Direct Sampling Mass Spectrometry for Clinical Analysis

Espectrometría de masas de muestreo directo para análisis clínicos

Fan Pua,c, Spencer Chianga,b, Dr. Wenpeng Zhang*,c, and Prof. Zheng Ouyang*,a,b,c

a. State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments, Department of Precision
Instrument, Tsinghua University, Beijing, 100084, China.

b. Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA.

c. Department of Chemistry, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA.

Abstract

La espectrometría de masas de muestreo directo (EM) ha avanzado agresivamente, mostrando un inmenso

potencial en la traducción de la EM en el campo clínico. A diferencia del análisis tradicional de EM que
implicaba una preparación extensa de la muestra y una separación cromatográfica, se dispuso de
procedimientos rápidos y sencillos con un pretratamiento o purificación mínima de la muestra con muestreo
directo. Se ofrece una visión general de la evolución en este campo, incluidos algunos métodos representativos
de ionización ambiental y extracción rápida. Se enfatizan las aplicaciones cuantitativas de estos métodos y se
resalta su eficacia desde un aspecto clínico; también se discuten las aplicaciones no cuantitativas en el análisis
clínico. Esta revisión también discute la integración de la EM de muestreo directo con espectrómetros de masas
en miniatura y su perspectiva futura como una herramienta clínica emergente para el análisis del punto de
atención.

Graphical Abstract

Direct sampling mass spectrometry enables high-performance clinical analysis, such as imaging, drug
monitoring and point-of-care testing.

*
Corresponding Authors: Dr. Wenpeng Zhang, zhan2360@purdue.edu, Department of Chemistry, Purdue
University, West Lafayette, IN, 47906, USA, Prof. Zheng Ouyang, ouyang@tsinghua.edu.cn, Department of
Precision Instrument, Tsinghua University, Beijing, 100084, China.

Conflicts of interest

Z. O. is the founder of PURSPEC Technologies Inc.

Introduction

La espectrometría de masas (EM) es una tecnología analítica indispensable para la industria sanitaria moderna.
Debido a su alta sensibilidad y selectividad, la esclerosis múltiple es excepcionalmente adecuada para
evaluaciones cuantitativas. La utilización de la EM junto con la cromatografía, especialmente la cromatografía
líquida (CL), ha sido el estándar de oro para el análisis cuantitativo de diversos compuestos. El uso de la
cromatografía para el análisis de muestras clínicas complejas podría proporcionar resultados analíticos
deseables, pero requiere una preparación de la muestra que suele ser muy laboriosa y requiere mucho tiempo.
Por lo tanto, los métodos de cromatografía-EM se limitan a su uso en laboratorios clínicos. Para su aplicación en
entornos limitados en recursos o con restricciones reguladoras, los procedimientos generales de laboratorio
para el análisis de EM plantean un obstáculo enorme que no se puede superar fácilmente. El desarrollo de
métodos de muestreo directo ha cambiado drásticamente esta situación, permitiendo una amplia adopción de
la EM para la investigación clínica y el diagnóstico.

Muestreo directo La EM abarca una amplia gama de métodos de EM que tienen como objetivo un análisis
rápido y sencillo que requiere un pretratamiento mínimo de las muestras biológicas. La característica más
importante es que las muestras se introducen directamente en los espectrómetros de masas sin separación
cromatográfica. La ionización ambiental representa una dirección importante en la investigación y el desarrollo
técnico para el muestreo directo de EM, originando con el desarrollo de la desorción electrospray ionización
(DESI)1 y el análisis directo en tiempo real (DART). 2 En la última década, se ha desarrollado un gran número de
métodos de ionización ambiental, como la sonda de análisis sólido a presión atmosférica3, la ionización por
electropulverización por ablación láser (LAESI),4 plasma a baja temperatura (LTP)5, ionización por descarga de
barrera dieléctrica, ionización por electropulverización extractiva7 y ionización por pulverización de papel (PSI).
8

Con el avance de las técnicas de muestreo directo, análisis cuantitativo juega un papel importante en
aplicaciones clínicas como el diagnóstico de enfermedades y el cribado de rutina que se han discutido en varias
revisiones.9-11 El análisis cuantitativo utilizando muestreo directo EM sigue siendo difícil debido a la
complejidad de las matrices y la falta métodos adecuados para incorporar las normas internas. Para evaluar el
rendimiento cuantitativo de los métodos de muestreo directo de EM, pueden utilizarse criterios generalmente
utilizados para la validación del método bioanalítico, como la linealidad de la curva de calibración ajustada a la
matriz, el límite inferior de cuantificación (LOQ) y la desviación típica relativa (RSD). También debe
caracterizarse la selectividad, reproducibilidad y estabilidad de los métodos desarrollados. Para aplicaciones no
cuantitativas tales como imágenes y perfiles químicos, utilizando una intensidad de señal relativa o relaciones
de analitos emparejados con pruebas estadísticas permiten un análisis clínico eficiente.

Otro factor importante para el futuro análisis clínico de la EM es la disponibilidad de sistemas adecuados de
espectrometría de masas. Las muestras se pueden recoger y enviar a laboratorios clínicos para su análisis; sin
embargo, para aprovechar plenamente el análisis de muestreo directo, los sistemas de punto de atención (POC)
representan soluciones más sensatas. Las muestras se pueden analizar en el punto de recolección,
proporcionando retroalimentación inmediata para ayudar a la toma de decisiones. Los problemas de
compatibilidad y automatización de métodos son obstáculos significativos que deben superarse para
proporcionar información única que sólo puede obtenerse en el POC. El denominador común en todos los
aspectos clínicos es un espectrómetro de masas que cumple varios criterios POC. Un sistema POC MS debe
consistir en un espectrómetro de masas robusto y fácil de usar y cartuchos de muestreo con procedimientos de
muestreo conocidos por los profesionales clínicos, por lo que pueden ser operados por el personal sanitario
para obtener resultados fiables.12
En esta revisión, discutiremos las aplicaciones de una variedad de métodos de muestreo directo para el análisis
de EM relacionados con aplicaciones clínicas, se presentan aspectos cuantitativos y cualitativos. Para los
métodos cuantitativos, discutimos varias técnicas de ionización ambiental, así como métodos para mejorar el
rendimiento cuantitativo general; para los métodos no cuantitativos, discutimos imágenes de espectrometría
de masas (MSI), métodos de perfiles químicos y emergentes intra-herramientas quirúrgicas para el análisis in
vivo de la esclerosis múltiple. También destacamos el desarrollo de tecnologías de cartuchos y espectrómetros
de masas en miniatura para futuros sistemas POC MS.

Muestreo directo EM para análisis cuantitativo

Las aplicaciones cuantitativas de los métodos de muestreo directo tienen por objeto la detección diagnóstica o
el muestreo rutinario de drogas de uso indebido o la vigilancia terapéutica de drogas. Además, la cuantificación
de metabolitos también puede proporcionar información diagnóstica clínicamente relevante que se ha
reportado en varios métodos. Esta sección introduce tres métodos de ionización ambiental significativos para la
cuantización: ionización por pulverización de papel, ionización por electropulverización de desorción y análisis
directo en tiempo real.

2.1 Ionización por pulverización de papel (PSI)

Desde su introducción en 20108, PSI ha estado atrayendo cada vez más interés en el campo de la ionización
ambiental MS. Este método presenta la máxima simplicidad para analizar directamente muestras tan complejas
como la sangre o los tejidos. En un experimento típico, el papel de cromatografía se corta en un triángulo y
unos pocos microlitros de muestra líquida, como la sangre, se cae sobre el papel para formar una mancha de
muestra seca (fig. 1A-C). El triángulo de papel se mantiene entonces delante de la entrada MS y una pequeña
cantidad (5-30 µL) de disolvente se aplica directamente sobre el triángulo (Fig. 1D). El disolvente eluye los
analitos del punto de la muestra; cuando se aplica una alta tensión (alrededor de 3 kV) en el papel mojado, se
genera un electrospray para producir iones que serán analizados por la EM. Para el análisis de muestras
biológicas complejas, el papel de celulosa sirve como un sustrato que retiene especies que interfieren,
incluyendo sales, desechos celulares y proteínas. Debido a este efecto de limpieza, PSI es particularmente
adecuado para la cuantificación de manchas de muestras secas, especialmente de muestras biofluidas como
sangre y orina.13 PSI también es aplicable al análisis de muestras sólidas, La simplicidad del PSI permite que los
experimentos se lleven a cabo fácilmente en diversos entornos, y ha inspirado metodologías novedosas como
la pulverización foliar15.

Se ha realizado un esfuerzo considerable para mejorar la reproducibilidad y la eficiencia de la ionización, así

como para reducir el ruido de fondo a fin de permitir el análisis cuantitativo mediante métodos PSI-MS. Es bien
sabido que la incorporación del EI es fundamental para la cuantificación de la esclerosis múltiple y aún más para
los métodos directos de análisis de la esclerosis múltiple. En el caso del PSI-MS, el EI puede introducirse en la
muestra o imprimirse previamente en el sustrato de papel.16, 17 La naturaleza porosa del papel de celulosa
permite cargar ciertas cantidades de compuestos que posteriormente se van a eluir mediante disolventes
durante la pulverización de papel. La incorporación del SI también puede combinarse con procesos de
recolección de muestras. Por ejemplo, en un estudio, el EI se precargó en la pared interna de un capilar de
muestreo, que se utilizó para recoger y transferir muestras de sangre a El sustrato de papel para PSI-MS.17
Mejora de la reproducibilidad (SSD inferior al 8%) se obtuvo para el análisis de fármacos terapéuticos.
La aplicación de la ISP para el análisis del uso indebido de drogas ha atraído una considerable cantidad de
intereses9 debido a su simplicidad y amplia aplicabilidad. La cuantificación de drogas de abuso y sus
metabolitos en manchas secas de sangre (DBS) fue demostrada por PSI-MS/MS.18Espy et al. compararon la
cuantificación de ocho drogas de abuso en sangre entera usando cartuchos prototipo de PSI e ionización por
pulverización de extracción.20 Resultados similares satisfactorios para drogas de análisis de abuso fueron
obtenidos usando estos dos métodos. Además de DBS, PSI también se puede aplicar para el análisis de
muestras recogidas en otras formas, por ejemplo, huellas dactilares. Costa et al. informaron del análisis de las
drogas de uso indebido en las huellas dactilares recogidas en papel por la PSI-MS cuantitativa. Los resultados
del análisis de 239 muestras de huellas dactilares de drogas de usuarios y grupos de control abusadores
mostraron un 99% de verdadero positivo y un 2,5% de falso positivo para la detección de cocaína.21 Las
ventajas de la ISP, incluyendo un costo extremadamente bajo, tiempo de análisis corto y procedimientos
simples, poner de relieve el potencial de la aplicación de la detección del uso indebido de drogas en el marco
del PSI-MS para las fuerzas del orden.

Otra importante aplicación clínica demostrada con el PSI es la cuantificación de fármacos terapéuticos en
sangre. Una amplia variedad de fármacos terapéuticos han sido monitoreados a través de PSI-MS, como
medicamentos contra el cáncer o inmunosupresores.9 Se realizó una caracterización integral con imatinib, un
medicamento contra el cáncer. Se prepararon muestras de sangre entera con imatinib en una serie de
concentraciones y imatinib-d8 a 1 µg/mL como IS. Para el análisis, sólo se observó una muestra de sangre de
0,4 µL en el sustrato de papel y se dejó secar.8 Se obtuvo un rango dinámico lineal de 62,5 ng/mL a 4 µg/mL,
cubriendo todo el rango terapéutico. Manicke et al. investigaron el desempeño cuantitativo del PSI para el
monitoreo de fármacos terapéuticos (TDM), para 15 fármacos hidrofóbicos y débilmente básicos.22 Se
prepararon muestras de estándares de calibración y control de calidad (QC) para maquisita y amitriptilina. Para
la sitamaquina, el EI marcado con isótopos se pinchó en sangre húmeda, permitiendo un rango lineal de 5-1000
ng/mL; los resultados del QC mostraron una RSD inferior al 5 % y una imprecisión dentro del 2 %. En el caso de
la amitriptilina, se depositó en el papel IS marcada con isótopos antes de cargar la muestra de sangre. La
imprecisión fue de aproximadamente 10% para todas las concentraciones analizadas, excepto para 0,9 ng/ml
(imprecisión 22%). Al comparar los resultados de la cuantificación de muestras de sangre de diferentes
donantes, se concluyó que este método no se vio afectado por efectos matriciales relativos.

Aunque el rendimiento cuantitativo de la ISP ha sido ampliamente explorado para diferentes tipos de fármacos
terapéuticos, queda aún por validar con muestras clínicas reales. Shi et al. evaluaron tacrolimus, un fármaco
inmunosupresor que tiene una alta demanda clínica de TDM, utilizando una fuente de PSI automatizada y un
cartucho diseñado en Purdue University12, 23 y posteriormente comercializado por Prosolia24, 25. Para
establecer la relevancia clínica, el PSI también fue validado con inmunoensayos aprobados por la FDA y
métodos LC-MS/MS. Se establecieron correlaciones significativas entre el PSI-MS y otros métodos, incluyendo
dos inmunoensayos y dos ensayos LC-MS/MS (fig. 2). Utilizando un enfoque similar, también ampliaron el
método al cuantificar simultáneamente ciclosporina y sirolimus, mostrando que el PSI era un medio novedoso y
efectivo para el MDT de fármacos inmunosupresores.25 En otro estudio,La cuantificación del imatinib en
plasma se realizó mediante el uso de PS asistido en campo, donde se montó una aguja de acero inoxidable
axialmente al triángulo de papel para aumentar la resistencia del campo. 26 Diecinueve pacientes con tumores
de estroma gastrointestinal tratados con 400 mg/día de imatinib se inscribieron en un estudio para evaluar la
capacidad de cuantificación de PSI-MS/MS, en comparación con la LC-MS/MS tradicional. Los resultados
mostraron una correlación de r = 0,783 en términos de concentraciones de drogas en muestras de sangre.
Yannell et al. compararon el análisis PSI-MS de la ECP utilizando diferentes dispositivos para recoger muestras
de sangre encampo.27 Se recogieron muestras de sangre en una zona remota de Vietnam utilizando pipetas
desechables con sustratos de papel Whatman 31ET prefabricados para PSI, tarjetas de recogida DBS y
cartuchos PSI. El imatinib y su principal metabolito N-desmetil-imatinib se midieron a partir de muestras de
sangre recolectadas en el campo de 4 pacientes durante 5 días consecutivos.

Se identificaron buenas linealidades en concentración para todos los dispositivos. Los SSD para el análisis
fueron de alrededor del 31% en promedio, lo que puede atribuirse a la dificultad en el control de los pequeños
volúmenes de muestras de sangre recogidas y dispensadas en papel.

1.1 Ionización por electroaerosol de desorción (DESI)

Como uno de los métodos pioneros para la ionización ambiental, el DESI se ha aplicado ampliamente en
Campos farmacéuticos y forenses.28 La metodología detrás de DESI utiliza un flujo de solvente cargado en
ángulo hacia la superficie de la muestra para extraer analitos y propulsar los iones resultantes hacia la entrada
de MS. A diferencia de los métodos convencionales como perforar o cortar (PSI), DESI tiene la ventaja de
analizar instantáneamente ECP sin pasos adicionales y permitir la ionización punto por punto para la obtención
de imágenes, cubierto más adelante en la revisión. Siebenhaar et al. usaron DESI para cuantificar la aspirina en
la ECB midiendo su concentración en sangre entera en múltiples puntos de tiempo (hasta 300 min) después de
administrar aspirina a un voluntario sano.29 El límite de detección reportado (LOD) para la aspirina fue de 8
µg/mL y LOQ fue de 10 µg/mL, con un rango lineal de 10 a 2000 µg/mL con un RSD inferior al 14%. Wiseman et
al. reportaron análisis directos de ECP con DESI, cuantificando sitamaquina, terfenadina y prazosina usando
verapamilo como estándar interno.Se encontró que las LODs de 10 ng/mL y rangos lineales de 10-10000 ng/mL
fueron alcanzados. El análisis cuantitativo de fármacos en la orina se realizó mediante el acoplamiento de
microextracción en fase sólida (SPME) con DESI, se lograron LDD por debajo de 50 ng/ml en orina para todos los
fármacos analizados excepto para meprobamato, cuyo LOD fue encontrado para ser 160 ng/mL.31 La
naturaleza de DESI lo hace muy conveniente para la proyección de alta velocidad. Dicha metodología podría
aplicarse potencialmente a la elaboración de perfiles de impurezas de alto rendimiento y al control de procesos
en la industria farmacéutica.32 Por ejemplo, Chen et al. informaron de la medición semicuantitativa de un fallo
simulado del proceso en la línea de producción farmacéutica, a una velocidad de análisis de 2-3 muestras/s,
donde la degradación térmica de la loratadina era clara detección.

1.1 Análisis directo en tiempo real

A diferencia de PSI o DESI donde los iones son generados por un electrospray basado en solventes, el análisis
directo en tiempo real (DART) utiliza una descarga de corona que resulta en la generación de iones que luego se
exponen a una muestra. Las aplicaciones iniciales de DART han mostrado buena disposición para varios analitos
polares y no polares en muestras crudas.2 Aunque la mayoría de las aplicaciones cuantitativas de DART fueron
sobre seguridad alimentaria,33-35 las aplicaciones forenses y de seguridad de DART también fueron
demostradas para el análisis de drogas de abuso y explosivos.36 Una aplicación temprano de DART-MS/MS
para el análisis de moléculas pequeñas cuantitativas fue reportado por Zhao et al.37, alrededor del 80% de los
compuestos comerciales probados se encontró que tienen LODs por debajo de 5 ng/mL en plasma, los rangos
lineales fueron 0.5-2000 ng/mL para verapamil y loperamida, y 1-2000 ng/mL para bufuralol con precisión y
precisión aceptables. Yu et al.38 reportaron la implementación de DART para la cuantificación de fármacos en
matrices biológicas. Se encontró que el LOD de verapamilo en plasma de rata era de 0,1 ng/mL, se logró un
rango lineal de 2-20000 ng/mL aunque no se incorporó IS durante el análisis. DART se puede acoplar con pasos
de preparación de la muestra como SPME para la cuantificación de fármacos en muestras de sangre.Se obtuvo
LOD de 0,3 µg/ml para el análisis de diazepam en muestras de sangre de 5 µL. Hsieh y otros reportaron un flujo
de trabajo para la cuantificación del colesterol endógeno en suero humano con DART donde el suero se cargó
en papel cromatográfico. La cuantificación se realizó manchando colesterol-d6 en la muestra de suero en papel.
Se ha validado en 63 muestras séricas de 21 corredores ultramaratónicos en tres momentos diferentes, los
resultados se compararon con los obtenidos en ensayos fluorométricos enzimáticos.

1.1 Pulverizador de cuchilla recubierta

El spray de lámina recubierta (CBS) fue desarrollado como un método que integra SPME y la ionización por
pulverización a base de sustrato (Fig. 3). 41, 42 Al igual que las modificaciones del spray de papel, las chapas de
acero inoxidable estaban recubiertas con materiales como el poliacrilonitrilo C18. CBS conserva la simplicidad
de PSI evitando la unión de la matriz a un sustrato poroso. Las cuchillas recubiertas tenían un área de superficie
más grande que el SPME lo que resulta en una mayor capacidad de carga, mientras que un paso de lavado
elimina sustancias sueltas para minimizar los efectos de la matriz. Un procedimiento típico incluye el
preacondicionamiento del dispositivo, extracción de muestras, lavado y análisis de EM. Aunque se añadieron
varios pasos adicionales, todo el proceso podría terminarse en 3 minutos mientras se logra un LOQ en el nivel
de partes por billón para la cocaína enriquecida en soluciones salinas tamponadas de fosfato.

Se aplicó CBS para el cribado y cuantificación de alto rendimiento de sustancias controladas y fármacos
terapéuticos en biofluidos.43 Se construyó un soporte para 96 dispositivos CBS y se utilizó junto con un sistema
robótico de preparación de muestras para preacondicionamiento, extracción y lavado. Se lograron LOQs de 0,1-
10 ng/mL para plasma y 0,25-10 ng/mL para orina para 18 compuestos. Aunque se requirió un tiempo de
extracción más largo en comparación con el modo manual, la automatización de CBS permitió reducir el tiempo
de análisis por muestra a menos de un minuto. Utilizando el mismo sistema automatizado de preparación de
muestras, se demostró la cuantificación de fármacos inmunosupresores en muestras de sangre enteras.44 Cabe
señalar que se necesitaron cantidades relativamente grandes de muestras (> 100 µL) para el CBS. Con el fin de
minimizar la cantidad de muestra, las muestras de biofluidos también se pueden ver directamente en cuchillas
recubiertas con partículas de equilibrio hidrofóbico-lipofílico,45 que sólo requiere 10 µL de muestra de
biofluidos. Se lograron VOC de 1-5 ng/mL en plasma y 1-10 ng/mL en sangre para 17 fármacos.

1.1 Mejora del rendimiento cuantitativo

Las aplicaciones clínicas, como el cribado diagnóstico o el muestreo de rutina, hacen mucho hincapié en la
mejora de los rendimientos cuantitativos de la sensibilidad y la reproducibilidad. Con los actuales métodos de
muestreo directo mencionados anteriormente, varias limitaciones derivadas de matrices complejas o de baja
desorción/ionización conducen a una sensibilidad suprimida que puede afectar al análisis cuantitativo. Para
superar este obstáculo, los métodos de extracción rápida y las modificaciones de los métodos tradicionales de
ionización ambiental se presentan como soluciones para mejorar el análisis cuantitativo.

1.1.1 Microextracción de flujo de babosas (SFME):

la extracción líquido-líquida es un método común de extracción de muestras utilizado en los procedimientos

analíticos. Debido a que la extracción convencional líquido-líquido exige grandes cantidades de disolvente, se
han dedicado esfuerzos a reducir el volumen de muestreo. Algunos ejemplos incluyen microextracción líquido-
líquida46 dispersiva, microextracción fase líquida de fibra hueca 47 y extracción electromembrana48. Para
acoplar la microextracción líquida rápida con el análisis directo de la EM, se desarrolló un método de
microextracción de flujo de babosas (SFME) altamente eficiente (fig. 4A). 49 El movimiento de los tapones
inmiscibles de disolventes y biofluidos dentro del capilar de vidrio introdujo una turbulencia que facilita la
transferencia de analitos al disolvente de extracción, donde se pudo lograr el equilibrio después de 5 ciclos de
movimientos de flujo de babosas. SFME podría ser operado en cualquier línea
o modo fuera de línea; para el modo en línea, la extracción se llevó a cabo dentro de la nanopunta que se
utilizará para nanoESI; para el modo fuera de línea, la extracción se realizó utilizando un capilar de vidrio y
luego el disolvente de extracción se transfiere a una nanopunta para el análisis directo de la EM. Ambos
métodos requirieron una corta cantidad de tiempo. Teniendo en cuenta que las muestras de biofluidos se
podían analizar en su forma recogida, este método era especialmente adecuado para aplicaciones de punto de
cuidado. Usando solo 5 µL de muestras de biofluidos (sangre o orina completa), se lograron LDD mejores que 1
ng/mL para la mayoría de los analitos. La derivatización en línea también se demostró en este estudio, que
mejoró la detección de analitos normalmente difícil para el análisis directo, como los esteroides en la orina. El
rendimiento cuantitativo de la SFME se demostró en la investigación inicial: la metanfetamina y el EI en sangre
mostraron una respuesta lineal en el rango examinado de 1 ng/mL a 100 ng/mL (fig. 4B). Para concentraciones
superiores a 10 ng/mL se obtuvo RSD dentro de 10%.

Dado que los disolventes inmiscibles en agua eran necesarios como disolventes de extracción, el SFME
normalmente no era eficiente para los compuestos polares. Recientemente, también se introdujo un método
SFME trifásico como un enfoque adecuado para analizar compuestos polares en biofluidos (Fig. 4C), donde se
colocó un disolvente puente inmiscible en agua entre el biofluido y los tapones de disolvente de extracción
polar.50El sistema SFME de fase de biofluido-hexano-metanol/agua, sales, desechos celulares y proteínas en el
biofluido fueron bloqueados por el hexano, mientras que los analitos polares pudieron ser transferidos a los
disolventes de extracción ciclo a ciclo. Mediante el acoplamiento con el análisis directo de MS, se obtuvieron
LODs de 2 ng/mL para aminoácidos en muestras de orina (fig. 4D). El método SFME trifásico también se aplicó a
fármacos hidrofílicos como el tenofovir-difosfato (logP 4.6). La SFME normal también fue ineficiente en el
análisis de compuestos que están suspendidos en matrices de baja polaridad, como muestras de aceite. Se
desarrolló un método de SFME de fase inversa, donde se utilizaron disolventes polares como metanol/agua
como disolventes de extracción. Este método se aplicó para analizar residuos de plaguicidas en aceites
vegetales, permitiendo un análisis altamente sensible y cuantitativo.

1.1.2 Microextracción de fase sólida (SPME)-SPME:

es una tecnología de preparación de muestras que combina preconcentración de muestras y limpieza de

muestras. Comúnmente, SPME se combina con métodos de cromatografía para el análisis cuantitativo de
compuestos en diferentes tipos de matrices.51-54 El reciente acoplamiento de SPME con EM ambiente ha
abierto nuevas oportunidades para el campo, como mejora significativa de los resultados cuantitativos gracias a
esta evolución.55

Teóricamente, las fibras y otros dispositivos utilizados en SPME-GC o -LC podrían ser utilizados directamente
para el análisis de MS. Sin embargo, algunos aspectos del SPME convencional necesitan ser mejorados,
especialmente los tiempos de adsorción y desorción bajo condiciones leves. Para el muestreo rápido de analitos
de muestras de sangre, se aplicó agitación de alta velocidad con vórtice sobre fibras SPME disponibles en el
mercado. El proceso de adsorción se completa en 2 min, siguiendo con un paso de aclarado rápido. Finalmente,
la fibra se insertó en una punta afilada llena de disolventes para la desorción de los analitos, análisis de nanoESI
y MS (fig. 5A). 56 El recubrimiento biocompatible en la fibra SPME no causó incrustación o absorción de
proteínas, minimizando los problemas de obstrucción para el emisor de nanoESI. Debido al efecto de
preconcentración del SPME, el análisis de volúmenes de muestra relativamente grandes produjo LOQs tan
bajos como 100 pg/mL para la metadona a partir de 700 µL de orina, y 100 pg/mL para la amitriptilina a partir
de 300 µL de sangre entera. Para muestras de pequeño volumen, se utilizó una fibra SPME miniaturizada
recubierta de polipirrol. A diferencia de los procedimientos SPME-nanoESI discutidos anteriormente, este
dispositivo era mucho más pequeño y permitía extracciones estáticas de muestras de biofluidos de 1-10 µL.57
Análisis cuantitativo de muestras de biofluidos enriquecidos (orina, plasma y sangre entera) Los LOQs
entregados a los niveles bajos de ng/mL con rangos dinámicos que abarcan dos órdenes de magnitud,
manteniendo el tiempo total de análisis a menos de 5 minutos.

Otra estrategia de acoplamiento de SPME con MS fue a través de sondas de puerto abierto (OPP), según lo
reportado por Gómez-Ríos et al.58 (Fig. 5B) desorber y transferir los analitos extraídos a una fuente de
ionización por aspiración. El rendimiento cuantitativo de este método se caracterizó por el análisis de fentanilo,
buprenorfina y clenbuterol en muestras de orina, identificando una precisión superior al 90%. Tascon et al.
adoptaron una interfaz abierta de microfluidos (MOI) para acoplar SPME a MS, que presentaba una cámara de
desorción más contenida que la OPP (fig. 5C). 59 Este método se aplicó para cuantificar varios fármacos
inmunosupresores de 100 µL de sangre entera, reportando LOQs inferiores a 1 ng/mL.

1.1.3 Ionización por pulverización en papel modificado:

aunque varios documentos han concluido la aplicabilidad de la ISP para el análisis clínico cuantitativo, la
sensibilidad de la ISP puede estar limitada por varias limitaciones, como los efectos de matriz al analizar
muestras biológicas complejas; por lo tanto, ciertas sensibilidades del analito se pueden suprimir. Para ampliar
la aplicabilidad de la ISP y mejorar su sensibilidad, muchos estudios han tratado de modificar los sustratos de
papel. Los materiales de recubrimiento sobre los sustratos de papel mostraron mejoras significativas,
incluyendo el uso de grafeno,60 zirconia,61 marco metálico-orgánico62 como materiales de recubrimiento. Los
sustratos de papel (grado Whatman SG81) recubiertos con sílice disponible en el mercado podrían utilizarse
directamente para PSI. Para el análisis de la ECP, se observaron aumentos de 5 a 50 veces en las VOC de
lidocaína, amitriptilina, sunitinib, verapamilo y citalopram en comparación con el papel de cromatografía
31ET.63 Otro estudio reportó LOQs muy bajos de 0.004-0.084 ng/mL en biofluidos por recubrimiento con
microesferas de poliestireno.64 RSDs menores que Se obtuvieron un 5% para diferentes analitos en ECP a
concentraciones de 10 ng/ml. Al modificar las propiedades del papel, se habilitaron nuevas características como
la extracción en línea a través de papel hidrofóbico tratado con silano (Fig. 6A-B). 65 El tratamiento del papel
impidió que las muestras biológicas acuosas humedecieran los sustratos, mientras que un solvente orgánico
con baja tensión superficial podría hacerlo. Por lo tanto, la extracción líquida-líquida en línea podría ocurrir y
permitir que los biofluidos se analicen directamente sin interferir los efectos de la matriz. Basado en este
diseño de papel hidrofóbico, el mismo grupo desarrolló una nueva estrategia de recolección de sangre donde
se recogió esferoide de sangre seca en lugar de DBS tradicional. Los beneficios incluyen la estabilización de los
analitos, la extracción de muestras más fácil y la minimización de los efectos negativos que son comunes para la
ECB (p. ej., efectos de hematocrito). La cuantificación de fármacos en esferoides de sangre seca se realizó
mediante PSI.66 En un trabajo muy reciente, se fabricaron sustratos de papel impregnados de poliestireno y se
aplicaron en PSI-MS de proteínas y péptidos (fig. 6C). 67 Con una mejora significativa de la eficiencia de
extracción/ionización, algunas proteínas y péptidos (por ejemplo, angiotensina II y mioglobina) podrían ser bien
detectados incluso en concentraciones muy bajas con LOQs en el rango de 1-5 ng/mL.

Además de las modificaciones integrales en el sustrato de papel, microfluídica basada en papel es otro campo
de rápido desarrollo con dispositivos más inteligentes que abren nuevas oportunidades para cost
diagnostics.68, 69 La impresión de cera es un método muy simple para imprimir estructuras de microfluidos en
papel.70 Integración de canales de microfluidos en sustrato de papel mediante impresión de cera para PSI,
como lo demuestran Damon et al, podría proporcionar una señal mejorada debido a un electrospray más
estable y a una evaporación más lenta del disolvente.71 El mismo grupo reportó una plataforma de
inmunoanálisis de EM en papel, donde un reportero de masa divisible se conjugaba con anticuerpos y se
ionizaba en una cerasustrato de papel impreso para el análisis de MS, se logró la cuantificación de la
proteína.72 Mediante el diseño cuidadoso de los canales microfluidos en el sustrato de papel, nuevas
aplicaciones de PSI aún no se han explorado.

2. Métodos de muestreo directo no Quantitativo para el análisis clínico

Fuera del análisis cuantitativo, los métodos de muestreo directo de la EM también han mostrado capacidades
únicas en otras aplicaciones clínicas, como la obtención de imágenes, el perfil clínico directo y el seguimiento
en tiempo real de muestras de tejido. Estos métodos utilizan métodos semi a no cuantitativos tales como
relaciones analíticas relativas o correlaciones entre la concentración del analito y la intensidad de la señal para
verificar su valor diagnóstico, eliminando el uso del EI y la variabilidad. Estos métodos facilitan la detección de
información química valiosa in vivo que sólo puede obtenerse después de un pretratamiento extenso o en su
estado nativo.

2.1 Ionización ambiental MS Imaging

MSI ha sido bien establecida como una herramienta clínicamente significativa para generar imágenes
moleculares específicas a partir de muestras de tejido. El MSI basado en ionización ambiental permite obtener
imágenes de información química sobre muestras no tratadas bajo presión atmosférica fuera del
espectrómetro de masas. 73, 74 Aquí destacamos alguna ionización ambiental que ha sido bien aplicada para
MSI de muestras biomédicas, incluyendo DESI, nanospray desorción electrospray ionización (nano- DESI), y
LAESI.

DESI tiene una ventaja significativa al proporcionar información espacial a partir de muestras de tejido. DESI
MSI se ha implementado regularmente para el análisis clínico. Algunas aplicaciones recientes incluyen perfiles
de lípidos y metabolitos para la discriminación de la materia gris, la materia blanca y diferentes tipos de tejidos
tumorales (fig. 7A),75 mapeo intraoperativo del oncometabolito 2- hidroxiglutarato (2-HG, un biomarcador
para las mutaciones de isocitrato deshidrogenasa I y II) para guiar la cirugía de tumores cerebrales76, y la
discriminación de tumores de piel microscópicos malignos y benignos77. Pirro et al. reportaron la evaluación
del margen tumoral durante la resección tumoral usando DESI, al normalizar las intensidades de señal de 2-HG
a los recuentos totales de iones, los autores fueron capaces de correlacionar la intensidad normalizada a la
concentración de 2-HG.78 En otro estudio, Banerjee et al. informaron que utilizaban relaciones de iones
glucosa/citrato para predecir el cáncer de próstata. Esta información se puede recoger en menos de un minuto
después de la preparación rápida de la muestra y predecir el estado canceroso. 79 Mediante el uso de análisis
estadísticos para identificar metabolitos significativos en un conjunto independiente de muestras, el modelo
generado diferenció secciones sanas y cancerosas del tejido prostático con casi 90% de precisión.

Nano-DESI es diferente de DESI en que separa la desorción y la ionización donde los analitos fueron extraídos
en un puente líquido formado entre capilares primarios y secundarios, y transferidos a un capilar secundario
para nanospray.80 Nano-El DESI se aplicó a las imágenes tisulares y tuvo una resolución superior a 12 µm.81
Una ventaja significativa para el nano-DESI es el mapeo simultáneo, la identificación y la cuantificación de los
analitos. Mediante la incorporación de IS en el disolvente nano-DESI, se puede lograr la cuantificación absoluta.
Esto se comprobó en varios informes, uno de los cuales añadió nicotina deuterada al disolvente nano-DESI para
cuantificar la nicotina en el tejido cerebral de las ratas.82 La misma estrategia se amplió y se aplicó a la
cuantificación de fosfatidilcolina endógena en las secciones del tejido cerebral (fig. 7B),83 cuantificación de los
neurotransmisores de moléculas pequeñas en las secciones del tejido cerebral de las ratas,84 y, más
recientemente, cuantificación de las prostaglandinas en la sección del tejido uterino de los ratones85.

LAESI es un método combinatorio, donde se utiliza un láser para generar especies neutras e ionizadas por gotas
cargadas. La combinación de desorción láser y ESI se reportó por primera vez en 2005 (i.e. la ionización de
desorción láser asistida por electrospray, ELDI), donde la post-ionización de especies neutras desorbidas por
láser genera los iones.87 Como una extensión de ELDI, LAESI utiliza infrarrojo medio (IR medio) Este método es
aplicable a las muestras ricas en agua debido a la fuerte absorción de la mitad del IR por las moléculas de agua.
En la publicación inicial, se aplicó LAESI para cuantificación de verapamilo y reserpina en 50% de soluciones de
metanol acidificadas con ácido acético al 0,1%, se logró un rango dinámico lineal de cuatro órdenes de
magnitud sin adición de patrón interno. Se encontró que las LDD eran de 8 y 25 fmol para verapamilo y
reserpina, respectivamente.

Aunque no se notificó cuantificación en matriz compleja, se aplicó LAESI a análisis directos de orina, sangre
entera y muestras séricas, así como el perfilado in vivo de metabolitos en una plántula de marigod francesa.4 El
mismo grupo informó más tarde el perfilado de profundidad del tejido de la hoja y la imagen molecular in vivo
en una hoja, la resolución espacial de LAESI en imagen molecular se estimó en 200-300 µm.88 Se notificaron
otras aplicaciones de imagen de LAESI para el análisis tisular, como la imagen de pequeños metabolitos y lípidos
en tejido cerebral de rata (fig. 7C)86 y MSI de arriba hacia abajo de proteínas intactas en una sección de tejido
pulmonar de ratón utilizando comercializado LAESI source89.

2.2 Perfiles directos de muestras clínicas

Además de las imágenes, hay varios métodos basados en la EM que se pueden aplicar para aplicaciones clínicas
como biomarcadores o análisis de enfermedades. Los métodos de muestreo directo de alto rendimiento
podrían facilitar el descubrimiento de biomarcadores y fácilmente transferirlos a métodos rutinarios de
detección de enfermedades. Las presencias de las moléculas diana pueden proporcionar pautas generales para
el análisis y la verificación clínica, eliminando la dependencia de un EI. Por lo tanto, la cuantificación relativa
basada en la intensidad iónica o el perfilado (p.ej. perfiles de lípidos/metabolitos) proporciona pruebas
suficientes para el diagnóstico. En esta sección, discutimos varios métodos que se han utilizado para el
perfilado de información química de muestras clínicas, incluyendo análisis de superficie de extracción de
líquidos (LESA), sonda de muestreo de superficie de microunión líquida (LMJ- SSP), y aerosol táctil. Cabe señalar
que LESA90 y LMJ-SSP91 también han mostrado potencial para MSI.

LESA es un método de muestreo directo desarrollado en 2010,94 donde se coloca una gota de disolvente sobre
una superficie de muestra para una extracción rápida de la superficie líquida e ionizada por nanoESI. Kertesz y
Van Berkel describieron la adaptación de un sistema Advion NanoMate basado en chips de infusión nanoESI
para realizar LESA totalmente automatizado. El sistema fue demostrado para MALDI spot, DBS y análisis de
tejidos. La cuantificación del verapamilo se realizó en puntos MALDI con un rango lineal de 1-200 ng/mL.
Además, LESA también se utilizó en una capacidad de imagen limitada, mapeando la distribución de drogas en
el tejido cerebral de ratas. Mediante el monitoreo de varios compuestos de analitos a través de secciones de
tejido, las imágenes evaluaron la penetración de xenobióticos a través de la barrera hematoencefálica a una
resolución espacial de 1 mm.95 Edwards et al. informaron LESA de ECB para el análisis de hemoglobina (Hb)
variantes.96 Griffiths y Cooper demostraron más tarde el análisis del complejo de hemoglobina intacta
muestreado a partir de secciones de tejido hepático de ratón, que proporcionan una herramienta para la
obtención de imágenes de EM nativas.97 El mismo grupo también reportó una combinación de movilidad de
iones en forma de onda asimétrica de campo (FAIMS) con LESA de DBS, FAIMS permitió la separación de
unidades de hemoglobina α- y β- de especies lipídicas, por lo que la detección de lípidos fue posible.98 LESA ha
demostrado ser una herramienta de perfil significativa para examinar los xenobióticos en las secciones de
tejido.

LMJ-SSP utiliza la microunión líquida formada entre la superficie de la muestra y la sonda para extraer los
analitos, y luego transferir el líquido para la ionización en condiciones atmosféricas. 99 Aunque similar a nano-
DESI, la diferencia es que LMJ-SSP utiliza un tubo coaxial dual. Gaissmaier et al. informaron que usaron una
versión comercializada de LMJ-SSP, Flowprobe (Prosolia), para TDM con muestras de DBS.100 Se determinó
que el LOQ para acetaminofeno era de 5 µg/mL, aunque la sensibilidad del método era limitada, todavía era
apropiado para acetaminofeno (10-20 µg/mL), cubriendo toda la gama terapéutica. LMJ-SSP también fue
acoplado con la reacción fotoquímica en línea Paternò-Büchi para realizar una rápida determinación in situ de
isómeros de localización de lípidos C=C en muestras de tejido (fig. 8A). 92, 101 LMJ-SSP se utilizó para extraer
lípidos insaturados y luego reaccionar con acetona bajo irradiación UV; los productos de reacción se ionizaron y
analizaron en modo MS y MS/MS. La cuantificación relativa se realizó sobre la base de intensidades de iones
diagnósticas de dos isómeros.

El aerosol táctil MS está estrechamente relacionado con la ionización por electroaerosol de la sonda en que
utiliza una sonda de metal y similar al PSI porque también es ionización por pulverización a base de
sustrato.102 Para el aerosol táctil, se utiliza una aguja para "tocar" la muestra sólida, luego se aplican
disolvente y alto voltaje a la aguja para ionizar los analitos frente a la entrada de MS. En la investigación inicial,
se demostró la aplicación de aerosol táctil para una variedad de aplicaciones: detección de lípidos en tejido
cerebral de ratón, detección ex vivo de cáncer de próstata, detección in vitro de bacterias, detección de drogas
ilícitas en DBS, Cuantificación de fármacos terapéuticos en sangre entera y detección de fungicidas en
naranjas.103 El spray táctil se utilizó para diferenciar el cáncer de próstata humano del tejido normalen sus
perfiles de lípidos.104 También se aplicó una metodología similar al análisis de los tejidos renales humanos
para distinguir los carcinomas de células renales de los tejidos sanos.105 fluid107. Pirro et al. también
reportaron la evaluación de márgenes quirúrgicos y oncometabolitos utilizando secciones de tejido de glioma
humano, lo que demuestra el potencial de pulverización de frotis táctil para el análisis de EM intraoperatoria
(fig. 8B). 93

2.3 Análisis de EM in vivo

Derivado del éxito del análisis de biomolécula de muestreo directo basado en MS, el diagnóstico in vivo traduce
estos métodos en un sistema integral que puede mostrar resultados positivos/ negativos al instante, un
componente crítico en entornos sensibles al tiempo como la cirugía. El muestreo directo permite utilizar estos
métodos fuera de los laboratorios analíticos, mientras que las técnicas cuantitativas relativas eliminan las
complicaciones del EI. Junto con los análisis estadísticos, se puede obtener información diagnóstica en tiempo
real considerando la biocompatibilidad para diagnósticos in vivo. Esta sección revisa dos nuevos métodos de
monitoreo de analitos en tiempo real, Rapid evaporative ionization MS (REIMS) y MasSpec Pen, que han
reportado la diferenciación de tejido enfermo y sano.

REIMS utiliza la evaporación térmica rápida para generar iones, por lo tanto puede aplicarse directamente a los
tejidos vivos. Mediante el análisis principio-componente, REIMS fue capaz de diferenciar tejido mamario sano y
canceroso (fig. 9A). 108 Se realizó un análisis intraoperatorio del tumor in vivo con REIMS109 y también se
desarrolló un método endoscópico basado en REIMS para la identificación tisular110. La utilización de REMIS
para recoger el perfil de MS y el análisis de datos para obtener información de diagnóstico fue acuñada "iKnife",
que ahora es comercializado por Waters Corporation. La identificación de microorganismos clínicamente
relevantes se realizó colocando biomasa microbiana directamente en las fórceps bipolares.111 La metodología
ha sido adaptada y utilizada para la identificación automática de alto rendimiento de microorganismos.
Resultados similares se obtuvieron para la sonda bipolar manual REIMS y REIMS de alto rendimiento, con
precisiones de especiación del 96,3% y 93,9%, respectivamente.112

Junto con REIMS, una importante herramienta emergente para el diagnóstico in vivo basado en MS es el
MasSpec Pen (Fig. 9B). 113 Similar a LESA, DESI y nano-DESI, el bolígrafo MasSpec es una sonda de muestreo
automatizada que utiliza la interacción líquido-sólido para el análisis de tejidos in vivo y ex vivo. La sonda
genera una gota de agua para entrar en contacto con el tejido durante varios segundos y lo transporta a una
esclerosis múltiple de alta resolución para su análisis. A diferencia de otras técnicas de muestreo directo, el
método MasSpec Pen se dirige a aplicaciones in vivo y tiene en cuenta la biocompatibilidad. Se demostró el
análisis ex vivo de muestras de tejido humano y el diagnóstico in vivo de cáncer durante la cirugía de un modelo
de ratón. Posteriormente, se aplicó un análisis estadístico para construir modelos y compararlos con otras
técnicas basadas en la EM, identificando el 87,5% de sensibilidad y especificidad del 100% para el cáncer, así
como precisión del 95,6% para el cáncer de mama. Otros algoritmos estadísticos que utilizan aprendizaje
automático e información molecular validada muestran una sensibilidad general, especificidad y precisión del
96,4%, 96,2% y 96,3% para el cáncer, respectivamente.

3. Traducción de los EM de muestreo directo a las solicitudes de POC

Los beneficios de la EM de muestreo directo sólo se pueden apreciar plenamente cuando se aplica en un
entorno de POC, donde la retroalimentación rápida de los resultados de las pruebas es crucial para la toma de
decisiones en el diagnóstico o tratamiento de la enfermedad. Aunque la ionización por muestreo directo ha
simplificado en gran medida el funcionamiento del análisis de EM, los procedimientos excesivos todavía pueden
ser demasiado complicados para los usuarios sin formación profesional como químicos analíticos. Por lo tanto,
es fundamental desarrollar tecnologías fáciles de usar y rentables que sean accesibles al sistema de salud
actual.

4.1. Desarrollo de cartuchos

Los cartuchos de muestra desechables son ideales para aplicaciones POC porque son fáciles de usar, baratos de
producir y evitan la contaminación cruzada. Debido a su simplicidad, PSI tiene un gran potencial para el
desarrollo de cartuchos. Se fabricó un cartucho PS preliminar utilizando el proceso SLA (aparato de
estereolitografía); el cartucho estaba hecho de resina SLA Nanoform 15120 y consistía en soporte, tapa y
electrodo.23 Con poco tiempo de análisis, El PSI basado en cartuchos también sería susceptible de análisis de
alto rendimiento, como se informó anteriormente.114 Se creó una plataforma para sostener y mover 14 puntas
de PS (Fig. 10A) para el análisis. Una fuente automatizada fue diseñada en la Universidad de Purdue y
posteriormente comercializada por Prosolia Inc. (Indianapolis, IN, EE.UU.). 24, 25, 27

Varios diseños de cartuchos también permitieron la integración de otras funciones con métodos de muestreo
directo. Zhang y Manicke fabricaron un cartucho PSI con extracción de fase sólida integrada (SPE) (Fig. 10B).
115 La columna SPE mejoró significativamente la señal al enriquecer selectivamente los compuestos diana y
eliminar las matrices de muestras. La sensibilidad a cinco fármacos mejoró entre 14 y 70 veces en comparación
con la ISP directa. Bills y Manicke desarrollaron un cartucho PSI con capacidades de fraccionamiento de la
sangre utilizando diferentes membranas integradas en el cartucho, por lo que las muestras de plasma en lugar
de muestras de sangre entera podrían analizarse con PSI-MS cuando se desea.117 Se comparó el análisis
cuantitativo de atenolol y carbamazepina por este nuevo cartucho PSI con el análisis PSI de muestras de plasma
obtenidas por centrifugación, que mostró resultados similares. Salentijn et al. reportaron un cartucho PSI
impreso en 3D con humectación rápida y características de suministro continuo de solventes, permitiendo una
pulverización continua de más de diez minutos en comparación con el tiempo de pulverización de un minuto
utilizando el PSI original.118 También informaron de otros dos diseños de cartuchos PSI fabricados a través de
impresión 3D, integrando la desolvación y la óptica iónica.119 En ambos diseños, Se utilizó gas de vaina para
mejorar las señales, mientras que el segundo diseño incluía una lente electrostática para enfocar el aerosol.
Otro cartucho diseñado por Zhang et al. utilizó columnas de anticuerpos para enriquecer selectivamente
proteínas de biofluidos, y utilizó una punta de polietileno poroso recubierta de nanotubo de carbono para
generar electrospray (Fig. 10C). 116 El dispositivo podría utilizarse para la detección de la variante de la
apolipoproteína C1 T45S, las especies de hemoglobina, la transtiretina de tipo silvestre y los mutantes de la
transtiretina en muestras de plasma humano.

Sistemas MS en miniatura

La miniaturización de los sistemas de MS es otro aspecto importante para transferir métodos de MS a

aplicaciones clínicas y de POC. Los sistemas POC MS deben cumplir un conjunto de nuevos criterios que sean
diferentes de los utilizados para evaluar espectrómetros de masas tradicionales en el laboratorio.

En general, se esperan operaciones de bajo costo, bajo consumo de energía, alta portabilidad, robustez y
rendimiento analítico suficiente para aplicaciones POC.10, 11, 120, 121

Una de las barreras más importantes para miniaturizar espectrómetros de masas es la limitada capacidad de
bombeo debido a la reducción de tamaño, que podría tener un impacto significativo en la ingesta de iones
analitos y por lo tanto la sensibilidad del análisis. Una solución a esta limitación fue modificar el sistema de
interfaz continua utilizando el bombeo diferencial introducido en 2015 por Zhai et al122. También se hicieron
varias modificaciones al sistema, incluyendo la ionización plasmática en vacío 123, la integración de un
funnel124 de iones y la ionización de laserspray para muestras biológicas.125

Otra solución a esta barrera es la interfaz de presión atmosférica discontinua (DAPI) que permitió una
reducción significativa del sistema de bombeo manteniendo una buena sensibilidad para el análisis.126 Se
utilizó una válvula de apriete para mantener el sistema de vacío cerrado y sólo se abre brevemente para la
introducción de la muestra. Esto permitió que la cámara de vacío para mantener una presión de 10 5 Torr sólo
utilizando pequeñas bombas y una curva de presión característica durante el funcionamiento. El interesante
comportamiento de presión introducido por el DAPI condujo a un nuevo método de ionización llamado
ionización de descarga sincronizada, que potencialmente podría ser utilizado para muestras biológicas sólidas
como secciones de tejido o biopsias.127, 128 Se desarrolló una serie de espectrómetros de masas en miniatura
utilizando trampa iónica con DAPI, incluyendo Mini 11129, Mini 12 (Fig. 11A-B)12, una mochila Mini130 y Mini
β.131 LTP análisis de melamina en matrices complejas como la leche y la orina sintética se informó utilizando
Mini 10.5.132 Dependiendo de las diferentes matrices, los LODs se variaron de 0.03 µg/mL a 0.25 µg/mL.

Algunos métodos de muestreo directo se pueden acoplar directamente al Mini 12.12 El sistema consistía en
una trampa de iones rectilíneo, se demostró para capacidades de MS en tándem hasta MS5 (Fig. 11C). El
análisis cuantitativo directo se realizó con amitriptilina enriquecida en sangre entera utilizando aerosol de papel
como fuente de ionización, reportando LODs de al menos 7,5 ng/mL (fig. 11D). Ma et al. informaron del uso del
acoplamiento PSI a Mini 12 para el análisis de cannabinoides sintéticos en biofluidos34. Los LOQs de los
cannabinoides sintéticos analizados en sangre u orina estaban entre 10 y 20 ng/ml. Kirby et al. también
demostraron el análisis del uso indebido de drogas en la orina junto con la microfluidics135 digital, donde la
extracción de la mancha de orina seca se llevó a cabo en un sistema de microfluídica digital construido en casa
y analizado utilizando Mini 12. El LOQ era de 40 ng/mL por cocaína.

Para acoplar mejor el PSI con el sistema MS en miniatura, se propuso un diseño alternativo como el spray
capilar de papel. Se insertó un capilar de sílice fundida en el papel de filtro cortado para actuar como
pulverizador (Fig. 11E-F). 128 El spray capilar de papel combina la sencilla metodología de muestreo de PSI con
el electrospray estable de nanoESI. Como resultado, el aerosol capilar de papel generó un solo cono de Taylor
estable y tiene una formación de gotas más uniforme en comparación con el PSI. Se demostró la cuantización
de la sitagliptina en sangre entera bovina, mostrando un amplio rango lineal y una fuerte reproducibilidad.

Como exploración de un sistema de EM miniatura para el descubrimiento de fármacos y aplicaciones clínicas, se

realizó un estudio farmacocinético con muestreo de SFME y miniMS de fármacos terapéuticos en muestras de
sangre entera (fig. 11G-H). 133 En este estudio, se utilizó una muestra de sangre automatizada para extraer
muestras de sangre entera de ratas que se movían libremente y se administraban medicamentos terapéuticos.
El SFME se utilizó para extraer los compuestos del fármaco de todas las muestras de sangre que fueron
analizadas por Mini 12 utilizando nanoESI. El análisis de muestras enriquecidas utilizando SFME y Mini 12
produjo altos niveles de precisión y precisión que cumplieron con los criterios recomendados al trazar curvas
TDM.

4. Conclusión y perspectivas futuras

El desarrollo de la ionización ambiental ha promovido la aplicación de la espectrometría de masas en el análisis

clínico. Además de la elaboración directa de perfiles de información química a partir de muestras de tejidos e
imágenes del estado de la enfermedad de los órganos, el análisis cuantitativo por muestreo directo basado en
la esclerosis múltiple también desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades y el análisis
de fármacos. Aunque se han desarrollado muchos métodos de muestreo directo y algunos de ellos se han
demostrado en muestras clínicas, la traducción de la EM de muestreo directo en prácticas clínicas sigue siendo
difícil y necesita mejoras adicionales.

Dado que la ionización se realiza a menudo en presencia de matrices, la eficiencia de la ionización y la

reproducibilidad pueden verse fácilmente afectadas. Las modificaciones del sustrato de papel con materiales
como esferas de poliestireno o nanotubos de carbono han mostrado una mejor sensibilidad a una serie de
compuestos. La extracción de muestras con SFME ha demostrado mejorar aún más el rendimiento cuantitativo
para el análisis de biofluidos. Algunos métodos de extracción también fueron desarrollados para otros métodos
como SPME y CBS pueden lograr una sensibilidad y reproducibilidad superiores para el análisis de biofluidos,
pero están limitados por las etapas de precondición, muestreo y enjuague requeridos. Debido a las diferentes
eficiencias de ionización entre muestras y métodos, la incorporación de SI sigue siendo necesaria para la
calibración o aplicación de otros métodos cuantitativos relativos. El SI se puede introducir directamente en la
muestra, pero esto puede plantear un problema cuando sólo se dispone de un pequeño volumen de muestras
clínicas. La cuantificación basada en las relaciones de metabolitos o isómeros lipídicos también puede
emplearse en métodos de muestreo directo de la EM. Numerosos estudios han demostrado que las relaciones
de algunos metabolitos se pueden utilizar como biomarcadores para algunas enfermedades, como el uso de la
relación de señal de iones de glucosa/citrato para el diagnóstico de cáncer de próstata79, y las relaciones de
isómeros de doble enlace lipídicos 136 o sn- isomers137.

Los métodos de muestreo directo también han mostrado un buen rendimiento en la obtención de imágenes y
perfiles basados en la EM de información química en análisis cinológicos. DESI es el más adecuado para la
obtención de imágenes clínicas y el cribado de alto rendimiento, donde la cuantificación también es posible
pero no muestra una sensibilidad muy alta. Como mejora del DESI, el nano-DESI ha mostrado potencial para la
obtención de imágenes cuantitativas, un aspecto novedoso que puede permitir una caracterización
biomolécnica o xenobiótica más específica que podría ser útil en la clasificación o la distribución de fármacos
por imágenes en todo un órgano. Del mismo modo, la naturaleza de extracción rápida de los métodos de
muestreo de extracción líquida (LMJ-SSP, LESA, nano-DESI) podría acelerar el análisis, pero inevitablemente
sacrifica la eficiencia de la extracción. Las imágenes de LAESI MSI muestran una compatibilidad más amplia con
los analitos y son adecuadas para muestras ricas en agua. Sin embargo, estos métodos pueden no ser aplicables
a los analitos de bajo contenido en matrices o analitos que son incompatibles con ciertos disolventes. Y nuevas
mejoras en la automatización y comercialización de estas fuentes podrían ayudar a reducir esta barrera y
permitir más investigación clínica. Con compatibilidad demostrada para diagnósticos de cáncer ex e in vivo,
tecnologías como REIMS y MasSpec pen han dado el primer paso en la traducción de MS para aplicaciones
intraquirúrgicas. Aunque se han desarrollado y evaluado numerosos métodos de muestreo directo para el
análisis de diferentes tipos de compuestos, como fármacos, metabolitos y lípidos, sólo unas pocas
investigaciones exploraron el análisis de otras clases importantes de moléculas biológicas, como las proteínas,
que suelen ser biomarcadores importantes en el análisis clínico. Otra limitación es la falta de estandarización a
lo largo de cada método de muestreo directo; varios trabajos sobre el mismo método han reportado diferentes
condiciones experimentales como la introducción del EI o muestras de biofluidos, las diferentes eficiencias y
sensibilidades resultantes de la ionización. Muchos estudios muestran nuevas pruebas de concepto o mejoras a
los métodos existentes, pero la implementación en lugar de la innovación es clave en el campo casi saturado de
muestreo directo MS. Una solución a esto es el desarrollo de cartuchos. Para aplicar métodos de muestreo
directo al análisis clínico, los cartuchos deben desarrollarse de acuerdo con las prácticas clínicas. Por ejemplo, la
recogida de muestras, el almacenamiento y la bioseguridad son criterios que deben considerarse junto con los
costes y la facilidad de uso. Actualmente, los cartuchos de aerosol de papel y spray de cuchilla recubierta están
disponibles comercialmente.

El otro aspecto del desarrollo de un sistema completo de MS POC para aplicaciones clínicas y de campo es la
miniaturización de la MS. Cabe señalar que los análisis cuantitativos en miniatura basados en MS o en campo
son principalmente para aplicaciones específicas, que son muy diferentes con los métodos normales de MS que
buscan mejores rendimientos y aplicaciones amplias. Hemos visto varios sistemas MS miniatura que son
capaces de analizar muestras de biofluidos y tejidos mediante el acoplamiento con métodos de muestreo
directo, como el sistema MS miniatura acoplado PSI, que proporciona a los usuarios niveles significativos de
sensibilidad y especificidad. En los próximos años, esperamos poder ver más sistemas MS en miniatura
integrados con tamaños más pequeños y mejores prestaciones.

Agradecimientos: Los autores desean agradecer el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (Proyecto 21627807) y los Institutos Nacionales de Salud (Proyecto 1R01AI122298 y
R01AI122932).
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Fig. 1.

(A) Esquema de aerosol de papel. (B) Estructura química y espectro de masas de imatinib en sangre entera por aerosol de papel-MS/MS.
(C) Análisis cuantitativo de imatinib en muestras de sangre entera usando imatinib-D8 como el estándar interno (Reimpreso con
permisión8. Copyright 2010 Wiley-VCH). (D) Caracterización espacial de la intensidad de pulverización de papel en relación con la
entrada de espectrometría de masas (Reimpreso con permisión13. Copyright 2010 American Chemical Society).

Fig. 2.

Comparación de métodos de PSI a dos inmunoensayos (A) y (B), y dos ensayos de LC-MSMS

(C) y (D) (Reimpreso con permisión24. Copyright 2010 Elsevier).

Fig. 3.

(A) Instalación experimental para la extracción por pulverización de cuchillas y desorción/ionización. Análisis cuantitativo por CBS-MS, B)
plasma enriquecido con cocaína y su isotopologo [D3] cocaína, C) orina enriquecida con diazepam y su isotopologo [D5] diazepam
(Reimpreso con permisión41. Copyright 2014 Wiley-VCH).

Fig. 4.

(A) Esquema de SFME, y (B) curva de calibración de metanfetamina obtenida en sangre bovina por SFME-MS mediante la adición de
estándar interno (IS) en el disolvente de extracción (Reimpreso con permisión49. Copyright 2014 Wiley-VCH). (C) Esquema de espectros
trifásicos SFME, D) MS/MS de glutamina (2 ng/mL) en la muestra de orina sintética mediante análisis trifásico SFME y MS directo
(reimpreso con autoridad50. Copyright 2018 Elsevier).
Fig. 5.

(A) SPME-nanoESI (Reimpreso con permisos 56. Copyright 2016 American Chemical Society); (B) SPME-OPP (Reimpreso con permisos 58.
Copyright 2017 American Chemical Society); (C) SPME-MOI (Reimpreso con permisos 59. Copyright 2018 Future Science).

Fig. 6.

(A) PSI-MS por el sustrato de papel hidrofóbico, y (B) análisis en tándem de los fármacos extraídos de la orina y la sangre. 3.9 ng/mL
metanfetamina en sangre y 3.9 ng/mL transiciones de benzoillecgonina en orina (Reimpreso con permisión65. Copyright 2016 American
Chemical Society). (C) Comparación de espectros de masa de varias proteínas por papel de filtro y sustratos de papel impregnados con
PS PSI-MS (Reimpreso con permisión67. Copyright 2018 Royal Society of Chemistry).
Fig. 7.

(A) Proyección del PCA del DESI-MS y tinción del H&E del tejido cerebral humano. Se puede hacer una clara distinción entre glioma y
tejido de materia blanca con concentración relativa de células tumorales calculada. (Reimpreso con permisión75. Copyright 2015
National Academy of Sciences). (B) Nano-DESI imágenes cuantitativas de PC endógena y su abundancia absoluta en varias secciones del
tejido cerebral. (Reimpreso con permisión83. Copyright 2014 American Chemical Society). (C) Imágenes LAESI combinadas con MS de
alta resolución para diferenciación clara de especies con masa nominal idéntica. (Reimpreso con permisión86. Copyright 2010 American
Chemical Society).

Fig. 8.

(A) Reacciones fotoquímicas combinadas con LMJ-SSP para el perfilado de isómeros lipídicos en tejido. (Reimpreso con permisión92.
Copyright 2018 American Chemical Society). (B) Touch Spray MS para la evaluación intraoperatoria del glioma humano. (Reimpreso con
permisión93. Copyright 2017 Royal Society of Chemistry).
Fig. 9.

(A) REIMS para la identificación del tejido intraoperatorio. (Reimpreso con permisión109. Copyright 2017 American Association for the
Advancement of Sciences). (B) MasSpec Pen para diagnósticos de cáncer in vivo. (Reimpreso con permisión113. Copyright 2017
American Association for the Advancement of Sciences).

Fig. 10.

(A) PSI de alta resolución (Reimpreso con permisión114. Copyright 2013 Elsevier); (B) Cartucho PSI con SPE integrado (Reimpreso con
permisión115. Copyright 2015 American Chemical Society); (C) Cartucho impreso en 3D para la detección de proteínas dirigidas
(Reimpreso con permisión116. Copyright 2017 American Chemical Society).
Fig. 11.

(A) Un protocolo de operación simplificado del sistema Mini 12 MS. (B) Configuración del sistema Mini 12. (C) Espectro de masas MS5
para el clenbuterol de 20 ppm en 50/50 MeOH/H2O, utilizando nanoESI-Mini 12 (el recuadro muestra el pico aislado de iones con m/z
168). (D) Curva de calibración que muestra la proporción de amitriptilina/amitriptilina-d6 en sangre, por ionización por pulverización de
extracción y Mini 12 (producto de ion m/z de 233 fue monitoreado) (Reimpreso con autoridad12. Copyright 2014 American Chemical
Society). (E) Esquema del aerosol capilar de papel, calibración (F)curva de sitagliptina por análisis de MS en aerosol capilar de papel
(Reimpreso con permisión128. Copyright 2016 Springer). (G) El esquema de análisis rápido de drogas en sangre por Culex autosampler,
SFME y Mini 12, (H) muestra el perfil de concentración de la sangre entera de sitagliptina por el sistema (Reimpreso con permission133.
Copyright 2017 Future Science).