteínas desempeñan un importante papel en la formación del gel y por tanto la consistencia y
viscosidad del producto es directamente proporcional a la concentración de proteína presente (Tamine y
Robinson, 1991).

27
 Introducción

La composición de la leche fresca, independientemente de su procedencia, varía dentro de una misma raza.
De acuerdo a Tamine y Robinson (1991) para evitar los efectos de estas variaciones de la composición de la
leche es preciso recurrir a la estandarización, normalización y/o enriquecimiento de la leche con el
propósito de:
ƒ Cumplir las especificaciones exigidas por las normas acerca de la composición del yogurt, es decir, el
contenido mínimo en grasa y/o extracto seco.
ƒ Estandarizar la calidad del yogurt, es decir, la acidez, la suavidad y la consistencia del gel, para
satisfacer las exigencias de los consumidores.

En cuanto al tratamiento térmico de la leche, éste es de gran importancia ya que se destruyen

microorganismos patógenos y otros microorganismos indeseables. Adicionalmente, se originan cambios en
las propiedades físico-químicas de los componentes de la leche (Tamine y Robinson, 1991).

Durante la elaboración del yogurt, la leche una vez sometida al tratamiento térmico se enfría hasta la
temperatura de incubación del cultivo iniciador (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii) y la
fermentación tiene lugar por lo general a temperatura de 40-45°C, es decir, en las condiciones óptimas de
crecimiento del cultivo mixto (método de incubación corto). En algunos casos el período de incubación
puede ser de sólo 2.5 horas, para cultivos iniciadores activos. No obstante, también puede recurrirse a
métodos de incubación largos a 30°C durante 18 horas o hasta alcanzar la acidez deseada (Tamine y
Robinson, 1991; Heller, 2001).

La fase de fermentación propiamente dicha puede tener lugar en los envases de comercialización, en el caso
del yogurt natural, o en tanques, para la elaboración de yogurt batido. No obstante, independientemente
del tipo de yogurt elaborado, las reacciones bioquímicas responsables de la formación del gel son
exactamente las mismas (Tamine y Robinson, 1991).

La única diferencia entre el yogurt natural y el batido radica en las propiedades reológicas del gel, ya que en
el primer tipo de yogurt la leche se deja en reposo durante el período de incubación, lo que determina la

28
formación de un gel semisólido, mientras que el yogurt batido resulta de la ruptura de la estructura del gel
al final del período de incubación (Tamine y Robinson, 1991).

La elaboración del yogurt es un proceso biológico, siendo la refrigeración uno de los métodos tradicionales
más empleados para controlar la actividad metabólica de los cultivos estárter y sus enzimas. El enfriamiento
del coágulo comienza inmediatamente después de alcanzar la acidez óptima del producto, es decir, a un
valor de pH de aproximadamente 4.6 o una concentración de ácido láctico del 0.9% (Tamine y Robinson,
1991).

Debido a la escasa actividad de los microorganismos del yogurt a temperaturas de 10°C aproximadamente,
el objetivo básico del enfriamiento es disminuir la temperatura del coágulo de 30-45°C a menos de 10°C
(preferiblemente a unos 4°C) tan rápidamente como sea posible, para así controlar la acidez final del
producto (Tamine y Robinson, 1991).

1.1.13.3. Cultivos iniciadores utilizados para la producción de yogurt.

Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus son los cultivos iniciadores más utilizados en los
productos tipo yogurt. Entre dichos cultivos se produce un sinergismo que hace que la acidificación de la
leche y la multiplicación de los microorganismos sea eficiente como consecuencia del consumo de
nutrientes cruzado de dichos microorganismos (Heller, 2001).

Adicionalmente, los metabolitos producidos por las dos especies dan el sabor distintivo al yogurt, siendo el
acetaldehído su principal componente. Sin embargo, compuestos como ácidos grasos libres, aminoácidos,
acetona, diacetilo, cetoácidos e hidroxiácidos también contribuyen al sabor final del producto (Tamine y
Robinson, 1991; Robinson et al; 2000).

29
 Introducción

La protocooperación de Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus se basa en lo siguiente (Robinson

et al, 2000; García et al, 2002):
ƒ Streptococcus thermophilus crece más rápidamente que Lactobacillus thermophilus, liberando ácido láctico y
dióxido de carbono por el rompimiento de la urea y el ácido fórmico, lo cual estimula el crecimiento y
el metabolismo de Lactobacillus delbrueckii. Adicionalmente, durante las primeras etapas de la
fermentación Streptococcus thermophilus crece rápidamente causando una disminución en el oxígeno
disuelto favoreciendo así el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii.

ƒ Lactobacillus delbrueckii hidroliza la caseína, y junto con la actividad de la peptidasa (predominantemente

originada por Streptococcus thermophilus) se liberan los aminoácidos esenciales para el desarrollo de
ambos microorganismos. Dando como resultado que las dos especies metabolizan activamente la
lactosa a ácido láctico, llevándose a cabo exitosamente la fermentación.

ƒ La glicina producida por Lactobacillus delbrueckii, como un subproducto de la conversión de treonina a

acetaldehído, estimula el desarrollo de Streptococcus thermophilus.

Los principales factores que determinan la proporción entre bacilos y cocos durante el proceso de
fermentación y las características organolépticas (acidez titulable, aroma y sabor) del producto son (García
et al, 2002):
ƒ Temperatura de incubación. La incubación a temperaturas superiores a los 40-45°C favorece el
crecimiento de Lactobacillus delbrueckii, mientras que temperaturas alrededor de los 31-38°C permiten
que domine Streptococcus thermophilus.

ƒ Tiempo de incubación. El tiempo de incubación puede ser corto o largo, dependiendo de la

temperatura de incubación a la que se realice el proceso de fermentación. En el tiempo de incubación
corto (temperatura más alta) se produce un aumento en la población de Lactobacillus delbrueckii, y por el
contrario tiempos de incubación largos favorecen el predomino de Streptococcus thermophilus.

30
 Introducción

ƒ Porcentaje del inóculo. El incremento del porcentaje del inóculo aumenta la acidificación del
medio y como consecuencia se genera una disminución drástica en el pH; por lo que se detiene el
crecimiento de Streptococcus thermophilus y se favorece el desarrollo de Lactobacillus delbrueckii.

ƒ Valor del pH durante el proceso. Aunque ambas especies son acidúricas, Streptococcus thermophilus
crece mejor a pH más altos, es decir, al principio de la fermentación. Cuando el pH cae debajo de 5.5,
Lactobacillus delbrueckii es más activo que Streptococcus thermophilus. Y a pH inferior a 4.2 la fermentación
es enteramente dominada por Lactobacillus delbrueckii. Hacia el final de la fermentación, la proporción
de bacilo a coco varía de 1:1 a 1:8 dependiendo del pH final del producto.

1.1.13.4. Situación del yogurt en el mercado en México.

El yogurt cuenta con gran aceptación en el mercado mexicano. En la figura 3 se muestra el creciente
consumo de yogurt en la última década. En 1994 hubo un consumo de 139,329 toneladas de yogurt,
incrementándose en el 2002 a 328,200 toneladas. Lo que representa un aumento de 7.5 a 53 millones de
dólares americanos en ventas (Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática, INEGI, 2002).

Representa
375,000
1994: 7.5 millones de USD
300,000 2002: 53 millones de USD

225,000
TONELADAS
150,000

75,000

0
1994 2002
Fuente: INEGI, 2002.
AÑO
Figura 3. Consumo de yogurt en México.

31
 Introducción

El mayor consumo de yogurt en México se debe principalmente:

ƒ Al valor nutrimental atribuido al producto.
ƒ A los efectos benéficos a la salud que se le adjudican.
ƒ Al aumento de la diversidad de formas de presentación del producto con lo cual se satisface la demanda
de los consumidores.
ƒ Y recientemente, se debe a su utilización como vehículos en los que se incorporan cepas probióticas
(Tamine y Robinson, 1991; Stanton et al, 2001).

1.1.13.5. Características idóneas del yogurt para ser vehículo de cepas

probióticas.
El yogurt es un alimento adecuado para promover los efectos benéficos a la salud atribuidos a los
probióticos por varias razones (Heller, 2001):
ƒ La imagen ya establecida del yogurt de ser un alimento saludable.
ƒ Los consumidores están familiarizados con el hecho que contiene organismos vivos.
ƒ Las cepas probióticas como cultivos iniciadores del yogurt combinan la imagen positiva de los
beneficios de los probióticos y del yogurt.
ƒ Se facilita la recomendación del consumo diario de los probióticos.
ƒ Tecnológicamente el proceso de elaboración del yogurt está optimizado, por lo que sólo deben
efectuarse las modificaciones necesarias para que se pueda dar el desarrollo de la cepa probiótica en la
matriz del producto.
Las operaciones que susceptibles de modificarse son: La adición de cultivos iniciadores tradicionales ya
que en este momento también se incorpora el probiótico y durante la fermentación se efectúan
cambios en las condiciones del proceso, tales como, el tiempo y la temperatura de fermentación, así
como las condiciones anaerobias durante el proceso, con el fin de favorecer el desarrollo de dicha cepa
(Heller, 2001). En la figura 4 se muestran encerradas en óvalos las operaciones unitarias del proceso de
elaboración del yogurt natural que potencialmente se modifican al incorporar un cultivo probiótico.

32
 Introducción

Leche pasterizada
o esterilizada a 42°C

Adición de cultivos iniciadores

tradicionales

INCORPORACIÓN DE Fermentación
CULTIVO PROBIÓTICO

CAMBIOS DE LAS CONDICIONES

DE FERMENTACIÓN

Enfriamiento y almacenamiento a 4-8°C

FUENTE: Heller, 2001.

Figura 4. Operaciones unitarias susceptibles de modificarse en el proceso de elaboración de yogurt

probiótico.

1.1.13.6. Factores que deben considerarse al incorporar bacterias probióticas

al yogurt.
Cuando cepas probióticas son adicionadas al yogurt deben ser tomados en cuenta factores que puedan
influir en la habilidad de los probióticos de sobrevivir en el producto y ser activos en el tracto
gastrointestinal del consumidor.

El requisito más importante es que la bacteria probiótica debe encontrarse en una cantidad suficiente en el
producto, por lo que su estabilidad física y genética debe garantizarse durante el almacenamiento.
Adicionalmente, las bacterias probióticas no deben afectar ni el sabor ni el aroma del producto por lo que
debe evitarse el desarrollo de acidez durante su vida en anaquel. Finalmente, los métodos que se utilicen
para su identificación deben ser inequívocos (Heller, 2001).

33
 Introducción

Para poder explotar completamente las propiedades funcionales de la bacteria probiótica, las condiciones
del proceso utilizado para la manufactura del yogurt deben modificarse para cumplir con las condiciones
requeridas por cada cepa en específico. Por ejemplo, debe considerarse en el proceso el contenido o
ausencia de oxígeno, el potencial redox y la actividad del medio ya que el ambiente natural de la bacteria
probiótica es el intestino (Heller, 2001).

Los microorganismos son muy activos e interactúan intensivamente con su ambiente intercambiando
componentes del medio por productos metabólicos. Por lo que la composición química de la leche con que
se elabore el yogurt es de gran importancia para las actividades metabólicas de las bacterias. Son vitales el
tipo y cantidad de carbohidratos disponibles, el grado de hidrólisis de las proteínas de la leche por la
disponibilidad de aminoácidos esenciales y el grado de hidrólisis de los lípidos de la leche por la
disponibilidad de ácidos grasos de cadena corta (Heller, 2001).

En la producción de yogurt probiótico es necesario tomar en cuenta las interacciones que pueden
establecerse entre la cepa probiótica y otros cultivos que puedan adicionarse al producto. Estas
interacciones pueden generar efectos sinérgicos o antagonistas por lo que deben seleccionarse
adecuadamente los cultivos utilizados para que no se vea afectado el proceso de fermentación (Heller,
2001).

El estado fisiológico de las cepas probióticas utilizadas es de relevancia ya que de este estado depende la
actividad de las mismas. Se recomienda que sean incorporadas al producto en fase de crecimiento
exponencial (fase log) ya que en fase de adaptación (fase lag) generan tiempos de producción más largos
(Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

1.1.14. Identificación de bacterias probióticas en productos fermentados.

La identificación y cuantificación de las bacterias probióticas es un punto de interés para las industrias que
elaboran productos con este tipo de bacterias, ya que para garantizar su valor terapéutico deben
encontrarse en una concentración igual o superior a 1.0x108 unidades formadoras de colonia por mililitro
(UFC/mL); por lo que es necesario contar con métodos que permitan una detección y enumeración
confiable de la bacteria probiótica contenida en el producto.

34
 Introducción

En la actualidad se han reportado el uso de diferentes métodos selectivos para la identificación cualitativa y
para la cuantificación dentro de una matriz con microflora mixta.

1.1.14.1. Métodos microbiológicos para la identificación de bacterias

probióticas en productos fermentados.
Los métodos microbiológicos utilizados para la identificación de bacterias probióticas en productos
fermentados se fundamentan en la bioquímica y fisiología de las bacterias para poder llevar a cabo su
aislamiento, caracterización y enumeración (Robinson et al, 2000).

La metodología estándar de la Federación Internacional de Lácteos (conocida como IDF por sus siglas en
inglés) ha establecido el conteo de UFC en placas con la utilización de diferentes medios para la evaluación
de productos lácteos fermentados; los cuales están basados en la inhibición del crecimiento de la flora
acompañante mediante el empleo de antibióticos, de aditivos al medio o de algún promotor específico del
crecimiento de la bacteria de interés (Robinson et al, 2000). En la tabla 7 se presentan algunos medios de
cultivo que han sido utilizados para la detección selectiva de bacterias del género Bifidobacterium (género al
que pertenece el probiótico que fue objeto de esta investigación).

Tabla 7. Medios de cultivo utilizados para la detección y enumeración selectiva del género
Bifidobacterium spp.
Género del
Microorganismo Medio de cultivo
probiótico
Medio TPY (trypticase phytone yeast) con solución que contiene ácido propiónico,
cloruro de litio y de sulfato de neomicina B y otra solución que contiene L-cisteína y
agua
Medio MBGA (modified bifid glucose) con solución de agentes selectivos que contiene
ácido nalidíxico, monosulfato de kanamicina y polimixina B
Medio MGRCA (maltose-galactose reinforced clostridial)
Bifidobacterium spp.
Medio MRS (Man Rogose Sharpe) en combinación con la solución NNLP (Nalidixic
acid-neomycin sulfate-lithium chloride-paramomycin sulfate)
Medio de cultivo (no se reporta ninguno en específico) con alguno de los siguientes
antibióticos: kanamicina, sulfato de paramomicina, ácido nalidíxico o polimixina B a
concentraciones menores a 50 µg/mL
Medio de cultivo con alguno de los siguientes inhibidores: azul de metileno (0.13
g/L), cloruro de litio (2 g/L), ácido propiónico (5 mL/L), cristal violeta (0.4
mg/L) o sulfito de sodio (2 g/L)
Fuente: Berrada et al, 1991; Lapierre et al 1992; Lim et al, 1993; Dave y Shah, 1996; Davidson et al, 1999.

35
 Introducción

El realizar la identificación y cuantificación de microorganismos por estos métodos implica invertir grandes
cantidades de tiempo y dinero. Tomando en cuenta la importancia del tiempo que se invierte en un análisis
en la industria de alimentos, es esencial que la información que se derive de un análisis acerca de la calidad
de un alimento se obtenga en un tiempo corto, por un método reproducible, específico y sensible.

1.1.14.2. Métodos de biología molecular para la identificación de bacterias

probióticas en productos fermentados.
La detección de una cepa probiótica específica puede hacerse también mediante la aplicación de métodos
moleculares, basados en la detección y cuantificación del ácido desoxirribonucleico, conocido como ADN
por sus siglas (Takahiro et al, 1999; Brigidi et al, 2002; Requena et al, 2002; Vaugien et al, 2003; Bonjoch
et al, 2004).

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), permite la replicación in
vitro de pequeñas cantidades de ADN al utilizar la enzima ADN polimerasa. La enzima ADN polimerasa es
la que se encarga de sintetizar el ADN, ya que cataliza la adición de un nucleótido al extremo 3’ de la
cadena mediante un enlace fosfodiéster. Para que una enzima ADN polimerasa pueda actuar es necesario
que la cadena a sintetizar tenga un orden determinado, por lo se necesita de una plantilla (primers, oligos o
iniciadores) con la secuencia específica que permite la identificación de la bacteria de interés (Sambrook y
Maniatis, 1989).

La técnica consiste en una serie de ciclos repetidos que tienen las funciones siguientes (Sambrook y
Maniatis, 1989):
ƒ Desnaturalizar el ADN por medio de calor. En esta primera etapa el ADN de doble cadena se convierte
en cadena sencilla por acción de calor (el ADN se desnaturaliza temperaturas mayores a los 94°C).
ƒ Hibridación de oligonucleótidos. En esta etapa los oligonucleótidos se hibridan en sus regiones
complementarias en el ADN templado. La temperatura en esta etapa puede variar desde los 37 a los
65°C, dependiendo de la región homóloga del oligonucleótido al templado.
ƒ Síntesis de ADN (extensión). Acá la enzima ADN polimerasa reconoce el extremo libre 3’ del
oligonucleótido y adiciona los desoxirribonucleótidos de adenina, guanina, timina y citosina generando
la cadena de ADN complementaria. Esta etapa se realiza a 72°C.

36
 Introducción

La técnica de PCR ha sido muy utilizada como herramienta para la detección e identificación de bacterias
en diferentes entornos. Esta técnica tiene la ventaja de ser rápida, sencilla y confiable para la identificación
de microorganismos si se compara con las técnicas microbiológicas existentes (Brigidi et al, 2002).

Hasta hoy en día las aplicaciones de la técnica de PCR dentro de la industria de alimentos está enfocada a la
detección de microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis y Salmonella
typhi en alimentos frescos y procesados. El aseguramiento de la calidad en los alimentos puede implicar la
verificación de la identidad genética de los componentes y/o analizar la variación genética e identificar cada
uno de los componentes de los alimentos, ya que se pueden detectar fraudes por la sustitución de
componentes o presencia de componentes no declarados en la composición del alimento (Solís, 2004).

Adicionalmente, la técnica de PCR ha sido empleada por diferentes autores para la identificación del
género de Bifidobacterium spp. en muestras no alimentarias (Takahiro et al, 1999; Brigidi et al, 2002;
Requena et al, 2002; Vaugien et al, 2003; Solís, 2004; Bonjoch et al, 2004).

La comparación de secuencias de la región 16S del ácido ribonucleico ribosomal (rRNA por sus siglas en
inglés) ha sido considerada como un método confiable para la clasificación e identificación de numerosas
especies bacterianas ya que en estudios realizados se ha demostrado que al utilizar secuencias de oligos
basadas en esta región existe efectividad en la detección e identificación de géneros o de especies
individuales de microorganismos en poblaciones mixtas que son difíciles o imposibles de caracterizar
fenotípicamente (Takahiro et al, 1999; Bonjoch et al, 2004).

En su investigación Takahiro et al (1999) mediante la técnica de PCR identificaron diferentes especies del
género Bifidobacterium: Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium
adolescentis y Bifidobacterium longum presentes en muestras de heces fecales de humanos recién nacidos y
adultos. Esta identificación se realizó tomando como referencia la secuencia 16S rRNA de la subunidad
pequeña del ribosoma, de la cual se diseñaron oligos específicos de dicha región para cada una de las
bacterias en estudio. A continuación en la tabla 4 se muestran las secuencias de los oligos utilizados por
Takahiro et al (1999) para la identificación de Bifidobacterium infantis.

37
 Introducción

Tabla 8. Secuencia de oligos específicos para la identificación de Bifidobacterium infantis diseñados

por Takahiro et al (1999).
Pares de Tamaño del producto
Cepa Primer Secuencia
bases (pb) de amplificación (pb)
Bifidobacterium BiINF-1 TTCCAGTTGATCGCATCCTC 20
828
infantis BiINF-2 GGAAACCCCATCTCTGGGAT 20

Estos oligos que son específicos para la identificación de Bifidobacterium infantis ya fueron empleados por
Solís (2004) en muestras de leche fermentada; pero modificando las condiciones de amplificación mediante
PCR reportadas previamente por Takahiro et al (1999).

1.1.15. Prebióticos.
Otra forma de intervenir en el equilibrio de la microflora intestinal es por medio de la utilización de
prebióticos, los cuales se definen como sustancias no digeribles de la dieta, que producen efectos benéficos
fisiológicos en el hospedero a través de la estimulación selectiva del crecimiento o actividad de un número
limitado de bacterias nativas (Reig y Anesto, 2002; Reid et al, 2003).

Algunos carbohidratos no digeribles pero fermentables que se incluyen en la dieta, estimulan

selectivamente a ciertos grupos de bacterias residentes del colon, como son bifidobacterias, lactobacilos y
eubacterias, por lo que se consideran benéficos para la salud del humano. Por la resistencia a la digestión
estos carbohidratos de cadena corta son denominados oligosacáridos no digeribles o carbohidratos
escasamente digeribles (Holzapfel y Schillinger, 2002).

En Europa, la inulina y los fructooligosacáridos son los prebióticos más ampliamente utilizados en
productos probióticos. Adicionalmente, a los galactooligosacáridos y lactulosa también se les atribuyen
efectos moduladores de la actividad de la flora intestinal por los resultados obtenidos en pruebas de
laboratorio, con animales y humanos que se han llevado a cabo en diferentes centros de investigación
(Holzapfel y Schillinger, 2002; Reid et al, 2003).

38
 Introducción

En Japón entre los prebióticos utilizados en productos funcionales también se incluyen soyoligosacáridos,
xilooligosacáridos, isomaltooligosacáridos, gentiooligosacáridos, sacarosa y glucooligosacáridos.
Adicionalmente, almidones resistentes y fibras dietéticas obtenidas a través de procedimientos enzimáticos
como los oligosacáridos de la pectina, xilano y celulosa han sido propuestos para ser utilizados como
prebióticos. Sin embargo, para optimizar el uso de estos como prebióticos se requiere de estudios para
determinar su impacto sobre el crecimiento relativo de diferentes especies (Holzapfel y Schillinger, 2002;
Reid et al, 2003)

Entre los efectos y aspectos de los que se tiene respaldo científico acerca de los prebióticos están (Marquina
y Santos, 2000; Holzapfel y Schillinger, 2002; Akahn et al, 2004):
ƒ Que no son digeribles y que poseen un bajo valor energético: menos de 2.16 kilocalorías por gramo
(kcal/g).
ƒ Aumentan el contenido fecal.
ƒ Modulan la flora del colon mediante la estimulación benéfica de Bifidobacterium, Lactobacillus y
Eubacterium spp. e inhiben el desarrollo de bacterias indeseables como son Clostridium y Bacteroides.
ƒ Previenen de infecciones intestinales.
ƒ Modulan la respuesta inmune.
ƒ Prevención de cáncer colorectal.
ƒ Reducen los niveles de colesterol.
ƒ Reducen el riesgo de osteoporosis.

La combinación de probióticos con prebióticos se ha definido como simbiótico, la cual beneficia al

hospedero a través del aumento de la viabilidad e implantación de los microorganismos vivos de los
suplementos dietéticos en el tracto gastrointestinal (Reig y Anesto, 2002; Bielecka et al, 2002; Holzapfel y
Schillinger, 2002; Reid et al, 2003; Rastall y Maitin, 2003; Kieran et al, 2003; Roller et al, 2004).

39
 Introducción

Dicha asociación sugiere que se da un aumento en la supervivencia de bacterias en la fase de tránsito

intestinal, aumentando el potencial de éstas para desarrollar su función en el colon al estimular el
crecimiento y contribuir a la instalación de la microflora bacteriana específica que provee de beneficios para
la salud (Reig y Anesto, 2002; Bielecka et al, 2002; Holzapfel y Schillinger, 2002; Reid et al, 2003; Rastall
y Maitin, 2003; Kieran et al, 2003; Roller et al, 2004).

1.1.16. Prebiótico estudiado en esta investigación.

Se seleccionó a la inulina como prebiótico porque se le han atribuido propiedades bifidogénicas, es decir,
capacidad para estimular el crecimiento de Bifidobacterium (Roberfroid et al, 1998; Rao, 1999; Niness,
1999; Coussement, 1999).

Se ha reportado que el efecto bifidogénico se observa cuando la inulina se encuentra en un porcentaje de

peso sobre peso (P/P) o peso sobre volumen (P/V) entre 1.5-4.0 en el producto tanto en evaluaciones
realizadas in vivo como in vitro (Roberfroid et al, 1999; Coussement, 1999; Roberfroid, 2000).

En la presente investigación se realizó un estudio para evaluar si la adición de inulina, al 3% P/V, afecta la
viabilidad de Bifidobacterium infantis en el producto probiótico fermentado durante su almacenamiento en
refrigeración.

1.1.16.1. Inulina.
La inulina es un término aplicado a una mezcla heterogénea de polímeros de fructosa que se han
encontrado ampliamente distribuidos en la naturaleza como una reserva de carbohidratos en plantas; está
presente en más de 36,000 especies de vegetales y plantas tales como el trigo, bananas, ajo, cebollas y
achicoria (Niness, 1999).

La mayor parte de inulina disponible comercialmente como ingrediente alimenticio es sintetizada a partir
de sucrosa o extraída de las raíces de achicoria, las cuales contienen inulina de un 15-20 % P/P (Niness,
1999). En la tabla 9 se muestran las características principales de la inulina.

40
 Introducción

Tabla 9. Características de la inulina.

Polímeros heterogéneos de fructosa con enlaces

β(2-1). Al final de la cadena una molécula de
glucosa se une por medio de un enlace α(1-2).
Las cadenas están formadas desde 2 hasta 60
unidades; en promedio formadas por 10 unidades.
Características estructurales

Características nutricionales Valor calórico reducido: menor a 2.16 kcal/g.

Efectos característicos de las fibras dietéticas.
Características bifidogénicas Estimula el crecimiento de Bifidobacterium en el intestino.
Aumenta la absorción y almacenamiento de calcio en los huesos.
Otras características Previene e inhibe el cáncer de colon y mama.
Modula las funciones inmunológicas intestinales.
Disminuye los niveles de triglicéridos séricos y el colesterol en sangre
Fuente: Niness, 1999; Coussement, 1999; Davidson y Maki, 1999 ; Roberfroid, 2000; Roller et al, 2004.

Es importante resaltar que además de las propiedades bifidogénicas de la inulina, ésta puede ser considerada
un alimento nutracéutico por los efectos que puede ejercer en el hospedero (aumentar la absorción y
almacenamiento de calcio en los huesos, prevenir e inhibir el cáncer de colon y mama, modular las
funciones inmunológicas intestinales y disminuir los niveles de triglicéridos séricos y el colesterol en
sangre).

Por las características estructurales que presenta, la inulina es considerada como una molécula compleja. Es
un polímero de fructosa (fructano) conectado a través de enlaces β(2-1), frecuentemente con una unidad de
glucosa al final. La longitud promedio de la cadena es de 10 unidades de azúcar (Niness, 1999;
Coussement, 1999; Roller et al, 2004).

41
 Introducción

El aspecto característico de la estructura de la inulina son sus enlaces β(2-1), ya que éstos son los responsables
de su reducido valor calórico (menos de 2.16 kcal/g) si se compara con los típicos carbohidratos. En algunos países
la inulina se utilizada como sustituto del azúcar, reduciendo el contenido calórico de alimentos como helados,
productos lácteos, dulces y productos para panificación (Niness, 1999).

Adicionalmente, los enlaces β(2-1) que unen las moléculas de fructosa, evitan la digestión de la inulina por las
enzimas intestinales presentes en los humanos, por lo pasa por el estómago y el intestino delgado sin ser
metabolizada. Por no ser digerida, según estudios realizados por Beringer y Wender (1995) y Sanno et al (1984) es
ideal el consumo de inulina por personas diabéticas, ya que no influye en los niveles de glucosa sérica y no estimula la
secreción de insulina ni glucagón (Niness, 1999).

Otro atributo importante de la inulina es que se considera una fibra dietética soluble, influyendo en la
función intestinal con al aumento de la motilidad intestinal, principalmente, en pacientes que sufren de
constipación (Niness, 1999).

En cuanto a las características bifidogénicas, la inulina es capaz de estimular el crecimiento de

Bifidobacterium en el intestino, ya que es considerada como un nutriente para el desarrollo de este género de
bacterias. Una pequeña cantidad de inulina es detectada en heces fecales, ya que el metabolismo de
fermentación anaeróbico de las bacterias en el colon es casi completo, produciendo ácidos grasos de cadena
corta, ácido láctico y gases como el hidrógeno, dióxido de carbono y metano (Niness, 1999; Davidson y
Maki, 1999).

La inulina aumenta la absorción y almacenamiento de calcio en los huesos de ratas y humanos. Por lo que
podría contribuir a la prevención de la osteoporosis (Niness, 1999; Roberfroid, 2000).

De acuerdo a resultados de estudios recientes la inulina puede jugar un rol importante en la prevención e
inhibición del cáncer de colon y mama (Niness, 1999; Roberfroid, 2000).

42
 Introducción

Se ha reportado que la inulina modula las funciones inmunológicas intestinales de forma indirecta, al
modificar la composición de la flora intestinal que es la que provoca los efectos sistémicos inmunológicos y
los efectos inmunológicos locales en el intestino del hospedero. La modulación de la respuesta inmune en
el tejido linfoide asociado al intestino se debe al aumento de la producción de citoquinas y células
mononucleares sanguíneas periféricas (Roller et al, 2003).

La inulina puede ser capaz de disminuir los niveles de triglicéridos sérico y colesterol en sangre en humanos
y ratas. Para explicar el posible efecto de la inulina sobre el metabolismo de los triacilgliceroles, dos efectos
se han hipotetizado de acuerdo a lo reportado por Roberfroid (2000). El primer efecto es la modificación
de la concentración de glucosa o insulina, ya que la modulación de la lipogénesis es regularmente ligada a
algunos cambios fisiológicos. Al haber una disminución en la concentración de glucosa también disminuye
la concentración de insulina produciendo una menor cantidad de enzimas lipogénicas a través de la
transcripción genética. El segundo efecto es la producción en el intestino delgado de ácidos carboxílicos de
cadena corta que ocasionan un aumento en la concentración de propionato, que es un inhibidor de la
síntesis de ácidos grasos (Niness, 1999; Roberfroid, 2000).

1.2. Antecedentes.
1.2.1. Trabajos previos.
Entre los trabajos dentro de la misma línea de investigación se encuentran los siguientes:
Lamoreaux et al (2001) prepararon productos tipo yogurt utilizando como inóculos Bifidobacterium animalis,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium longum de forma
individual y en mezclas. En el proceso de elaboración se adicionó una etapa de preincubación logrando
producción significativa de oligosacáridos y un número relativamente alto de supervivencia de
Bifidobacterium. Por un lado, la concentración más alta de oligosacáridos obtenida al final del proceso de
fermentación y después de 28 días de almacenamiento se obtuvo en los yogurt que contenían Bifidobacterium
infantis; y por otro lado, los yogurt que se fermentaron con Bifidobacterium breve mostraron menores
concentraciones de lactosa luego del proceso fermentativo y tras el período de almacenamiento de 28 días.
Estos resultados son interesantes ya que aunque las cepas pertenezcan al género de Bifidobacterium varían
tanto en la capacidad de producción de oligosacáridos y en la actividad de la enzima β-galactosidasa.

43
 Introducción

La investigación realizada por Shimakawa et al (2003) puso en evidencia la capacidad de Bifidobacterium breve
para desarrollarse en leche de soya sin necesidad de agregar aditivos. Con 12 horas de incubación
anaeróbica se logró una concentración de 109 UFC/mL, la cual se mantuvo sin variación durante el
almacenamiento a 10°C por 20 días. Adicionalmente, las funciones probióticas en humanos de esta cepa se
probaron con el aumento del número total de bifidobacterias recuperadas en la materia fecal de los
humanos sujetos de experimentación.

Ostlie et al (2003) realizaron un estudio del crecimiento y metabolismo de 5 cepas del género Lactobacillus
en leche tratada térmicamente mediante el proceso de esterilización a ultra alta temperatura conocido
como UHT. Con los resultados del monitoreo de los metabolitos (compuestos volátiles, ácidos orgánicos y
dióxido carbono) que produjeron las cepas, se mostró la importancia del control del tiempo de
fermentación de acuerdo a las cantidades de productos metabólicos producidos.

Akahn et al (2004) en su investigación realizaron un estudio de la viabilidad de 2 cepas de Bifidobacterium

(Bifidobacterium animalis y Bifidobacterium longum) en productos tipo yogurt que contenían
fructooligosacáridos y sin fructooligosacáridos durante 28 días. En todos los productos se observó una
disminución en la cuenta viable de bifidobacterias durante su almacenamiento a 4°C. Sin embargo, la
viabilidad de Bifidobacterium en el yogurt fue influenciada por el tipo de cepa y la presencia de
fructooligosacáridos; Bifidobacterium animalis mostró mejor estabilidad en el yogurt (con y sin prebiótico)
que Bifidobacterium longum.

El trabajo de Takahiro et al (1999) es de gran importancia ya que se desarrollaron técnicas de de PCR

específicas para la identificación de una determinada especie de Bifidobacterium, utilizando como blanco la
región del gen 16S rRNA. Se diseñaron primers específicos para diferentes especies de Bifidobacterium los
cuales resultaron idóneos para la detección cualitativa de Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium breve.

44
 Introducción

Los primers que se utilizaron en el trabajo anterior para la detección de Bifidobacterium infantis también
fueron utilizados por Solís (2004), quien implementó una técnica de PCR para la identificación de esa
bacteria. Adicionalmete, su investigación es el primer trabajo encontrado en donde se determinó que la
leche de cabra es un sustrato favorable para el desarrollo de Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y
Streptococcus thermophilus bajo condiciones de anaerobiosis utilizando dióxido de carbono.

1.2.2. Problemática.
La tendencia mundial de las dos últimas décadas hacia un mayor consumo de productos lácteos
fermentados, debido a la mayor disponibilidad de leche (vaca, cabra y oveja) y a la aparición de una amplia
variedad de productos de este tipo permite la posibilidad de incorporarles cepas probióticas para proveer a
los consumidores de los beneficios de ellas a través de productos que son bien aceptados en el mercado
(Hartley et al, 2001).

Actualmente, existen en el mercado mundial entre 60 y 70 productos lácteos fermentados que contienen
microorganismos probióticos según reportó Dubeuf et al (2003). En el mercado mexicano los productos
probióticos lácteos fermentados disponibles son 9.

En su mayoría los productos lácteos fermentados utilizan como sustrato leche de vaca. De acuerdo a las
fuentes de información consultadas, hasta el momento no existe en el mercado mexicano un producto
probiótico lácteo fermentado en el que se utilice leche proveniente de otros mamíferos. Por lo que es
necesario conocer la factibilidad de uso de otros sustratos para este fin.

La leche de cabra constituye una alternativa a la leche de vaca en la alimentación humana (Dubeuf et al,
2003). Por lo que se ha considerado a la leche de cabra como un sustrato idóneo para la elaboración de
productos lácteos fermentados, aprovechando así los recursos con los que se cuentan en la región
(SAGARPA, 1998; Cervantes, 2000).

Aunque existen unidades caprinas en las cuales se aplica tecnología avanzada, el común denominador de
este sector pecuario es la escasa o nula tecnificación aplicada en los procesos productivos (SAGARPA,
1998; Cervantes, 2000).

45
 Introducción

El estado de Nuevo León con el ITESM está apoyando actualmente al sector caprino organizado con la
construcción de una Planta Industrializadora de Ganado Caprino en el campo experimental con el que
cuenta el ITESM en Hualahuises, Nuevo León.

El ITESM además de proporcionar el lugar donde estará ubicada la planta busca colaborar con transferencia
de tecnología, asistencia técnica y capacitación, para que adicionalmente a la producción de leche
pasteurizada y carne se elaboren productos de valor agregado. Por lo que la presente investigación busca
ser una contribución para el posible desarrollo de un yogurt natural probiótico utilizando leche de cabra
como sustrato.

En la elaboración de productos que contienen bacterias probióticas es importante tomar en cuenta dos
aspectos que representan grandes desafíos tecnológicos: la viabilidad y la estabilidad de los probióticos.

Los productos probióticos deben contener la cepa específica con la que fueron elaborados y un nivel
deseable de células viables de la misma durante la vida de anaquel del producto. Es en el mantenimiento de
la viabilidad de estos microorganismos que los prebióticos juegan un papel de gran importancia, ya que
éstos producen un efecto en el hospedador al estimular el crecimiento selectivo y/o actividad metabólica
de un número limitado de bacterias nativas del colón.

En la obtención de un producto que contenga Bifidobacterium infantis deben establecerse condiciones de

anaerobiosis para que esta cepa pueda desarrollarse. En la investigación realizada por Solís (2004) se puso
en evidencia que la leche de cabra resulta ser un buen sustrato para la fermentación anaeróbica en
atmósfera de dióxido de carbono con Bifidobacterium infantis sin haber modificado ninguno de los
componentes de la leche de cabra.

A diferencia del trabajo realizado por Solís (2004) en el sistema de fermentación utilizado en la presente
investigación las condiciones de anaerobiosis necesarias para el desarrollo de Bifidobacterium infantis fueron
creadas mediante la incorporación de nitrógeno. Ya que es de vital importancia establecer condiciones de
anaerobiosis que sean seguras para el consumidor y particularmente que sean escalables a nivel industrial.

46
 Introducción

Con fundamento en la problemática anteriormente presentada, es menester realizar un estudio del efecto
del cambio de escala del proceso de obtención de yogurt natural con Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
delbrueckii y Streptococcus thermophilus utilizando leche de cabra como sustrato, y una evaluación para
determinar cómo influye la adición de la inulina, como prebiótico, en el mantenimiento de la viabilidad de
Bifidobacterium infantis en el producto fermentado almacenado en refrigeración.

La identificación y cuantificación de las bacterias probióticas es un punto de interés en los productos con
este tipo de bacterias.

Teniendo el antecedente que en la investigación realizada por Solís (2004) se utilizaron los oligos BiINF-1 y
Bi-INF-2 reportados por Takahiro et al (1999) para la identificación específica de Bifidobacterium infantis en
una muestra de leche fermentada; para verificar la presencia Bifidobacterium infantis en el yogurt probiótico
que se elaboró se implementó la técnica de PCR utilizada por Takahiro et al (1999).

La cuantificación de Bifidobacterium infantis en el producto fermentado elaborado se realizó por conteo de

colonias en placas. Para ello se utilizó medio MRS al que se le incorporó kanamicina a una concentración de
38 µg/mL y cloruro de litio al 0.2 % P/V (Lim et al, 1993; Lapierre et al, 1992; Lamoureux et al, 2002).

47
 Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Estudiar el efecto del cambio de escala en el proceso de obtención de yogurt natural probiótico con
Bifidobacterium infantis ATCC 17930, Streptococcus thermophilus ATCC BAA250 y Lactobacillus delbrueckii
ATCC11842 utilizando leche de cabra como sustrato; y la influencia de la adición de inulina sobre la
prevalencia de Bifidobacterium infantis en el producto fermentado.

2.2. Objetivos específicos

ƒ Escalar 7 veces el volumen del proceso de fermentación determinando las condiciones óptimas del
mismo: inóculo de trabajo total (porcentaje V/V con respecto al volumen total de fermentación), relación de
las tres bacterias en el inóculo total, concentración inicial de cada una de las bacterias al inicio de la
fermentación, temperatura y tiempo de fermentación.

ƒ Evaluar si la adición de inulina, al 3% P/V, afecta la viabilidad de Bifidobacterium infantis en el producto

probiótico fermentado durante su almacenamiento en refrigeración.

ƒ Reducir la fase de adaptación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930, Streptococcus thermophilus ATCC
BAA250 y Lactobacillus delbrueckii ATCC11842 mediante resiembras sucesivas en medio de cultivo.

ƒ Determinar la concentración de bacterias en los cultivos madre de cada una de ellas mediante conteo
en placas.

ƒ Monitorear las cinéticas de consumo de lactosa, cambios en el número de UFC/mL de Bifidobacterium

infantis, variación de pH y acidez titulable durante el proceso de fermentación en el reactor de 4.0 L.

48
 Objetivos

ƒ Verificar a través de amplificación por PCR y electroforesis la presencia de Bifidobacterium infantis en el

producto fermentado.

ƒ Verificar la existencia de una concentración igual o superior a 1.0x108 UFC/mL de Bifidobacterium

infantis en el producto fermentado, mediante conteo en placas utilizando medio de cultivo MRS
suplementado con kanamicina y cloruro de litio.

49
 Hipótesis

3. HIPÓTESIS

Con el fin de lograr los objetivos de la presente investigación, las hipótesis planteadas fueron:
I- Un cambio de escala del proceso de fermentación (de 500 mL a un volumen de 3.5 L) no genera cambios
en la concentración de lactosa residual, pH, acidez titulable y viabilidad de Bifidobacterium infantis del
producto probiótico que se obtiene.

II- La adición de inulina genera cambios en la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el

almacenamiento del producto en refrigeración.

50
 Estrategia Experimental

4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Para el logro de los objetivos planteados se diseñó una estrategia experimental que se divide en 6 grandes
etapas:
Etapa I: Caracterización y tratamiento térmico de la leche de cabra en la elaboración de yogurt probiótico.

Etapa II: Reactivación de cepas utilizadas para la preparación de yogurt probiótico de leche de cabra,
reducción de la fase lag de las mismas y criopreservación.

Etapa III. Preparación de cultivos madre y de inóculos de trabajo necesarios para elaborar yogurt de leche
de cabra probiótico.

Etapa IV: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 500 mL utilizando leche de cabra como
sustrato para la obtención de yogurt probiótico.

Etapa V: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 3.5 L utilizando leche de cabra como sustrato
para la obtención de yogurt probiótico.

Etapa VI: Estudio del efecto de la incorporación de inulina en la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante
el almacenamiento refrigerado del yogurt de cabra probiótico.

La estrategia experimental correspondiente a cada una de las etapas se muestra en las figuras 5, 6, 7, 8, 9 y
10.

51
 Estrategia experimental

Pruebas de plataforma:
Recepciónde leche pH Métodopotenciométrico Lecherechazada
Acidez titulable Método947.05 AOAC No continuar
de cabra CAE ITESM

Lecheaceptada

Esterilización
Caracterizar en base a los siguientes parámetros: 95 ±2°C / 4 minutos,
• Proteínas Método 930.29 AOAC enfriamiento 8°C
• Grasa NOM-F-387-1982
•Lactosa Método 984.05 AOAC

Lecherechazada
Análisis microbiológico
No continuar
NOM-112SSA1-1994

Leche aceptada

Continuar
Fuente: Solís, 2004.

Figura 5. Etapa I: Caracterización y tratamiento térmico de la leche de cabra utilizada en la

elaboración de yogurt probiótico.

52
 Estrategia experimental

Cepas criopreservadas medio/glicerol

Bifidobacterium infantis ATCC 17930
Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842
Streptococcus thermophilus ATCC BAA 250

Reactivación en tubo
Medio MRS y CASOY
Temperatura 37±1 °C
Anaerobiosis al vacío

Seguimiento de cinéticas de crecimiento

hasta alcanzar fase exponencial
Determinación de D.O. a 660 nm

Resiembras sucesivas Medio MRS y CASOY y 5% de inóculo

1. 20 mL de volumen final. Hasta lograr constancia en td y µ
2. 100 mL de volumen final. Hasta lograr constancia en td y µ

Resguardos de las bacterias en medio MRS/glicerol

y CASOY/glicerol a -80°C

Figura 6. Etapa II: Reactivación de cepas utilizadas para la preparación de yogurt probiótico de
leche de cabra, reducción de la fase lag de las mismas y criopreservación.

53
 Estrategia experimental

Inocular medio MRS y CASOY con bacterias resguardadas

Incubar a 37±1 °C
Anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno

Inocular leche de cabra (100 mL volumen final)

Incubar a 37±1 °C
Anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno

Resembrar en leche de cabra (1 L volumen final)

Incubar a 37±1 °C
Anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno

Almacenar Cultivos
Madre 4±1°C

Conteo de UFC/mL en Cultivos Madre

NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994

Fraccionamiento de Cultivos Madre Almacenar Inóculos

en Inóculos de Trabajo trabajo 4±1°C

Figura 7. Etapa III: Preparación de cultivos madre y de inóculos de trabajo necesarios para la
elaboración de yogurt de leche de cabra probiótico.

54
 Estrategia experimental

Leche de cabra estéril

Temperatura de 42±1°C

Inoculación de Bifidobacterium infantis,

Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus
thermophilus

Fermentación 500 mL
Anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno
Temperatura 42±1°C / 6 horas

Enfriamiento y almacenamiento 4°C

Caracterización del producto fermentado:

• pH Método potenciométrico
• Acidez titulable Método 947.05 AOAC
• Lactosa residual Método 984.15 AOAC
• UFC/mL de Bifidobacterium infantis Conteo en placas medio MRS con kanamicina y cloruro de litio

Figura 8. Etapa IV: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 500 mL utilizando leche de
cabra como sustrato para la obtención de yogurt probiótico.

55
 Estrategia experimental

Leche de cabra estéril

Temperatura de 42±1°C

Inoculación de Bifidobacterium infantis,

Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus
thermophilus

Cinéticas-fermentación:
Fermentación 3.5 L
Inyección de nitrógeno 10 mL/min durante 5 minutos • Variación de pH
• Formación de ácido láctico
Temperatura 42±1°C / 6 horas
• Consumo de lactosa
• UFC/mL de Bifidobacterium
infantis

Enfriamiento y almacenamiento 4°C

Caracterización del producto fermentado:

• pH Método potenciométrico
• Acidez titulable Método 947.05 AOAC
• Lactosa residual Método 984.15 AOAC
•UFC/mL de Bifidobacterium infantis Conteo en placas medio MRS con kanamicina y cloruro de litio
Identificación de Bifidobacterium infantis mediante PCR y electroforesis

Figura 9. Etapa V: Fermentación ácido láctica de un volumen total de 3.5 L utilizando leche de cabra
como sustrato para la obtención de yogurt probiótico.

56
 Estrategia experimental

Leche de cabra estéril

Temperatura de 42±1°C

Fermentación con inulina I

Adición de inulina 3% P/V

Inoculación de Bifidobacterium infantis,

Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus
thermophilus

Fermentación 500 mL
Anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno
Temperatura 42±1°C / 6 horas
Fermentación con inulina II
Adición de inulina 3% P/V

Enfriamiento y almacenamiento 4°C

Monitoreo de la viabilidad de Bifidobacterium infantis a los

0, 7, 14 y 21 días de almacenamiento en refrigeración

Figura 10. Etapa VI: Estudio del efecto de la incorporación de inulina en la viabilidad de
Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento refrigerado del yogurt de leche de cabra
probiótico.

57
 Materiales y métodos

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Procedencia y suministro de la leche de cabra.

La leche de cabra que se utilizó fue procedente de la producción del hato de cabras de la raza nubia en el
período comprendido de abril de 2004 a febrero de 2005. Dicha leche fue proveída por el Campo Agrícola
Experimental (CAE) del ITESM, ubicado en Apodaca, Nuevo León; se recibía en la oficina del CAE del
campus del ITESM, envasada en recipientes de plástico de polietileno de alta densidad, con capacidad de 1
galón.

5.2. Pruebas de plataforma.

Durante la recepción de la leche de cabra fue necesaria la determinación de ciertos parámetros físico-
químicos como el pH y la acidez para asegurar que la materia prima fuera de buena calidad y/o detectar
posibles adulteraciones (Keating y Gaona, 1986). Se realizaron sistemáticamente la determinación de pH y
acidez titulable al recibir leche de cabra para verificar la calidad de la misma y tomar la decisión de
aceptarla o rechazarla.

Determinación de pH. La determinación del pH se realizó potenciométricamente utilizando un

potenciómetro Beckman Φ50 Meter, Texas Instruments, Fullerton, CA; que fue previamente calibrado
con buffer fosfato de pH 4 y 7. El pH normal de la leche fresca es de 6.4 – 6.8. Valores superiores se
observan generalmente en leches mastíticas mientras que valores inferiores indican la presencia de calostro
o descomposición bacteriana (Walstra et al, 2001).

Determinación de la acidez titulable. Esta determinación se llevó a cabo de acuerdo al método

947.05 de los métodos oficiales de análisis (AOAC por sus siglas en inglés, 1990). La leche fresca de cabra
puede tener una acidez titulable aceptable equivalente a 0.15-0.18 % P/V de ácido láctico; esto debido a su
contenido de anhídrido carbónico, proteínas y algunos iones como fosfato y citrato (Walstra et al, 2001).

58
 Materiales y métodos

5.3. Caracterización de la leche de cabra.

Desde el punto de vista nutricional e industrial los componentes de mayor importancia en la leche de cabra
son: las proteínas, la grasa y la lactosa. Cualquier cambio en la composición de la leche de cabra es
importante ya que afecta las propiedades de los productos que se elaboran a partir de esta materia prima.
(Keating y Gaona, 1986; Vicente, 1990; Tamine y Robinson, 1991).

Determinación de proteínas totales. La determinación de proteínas totales se realizó por el método

Kjeldahl de acuerdo a lo estipulado en el método 930.29 de la AOAC (1990).

Determinación de grasa. Para la determinación del contenido de grasa de la leche de cabra se utilizó el
método de Gerber según norma NMX-F-387-1982.

Determinación de lactosa. La cuantificación de lactosa se realizó utilizando el kit para determinación de

lactosa/D-galactosa (Boehringer Mannheim/R-Biopharm) de acuerdo al método 984.15 de la AOAC
(1990).

5.4. Tratamiento térmico de la leche de cabra.

Cada vez que fue recibida leche de cabra del CAE, se esterilizó para garantizar ausencia de
microorganismos que pudieran establecerse en este sustrato rico en nutrientes.

El proceso de esterilización utilizado consistió en un choque térmico que se efectuó calentando la leche de
cabra (previamente colada) hasta ebullición (95 ± 2°C). Se sostuvo en ese rango de temperatura durante 4
minutos. Inmediatamente después se colocó la leche de cabra en un baño de hielo para provocar el choque
térmico. Se almacenó en refrigeración a 8 ± 2°C utilizando un refrigerador Fisher Scientific Isotemp
176G-2, Hayward, CA. Para el calentamiento de la leche de cabra se utilizó una placa calefactora Barnstead
PMC 524C, Iowa, USA.

59
 Materiales y métodos

5.5. Control microbiológico de la leche de cabra esterilizada.

Con el fin de corroborar la eficacia del tratamiento térmico para esterilizar la leche de cabra se realizaron
los análisis microbiológicos siguientes:
Estimación del número de coliformes. Esta estimación se realizó por medio del cálculo del número
más probable (NMP) de acuerdo a la norma NOM-112SSA1-1994. El límite máximo permitido es de 20
UFC de coliformes totales/mL de leche.

Determinación de mesófilos aerobios totales. Esta determinación se llevó a cabo por conteos en
placas de mesófilos aerobios totales en la leche de cabra tratada térmicamente, de acuerdo a las normas:
NOM-091-SSA1-1994, NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. El límite máximo permitido es de
30,000 UFC de microorganismos mesófilos aerobios/mL de leche.

5.6. Cepas en estudio.

Las cepas utilizadas para la realización de esta investigación fueron: Bifidobacterium infantis ATCC 17930,
Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 y Streptococcus thermophilus ATCC BAA250. Dichas cepas fueron
adquiridas de la colección de cepas American Type Culture Collection (ATCC por sus siglas) previamente por
nuestro grupo de investigación.

5.7. Reactivación y resguardo de las cepas objeto de estudio.

Para la reactivación y resguardo de las diferentes bacterias (Bifidobacterium infantis ATCC 17930,
Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 y Streptococcus thermophilus ATCC BAA250) se partió de viales de cada
una de las bacterias que se encontraban criopreservadas a -80 ± 2°C en un ultracongelador Fisher Scientific
Isotemp Freezer I821UA12, Hayward, CA. Se tuvo la precaución de utilizar material estéril y manipularlas
dentro de la campana de seguridad biológica (Backer 4-TX, Class II, Type B2, Sandford, MA) para evitar
contaminación.

60
 Materiales y métodos

Se determinaron las cinéticas de crecimiento y los parámetros cinéticos µ y td de cada una de las bacterias
involucradas en la investigación. Las cinéticas iniciales de cada una de ellas se llevaron a cabo por duplicado
y las cinéticas de crecimiento de las bacterias criopreservadas luego de acortar la fase lag a través de las
transferencias se determinaron 6 veces.

Tomando en cuenta que se persigue que esta investigación sea una aportación para el desarrollo industrial
de productos de valor agregado en la Planta Industrializadora de Ganado Caprino en el campo
experimental del ITESM en Hualahuises, Nuevo León, una de las principales metas que se buscó alcanzar
fue que el proceso de fermentación tuviera una duración de 6 horas como máximo para ser considerado
como rentable a nivel industrial. Por lo que alcanzar una óptima actividad de las cepas durante el proceso
de fermentación ácido láctica utilizando leche de cabra como sustrato, se realizaron resiembras sucesivas de
cada una de ellas con la finalidad de incrementar su velocidad específica de crecimiento y la respectiva
disminución de la duración de la fase lag y del tiempo de duplicación.

Los medios de cultivo utilizados fueron los siguientes:

ƒ Medio MRS (Difco ™, Le Pont de Claix, Francia) para la propagación de Bifidobacterium infantis ATCC
17930 y Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842.
ƒ Medio CASOY (Bioxon, México, DF) para el desarrollo de Streptococcus thermophilus ATCC BAA250.

5.7.1. Cinéticas de crecimiento de las cepas.

El monitoreo de las cinéticas de crecimiento de cada una de las bacterias se realizó para evaluar el estado
fisiológico de las mismas tras su criopreservación. Esto se realizó mediante mediciones de la densidad
óptica (D.O.) a 660 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman DU650, Fullerton, CAi.

i
Todas las determinaciones de D.O. se realizaron con este equipo.
61
 Materiales y métodos

Cada 1-2 horas se realizaron mediciones de la D.O. hasta completar las gráficas de las cinéticas de
crecimiento de las bacterias (se monitoreó el crecimiento de las bacterias hasta el inicio de la fase
estacionaria, para evaluar adecuadamente la evolución de las fases de adaptación y de crecimiento).

Para el monitoreo de las cinéticas se procedió de la siguiente manera: Se descongeló un vial del cultivo
bacteriano en un baño de agua (Fisher Scientific Isotemp Water Bath 228, Pittsburgh, PA) a 37ºC durante
3 minutos. Se colocaron 400 µL de la suspensión de bacterias en 7.6 mL de medio de cultivo y se mezcló.
Se tomaron 100 µL del tubo para medir la D.O. inicial. El cultivo de bacterias se incubó a 37 ± 1ºC
utilizando una incubadora al vacío (Sheldon Manufacturing, Inc. A-141, Cornelius, OR), en la que se
mantuvo un vacío equivalente a 20 mm de Hgii.

Con los valores que se obtuvieron de las D.O. se hicieron los cálculos para determinar los parámetros
cinéticos: velocidad específica de crecimiento (µ) y tiempo de duplicación (td). Las ecuaciones que se
utilizaron para el cálculo de dichos parámetros fueron las siguientes (Robinson et al, 2000):

µ = ∆ log D.O. x 2.303 Ecuación 1

∆t

Donde:
µ = velocidad específica de crecimiento (h-1)
∆log D.O. = diferencial que corresponde a los valores de dos puntos de la gráfica de crecimiento
construida del monitoreo de las D.O. a 660 nm
∆t = diferencial del tiempo de los valores correspondiente a dos puntos de la gráfica de crecimiento
construida del monitoreo de las D.O. a 660 nm
t = tiempo (h)

ii
En todas las ocasiones al mencionar incubación al vacío utilizando una incubadora Sheldom Manufacturing, Inc. A-141, se
mantuvo un vacío equivalente 20 mm de Hg para crear condiciones de anaerobiosis en el sistema.
62
 Materiales y métodos

El parámetro cinético del tiempo de duplicación se obtuvo por el cálculo directo de la ecuación 2.

td = ln2 = 0.693 Ecuación 2

µ µ

Donde:
td = tiempo de duplicación (horas)
ln 2 = logaritmo natural de 2 = 0.6931
µ = velocidad específica de crecimiento (h-1)

5.7.2. Reducción de la fase de adaptación de las cepas.

La reducción de la fase lag es de gran importancia ya que procesos que implican la fermentación con
bacterias como en este caso, fases de adaptación largas hacen improductivos los procesos e incrementan los
costos de los mismos (Robinson et al, 2000).

La disminución de la duración de la fase lag se realizó con la finalidad de acortar el tiempo de adaptación de
las bacterias al medio de cultivo.

Para reducir la fase lag de las bacterias se procedió de la manera siguiente: Se descongeló un vial del cultivo
bacteriano en un baño de agua (Fisher Scientific Isotemp Water Bath 228, Pittsburgh, PA) a 37ºC por 3
minutos. Se inició la reactivación en un volumen final de 20 mL que fue inoculado con 5% V/V de la
suspensión de bacterias: 1 mL de suspensión de bacterias en 19 mL de medio de cultivo. Se tomaron 100
µL del tubo para medir la D.O. inicial. El cultivo de bacterias se incubó a 37 ± 1ºC al vacío utilizando una
incubadora Sheldon Manufacturing, Inc. A-141, Cornelius, OR.

Se midieron las D.O. a 660 nm y al alcanzar el valor que indicaba que el cultivo había iniciado la fase log
(D.O. que fue determinada al monitorear las cinéticas) se hicieron transferencias en medio de cultivo
fresco inoculando con el 5% V/V del cultivo bacteriano. Se realizaron resiembras hasta obtener constancia
en el tiempo en el que se alcanzaba el valor de D.O. que indicaba el inicio de la fase log.

63
 Materiales y métodos

Posteriormente, se realizaron resiembras utilizando un volumen total de 100 mL para la propagación de las
bacterias. Se colocaron 5 mL del cultivo de bacterias en 95 mL de medio de cultivo. Se tomaron 100 µL
para medir la D.O. inicial. Se incubó al vacío a 37 ± 1ºC en la incubadora Sheldon Manufacturing, Inc. A-
141, Cornelius, OR.

Se midieron las D.O. y al alcanzar la D.O. que indicaba que el cultivo había iniciado la fase log se
realizaron resiembras sucesivas en un volumen total de 100 mL hasta alcanzar en el mismo tiempo el valor
de la D.O. que correspondía al inicio de la fase log.

5.7.3. Criopreservación de las cepas adaptadas.

Una vez que se obtuvo constancia en el tiempo de propagación y en los parámetros cinéticos, las bacterias
fueron criopreservadas. Este procedimiento consistió en la recuperación de las bacterias por
centrifugación; se utilizó una centrífuga IEC HN-SII, International Equipment Co., MA. Bifidobacterium
infantis ATCC 17930 y Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 se centrifugaron por 10 minutos a 3,500
revoluciones por minuto (rpm) a diferencia de Streptococcus thermophilus ATCC BAA250 que se centrifugó
por 20 minutos a 3,500 rpm.

Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 50 mL en una solución de medio de cultivo fresco

y glicerol al 20% P/V (Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V., DEQ) como crioprotector.
Se fraccionó en viales criogénicos con 1 mL en cada uno y se congelaron a -80 ± 2ºC en un ultracongelador
Fisher Scientific Isotemp Freezer I821UA12, Hayward, CA.

Nuevamente se determinaron las cinéticas de crecimiento y los valores de los parámetros cinéticos µ y td
de cada una de las bacterias para evidenciar los cambios después de la serie de resiembras efectuadas.
Adicionalmente, se determinaron los tiempos de duración de la fase lag de cada una de las bacterias
estudiadas.

64
 Materiales y métodos

La criopreservación de las cepas adaptadas se realizó para preservar y mantener a las bacterias con los
parámetros cinéticos optimizados de manera que se obtenga constancia en el proceso de fermentación. Esto
es de importancia a nivel industrial ya que así se asegura un producto de calidad y características específicas.

5.8. Preparación de cultivos madre.

La preparación de los cultivos madre se realizó con la finalidad de adaptar las bacterias al sustrato de
fermentación. Se preparó un cultivo madre de cada una de las bacterias en estudioiii. Para la preparación de
éstos se utilizaron viales de las bacterias criopreservadas adaptadas al medio de cultivo que se obtuvieron de
la experimentación descrita en el apartado anterior (5.7.2).

En la preparación de los cultivos madre las condiciones de anaerobiosis se crearon utilizando una
incubadora (Sheldon Manufacturing, Inc. A-141, Cornelius, OR) con atmósfera de nitrógeno con el fin de
que Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus desde su primer contacto con
la leche de cabra durante estuvieran bajo condiciones de anaerobiosis escalables a nivel industrial.

La preparación de los cultivos madre inicia con la propagación de las bacterias adaptadas criopreservadas en
un volumen total de 20 mL. El desarrollo de las bacterias en medio de cultivoiv se realizó de la manera
descrita en el apartado 5.7.2, con la única diferencia que las condiciones de anaerobiosis durante la
incubación se lograron de manera distinta.

Transcurrido el tiempo de duración de la fase lag y iniciado la fase log para cada una de las bacterias, se
realizaron de acuerdo al apartado 5.7.2, dos transferencias en las que se utilizó leche de cabra como medio
de propagación. La primera en un volumen total de 100 mL y la segunda en un volumen total de 1 L. En
las transferencias realizadas el inóculo de bacterias correspondió al 5% V/V del volumen total.

iii
El método de preparación de los cultivos madre fue el mismo para las 3 bacterias.
iv
Los medios de cultivo fueron los mismos que se utilizaron para la reactivación y resguardo de las cepas probióticas.

65
 Materiales y métodos

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, los inóculos se almacenaron a 4 ± 1ºC en un refrigerador
Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA.

5.9. Determinación de la concentración de bacterias en los cultivos madre.

Conocer la concentración de bacterias en los cultivos madre fue de gran importancia para decidir en que
relación serían utilizadas las bacterias en el proceso de fermentación para la obtención del producto
probiótico. Adicionalmente, la concentración del cultivo de madre de Bifidobacterium infantis es de
particular interés ya que el mantenimiento de la viabilidad de esta bacteria es esencial para nuestro
objetivo, ya que en el producto final tenía que haber una concentración igual o superior a 1.0x108 UFC de
Bifidobacterium infantis/mL.

La determinación de la concentración de bacterias en los cultivos madre se realizó por conteos de colonias
en placa de acuerdo a las normas: NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. La determinación
consistió en preparar diluciones de los cultivos madre en agua peptonada (Difco ™, Le Pont de Claix,
Francia). De estas diluciones, por triplicado, se colocó 1 mL en las placas petri y se les añadió medio de
cultivo agar estándar método (Bioxon, México, DF). En la incubadora (Sheldon Manufacturing, Inc. A-
141, Cornelius, OR) se colocaron las placas y se incubaron al vacío a 37 ± 1°C por 72 horas. Transcurrido
ese tiempo se seleccionaron las placas con la dilución en la que era posible el conteo de las UFC y se
determinó la concentración de cada uno de los cultivos madre.

5.10. Identificación morfológica de las bacterias en estudio.

Se realizó la identificación de cada una de las bacterias en estudio con el fin de verificar su presencia en los
cultivos madre.

De las placas petri en donde se sembraron los cultivos madre se observaron las morfologías de las colonias
desarrolladas y se hicieron tinciones de Gram de las mismas para observar las características morfológicas
utilizando un microscopio Zeiss con los objetivos 10x, 40x y 100x.

66
 Materiales y métodos

5.11. Obtención de los inóculos de trabajo.

Conociendo la concentración de bacterias en cada uno de los cultivos madre, éstos se fraccionaron de
forma individual en los inóculos de trabajo que se utilizaron en las fermentaciones. Se almacenaron en
refrigeración a 4 ± 1 ºC en un refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA.

Los inóculos de trabajo mixtos se prepararon en el momento de realizar la inoculación para las
fermentaciones.

5.12. Estudio del efecto del cambio de escala en el proceso de obtención de

yogurt natural probiótico utilizando leche de cabra como sustrato.
Se modificó la escala del proceso de fermentación de 500 mL a un volumen de 3.5 L para determinar si se
generan cambios en la concentración de lactosa residual, pH, acidez titulable y viabilidad de Bifidobacterium
infantis de los productos probióticos fermentados que se obtienen.

En el escalamiento del proceso de fermentación de 500 mL a un volumen de 3.5 L se determinaron los

parámetros siguientes: inóculo de trabajo total (porcentaje V/V con respecto al volumen total de fermentación),
relación de las tres bacterias en el inóculo total, concentración inicial de cada una de las bacterias al inicio de la
fermentación, temperatura y tiempo de fermentación.

Uno de los grandes retos en la fermentación fue lograr la obtención de un producto probiótico tipo yogurt
natural utilizando leche de cabra como sustrato, siendo indispensable una concentración igual o mayor a
1.0x108 UFC/mL de Bifidobacterium infantis en el producto (Reid et al, 2001; Shimakawa et al, 2002;
Marteau, 2003); por lo que se establecieron condiciones de anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno durante
el proceso de fermentación, para el mantenimiento y desarrollo de Bifidobacterium infantis, ya que es un tipo
de bacteria anaerobia estricta, a diferencia de Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus que son
bacterias anaerobias facultativas (Robinson et al, 2000).

67
 Materiales y métodos

La temperatura de fermentación se fijó en 42 ± 1°C. Ya que a esta temperatura se puede lograr el

crecimiento de las 3 bacterias de acuerdo a las temperaturas óptimas de crecimiento reportadas para cada
una de ellas; Bifidobacterium infantis 37°C, Lactobacillus delbrueckii 45°C y Streptococcus thermophilus 40°C
(Robinson et al, 2000; Heller, 2001). Así mismo, la temperatura de fermentación establecida se encuentra
dentro del rango de temperatura (40-45°C) utilizado para la elaboración de yogurt natural (Tamine y
Robinson, 1991; Heller, 2001).

Adicionalmente, de la relación y concentración inicial de las 3 bacterias utilizadas en el proceso de

fermentación, depende la formación del gel característica del tipo de producto que se deseaba elaborar
(producto tipo yogurt natural). Por lo que el % V/V de inóculo total de las 3 bacterias y la proporción de
éstas en el mismo, se estableció en función de los parámetros cinéticos de µ y td determinados para cada
una de las bacterias y de la concentración de bacterias de los cultivos madre.

La duración del proceso de fermentación (formación del gel) se trató de optimizar en un estimado de 6
horas como máximo, ya que procesos largos no son considerados rentables a nivel industrial. Siendo un
punto importante ya que se pretende que esta investigación sea una aportación para el desarrollo de
productos de valor agregado en la Planta Industrializadora de Ganado Caprino en el campo experimental
del ITESM en Hualahuises, Nuevo León.

Finalizado el proceso de fermentación fue necesaria la disminución de la temperatura a 4 ± 1°C para

controlar un desarrollo de acidez indeseable y/o excesiva (Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al, 2000).

En la tabla 10 se muestran las variables involucradas en los procesos de fermentación al cambiar de escala.
Las fermentaciones se realizaron bajo condiciones controladas, evaluando las variables que influyen en el
proceso de obtención de un producto probiótico lácteo tipo yogurt utilizando leche de cabra como
sustrato.

68
 Materiales y métodos

Tabla 10. Variables en los procesos de obtención de yogurt probiótico de leche de cabra al cambiar
de escala.
Variables involucradas Niveles
Volumen de fermentación
500 3,500
(mL)
1.- Creación de vacío (20 mm de Hg).
2.- Incorporación de nitrógeno (15 mm
de Hg) al sistema.
3.- Liberación de la mezcla de oxígeno
y nitrógeno residual. Inyección de nitrógeno
Condiciones de 4. Entrada de nitrógeno (5 mm de Hg). directa al reactor a un flujo
anaerobiosis-proceso Las condicionces de anaerobiosis total de 10 mL/min durante 5
en atmósfera de nitrógeno se minutos.
establecieron en el sistema donde se
llevó a cabo la fermentación
(Incubadora Sheldon Manufacturing,
Inc. A-141, Cornelius, OR).
* El nitrógeno utilizado es de grado industrial y fue proveído por Praxair de Monterrey.

Independientemente del volumen de fermentación el proceso de fermentación consistió en calentar leche

de cabra estéril a una temperatura de 42 ± 1°C y colocarla en el fermentador estéril. Se adicionó el inóculo
de bacterias, y se dejó fermentar durante 6 horas a 42 ± 1°C bajo condiciones de anaerobiosis en atmósfera
de nitrógeno. Posteriormente se almacenó el producto en refrigeración a 4 ± 1°C en un refrigerador Fisher
Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA.

Con el objeto de verificar si un cambio de escala afecta las características finales del producto, se
compararon en los productos obtenidos los parámetros siguientes: pH, acidez titulable, lactosa residual y
viabilidad de Bifidobacterium infantis.

Para determinar si existen diferencias significativas entre los productos obtenidos al cambiar de escala, con
el programa estadístico MINITAB® Release 14 se realizó una prueba de hipótesis para dos muestras
utilizando la distribución t para establecer con un nivel de confianza del 95% (p < 0.05) las diferencias de
las medias de los valores del pH, acidez titulable, lactosa residual y viabilidad de Bifidobacterium infantis.

69
 Materiales y métodos

5.13. Determinación de cinéticas durante la fermentación en reactor de 4.0 L.

Durante el proceso de fermentación a escala de 3.5 L se determinaron las cinéticas de variación del pH, de
formación de ácido láctico, de consumo de lactosa y de variación en la viabilidad de Bifidobacterium infantis
ATCC 17930.

Las muestras se recolectaron una vez que la leche de cabra fue inoculada y posteriormente, cada 1.5 horas
hasta la finalización del proceso.

Variación de pH. El descenso del valor del pH durante la fermentación fue determinado
potenciométricamente con un potenciómetro Beckman Φ50 Meter, Texas Instruments, Fullerton, CA.

Velocidad de formación de ácido láctico. Se realizó a través de la determinación de la acidez

titulable en términos de ácido láctico. Esta determinación se llevó a cabo de acuerdo al método 947.05 de
la AOAC (1990).

Consumo de lactosa como sustrato. Se determinó el consumo de lactosa utilizando el kit para
determinación de lactosa/D-galactosa (Boehringer Mannheim/R-Biopharm) de acuerdo al método 984.15
de la AOAC (1990).

Viabilidad de Bifidobacterium infantis. Para determinar la viabilidad de Bifidobacterium infantis se

realizaron conteos en placas según las normas: NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. Los
conteos en placa de las UFC se realizaron de la forma descrita en el apartado 5.9, a excepción del medio de
cultivo utilizado. Para estos conteos en placa se utilizó como medio selectivo para Bifidobacterium infantis el
medio de cultivo MRS agar (Difco™, Le Pont de Claix, Francia) suplementado con 38 µg/mL de
kanamicina (kantrex, Bristol, México, DF) y 0.2 % P/V de cloruro de litio (Fermont, CA) (Lim et al,
1993; Lapierre et al, 1992; Lamoureux et al, 2002).

70
 Materiales y métodos

5.14. Identificación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 a través de PCR y

electroforesis.
Para verificar que Bifidobacterium infantis estaba presente en el producto fermentado se implementó un
método de PCR que amplifica una secuencia en la región 16S rRNA, la cual es específica para esta especie
si se utilizan los oligos BiINF-1 y BiINF-2 (Takahiro et al, 1999).

Los oligos fueron sintetizados por la compañía Alpha DNA (Probiotek, México). Constan de 20 bases cada
uno y sus secuencias son las siguientes:
BiINF-1 5’-TTCCAGTTGATCGCATGGTC-3’
BiINF-2 5’-GGAAACCCCATCTCTGGGAT-3’

Previo a la amplificación por PCR se llevó a cabo una lisis enzimática siguiendo el método establecido por
Solís (2004) y la extracción de ADN utilizando el kit Perfect gDNA Blood Mini Isolation (Eppendorf,
Westbury, NY).

Posterior a la amplificación por PCR se llevó a cabo la técnica de electroforesis para poder visualizar la
banda de interés, que corresponde a un producto de amplificación de 828 pares de bases (pb) (Takahiro et
al, 1999).

5.14.1. Lisis enzimática.

La lisis enzimática consistió en recuperar por centrifugación (3,500 rpm por 10 minutos) las bacterias
contenidas en 10 mL del cultivo de cepa pura de Bifidobacterium infantis (control positivo) y/o del producto
fermentado (muestra). Se utilizó una centrífuga IEC HN-SII, International Equipment Co., MA.

El pellet formado después de centrifugar se resuspendió en 180 µL de buffer de reacción (20 mM Tris-
HCl, pH 8.2; 2 mM EDTA; 1.2 % Tritón X-100) y se le adicionó 20 µL de una solución de lisozima 10
mg/mL en buffer Tris-HCl pH 8.0. Se incubó a 37°C en un baño de agua (Fisher Scientific Isotemp Water
Bath 228, Pittsburgh, PA) por 45 minutos el cultivo de cepa pura y 60 minutos el producto fermentado.

71
 Materiales y métodos

5.14.2. Extracción de ADN.

Una vez se llevó a cabo la lisis enzimática se realizó la extracción de ADN siguiendo el protocolo descrito a
continuación: Tomar 20 µL de proteinasa K reconstituida y colocarlos en un tubo Eppendorf. Adicionar
200 µL de producto digerido y 350 µL de solución G1 (buffer detergente); mezclar en vortex (se utilizó
un Vortex-Genie 2 VWR Scientific, Scientific Industries, Bohemia, NY) a la máxima velocidad por 5
segundos. Incubar a 70 ±1°C por 10 minutos en baño termostatado utilizando la placa calefactora
Thermolyne Mirak™, Iowa, USA; mezclando cada 3 minutos en vortex a la máxima velocidad por 5
segundos.

Posteriormente, centrifugar a la máxima velocidad en una microcentrífuga (Eppendorf, Centrifuge 5415C,

Westbury, NY) durante 3 minutos. Recuperar el sobrenadante y colocarlo en un tubo nuevo. Adicionar
200 µL. de solución G2 (mezcla de solución detergente e isopropanol). Mezclar en vortex por 5 segundos
a la velocidad máxima y transferir a un nuevo tubo ensamblado a una columna que posee un filtro (que
posteriormente se denominará como columna).

Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego centrifugar por 2 minutos a velocidad máxima
en la microcentrífuga. Remover la columna y decantar el líquido que queda en el tubo. Colocar de nuevo la
columna en el mismo tubo y agregar 600 µL de buffer de lavado (buffer salino). Centrifugar por 1 minuto a
la velocidad máxima en la microcentrífuga, remover la columna y decantar el líquido que pasa a través de la
misma. Ensamblar nuevamente la columna al tubo y agregarle 400 µL de buffer de lavado. Centrifugar por
3 minutos a la velocidad máxima en la microcentrífuga, remover la columna y colocarla en un tubo nuevo.
Adicionarle 200 µL de buffer de elución (10 mM Tris-HCl, pH 9.0) e incubar a 70 ±1°C por 3 minutos.
Centrifugar por 1 minuto a la velocidad máxima en la microcentrífuga y desechar la columna. Almacenar el
ADN extraído a -20°C hasta el momento de realizar la amplificación por PCR.

72
 Materiales y métodos

Para verificar la eficiencia del procedimiento de extracción del ADN se midieron las absorbancias a 260 nm
(longitud de onda de absorción del ADN) y 280 nm (longitud de onda de absorción de las proteínas) y se
determinó la relación de las mismas (A260/280 nm). El valor que indica una extracción del 100% del
ADN es de 1.8. Sin embargo, valores entre 1.8 y 2.0 indican una extracción de ADN satisfactoria. Por el
contrario valores entre 1.5 y 1.7 son indicadores de la presencia de proteínas remanentes en las muestras y
valores mayores a 2.0 indican que hay fragmentación del ADN (Manual del kit Perfect gDNA Blood Mini
Isolation, 2000; PrathapKumar y SureshKumar, 2001).

5.14.3. Amplificación de la región 16S rRNA de Bifidobacterium infantis ATCC

17930 por medio de PCR.
Para la amplificación por PCR se llevó a cabo el protocolo reportado por Takahiro et al (1999). En la tabla
11 se muestran los reactivos y concentraciones usados en la reacción de PCR para lograr la amplificación
del gen 16S rARN de Bifidobacterium infantis.

Tabla 11. Reactivos para la amplificación del gen 16S rRNA de Bifidobacterium infantis mediante
PCR.
Concentración inicial Volumen utilizado Concentración final en un
Reactivo
del reactivo (µL) volumen de 25 µL
Agua bidestilada estéril --- * c.b.p. 25 µL
Buffer Tris-HCl pH 8.3 125 mM 2.0 10 mM
Cloruro de potasio 625 mM 2.0 50 mM
Cloruro de magnesio 50 mM 0.75 1.5 mM
Nucleótidos 2.5 mM c/u 2.0 0.2 mM c/u
Oligo BiINF-1 125 picomoles/µL 2.0 250 picomoles
Oligo BiINF-2 125 picomoles/µL 2.0 250 picomoles
ADN templado * * 262 ng
Taq ADN polimerasa 5 U/µL 0.20 1U
* Cantidades variables y dependientes de la concentración de ADN obtenida en las extracciones.
c.b.p.: cuanto basta para.

73
 Materiales y métodos

El programa de amplificación utilizado fue el siguiente: 1 ciclo a una temperatura de 94 °C por 5 minutos,
seguido de 35 ciclos a 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos y 72°C por 30 segundos y finalmente
1 ciclo a 72°C por 5 minutos (Takahiro et al, 1999). Se utilizó un termociclador Thermohybaid 28503,
UK.

5.14.4. Detección de productos de amplificación por medio de electroforesis

en gel de agarosa.
Los productos de amplificación obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para la detección
de la presencia de la secuencia de la región 16S rARN correspondiente a Bifidobacterium infantis. Se preparó
gel de agarosa (Gibco, Gaithersburg, MD) al 2 % en buffer TAE 1X (Tris-Ácido acético glacial-EDTA). El
gel se tiñó con bromuro de etidio (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) antes de que solidificara (1 µL de
bromuro de etidio/21 mL de gel de agarosa).

El gel se colocó en una cámara de electroforesis (Mini Sub DNA Cell, Bio-Rad, USA) y se agregó buffer
TAE 1x hasta cubrir por completo el gel. Se cargaron los pocillos del gel con 6 µL; en el caso de las
muestras se colocó una mezcla compuesta de 5 µL del ADN amplificado y 1 µL de buffer de carga azul
(Bioline, Boston, MA). El marcador de peso molecular que se utilizó fue el Hyper Ladder I (Bioline, Boston,
MA), éste no se mezcla con buffer de carga pues ya contiene colorante.

Una vez que se cargaron los pocillos del gel con las muestras y el marcador de peso molecular, se encendió
la fuente de poder de la cámara de electroforesis y se aplicaron 70 voltios. Se detuvo la electroforesis hasta
que el colorante recorrió aproximadamente tres cuartas partes del gel, en ese momento se desconectó la
fuente de poder y se retiró el gel de la cámara. Se colocó el gel en un transiluminador (UV Amersham
Biosciencies, Hoefer Macro Vue UV-20, San Francisco, CA) acoplado a una cámara digital (Kodak EDAS
290, CA) y a una computadora (Compaq 5500, Houston Texas). Se observó si en la imagen captada del gel
aparecía la banda deseada (a 828 pb) que indicaba la presencia de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 en las
muestras.

74
 Materiales y métodos

5.15. Efecto de la incorporación de la inulina sobre la prevalencia de

Bifidobacterium infantis en el producto fermentado.
Esta evaluación es de gran importancia ya que se pretende observar si la adición de inulina genera cambios
en la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento del producto en refrigeración.

De acuerdo a lo reportado por Roberfroid et al (1999), Coussement (1999) y Roberfroid (2000) el efecto
bifidogénico se observa cuando la inulina se encuentra en un porcentaje P/P o P/V entre 1.5-4.0 respecto
al producto. Se adicionó inulina respetando ese rango, colocándose cerca del límite superior, siendo
adicionada a un 3% P/V.

El efecto de la inulina en el mantenimiento de la viabilidad de Bifidobacterium infantis es importate, ya que si

produce un aumento en la población de Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento del producto en
refrigeración se asegura la dosis de consumo diaria recomendada para obtener los beneficios que se le
adjudican a los productos probióticos.

Para verificar si la adición de inulina afectó la viabilidad de Bifidobacterium infantis en el producto probiótico
fermentado durante su almacenamiento en refrigeración se realizaron 6 fermentaciones utilizando leche de
cabra como sustrato.

Las fermentaciones realizadas se denominaron de la siguiente manera: Fermentación control, fermentación

con inulina I y fermentación con inulina II. Cada una se de las cuales se llevó a cabo por duplicado.

75
 Materiales y métodos

El procedimiento seguido para la fermentación con inulina I fue el siguiente: Se calentó leche de cabra
estéril a una temperatura de 42 ± 1°C, se le añadió 3 % P/V de inulina (MP-Biomedicals, Eschwege,
Alemania) y se agitó bien hasta disolver. Se adicionó el inóculo de bacterias y se fermentó en una
incubadora (Sheldon Manufacturing, Inc. A-141, Cornelius, OR) en condiciones de anaerobiosis con
atmósfera de nitrógeno a 42 ± 1°C durante 6 horas. Posteriormente, se fraccionó el producto probiótico
fermentado en tubos de 50 mL que fueron almacenados en refrigeración a 4 ± 1°C en un refrigerador
Fisher Isotemp 176G-2, Hayward, CA.

La fermentación con inulina I y la fermentación con inulina II difirieron únicamente en el momento de

adición de la inulina; ya que en la fermentación con inulina II se incorporó una vez que transcurrieron las 6
horas de fermentación. En el caso de las fermentaciones control (sin inulina) la fermentación se lleva a cabo
de igual manera pero suprimiendo el paso de incorporación de la inulina.

El porcentaje del inóculo total utilizado y la proporción de las bacterias en el mismo se establecieron a
partir de los resultados del apartado 5.8.

Con el objeto de determinar el efecto de la adición de la inulina al 3% P/V en todos los productos
fermentados se determinó la viabilidad de Bifidobacterium infantis a los 0, 7, 14 y 21 días de almacenamiento
en refrigeración. Para determinar la viabilidad de Bifidobacterium infantis se realizaron conteos en placas
según las normas: NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. Dichos conteos se realizaron como se
describe en el apartado 5.12.

Para determinar si existieron diferencias significativas en la viabilidad de Bifidobacterium infantis en los

productos almacenados en refrigeración, los resultados se analizaron estadísticamente utilizando el
programa MINITAB® Release 14. Se realizó el análisis de varianzas de un diseño de experimento factorial
para determinar la diferencia de medias con un nivel de confianza del 95% (p < 0.05). Los factores
establecidos fueron 2: el tiempo de almacenamiento en refrigeración (definido como semana) y el tipo de
producto (fermentación con inulina I, II y control).
76
 Resultados y Discusión

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Pruebas de plataforma.
Al momento de la recepción de la leche de cabra fue necesario el control de parámetros físico-químicos
como el pH y la acidez titulable para asegurar que la materia prima fuera de buena calidad y detectar
posibles adulteraciones. En la tabla 12 se muestran los resultados que se obtuvieron al realizar estos análisis
como las pruebas de plataforma a la leche de cabra.

Tabla 12. Pruebas de plataforma realizadas a la leche de cabra producida por el hato del CAE del
ITESM en el período comprendido entre abril de 2004 y febrero de 2005.
Determinación Promedio Error estándar
pH 6.59 a 1.38x10-2
Acidez titulable 0.15 % P/V b 1.00x10-4
a: Promedio de 7 determinaciones independientes.
b: Promedio de 6 determinaciones independientes por triplicado.

El pH promedio obtenido para la leche de cabra del CAE del ITESM fue de 6.59, valor que se encuentra
dentro del rango considerado como normal para el pH de la leche de cabra fresca, 6.4 – 6.8 (Walstra et al,
2001). De acuerdo a Keating y Gaona (1986) las variaciones del pH dependen de distintos factores o
variables como son: el estado sanitario de las glándulas mamarias; la cantidad de dióxido de carbono
disuelto en la leche; el desarrollo de microorganismos que al metabolizar la lactosa promueven la
producción de ácido láctico; el desarrollo de microorganismos alcalinizantes; la descomposición bacteriana
y/o la presencia de calostro.

La acidez de la leche de cabra fresca se debe a su contenido de anhídrido carbónico disuelto, caseína,
lactoalbúmina, iones fosfatos y ácido cítrico (Keating y Gaona, 1986).

En muchos casos el valor en la prueba de acidez es relativo, pero su utilidad es innegable para apreciar el
desarrollo microbiano por el desdoblamiento de la lactosa en ácido láctico (Walstra et al, 2001).

77
 Resultados y Discusión

Adicionalmente, el valor de la acidez titulable varía de acuerdo a cambios fisiológicos en el período de

lactancia del animal (la acidez del calostro es mayor y la acidez de la leche al final de la lactancia es menor
con respecto a la leche ‘‘normal’’) y a la presencia de condiciones patológicas como la mastitis, que
provoca una disminución en el valor de este parámetro. De ahí que esta determinación represente valiosa
información sobre la calidad sanitaria de la materia prima (Keating y Gaona, 1986).

El valor promedio de la acidez titulable (en términos de ácido láctico) obtenido para la leche de cabra
utilizado como materia prima fue de 0.15% P/V, el cual se encuentra en el límite inferior del rango de
valores reportado como aceptable para este parámetro: 0.15-0.18 % P/V (Walstra et al, 2001). La
frecuencia de estos valores y la poca variación sugirió que la leche pudiera proceder de cabras que sufrían
de mastitis, pero dicha posibilidad fue descartada al consultar directamente con el productor, quien indicó
el buen estado de salud del hato de cabras del CAE del ITESM.

6.2. Caracterización de la leche de cabra.

Desde el punto de vista nutricional e industrial los componentes de más importancia en la leche de cabra
son: las proteínas, la grasa y la lactosa. Por lo que la caracterización de la leche de cabra se realizó en
función de dichos parámetros. En la tabla 13 se presentan los resultados que se obtuvieron, comparándose
con los valores reportados para leche de cabra y de vaca.

Tabla 13. Caracterización de la leche de cabra producida por el hato del CAE del ITESM en el
período comprendido entre abril de 2004 y febrero de 2005.
Valores medios Valores medios
Error
Parámetro Promedio reportados para reportados para
estándar
leche de cabra * leche de vaca *
Proteínas totales
3.49 a 1.74x10-2 3.5 (2.9 – 5.6) 3.5 (3.3 – 4.0)
(% P/V)
Grasa
5.35 % a 9.17x10-2 4.20 3.70
(% P/V)
Lactosa
4.24 % b 2.18x10-2 4.30 4.90
(% P/V)
* Fuente: FAO, 1990; Brito, 1997.
a: Promedio de 5 determinaciones independientes por triplicado.
b: Promedio de 2 determinaciones independientes por triplicado.

78
 Resultados y Discusión

Las proporciones de estos componentes pueden variar por diversos factores como son: la fase de lactación,
la región, época del año, las condiciones climáticas, la alimentación, la raza y el estado general del animal.
Cualquier cambio en la composición de la leche de cabra es importante ya que afecta las propiedades de los
productos que se elaboran a partir de esta materia prima (Keating y Gaona, 1986; Vicente, 1990; Tamine y
Robinson, 1991).

Proteínas totales. En cuanto al contenido de proteínas totales, el valor obtenido en la caracterización de

la leche de cabra del CAE del ITESM fue de 3.49 % P/V, dicho valor no difiere de manera significativa con
el reportado en la literatura (FAO, 1990; Brito, 1997) para la leche de cabra ni de vaca: 3.5 % P/V.

El papel de las proteínas en la formación del gel que se obtiene en los productos tipo yogurt es esencial ya
que la consistencia y viscosidad del producto es directamente proporcional a la concentración de proteínas
presente (Tamine y Robinson, 1991). De acuerdo a lo reportado en la literatura (FAO, 1990; Brito, 1997) el
límite superior en cuanto al contenido de proteínas totales para la leche de cabra (5.6 % P/V) es 40 % mayor
que el de la leche de vaca (4.0 % P/V), por lo que a nivel industrial en el proceso de elaboración de yogurt la
utilización de leche de cabra que tuviera ese contenido de proteínas representaría una ventaja si se compara
con la leche de vaca, ya que entre mayor es el contenido proteico la formación del gel es más rápida y por
tanto más corto es el proceso de elaboración de este producto.

La formación del gel durante la elaboración del yogurt se debe básicamente a la desestabilización de las
caseínas (que representan el 75% de las proteínas presentes en la leche de cabra y que se encuentran
formando micelas o agregados de submicelas constituidas principalmente por caseínas α y β que están
estabilizadas por la κ-caseína, asociadas por calcio y fosfato de calcio) por la fermentación ácido láctica de la
leche de cabra (Tamine y Robinson, 1991; Scholz, 1997).

79
 Resultados y Discusión

A un pH cercano a 4.6 (punto isoeléctrico de las caseínas) las micelas de caseína de la leche coalescen en
forma de cadenas o conglomerados para formar una estructura tridimensional en la que queda atrapado el
suero. A pH altos (superiores a 5.4) las micelas de caseína mantienen su estado nativo (100-250 nm), pero
cuando alcanza valores de 5.1, las partículas sufren disociaciones parciales formando subpartículas de 30-40
nm, y cuando alcanza un pH del orden de 4.8-4.3 las partículas de caseína forman grandes conglomerados
que atrapan la grasa y el suero, y que son responsables de la viscosidad del producto. Esta matriz es un gel
en donde la fase acuosa constituye la fase discontinua y es el sistema que corresponde al yogurt tradicional
(García et al, 2002; Sodini et al, 2002).

Según reportan García et al (2002) las propiedades físicas del gel en cuanto a viscosidad y textura dependen
en gran medida de la proporción de caseínas y proteínas hidrosolubles; las relaciones óptimas son del orden
de 2.89-3.4 partes de caseínas por 1 parte de las otras proteínas. Por lo que utilizando leche de cabra es
posible obtener un gel de viscosidad y textura deseable ya que la relación de caseínas y proteínas
hidrosolubles es de 3:1. Siendo esto fundamental para uno de los objetivos perseguidos en este trabajo, es
decir, obtener un gel como producto.

Grasa. En cuanto al contenido de grasa, el valor obtenido en la caracterización de la leche de cabra del
CAE del ITESM fue de 5.35 % P/V, dicho valor difiere del reportado en la literatura (FAO, 1990; Brito,
1997) para la leche de cabra (4.20 % P/V) y la leche de vaca (3.70 % P/V).

La leche de cabra utilizada en esta investigación contuvo un alto contenido de grasa. Una leche con un alto
contenido de grasa es susceptible a un mayor grado de lipolisis (hidrólisis enzimática de los triglicéridos)
originando la aparición en la leche de ácidos grasos libres que imparten un sabor rancio. Suele producirse
un aumento en la acidez de la grasa especialmente al final de la lactación. Adicionalmente, al aumentar el
número de lactaciones también se da una mayor susceptibilidad de la leche a la lipolisis (Walstra et al,
2001).

80
 Resultados y Discusión

Por ser la grasa el constituyente que presenta más variación con respecto a los otros elementos de la leche
se sujeta a procesos de control y estandarización para ser industrializada tanto como leche fluida o como
materia prima para la elaboración de derivados lácteos como el yogurt (Keating y Gaona, 1986; Tamine y
Robinson, 1991).

El contenido en grasa del yogurt entero que se comercializa en México, de acuerdo a la norma NMX-F-
444-1983, debe estar en un valor mínimo de 2.5 % P/V pero no hay un límite para un máximo, por lo que
sería conveniente evaluar la necesidad ó no de la estandarización del contenido de grasa en la leche de cabra
para cumplir con las especificaciones mínimas fijadas por esta norma o recomendadas en la literatura de
composición del yogurt (2.5-4.0 % P/V, de acuerdo a Tamine y Robinson, 1991).

Lactosa. El contenido de lactosa en la leche de cabra del CAE del ITESM fue de 4.24 % P/V, dicho valor
difiere del reportado en la literatura (FAO, 1990; Brito, 1997) para la leche de cabra en 0.06 g de lactosa
menos (4.30 % P/V) y para la leche de vaca el valor del contenido de lactosa es mayor por 0.66 g (4.9 %
P/V). Comparando el valor promedio obtenido en la determinación de la concentración de lactosa de la
leche de cabra que se utilizó en la realización de esta investigación con el reportado en la literatura (FAO,
1990; Brito, 1997) para la leche de vaca, se deduce que la leche de cabra tiene un 15.5 % menos de lactosa
que la leche de vaca; representando una ventaja para las personas diabéticas o intolerantes a la lactosa.

La lactosa es el carbohidrato más importante de la leche de cabra; representa cerca de la mitad de los
sólidos no grasos y contribuye al valor energético de la misma (71 kcal/100 mL de leche). La lactosa es el
factor principal en las fermentaciones ácido lácticas, ya que es el sustrato de preferencia para el crecimiento
de bacterias ácido lácticas y bifidobacterias. Adicionalmente, contribuye al valor nutrimental de la leche y
subproductos, está relacionada con la textura, sabor y color de los productos tratados a altas temperaturas
(Keating y Gaona, 1986; Brito, 1997).

81
 Resultados y Discusión

En esta investigación no se varió la composición original de la leche de cabra. Sin embargo, para evitar los
efectos de las variaciones en la misma es necesario estandarizarla con dos propósitos industriales
primordiales:
1) Cumplir con las especificaciones exigidas por las normas legales de composición de productos tipo
yogurt, en cuanto al contenido en grasa (Tamine y Robinson, 1991).
2) Uniformizar la calidad del yogurt, en cuanto a la acidez, la suavidad y la consistencia/viscosidad del gel,
para satisfacer la demanda de los consumidores. Los dos primeros factores pueden controlarse durante la
producción, pero la consistencia/viscosidad en un producto natural (sin aditivos o agentes de textura) está
condicionada por la concentración de proteínas originales en la leche, pudiéndose incrementar su
contenido mediante el enriquecimiento con extracto seco magro, es decir, adición de leche, caseína y
suero de leche, en los tres casos en forma de polvo (Tamine y Robinson, 1991).

6.3. Control microbiológico de la leche de cabra esterilizada.

Cada vez que fue recibida leche de cabra del CAE se esterilizó para garantizar ausencia de microorganismos
que pudieran establecerse en este sustrato rico en nutrientes y poder inocular con los microorganismos de
prueba (Bifidobacterium infantis ATCC 17930, Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 y Streptococcus
thermophilus ATCC BAA250).

La eficacia del tratamiento térmico para esterilizar la leche de cabra se evidenció a través de los resultados
obtenidos en los análisis microbiológicos siguientes:
Estimación del número de coliformes. El análisis para determinar la presencia de coliformes totales
por medio del cálculo del NMP se llevó a cabo por triplicado con leche esterilizada en eventos
independientes. En todos los casos se obtuvieron los resultados que se presentan en la tabla 14.

Tabla 14. Resultados de los análisis microbiológicos para determinar la presencia de coliformes en
leche de cabra esterilizada. Prueba presuntiva.
Serie de 5 tubos con Caldo lactosado Leche de Número de tubos en los Índice del NMP por
campana Durham (mL) cabra (mL) que hubo formación de gas mL
A 20.0 10.0 0 < 0.02
B 10.0 1.0 0 < 0.02
C 10.0 0.1 0 < 0.02

82
 Resultados y Discusión

No fue necesario realizar la prueba confirmativa, ya que en ninguno de los tubos de la prueba presuntiva
hubo formación de gas luego de incubar por 48 ± 2 horas.

De acuerdo a la prueba presuntiva, el índice del NMP por gramo que se obtuvo de la combinación de tubos
positivos (0-0-0) con un límite de confianza del 95 % indica que fue posible encontrar en la leche de cabra
de 0.005 a 0.07 UFC de coliformes totales/mL. De acuerdo a la norma NOM-091-SSA1-1994 el límite
máximo permitido en leche tratada térmicamente es de 20 UFC de coliformes totales/mL, por lo que los
resultados confirmaron la eficiencia del tratamiento térmico.

Determinación de mesófilos aerobios totales. Los resultados que se obtuvieron en el conteo de

mesófilos aerobios totales presentes en leche de cabra después de haberse sometido a tratamiento térmico
se muestran en la tabla 15.Corresponden a tres eventos independientes.

Tabla 15. Resultados de las cuentas en placa de mesófilos aerobios totales en leche de cabra
esterilizada.
Análisis realizado Número de mesófilos aerobios presentes en las muestras (UFC/mL) a
1 120
2 170
3 140
Promedio total de la cantidad de mesófilos aerobios: 143 UFC/mL
a: Promedio de las UFC presentes en la dilución 1:10.

El promedio de mesófilos aerobios totales en las muestras fue de 143 UFC/mL, siendo un indicativo más
de que la esterilización de la leche de cabra fue efectiva, ya que el límite máximo permitido en leche tratada
térmicamente de acuerdo a la norma NOM-091-SSA1-1994 es de 30,000 UFC de mesófilos aerobios
totales/mL.

El tratamiento térmico al que fue sometida la leche de cabra fue suficiente para destruir la mayor parte de
las formas vegetativas de los microorganismos presentes en la leche cruda, aunque algunos
microorganismos esporulados y algunas enzimas termoestables pudieran resistir al mismo. Así mismo, este
tratamiento térmico provoca una disminución de los efectos de competitividad favoreciendo a que la leche
sea un buen medio de cultivo para los microorganismos iniciadores del yogurt (Tamine y Robinson, 1991).

83
 Resultados y Discusión

6.4. Determinación de las cinéticas de crecimiento y de los parámetros µ y td

de las cepas en estudio.
El estado fisiológico de las cepas probióticas utilizadas fue de gran importancia ya que de este estado
depende la actividad de la cepa. En el proceso de elaboración del yogurt probiótico fueron incorporadas en
fase log ya que en fase lag generan tiempos de producción más largos. Durante la fase lag los
microorganismos están adaptándose al medio en el que se encuentran y reconociendo los nutrientes con los
que cuentan, a diferencia de la fase log en donde se da un crecimiento exponencial de los microorganismos
ya que se encuentran adaptados completamente al medio en el que se están desarrollando (Robinson et al,
2000; Heller, 2001).

Las bacterias fueron capaces de reconocer ‘‘su ambiente’’ cada vez con mayor facilidad, ya que siempre se
mantuvieron constantes la cantidad de nutrientes (proveídos por los medios de cultivo utilizados), la
proporción del inóculo y las condiciones de incubación (temperatura y anaerobiosis), las cuales se muestran
en la tabla 16.

Tabla 16. Parámetros seleccionados para el crecimiento de las bacterias en estudio.

Parámetro Características/condiciones
Medio de cultivo utilizado MRS (Difco) y CASOY (Bioxon) *
Concentración del inóculo
5
(% V/V)
Temperatura de incubación (°C) 37 ± 1
Anaerobiosis por la creación de vacío en una incubadora Sheldon
Condiciones de anaerobiosis Manufacturing, Inc. A-141, manteniendo un vacío equivalente a
20 mm de Hg
* Medio MRS para el crecimiento de Bifidobacterium infantis y Lactobacillus delbrueckii y medio CASOY para el
desarrollo de Streptococcus thermophilus.

84
 Resultados y Discusión

Las transferencias en medio de cultivo fresco que fueron necesarias para obtener los valores de µ y td
óptimos con respecto a los iniciales se presentan en la tabla 17.

Tabla 17. Transferencias sucesivas realizadas en medio de cultivo para obtener µ y td óptimos.
Número de transferencias realizadas
Bacteria Volumen final de 20 Volumen final de 100
Total
mL mL
Bifidobacterium infantis
5 7 12
ATCC 17930
Lactobacillus delbrueckii
5 6 11
ATCC 11842
Streptococcus thermophilus
7 19 26
ATCC BAA250

En las figuras 11, 12 y 13 se muestran las cinéticas de crecimiento y los valores de los parámetros µ y td
para cada una de las bacterias. Los valores que aparecen en las gráficas de las cinéticas de crecimiento
corresponden a los valores promedio de las D.O. a 660 nm. Los parámetros µ y td se calcularon a partir de
dichos valores.

85
 Resultados y discusión

Parámetros iniciales para Bifidobacterium infantis ATCC 17930:

(a)
Parámetro Valor
µ 0.11 horas-1
1.73
td 6.56 horas
1.58
1.43
1.28
D.O. a 660 nm.

1.13
0.98
0.83 Fase lag Fase log
0.68
0.53
0.38
0.23
0.08
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Tiempo (horas)

Parámetros para Bifidobacterium infantis ATCC 17930 después de las

(b) transferencias:
Parámetro Valor
µ 0.37 horas-1
1.0 td 1.85 horas

0.8
D.O. a 660 nm.

0.6
Fase log
0.4 Fase lag

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (horas)

Figura 11. Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 al

reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b).

86
 Resultados y Discusión

En la figura 11 se muestran las cinéticas de crecimiento de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 al reactivar
y después de realizar 12 transferencias en medio de cultivo MRS (5 en un volumen total de 20 mL y 7 en
un volumen total de 100 mL). Al reactivar se alcanzó la fase log a las 8 horas de incubación anaeróbica a 37
± 1°C (al vacío) y realizadas las transferencias se optimizó dicha fase a las 1.75 horas, logrando reducir la
duración de la fase lag en un 78.12% a través de las resiembras sucesivas.

Los valores de los parámetros cinéticos determinados inicialmente al reactivar a Bifidobacterium infantis
ATCC 17930 fueron de 0.11 horas-1 para µ y 6.56 horas para td. Después de la adaptación de dicha
bacteria al medio de cultivo MRS, los valores de dichos parámetros se modificaron a 0.37 horas-1 para µ y
1.85 horas para td. Dichas diferencias representan un aumento del 236.36% en la velocidad de específica
de crecimiento y una disminución del 71.80% en el tiempo de duplicación de la bacteria.

En la figura 12 se presentan las cinéticas de crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 y puede
observarse que al reactivar a dicha bacteria la duración de la fase lag fue de 9.75 horas y que la duración de
dicha fase disminuyó a 3.0 horas después de efectuar 11 resiembras sucesivas en medio de cultivo MRS (5
en un volumen total de 20 mL y 6 en un volumen total de 100 mL) con incubación anaeróbica a 37 ± 1°C
(al vacío). A través de las resiembras se logró un acortar en un 69.23% la duración de la fase lag.

Los parámetros cinéticos determinados en la reactivación inicial de Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842
fueron los siguientes: Un valor de 0.26 horas-1 para µ y de 2.69 horas para td. Posteriormente, al realizar
las transferencias en medio de cultivo con el fin de adaptar a la bacteria el valor de µ fue de 0.47 horas-1,
incrementándose la velocidad específica de crecimiento en un 80.77% con respecto al valor inicial; y el
valor de td fue de 1.47 horas, habiendo una disminución del 45.35% con respecto al valor de este
parámetro en la propagación inicial de Lactobacillus delbrueckii.

87
 Resultados y Discusión

Parámetros iniciales para Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842:

(a)
Parámetro Valor
µ 0.26 horas-1
td 2.69 horas
1.80
1.60
1.40
D.O. a 660 nm.

1.20
1.00
0.80 Fase lag Fase log
0.60
0.40
0.20
0.00
0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (horas)

Parámetros para Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 después de las

(b) transferencias:
Parámetro Valor
µ 0.47 horas-1
td 1.47 horas
2.11

1.81

1.51
D.O. a 660 nm.

1.21
Fase
0.91 lag

0.61 Fase log

0.31

0.01
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Tiempo (horas)

Figura 12. Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 al

reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b).

88
 Resultados y Discusión

Parámetros iniciales para Streptococcus thermophilus ATCC BAA250:

(a)
Parámetro Valor
µ 0.10 horas-1
td 7.10 horas
0.76

0.66

0.56
D.O. a 660 nm.

0.46

0.36
Fase lag Fase log
0.26

0.16
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)

Parámetros para Streptococcus thermophilus ATCC BAA250 después de

las transferencias:
(b)
Parámetro Valor
µ 0.27 horas-1
td 2.61 horas

1.00

0.80
D.O. a 660 nm.

0.60

0.40 Fase
lag Fase log
0.20

0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (horas)

Figura 13. Cinética de crecimiento y valores de µ y td de Streptococcus thermophilus ATCC BAA250 al

reactivar (a) y luego de realizar transferencias (b).

89
 Resultados y Discusión

En la figura 13 se muestran las cinéticas de crecimiento de Streptococcus thermophilus ATCC BAA250 al

reactivar y después de realizar 26 transferencias en medio de cultivo CASOY (7 en un volumen total de 20
mL y 19 en un volumen total de 100 mL). Al reactivar se alcanzó la fase log a las 7 horas de incubación a 37
± 1°C al vacío y realizadas las transferencias se alcanzó dicha fase a las 0.75 horas, logrando reducir la
duración de la fase lag en un 89.28% a través de las resiembras sucesivas.

Los valores de los parámetros cinéticos determinados inicialmente al reactivar a Bifidobacterium infantis
ATCC 17930 fueron de 0.10 horas-1 para µ y 7.10 horas para td. Después de la adaptación de dicha
bacteria al medio de cultivo CASOY, los valores de dichos parámetros se modificaron a 0.27 horas-1 para µ
y 2.61 horas para td. Dichas diferencias representan un aumento del 170% en la velocidad de específica de
crecimiento y una disminución del 63.24% en el tiempo de duplicación de la bacteria.

En la tabla 18 se resumen los resultados obtenidos de la determinación de las cinéticas de crecimiento y los
valores de los parámetros µ y td de cada una de las bacterias en estudio después de la adaptación al medio
de cultivo, a través de transferencias sucesivas.

Tabla 18. Resultados de la determinación de las cinéticas de crecimiento de las bacterias en estudio
después de realizar su adaptación al medio de cultivo.
Duración de la fase lag Parámetros cinéticos
Bacteria
(horas) µ (horas-1) td (horas)
Bifidobacterium infantis
1.75 0.37 1.85
ATCC 17930
Lactobacillus delbrueckii
3.00 0.47 1.47
ATCC 11842
Streptococcus thermophilus
0.75 0.27 2.61
ATCC BAA250

90
 Resultados y Discusión

El tiempo de duración de la fase lag fue mayor para Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 (3.0 horas) al
compararla con el de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 (1.75 horas) y el de Streptococcus thermophilus
ATCC BAA250 (0.75 horas). Comparativamente, la duración de la fase lag de Lactobacillus delbrueckii fue
41.67 % mayor que la de Bifidobacterium infantis y 75% mayor que la de Streptococcus thermophilus. De las
tres bacterias en estudio fue Streptococcus thermophilus la que se adaptó más rápido al medio, alcanzando la
fase exponencial en menor tiempo; por el contrario, la que se adaptó más lentamente fue Lactobacillus
delbrueckii.

En cuanto a los valores de la velocidad específica de crecimiento, la mayor velocidad correspondió a

Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 (0.47 horas-1), seguida del valor de Bifidobacterium infantis ATCC
17930 (0.37 horas-1) y por último, la velocidad menor correspondió a Streptococcus thermophilus ATCC
BAA250 (0.27 horas-1). Los valores de la velocidad específica de crecimiento son inversamente
proporcionales a los valores del td para cada una de las bacterias, los valores de que se obtuvieron en la
determinación de este parámetro fueron los siguientes: 1.47 horas para Lactobacillus delbrueckii, 1.85 horas
para Bifidobacterium infantis y 2.65 horas para Streptococcus thermophilus.

La determinación de los parámetros cinéticos µ y td fueron de gran utilidad para determinar la proporción
de cada una de las 3 bacterias en el inóculo mixto de fermentación utilizado para la obtención del producto
probiótico tipo yogurt natural utilizando leche de cabra como sustrato, y para tener tiempo de procesos
constantes y de menor tiempo de duración.

6.5. Determinación de la concentración de bacterias en los cultivos madre.

En la tabla 19 se presentan los resultados que se obtuvieron de los conteos en placa de las UFC en los
cultivos madre después de ser elaborados. El cultivo madre con mayor concentración de células viables fue
el de Bifidobacterium infantis (3.0x108 UFC/mL) y el de menor concentración fue el de Lactobacillus
delbrueckii (4.5x106UFC/mL). La concentración del cultivo madre Streptococcus thermophilus fue de 9.6x107
UFC/mL.

91
 Resultados y Discusión

Tabla 19. Concentración de las UFC/mL en los cultivos madre.

Cultivo madre Promedio de UFC/mL a
Bifidobacterium infantis
3.0x108
ATCC 17930
Lactobacillus delbrueckii
4.5x106
ATCC 11842
Streptococcus thermophilus
9.6x107
ATCC BAA250
a: Promedio de 3 determinaciones por triplicado.

La conservación y manejo adecuado de los cultivos madres es importante ya que éstos deben contener el
máximo número de células viables y deben estar libres de contaminantes como coliformes, mohos y/o
levaduras y particularmente seguir conservando una tasa de reproducción constante (Tamine y Robinson,
1991).

A pesar de que en los cultivos madre se reduce o controla la actividad metabólica de los microorganismos
al ser almacenados en refrigeración a 4 ± 1°C cada semana fue necesario hacer una transferencia de los
cultivos madre para preparar uno nuevo de cada una de las bacterias, procurando así mantenerlos frescos,
con la menor posibilidad de contaminarse y con la disponibilidad necesaria de sustrato, ya que una escasez
de éste afectaría la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación de las bacterias,
ocasionando que la viabilidad de las mismas se viera disminuida. Adicionalmente, cada 5 semanas desde la
preparación inicial de los cultivos madres, éstos se volvían a elaborar utilizando viales de las bacterias como
punto de partida; con el objeto de reducir el riesgo de mutaciones (Tamine y Robinson, 1991).

De acuerdo al apartado 5.11 del capítulo correspondiente a la metodología, a partir de los cultivos madre
se prepararon los inóculos de trabajo (mixtos) al momento de realizar las inoculaciones para las
fermentaciones ácido lácticas utilizando leche de cabra como sustrato.

92
 Resultados y Discusión

6.6. Identificación morfológica de las bacterias en estudio.

De las placas petri en donde se sembraron los cultivos madre se observaron las morfologías de las colonias.
Posteriormente, se tomó una asada de cada una de las bacterias para realizar tinciones de Gram para poder
observar las características morfológicas al microscopio. En la tabla 20 se presentan las características
morfológicas de las bacterias en estudio.

Tabla 20. Características morfológicas de las bacterias utilizadas para la obtención de yogurt
probiótico de leche de cabra.
Bacteria
Característica Bifidobacterium infantis Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus
ATCC 17930 ATCC 11842 ATCC BAA250
Colonias pequeñas de
Morfología de las Colonias diminutas de Colonias cremosas de color
color blanco y/o
colonias color blanco amarillo
ligeramente amarillo

Reacción al Gram Gram (+) Gram (+) Gram (+)

Bastones cortos con Forma ovoide-esférica.

Morfología de las Bastones delgados y
apariencia segmentada. Agrupados en pares o en
bacterias largos
Algunos en forma de V cadenas más largas

Las morfologías observadas coinciden con las reportadas en la bibliografía (Leveau y Bouix, 2000; Robinson
et al, 2000). De acuerdo a Robinson et al (2000) Bifidobacterium infantis puede tener diferentes formas:
bifurcada, en forma en V o de bastones cortos con una pared que fortifica su estructura (a lo cual podría
deberse la apariencia segmentada observada).

93
 Resultados y Discusión

6.7. Condiciones del proceso de fermentación para la obtención de yogurt

natural probiótico utilizando leche de cabra como sustrato.
En la tabla 21 se presentan los parámetros que se establecieron para el proceso de fermentación.

Tabla 21. Condiciones del proceso de fermentación para la elaboración de yogurt natural
probiótico.
Parámetro
Inóculo de trabajo total (% V/V)
Relación de las bacterias en el inóculo total
Concentración inicial de bacterias al inicio de la
fermentación
Proceso para obtener condiciones de anaerobiosis
Especificación
15
1:1:1
Bifidobacterium infantis 1.50x107 UFC
Lactobacillus delbrueckii 2.25x105 UFC
Streptococcus thermophilus 4.80x106 UFC
Fermentación en reactor de 500 mL.
1.- Creación de vacío (20 mm de Hg).
2.- Incorporación de nitrógeno (15 mm de Hg) al
sistema.
3.- Liberación de la mezcla de oxígeno y nitrógeno
residual.
4. Entrada de nitrógeno (5 mm de Hg).
Las condicionces de anaerobiosis total en atmósfera
de nitrógeno se establecieron en el sistema donde se
llevó a cabo la fermentación (Incubadora Sheldon
Manufacturing, Inc. A-141).

Fermentación en reactor de 4.0 L

Inyección de nitrógeno directa al reactor a un flujo
de 10 mL/min durante 5 minutos.
Temperatura de fermentación 42 ± 1°C
Tiempo de fermentación 6 horas o hasta formación de gel

Tomando como referencia que en la elaboración tradicional de yogurt se utiliza Streptococcus thermophilus y
Lactobacillus delbrueckii en una relación 1:1 (Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al, 2000) y que en la
investigación realizada por Solís (2004) se efectuaron fermentaciones ácido lácticas utilizando leche de
cabra como sustrato con las 3 bacterias de estudio en una relación 1:1:1, se respetó esa relación en el
inóculo total de las bacterias que correspondía al 15 % del volumen total de fermentación.

94
 Resultados y Discusión

La decisión de utilizar en fase de crecimiento exponencial a Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y

Streptococcus thermophilus en una relación 1:1:1 en el inóculo de trabajo total, está basada en el hecho de que
al inicio de la fermentación el crecimiento de Streptococcus thermophilus (con una concentración inicial de
4.80x106 UFC) se ve favorecido por el pH inicial del sustrato (6.4-6.8, rango de pH de leche de cabra
fresca) ya que el pH óptimo de crecimiento de estos cocos es entre 6.5-7.0.

A pesar de que la concentración inicial de Lactobacillus delbrueckii (2.25x105 UFC) fue equivalente al 4.49% de
la concentración inicial de Streptococcus thermophilus, de acuerdo a los parámetros cinéticos de µ y td de
Lactobacillus delbrueckii (0.47 horas-1 y 1.47 horas respectivamente) fue posible un desarrollo favorable de
esta bacteria durante la fermentación si se comparan los valores de 0.27 horas-1 y 2.61 horas
correspondientes a µ y td para Streptococcus thermophilus. Adicionalmente, el desarrollo de Lactobacillus
delbrueckii se vio favorecido cuando en fermentación alcanzó valores de pH menores a 5.5, ya que el rango
de pH óptimo de crecimiento de esta bacteria es entre 5.5-5.8. Por lo que los productos metabólicos
liberados por Streptococcus thermophilus (ácido láctico, dióxido de carbono y ácido fórmico) posiblemente
estimularon el crecimiento de Lactobacillus delbrueckii al disminuir el pH del medio.

En cuanto a la concentración inicial de Bifidobacterium infantis (1.50x107 UFC), que es la bacteria probiótica
de mayor interés en este trabajo, ésta fue la concentración fijada como mínima para obtener de la
fermentación un producto probiótico tipo yogurt natural, ya que la dosis mínima diaria para obtener los
beneficios de estas bacterias probióticas debe ser de 1.0x108UFC/mL de acuerdo a lo reportado por Reid
et al (2001), Shimakawa et al (2002) y Marteau (2003). El desarrollo de Bifidobacterium infantis se vio
favorecido por el pH al inicio de la fermentación, ya que su rango de pH óptimo de crecimiento es de 6.5-
7.0.

El establecimiento de condiciones de anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno durante el proceso de

fermentación fue de vital importancia para el mantenimiento y desarrollo de Bifidobacterium infantis, ya que
es una bacteria anaerobia estricta a diferencia de Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus que son
bacterias anaerobias facultativas (Robinson et al, 2000).

95
 Resultados y Discusión

La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de 42 ± 1°C. A ésta se puede lograr el crecimiento de
las 3 bacterias de acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento de cada una de ellas. Coincidiendo con el
rango de temperatura reportado para la elaboración de yogurt natural a nivel industrial, entre los 40-45°C
(Tamine y Robinson, 1991; Robinson et al, 2000; Heller, 2001).

El tiempo de fermentación fue establecido con el objeto de lograr un proceso ‘‘ideal’’ en términos de
tiempo, es decir, en función de la rentabilidad del proceso a nivel industrial; estimando lograr en un turno
de 8 horas de trabajo un lote de producción de yogurt con 6 horas de gelificación.

El almacenamiento a temperatura de 4 ± 1°C inmediatamente después de detener la fermentación es

absolutamente necesario para controlar un desarrollo de acidez indeseable y/o excesiva que podría generar
inestabilidad en el gel causando sinéresis y para el mantenimiento del producto (Tamine y Robinson, 1991; Robinson
et al, 2000).

6.8. Estudio del efecto del cambio de escala en el proceso de obtención de

yogurt natural probiótico utilizando leche de cabra como sustrato.
Las fermentaciones se realizaron bajo las condiciones que se presentaron en el apartado 6.7 de este
capítulo. Se llevaron a cabo dos fermentación de 500 mL y tres fermentaciones de 3.5 L.

Con la finalidad de verificar si un cambio de escala afecta las características finales del producto, se
compararon en los productos de fermentación obtenidos los parámetros siguientes: pH, acidez titulable,
lactosa residual y viabilidad de Bifidobacterium infantis. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 22.

96
 Resultados y Discusión

Tabla 22. Caracterización de productos fermentados obtenidos.

Producto de Fermentación Producto de Fermentación
Parámetro
(500 mL) (3.5 L)
4.60 a 4.73 d
pH
1.41x10-2 * 2.0x10-2 *
Acidez titulable 0.58 b 0.57 e
(% P/V de ácido láctico) 4.08x10-2 * 3.07x10-3 *
3.98 a 3.92 d
Concentración de lactosa (% P/V)
2.97x10-1 * 1x10-4 *
UFC/mL de Bifidobacterium infantis 5.0x108 c 1.3x1010 e
a: Valores promedio de 2 eventos independientes.
b: Valores promedio de determinaciones por duplicado de 2 eventos independientes.
c: Valores promedio de determinaciones por triplicado de 2 eventos independientes.
d: Valores promedio de 3 eventos independientes.
e: Valores promedio de determinaciones por duplicado de 3 eventos independientes.
* Los valores corresponden al error estándar.

Para determinar si existieron diferencias significativas en los productos de fermentación obtenidos, por
efecto del cambio de escala del proceso, utilizando el programa MINITAB® Release 14 se realizó una
prueba de hipótesis para dos muestras utilizando la distribución t para establecer las diferencias de las
medias de los valores de los parámetros con un nivel de confianza del 95% (p<0.05). Los resultados que se
obtuvieron de dicho análisis se muestran en las figuras 14, 15, 16 y 17.

97
 Resultados y Discusión

Descriptive Statistics: pH

Volumen de
Variable fermentación Mean SE Mean StDev Variance
pH 3.5 L. 4.7300 0.0115 0.0200 0.000400
500 mL. 4.6000 0.0100 0.0141 0.000200

Test for Equal Variances

95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations

Sample N Lower StDev Upper

F3.5L. 2 0.0080073 0.0200000 1.27656
F500mL. 3 0.0067558 0.0141421 0.12609

F-Test (normal distribution)

Test statistic = 2.00,
p-value = 0.586

Two-Sample T-Test and CI Interval Plot of pH vs Volumen de fermentación

95% CI for the Mean
4.80

4.75

4.70

4.65
pH

4.60

4.55

4.50

3.5 L. 500 mL.

Difference = mu (1) - mu (2) Volumen de fermentación
Estimate for difference: 0.130000
95% CI for difference: (-0.077337, 0.337337)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 7.97 P-Value = 0.079 DF = 1

Figura 14. Análisis estadístico de la variación del pH en yogurt de leche de cabra al realizar un
cambio de escala en el proceso de fermentación.

El valor promedio de pH de los productos de fermentación de un volumen de 500 mL fue de 4.60 y el de

los productos de fermentación de un volumen de 3.5 L fue de 4.73. La diferencia entre los valores del pH
de los productos es equivalente al 2.14%. Del análisis estadístico que se presenta en la figura 14, con un
intervalo de confianza del 95% se sugiere con un valor p de 0.079 que no existen diferencias significativas
en el valor del pH en los productos finales de fermentación.

98
 Resultados y Discusión

Descriptive Statistics: % de ácido láctico

Volumen de
Variable fermentación N Mean SE Mean StDev Variance
% de ácido 3.5 L. 6 0.56833 0.00307 0.00753 0.0000567
láctico 500 mL. 4 0.58000 0.00408 0.00816 0.0000667

Test for Equal Variances

95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations

Sample N Lower StDev Upper

F500mL. 4 0.0039574 0.0075299 0.0356617
F3.5L. 6 0.0047886 0.0081670 0.0233654

F-Test (normal distribution)

Test statistic = 0.85,
p-value = 0.953

Two-Sample T-Test and CI

Interval Plot of % de ácido láctico vs Volumen de fermentación
95% CI for the Mean
0.595

0.590

0.585
% de ácido láctico

0.580

0.575

0.570

0.565

0.560
3.5 L. 500 mL.
Volumen de fermentación
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: 0.011670
95% CI for difference: (-0.000830, 0.024170)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 2.28 P-Value = 0.062 DF = 6

Figura 15. Análisis estadístico de los valores de acidez titulable en yogurt de leche de cabra al
realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación.

El valor promedio de la acidez titulable (en términos del ácido láctico formado) de los productos de
fermentación de un volumen de 500 mL fue de 0.58 % P/V y el de los productos de fermentación de un
volumen de 3.5 L fue de 0.57 % P/V. La diferencia entre los valores de la acidez titulable de los productos
es equivalente al 1.72%. Al analizar estadísticamente los resultados en función de la acidez titulable con un
intervalo de confianza del 95% hay evidencia con un valor p de 0.062 de que no existen diferencias
significativas en el porcentaje de ácido láctico presente en los productos fermentados elaborados.

99
 Resultados y Discusión

Descriptive Statistics: Concentración de lactosa

Volumen de
Variable fermentación N Mean SE Mean StDev Variance
% de lactosa 3.5 L. 3 3.9200 0.000000000 0.000000000 0.000000000
500 mL. 2 3.980 0.210 0.297 0.0882

Test for Equal Variances

95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations

Sample N Lower StDev Upper

F500mL. 2 0.118903 0.296985 18.9560
F3.5L. 3 0.000000 0.000000 0.0000

F-Test (normal distribution)

Test statistic = 8820000000000.00,
p-value = 0.000

Interval Plot of % de lactosa vs Volumen de fermentación

Two-Sample T-Test and CI 95% CI for the Mean
7

5
% de lactosa

1
3.5 L. 500 mL.
Volumen de fermentación
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: 0.060000
95% CI for difference: (-0.677789, 0.797789)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0.35 P-Value = 0.760
DF = 2

Figura 16. Análisis estadístico de la concentración de lactosa disponible en yogurt de leche de cabra
al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación.

La concentración de lactosa de los productos de fermentación de un volumen de 500 mL fue de 3.98 %

P/V y el de los productos de fermentación de un volumen de 3.5 L fue de 3.92 % P/V. La diferencia entre
las concentraciones de lactosa disponible de los productos es equivalente al 1.51%. Los resultados del
análisis estadístico realizado muestran que con un intervalo de confianza del 95% hay evidencia con un
valor p de 0.76 de que no existen diferencias significativas en la concentración de lactosa disponible en los
productos finales de fermentación.

100
 Resultados y Discusión

Descriptive Statistics: UFC/mL. de Bifidobacterium infantis

Volumen de
Variable fermentación N Mean SE Mean StDev Variance
UFC/mL. 3.5 L. 6 13133333333 1792143347 4389836747 1.92707E+19
500 mL. 6 500000000 44721360 109544512 1.20000E+16

Test for Equal Variances

95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations
Sample N Lower StDev Upper
F3.5L. 6 257391396 438984054 1255909172
F500mL. 6 64229701 109544512 313400807

F-Test (normal distribution)

Test statistic = 16.06,
p-value = 0.008

Two-Sample T-Test and CI

Interval Plot of UFC/mL. vs Volumen de fermentación
95% CI for the Mean
2.0000E+10

1.5000E+10
UFC/mL.

1.0000E+10

5000000000

0
3.5 L. 500 mL.
Volumen de fermentación
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: -12633333333
95% CI for difference: (-17241618604, -8025048062)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -7.05 P-Value = 0.001 DF = 5

Figura 17. Análisis estadístico de las UFC/mL de Bifidobacterium infantis en yogurt de leche de cabra
al realizar un cambio de escala en el proceso de fermentación.

La viabilidad de Bifidobacterium infantis de los productos de fermentación de un volumen de 500 mL fue de

5.0x108UFC/mL y el de los productos de fermentación de un volumen de 3.5 L fue de 1.3x1010UFC/mL.
La diferencia entre las concentraciones de Bifidobacterium infantis de los productos es equivalente al
96.15%. Del análisis estadístico anterior en función de la viabilidad de Bifidobacterium infantis con un
intervalo de confianza del 95% se sugiere con un valor p de 0.001 que existen diferencias significativas en
el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis en los productos finales de fermentación.

101
 Resultados y Discusión

Estas diferencias posiblemente se produjeron por las condiciones de anaerobiosis establecidas en cada una
de los procesos de fermentación, ya que los demás parámetros establecidos para la obtención de yogurt de
cabra probiótico fueron los mismas. Por lo que la inyección de nitrógeno (a un flujo de 10 mL/min
durante 5 minutos) directamente en el reactor fueron favorables para el desarrollo de Bifidobacterium
infantis. Adicionalmente, con estos resultados se verificó la hermeticidad del reactor utilizado.

Los resultados muestran que no hubo diferencias significativas en el pH, acidez titulable y concentración de
lactosa disponible en los productos de fermentación obtenidos a través de fermentaciones bajo las mismas
condiciones pero variando la escala en un 700%. Sin embargo, es de notar que con el cambio de escala del
proceso se vio favorecido el desarrollo de Bifidobacterium infantis. En el producto obtenido de la
fermentación de un volumen de 500 mL la concentración de dicha bacteria fue de 5.0 x 108 UFC/mL y en
el producto elaborado de la fermentación de un volumen de 3.5 L fue de 1.3 x 1010 UFC/mL. En ambos
productos obtenidos a diferente escala se obtuvo una concentración mayor a la que se buscaba obtener
(igual o mayor a 1.0 x 108 UFC/mL de Bifidobacterium infantis), lo cual es favorable si se pretende escalar a
nivel industrial el proceso ya que con los resultados de esta investigación se sientan precedentes de que es
posible la obtención de un producto probiótico tipo yogurt natural utilizando leche de cabra como sustrato
y en particular con este tipo de bacteria.

6.9. Determinación de cinéticas durante la fermentación en reactor de 4.0 L.

Durante el proceso de fermentación a escala de 3.5 L para la obtención del producto probiótico tipo yogurt
natural utilizando leche de cabra como sustrato se determinaron las cinéticas de la variación del pH, la
formación de ácido láctico, de consumo de lactosa y de variación en la viabilidad de Bifidobacterium infantis
ATCC 17930.

6.9.1. Variación del pH.

El valor del pH se ve modificado por el proceso de fermentación, cambiando de un valor inicial de 6.49
hasta 4.73 tras 6 horas de fermentación. Hubo una disminución del pH equivalente al 27.12% del valor
inicial. A las 6 horas de fermentación se obtuvo como producto un gel de textura suave.

102
 Resultados y Discusión

De acuerdo al pH óptimo de crecimiento de cada una de las bacterias responsables de la fermentación ácido
láctica, el pH al inicio de la fermentación (6.49) permitió el desarrollo de Streptococcus thermophilus y
Bifidobacterium infantis ya que los rangos del valor de pH que favorecen su crecimiento son de 6.5-6.8 y 6.5-
7.0, respectivamente. Al cabo de 3 horas de fermentación, el pH disminuyó hasta un valor de 5.64,
creándose las condiciones, en cuanto al pH, para la actividad de Lactobacillus delbrueckii, que tiene un rango
de pH óptimo de crecimiento entre 5.5-5.8. Las variaciones en el valor del pH durante la fermentación se
presentan en la figura 18.

Cambios de pH durante la fermentación:

Tiempo (horas) Valor de pH a Error estándar
0 6.49 3.18x10-4
1.5 6.26 1.41x10-4
3.0 5.64 3.18x10-4
4.5 5.20 5.66x10-4
6.0 4.73 5.66x10-4
6.5 4.62 3.18x10-4
a: Promedio de 3 eventos independientes.

8.00
6.49 6.26
7.00
5.64
6.00 5.20
4.73 4.62
5.00
pH

4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (horas)

Figura 18. Cinética del pH durante la fermentación en un reactor de 4.0 L.

103
 Resultados y Discusión

6.9.2. Formación de ácido láctico.

La formación de ácido láctico en el proceso de fermentación se debe a que las bacterias presentes
metabolizan la lactosa presente en la leche de cabra para cubrir sus demandas energéticas, dando lugar a la
formación de ácido láctico y de otros compuestos de acuerdo a la ruta metabólica seguida por las mismas
(Tamine y Robinson, 1991). En la figura 19 se muestran los resultados de la producción de ácido láctico
durante la fermentación.

Cambios en la acidez titulable (en términos de ácido láctico formado):

Tiempo (horas) % P/V de ácido láctico a Error estándar
0 0.20 6.06x10-5
1.5 0.25 2.69x10-5
3.0 0.40 2.69x10-5
4.5 0.52 2.69x10-5
6.0 0.57 8.25x10-5
6.5 0.61 2.69x10-5
a: Promedio de determinaciones por duplicado de 3 eventos independientes.

0.80

0.70 0.61
0.57
0.60 0.52
% de ácido láctico

0.50
0.40
0.40

0.30 0.25
0.20
0.20

0.10

0.00
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (horas)
Figura 19. Cinética de la formación de ácido láctico durante la fermentación en un reactor de
4.0 L.

104
 Resultados y Discusión

De acuerdo a los resultados, la concentración inicial de ácido láctico fue de 0.20% P/V (valor que
corresponde a la acidez titulable de la leche de cabra luego de ser inoculada), alcanzándose un valor de
0.57% P/V al final de la fermentación. Este valor final de ácido láctico es deseable ya que produce un
descenso del pH a un valor de 4.73, ya que se ha reportado que valores de pH menores a 4.6 pueden
afectar la supervivencia de Bifidobacterium spp. (Lamoureux et al, 2002).

La fermentación está limitada por la presencia del ácido láctico ya que propicia el descenso del pH en la
leche, pudiendo inhibir el crecimiento de los cultivos. La concentración de ácido láctico producido
depende del metabolismo de las bacterias probióticas y del tiempo de fermentación (Leveau y Bouix, 2000,
Solís, 2004).

6.9.3. Consumo de lactosa como sustrato.

La concentración de lactosa se determinó para evidenciar como el desarrollo de las bacterias durante la
fermentación origina cambios en el contenido de este carbohidrato, ya que es el sustrato de preferencia
utilizado por las bacterias.

La concentración inicial de lactosa fue de 4.36% P/V y disminuyó a 3.92% P/V al cabo de 6 horas de
fermentación. La diferencia entre los valores implica una disminución equivalente al 10.09% del contenido
de lactosa inicial. Indicando una hidrólisis escasa comparada con investigaciones sobre fermentaciones
lácteas en las que hay una disminución mínima en promedio del 39.45% de la concentración de lactosa
inicial (Davidson et al, 2000; Lamoureux et al, 2001). Sin embargo, hay disminución en el pH, desarrollo
de acidez y crecimiento de las bacterias evidenciado por la formación del gel obtenido y la concentración
de UFC/mL de Bifidobacterium infantis al final de la fermentación ácido láctica.

De acuerdo a los resultados obtenidos la leche de cabra puede ser considerada un medio rico en nutrientes
que puede ser utilizado por las bacterias implicadas en la investigación según las exigencias de crecimiento
de cada una de ellas. En general, las bacterias ácido lácticas sólo pueden crecer con facilidad en medios
ricos en vitaminas, bases nitrogenadas y fuentes de carbono y nitrógeno (Leveau y Bouix, 2000).

105
 Resultados y Discusión

Los resultados obtenidos de la cinética del consumo de lactosa durante el proceso de fermentación se
presentan en la figura 20.

Cambios en la concentración de lactosa:

Concentración de Error estándar
Tiempo (horas)
lactosa (% P/V) a
0 4.36 1.04x10-2
1.5 4.33 3.81x10-2
3.0 4.20 6.55x10-2
4.5 4.12 4.00x10-2
6.0 3.92 4.50x10-2
a: Promedio de 3 eventos independientes.

5.00
4.50 4.36 4.33 4.20
4.00 4.12
3.92
3.50
% de lactosa

3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0.00 1.50 3.00 4.50 6.00
Tiempo (horas)

Figura 20. Cinética del consumo de lactosa durante la fermentación en un reactor de 4.0 L.

Para corroborar que la determinación de lactosa utilizando el kit Lactose/D-galactose UV-method, Boehringer
Mannheim/R-Biopharm (método 984.15 de la AOAC, 1990) fue correcta y que las mediciones no se
vieron afectadas por ningún factor, sería recomendable la utilización de un método alternativo como la
cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC por sus siglas en inglés) con detector de índice de
refracción, ya que es un método de separación en el que podría determinarse la presencia de lactosa y sus
dímeros (galactosa y glucosa) en los productos de fermentación.

106
 Resultados y Discusión

6.9.4. Desarrollo de UFC de Bifidobacterium infantis durante la fermentación.

El desarrollo de Bifidobacterium infantis durante el proceso de fermentación fue un punto crucial, ya que del
número de UFC/mL de dicha bacteria al final del proceso depende si el producto obtenido se considera o
no como probiótico. Se buscaba obtener una concentración igual o mayor a 1.0 x 108 UFC/mL de
Bifidobacterium infantis lo cual se logró exitosamente con la creación de las condiciones de anaerobiosis por
medio de la inyección directa de nitrógeno al reactor (10mL/min durante 5 minutos) y la temperatura de
42 ± 1°C que se mantuvo durante el proceso de fermentación. Los resultados de la viabilidad de
Bifidobacterium infantis se presentan en la figura 21.

Cambios en el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis durante la fermentación:

Tiempo (horas) UFC/mL a
0 3.0 x108
1.5 1.4 x109
3.0 6.0 x109
4.5 9.4 x109
6.0 1.3 x1010
a: Promedio de determinaciones por duplicado de 3 eventos independientes.

1.5E+10 1.3E+10
UFC/mL. de Bifidobacterium infantis

9.4E+09
1.0E+10

6.0E+09

5.0E+09

1.4E+09
3.0E+08
1.0E+07
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (horas)

Figura 21. Cinética de la viabilidad de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 durante la fermentación
en un reactor de 4.0 L.

107
 Resultados y Discusión

La concentración inicial de Bifidobacterium infantis fue de 3.0 x 108 UFC/mL, alcanzándose una
concentración de 1.3 x 1010 UFC/mL al final de la fermentación (6 horas). Al cabo de 1.5 horas de
fermentación la concentración de Bifidobacterium infantis alcanzó un valor de 1.4 x 109 UFC/mL, es decir,
que la concentración se incrementó en un orden de magnitud durante ese tiempo. En las siguientes horas 3,
el crecimiento no fue tan pronunciado, llegando a tener a las 4.5 horas de fermentación una concentración
de Bifidobacterium infantis igual a 9.4 x 109 UFC/mL.

El crecimiento de Bifidobacterium infantis al inicio de la fermentación (primeras 1.5 horas) se vio favorecido
por el pH del medio durante ese tiempo (6.49-6.26) ya que el rango de valores de pH óptimo para el
crecimiento de esta bacteria es 7.0-6.5 (Robinson et al, 2000; Heller, 2001). La concentración se mantuvo
en el mismo orden de magnitud durante las siguientes 3 horas, en ese perídodo el pH del medio osciló
entre 6.26-5.20. Así mismo, es de notar que a pesar de que a las 6 horas de fermentación el pH había
descendido a un valor de 4.73, Bifidobacterium infantis alcanzó una concentración mayor en dos órdenes de
magnitud con respecto a la inicial.

6.10. Identificación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 a través de PCR y

electroforesis.
6.10.1. Extracción del ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930.
La extracción del ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 se llevó a cabo utilizando el kit Perfect gDNA
Blood Mini Isolation (Eppendorf). El protocolo fue modificado en todos los tiempos de centrifugación (2
minutos adicionales en cada paso) ya que las columnas con filtro utilizadas en los tubos Eppendorf se
obstruían en las etapas de lavado y elución, con lo que se corría el riesgo de obtener bajos rendimientos de
la extracción que serían evidenciados a través de la relación de las absorbancias a 260 y 280 nm (A260/280
nm).

108
 Resultados y Discusión

El promedio de la relación de A260/280 nm para las muestras de ADN extraído de la cepa pura de
Bifidobacterium infantis ATCC 17930 fue de 1.9385, con un error estándar de 2.76x10-2. Y en el caso de las
muestras de ADN de dicha bacteria presente en el producto probiótico elaborado (obtenido de las
fermentaciones de 3.5 L) el promedio fue de 1.9250, con un error estándar de 7.74x10-4. Los promedios
de la relación de A260/280 nm difieren entre sí en un 0.74%. En la tabla 23 se resumen los resultados que
se obtuvieron en las extracciones de ADN de cepa pura de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 (control
positivo) y de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 presente en el yogurt probiótico elaborado.

Tabla 23. Absorbancias de las muestras de extracción de ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930
utilizando el kit Perfect gDNA Blood Mini Isolation.
Muestras de ADN
Bifidobacterium infantis ATCC 17930
Cepa pura de Bifidobacterium infantis
presente en el producto probiótico
ATCC 17930 a
elaborado a
A B C D E F
Absorbancia a
2.8093 2.6204 2.4818 1.4924 1.4255 2.3383
260 nm
Absorbancia a
1.5865 1.3306 1.1958 0.7790 0.7294 1.2274
280 nm
A260/280 nm 1.7707 1.9694 2.0754 1.9157 1.9543 1.9051
a: Los valores corresponden al resultado de extracciones de ADN de muestras independientes.

6.10.2. Amplificación de la región 16S rRNA de Bifidobacterium infantis ATCC

17930 por medio de PCR.
Para la amplificación por PCR se utilizó la muestra denominada como B para la cepa pura (control positivo)
ya que la relación A260/280 nm es la más cercana al promedio obtenido en las extracciones del ADN. Y de
las muestras de ADN obtenidas a partir del producto probiótico se amplificaron las 3 (denominadas como
D, E y F).

El protocolo seguido estrictamente para la amplificación fue el reportado por Takahiro et al (1999). Sin
embargo, en su protocolo no aparece la concentración de ADN a utilizar en la mezcla de reacción PCR,
por lo que se decidió utilizar una concentración de 262 ng de ADN.

109
 Resultados y Discusión

En base a la relación reportada por Sambrook y Maniatis (1989) de que 1 unidad de densidad óptica a 260
nm es equivalente a 50 µg/mL de ADN de doble hélice en la tabla 24 se presentan las cantidades utilizadas
de cada muestra en las mezclas de reacción de PCR.

Tabla 24. Cantidades de muestra de ADN de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 utilizadas para
tener una concentración final de 262 ng de dicho componente en las mezclas de reacción de PCR.
Cantidad de agua
Concentración de Cantidad de muestra de
Absorbancia bidestilada estéril para
Muestra ADN extraído ADN utilizada en la
a 260 nm completar el volumen total
(µg/mL) mezcla de PCR (µL)
de la mezcla (µL) a
B 2.6204 131.02 2.00 12.05
D 1.4924 74.62 3.50 10.55
E 1.4255 71.28 3.65 10.40
F 2.3383 116.92 2.25 11.80
a: Volumen total de la mezcla de reacción de PCR 25 µL.

6.10.3. Detección de productos de amplificación por medio de electroforesis

en gel de agarosa.
Amplificadas las muestras se llevó a cabo la electroforesis, para verificar la presencia de Bifidobacterium
infantis ATCC 17930 por medio del producto de 828 pb que se obtiene con los primers BiINF-1 y BiINF-2
que son específicos para la amplificación de la región 16S rRNA para esta especie de Bifidobacterium según
reportaron Takahiro et al (1999).

El marcador de peso molecular utilizado en la detección de los productos de amplificación fue el Hyper
Ladder I (Bioline), que consta de 14 bandas que van desde 200 pb a 10 kilobases (kb); el patrón de las
bandas de dicho marcador se muestra en la figura 22. Este marcador es idóneo para esta investigación
porque contiene un fragmento (800 pb) que se aproxima al esperado (828 pb).

110
 Resultados y Discusión

Características de Hyper Ladder I:

- 14 bandas características que van
desde 200 pb a 10kb.

- Cada banda contiene una cantidad

exacta de dsADN, lo que permite
una cuantificación exacta. Cada 5µL
contienen 720 ng de ADN.

- Las bandas de 10kb y 1kb poseen

mayor intensidad para facilitar la
orientación e identificación.

* La fotografía corresponde a un gel

de agarosa 1% en el que se
cargaron 5µL del marcador.

Fuente: http/www.bioline.com

Figura 22. Especificaciones y patrón de las bandas del marcador de peso molecular Hyper Ladder I
utilizado para la identificación de Bifidobacterium infantis.

En las figuras 23 y 24 se muestran las fotografías de los resultados obtenidos en las electroforesis
efectuadas. En la figura 23 se observa en los carriles B (que corresponden a muestras de ADN de cepa pura
de Bifidobacterium infantis ATCC 17930) la banda característica de 828 pb que corrobora la presencia de esta
bacteria, por lo que se evidencia el éxito de la amplificación de la secuencia del gen 16S rRNA mediante el
método de PCR implementado. Los carriles designados como X son controles negativos que son útiles
como blanco control de los reactivos. El carril designado como M corresponde al marcador de peso
molecular Hyper Ladder I (Bioline).

111
 Resultados y Discusión

BBBXXM

2500 pb
2000 pb
1500 pb
1000 pb
800 pb
600 pb
400 pb
200 pb

Figura 23. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de la amplificación de la secuencia 16S rRNA de

Bifidobacterium infantis ATCC 17930. Carriles B: cepa pura; carriles X: control negativo; carril M:
marcador de peso molecular.

En la figura 24 aparecen los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en donde se corrieron las
muestras que correspondían al ADN extraído de los productos probióticos elaborados (obtenido de las
fermentaciones de 3.5 L) denominadas como D y E. El carril M corresponde al marcador de peso
molecular, los carriles X a los controles negativos (sin ADN) y los carriles M a los controles positivos (cepa
pura de Bifidobacterium infantis ATCC 17930). En dicha figura puede observarse la banda característica de
828 pb que hace posible la identificación de Bifidobacterium infantis en las muestras del producto probiótico
obtenido, con lo cual se logra la finalidad de la implementación de este método molecular.

112
 Resultados y Discusión

EEDDBB XXM

2500 pb
2000 pb
1500 pb

1000 pb
800 pb
600 pb

400 pb

200 pb

Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de la amplificación de la secuencia 16S rRNA de

Bifidobacterium infantis ATCC 17930. Carriles D y E: muestras de productos probióticos elaborados;
carriles B: cepa pura (control positivo); carriles X: control negativo; carril M: marcador de peso
molecular.

6.11. Efecto de la incorporación de la inulina sobre la prevalencia de

Bifidobacterium infantis en el producto fermentado.
Esta evaluación fue de gran importancia para determinar si la adición de inulina al 3% P/V generaba
cambios en la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento del yogurt de leche de cabra
en refrigeración. En la figura 25 se presentan las variaciones en el número de UFC/mL de Bifidobacterium
infantis en los productos almacenados en refrigeración por 0, 7, 14 y 21 días (semana 0, 1, 2 y 3
respectivamente).

113
 Resultados y Discusión

Variaciones en el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis durante la evaluación:

Tiempo de UFC/mL a
almacenamiento en Producto Producto Producto
refrigeración ‘‘Fermentación ‘‘Fermentación ‘‘Fermentación
(semanas) control’’ con inulina I’’ con inulina II’’
0 5.0 x108 4.2 x108 5.2 x108
8 8
1 5.0 x 10 5.2 x10 6.0 x108
2 1.0 x 1010 1.0 x1010 5.9 x109
9 9
3 9.8 x10 9.1 x10 1.2 x1010
a: Promedio de dos determinaciones por triplicado.
UFC/mL. de Bifidobacterium infantis

1.5E+10

1.0E+10

5.1E+09

1.0E+08
0 1 2 3
Tiempo (semanas)
Fermentación control Fermentación con inulina I Fermentación con inulina II

Figura 25. Cinética de la viabilidad de Bifidobacterium infantis durante el estudio del efecto de la
adición de inulina como prebiótico en los productos fermentados.

En el producto ‘‘fermentación control’’ a los 7 días de almacenamiento en refrigeración (semana 1) no

existieron cambios en la viabilidad de Bifidobacterium infantis con respecto a la semana 0, la concentración se
mantuvo en 5.0 x108 UFC/mL. De la semana 1 a la 2, en el producto en almacenamiento hubo un
aumento de dos ordenes magnitud, alcanzándose una concentración de Bifidobacterium infantis de 1.0 x1010
UFC/mL. En la semana 3 hubo descenso con respecto a la semana 2, el número de UFC/mL de
Bifidobacterium infantis disminuyó a 9.8 x109.

114
 Resultados y Discusión

En el producto ‘‘fermentación con inulina I’’ en la semana 0 la viabilidad de Bifidobacterium infantis fue de
5.2 x108 UFC/mL. A los 7 días de almacenamiento en refrigeración (semana 1) la viabilidad aumentó a 6.0
x108 UFC/mL, es decir, que hubo un incremento del 23.81% con respecto a la semana 0. De la semana 1
a la 2, en el producto en almacenamiento hubo un aumento de dos ordenes magnitud, alcanzándose una
concentración de Bifidobacterium infantis de 1.0 x1010 UFC/mL. En la semana 3 hubo descenso con respecto
a la semana 2, ya que el número de UFC/ mL de Bifidobacterium infantis fue de 9.1 x109.

En el producto ‘‘fermentación con inulina II’’ en la semana 0 la viabilidad de Bifidobacterium infantis fue de
4.2 x108 UFC/mL. A los 7 días de almacenamiento en refrigeración (semana 1) la viabilidad aumentó a
5.2x108 UFC/mL, que representa un incremento del 15.38% con respecto a la semana 0. De la semana 1 a
la 2, en el producto en almacenamiento la viabilidad varió en un orden de magnitud, alcanzándose una
concentración de Bifidobacterium infantis de 5.9 x109 UFC/mL. En el producto en almacenamiento la
viabilidad siguió en aumento, ya que en la semana 3 el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis
alcanzó un valor de 1.2 x1010.

Con los resultados obtenidos en la evaluación se realizó el análisis estadístico que se muestra en la figura
26. Con un intervalo de confianza del 95% se sugiere con un valor p de 0.000 que el número de UFC/mL
de Bifidobacterium infantis varía de manera significativa de una semana a otra en todos los productos
(control, con inulina I y II) durante su almacenamiento en refrigeración. Las variaciones más pronunciadas
se dan en todos los casos entre las dos primeras semanas (0 y 1) y las dos últimas (2 y 3).

Adicionalmente, con un intervalo de confianza del 95% y un valor p de 0.587 se evidencia que no existen
variaciones significativas en el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis durante el almacenamiento en
refrigeración de los productos fermentados (control, con inulina I y II) por la adición de inulina al 3% P/V.
Este resultado puede deducirse de manera visual al observar el gráfico de la figura 27 que corresponde a
los intervalos de confianza del 95% para las medias del número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis, ya
que en las diferentes semanas los intervalos correspondientes se traslapan, indicando que no hay diferencias
entre ellas.

115
 Resultados y Discusión

A pesar de que durante los 21 días que comprendió la evaluación no existieron diferencias significativas en
el número de UFC/mL de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 por efecto de la adición de inulina, es de
notar que este prebiótico se encontraba presente en la matriz del producto y por ser una fibra no digerible
podría ejercer su efecto en la colonización de bifidobacterias en el intestino del hospedero tras el consumo
del producto y adicionalmente gozar del valor nutracéutico de este fructano (Niness, 1999; Coussement,
1999; Davidson y Maki, 1999 ; Roberfroid, 2000; Roller et al, 2004).

General Linear Model: UFC/mL. versus Semana, Tratamiento

Factor Type Levels Values

Semana fixed 4 0, 1, 2, 3
Tipo de fixed 3 Cont, FI1, FI2
producto

Analysis of Variance for UFC/mL., using Adjusted SS for Tests

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P

Semana 3 1.43893E+21 1.43893E+21 4.79643E+20 151.69 0.000
Tipo de
producto 2 3.40361E+18 3.40361E+18 1.70181E+18 0.54 0.587
Error 60 1.89723E+20 1.89723E+20 3.16206E+18
Total 71 1.72296E+21

S = 1778216960 R-Sq = 88.99% R-Sq(adj) = 86.97%

IC del 95% para la media

1.8000E+10
UFC/mL. de Bifidobacterium infantis

1.6000E+10

1.4000E+10

1.2000E+10

1.0000E+10

8000000000

6000000000

4000000000

1000000000
100000000

Semana 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
Tratamiento Control FI I FI II

Figura 26. Análisis estadístico de los resultados del estudio del efecto de la adición de inulina sobre
la prevalencia de Bifidobacterium infantis en el yogurt de leche de cabra.

116
 Resultados y Discusión

Tanto en evaluaciones in vivo como in vitro el efecto bifidogénico se ha observado cuando la inulina se
encuentra en una concentración porcentual P/P o P/V entre 1.5-4.0 en el producto (Roberfroid et al,
1998; Coussement, 1999; Roberfroid, 2000). Sin embargo, con los resultados obtenidos en la evaluación
no se evidenció que la incorporación de la inulina en un 3% P/V produjera un aumento en la viabilidad de
Bifidobacterium infantis ATCC 17930 durante el almacenamiento refrigerado de los productos inulina I y II al
compararse con los productos control (sin inulina). Esto sugiere que en los productos existía lactosa
residual y este carbohidrato seguía siendo el sustrato de preferencia para Bifidobacterium infantis, ya que el
metabolismo de la lactosa, que es un dímero, es más fácil si se compara con un oligosacárido como la
inulina, por lo hasta que se agote la lactosa en la matriz del producto dicha bacteria utilizará a la inulina
como sustrato.

117
 Conclusiones

7. CONCLUSIONES

1. Un cambio de escala en el proceso de fermentación (de 500 mL a 3.5 L) no afectó las características del
yogurt natural obtenido con Bifidobacterium infantis ATCC 17930, Streptococcus thermophilus ATCC BAA250
y Lactobacillus delbrueckii ATCC11842 utilizando leche de cabra como sustrato.

2. Utilizando leche de cabra como sustrato y bajo las condiciones de anaerobiosis en atmósfera de
nitrógeno se logró alcanzar una concentración de 1.3x1010 UFC/mL de Bifidobacterium infantis por lo que el
yogurt natural obtenido utilizando un reactor de 4.0 L es considerado probiótico.

3.- Las condiciones óptimas del proceso de fermentación ácido láctica utilizando leche de cabra como
sustrato en el reactor de 4.0 L fueron las siguientes:
ƒ Porcentaje del inóculo de fermentación: 15% del volumen total de fermentación, en donde las
bacterias utilizadas se encuentran en una relación 1:1:1.
ƒ Concentración de las bacterias al inicio de la fermentación (en un volumen total de fermentación
de 3.5 L):
Bifidobacterium infantis 1.50x107 UFC
Lactobacillus delbrueckii 2.25x105 UFC
Streptococcus thermophilus 4.80x106 UFC
ƒ Temperatura de fermentación: 42 ± 1°C
ƒ Fermentación: En baño termostatado en condiciones de anaerobiosis creadas por la inyección
directa de nitrógeno en el reactor durante 5 minutos a un flujo de 10 mL/min.
ƒ Tiempo de fermentación: 6 horas.
ƒ Almacenamiento: 4 ± 1°C

4. El método de PCR implementado fue sensible para la identificación de Bifidobacterium infantis ATCC
17930 en el producto probiótico fermentado que se elaboró.

118
 Conclusiones

5. No se evidenció que la incorporación de la inulina al 3 % P/V ejerza un aumento en la viabilidad de

Bifidobacterium infantis ATCC 17930 durante el almacenamiento en refrigeración del producto probiótico
fermentado.

119
 Recomendaciones

8. RECOMENDACIONES

1.- Se sugiere modificar el diseño del reactor ya que el utilizado dificultaba la toma de muestras y con el
movimiento que se generaba puede verse afectaba la estabilidad del gel que se forma provocando sinéresis
en el producto.

2.- Evaluar la factibilidad de escalar a nivel industrial las condiciones del proceso de fermentación
propuesto, con el fin de producir un producto de valor agregado en la Planta Industrializadora de Ganado
Caprino en Hualahuises, Nuevo León.

3.- Realizar un estudio in vivo para determinar si tras el consumo del producto probiótico se obtiene el
efecto bifidogénico de la inulina al ser utilizada 3% P/V.

4.- Con el fin de obtener un yogurt probiótico batido se recomienda la realización de un estudio para
determinar el efecto de la agitación en el desarrollo de Bifidobacterium infantis durante el proceso de
fermentación.

5.- La evaluación sensorial del producto probiótico fermentado sería deseable con el fin de conocer la
aceptación/rechazo de las características obtenidas.

120
 Resumen

9. RESUMEN

Los probióticos se definen como microorganismos vivos, que al ser ingeridos son capaces de producir un
efecto fisiológico benéfico al hospedero. La mayoría de estos microorganismos pertenecen al grupo de
bacterias ácido lácticas y son utilizadas por la industria alimentaria para la elaboración de productos
fermentados. Las bacterias lácticas comúnmente utilizadas en este tipo de productos incluyen algunas
especies de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus.

En la elaboración de productos que contienen bacterias probióticas es importante tomar en cuenta dos
aspectos que representan grandes desafíos tecnológicos: la viabilidad y la estabilidad de los probióticos. Es
en el mantenimiento de la viabilidad de estos microorganismos que los prebióticos juegan un papel de gran
importancia, ya que éstos producen un efecto en el hospedero al estimular el crecimiento selectivo y/o
actividad metabólica de un número limitado de bacterias nativas en el colón.

En su mayoría los productos lácteos fermentados utilizan como sustrato leche de vaca. De acuerdo a las
fuentes de información consultadas, hasta el momento no existe en el mercado mexicano un producto
probiótico lácteo fermentado en el que se utilice leche de otra procedencia. Siendo necesario conocer la
factibilidad de uso de otros sustratos para este fin.

La leche de cabra constituye una alternativa a la leche de vaca en la alimentación humana. Se ha pensado en
la leche de cabra como un sustrato idóneo para la elaboración de productos probióticos lácteos
fermentados, aprovechando así los recursos con los que se cuentan en la región.

Sin embargo, la producción caprina se encuentra centralizada en dos productos: carne y leche. Siendo
necesaria la propuesta de iniciativas que tengan como fin, la elaboración de productos de valor agregado.
Por lo que con esta investigación se busca dar una aportación al sector caprino a través de la Planta
Industrializadora de Ganado Caprino ubicada en el campo experimental del ITESM en Hualauises, Nuevo
León, con la transferencia de tecnología acerca de la obtención de un producto probiótico fermentado.

121
 Resumen

En la presente investigación se estudió el efecto de un cambio de escala del proceso de fermentación en la

obtención de yogurt natural con Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus
utilizando leche de cabra como sustrato. En el sistema de fermentación que se utilizó, las condiciones de
anaerobiosis necesarias para el desarrollo de Bifidobacterim infantis fueron creadas mediante la incorporación
de nitrógeno, a diferencia de la investigación realizada por Solís (2004) en la cual se utilizó dióxido de
carbono para lograr dichas condiciones; este cambio es vital si se pretende que el proceso de fermentación
propuesto sea escalable a nivel industrial.

Adicionalmente, se determinó si la incorporación de inulina al 3% P/V como prebiótico, influye en la

viabilidad de Bifidobacterium infantis en el yogurt de leche de cabra elaborado durante su almacenamiento en
refrigeración.

La estrategia experimental consistió en la caracterización y tratamiento térmico de la leche de cabra

proveniente del hato del CAE del ITESM; reactivación de las cepas objeto de estudio, optimización de los
parámetros µ y td de las mismas; preparación de cultivos madre y determinación de la concentración de
células viables en ellos; obtención de los inóculos de trabajo; selección de las condiciones óptimas y
escalamiento del proceso de fermentación de un volumen de 500 mL a 3.5 L; determinación de las cinéticas
de variación del pH, formación de ácido láctico, consumo de sustrato y viabilidad de Bifidobacterium infantis durante la
fermentación en un reactor de 4.0 L y en la evaluación para determinar si la adición de inulina afectaba la
viabilidad de Bifidobacterium infantis en el producto probiótico fermentado durante su almacenamiento en
refrigeración.

Para determinar el potencial probiótico del producto obtenido se detectó la presencia de Bifidobacterium infantis a
través de la implementación de una técnica de PCR utilizando la secuencia 16S rRNA de dicha bacteria y posterior
electroforesis; también se determinó la concentración de células viables de Bifidobacterium infantis a través de conteos
en placa utilizando como medio selectivo el medio de cultivo MRS suplementado con kanamicina y cloruro de litio.

122
 Resumen

Con los resultados obtenidos se evidenció que el aumento en la escala del proceso de fermentación
favorece el desarrollo de Bifidobacterium infantis. Independientemente de la escala, el producto obtenido de
la fermentación es considerado probiótico ya que con el proceso de fermentación optimizado se logró una
concentración arriba de 1.0x108 UFC/mL de Bifidobacterium infantis. Así mismo, la identificación de este
microorganismo en el producto obtenido fue posible a través del método de amplificación por PCR
implementado.

En el estudio de la adición de la inulina como prebiótico, la incorporación de ésta al 3 % P/V no ejerció un

aumento en la viabilidad de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 durante el almacenamiento en
refrigeración del yogurt de leche de cabra que se elaboró.

123
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