Manual Bioquimica Enfermeria 2019

UNIVERSIDAD DE LA SERENA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FACULTAD DE CIENCIAS
MANUAL DE BIOQUIMICA
ENFERMERÍA
2019
PROFESORES:
VERÓNICA PLAZA SANTANA
LUIS CASTILLO BARAHONA
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
GRUPO FECHA ACTIVIDAD DE LABORATORIO

L1 09/09 ESPECTROFOTOMETRIA DE PROTEÍNAS
L2 16/09
L3 13/09
L4 27/09
L1 23/09 PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
L2 07/10
L3 04/10
L4 11/10
L1 14/10 CINETICA ENZIMÁTICA
L2 21/10
L3 18/10
L4 25/10
L1 28/10 METABOLISMO DE LOS AZÚCARES
L2 11/11
L3 15/11
L4 22/11
L1 18/11 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
L2 25/11
L3 29/11
L4 06/12
L1 02/12 EXTRACCIÓN DE ADN Y ELECTROFORESIS
L2 09/12
L3 13/12
L4 20/12
TODOS 27/11 (14:30 PRUEBA PRACTICA
HRS)
TODOS 23/12 (08:00) PRUEBA ESCRITA
EVALUACIÓN: Ponderación de Laboratorio en el curso de
Bioquímica: 25%
EVALUACIÓN PONDERACIÓN
Prueba 25%
práctica
Prueba 25%
escrita
Informes 30%
Seminarios 10%
Quiz de 10%
entrada
TOTAL 100%
• La Prueba Practica sera evaluada en grupos de 4

alumnos, los cuales tendran que resolver de
manera experimental diversos problemas (lab 1-4).
• La Prueba escrita, es una evaluacion individual que
se realizara al final del semestre e involucra todos
los laboratorios.
• Con cada laboratorio realizado debe de realizarse
un informe de laboratorio (4 alumnos maximo). (Ver
modelo de informe y rubrica mas abajo)
• Los seminarios se realizaran en clases, en el cual los
alumnos deberan de exponer diversas tematicas
de bioquimica relacionadas con la enfermería.
• Los Quiz de entrada se realizarán en todos los
laboratorios, donde se evaluará el laboratorio a
realizar y el laboratorio anterior.
ASISTENCIA: Se requiere de un mínimo de asistencia de

70% a las sesiones de laboratorio. Las inasistencias pueden
ser justificadas con el (la) Director (a) de Escuela, de no
ser así le corresponderá rendir un examen de manera
automática para aprobar la asignatura.
RÚBRICA PARA EVALUACIÓN DE INFORMES DE PRÁCTICOS
Criterios generales del informe Puntaje
No respeta las Se respeta parcialmente las instrucciones, presentes en Confecciona todo el informe
Formato de informe instrucciones, presentes en el paper “elaboracion de un articulo cientifico” según las normas exigidas en el
el paper “elaboracion de un (0,2 ptos) paper “elaboracion de un
articulo cientifico” articulo cientifico”.
(0 pto) (0,5 ptos)
Presenta un número mayor a 10 faltas de ortografía. Presenta un número menor o igual a 10 faltas de ortografía.
Faltas de ortografía
(0 (0,5 ptos)
pto)
Introducción y objetivos
Resumen y Abstract No entrega una visión Entrega una visión general Entrega una visión Entrega una visión resumida
resumida del tema a del tema. (0,2 ptos) resumida del tema a del tema a estudiar en
estudiar. (0 pto) estudiar en español – español – ingles, incluyendo
ingles. ademas palabras claves. (0,3
(0,2 ptos) ptos)
No entrega una visión Entrega una visión general Entrega una visión general Entrega una descripción
general del tema a estudiar, del tema a estudiar, sin del tema a estudiar, con un general del tema, basada en
Redacción de la Introducción o realiza una copia textual marco teórico y sin marco teórico apoyado en al la literatura disponible, la
de la guía y/o páginas de referencias. (0,3 ptos) menos una referencia. cual es citada en la sección
internet. (0 pto) (0,5 ptos) “Referencias
Bibliográficas”.
(0,7 ptos)
No se explicitan, o no Son una copia literal de la Son una leve modificación Son originales y acordes a las
Objetivos generales
tienen relación con las guía o están de los objetivos actividades propuestas.
y/o específicos
actividades redactados ejemplificados en (0,3 ptos)
realizadas. (0 pto) incorrectamente. (0,1 pto) la guía. (0,2 ptos)
Metodología
Es una copia del protocolo Describe en forma Describe forma incompleta Describe el procedimiento
experimental presente en la incompleta el el procedimiento experimental realizado
Elaboración del guía, en informes de procedimiento experimental considerando completo,considerando
procedimiento semestres anteriores, o experimental sin considerar materiales, métodos y materiales, métodos y
experimental describe los procedimientos métodos y técnicas técnicas utilizadas. (0,3 técnicas utilizadas en el
sin utilizadas, o no menciona ptos) laboratorio. (0,5
coherencia. (0 pto) materiales utilizados. ptos)
(0,1 pto)
Resultados
Es plagio total o parcial, o Describe de manera Describe de manera Describe de manera
no los presenta. (0 pto) desordenada unos pocos ordenada gran parte de la ordenada y completa toda
Registro escrito de las resultados, o no hace información obtenida, y la información obtenida,
observaciones recopiladas referencia a las figuras, hace referencia a las figuras, haciendo referencia a las
en las actividades tablas o ejemplos de tablas o ejemplos de figuras tablas o ejemplos de
cálculos. Los datos no cálculos. Solo algunos datos cálculos. Todos los datos
contemplan incluyen unidades. (0,3 incluyen unidades. (0,5
unidades. (0,2 ptos) ptos) ptos)
Presenta solo una Las figuras no presentan Las figuras están elaboradas Las figuras presentan título,
Confección de figuras aproximación de las figuras, título o una breve en forma incompleta breve descripción de su
(imágenes, tablas, cuadros sin descripción, o presenta descripción, o éstas son (rótulos, unidades, escala, representación y están
y/o cálculos) obtenidas en figuras que no corresponden erróneas o incompletas tamaño) o no tienen real correctamente elaboradas
las actividades a sus observaciones en el (rótulos, unidades, escala, coherencia con lo (rótulos, unidades, escala,
laboratorio. tamaño). observado. (0,3 ptos) tamaño, color). (0,5 ptos)
(0 pto) (0,2 ptos)
Discusión
Sólo describe los resultados Analiza sólo algunos de los Analiza los resultados Analiza todos los resultados
obtenidos o realiza un resultados obtenidos y no obtenidos y esperados sin obtenidos y esperados y
análisis erróneo de los los compara con contextualizarlos ni realiza proyecciones
Análisis de resultados mismos. (0 pto) bibliografía pertinente. proyectarlos en un marco contextualizadas en un
(0,5 ptos) teórico pertinente, marco teórico pertinente,
fundamentado en al menos fundamentado en al menos
una referencia. (1,0 pto) dos referencias de distinto
autor.
(1,5 ptos)
Conclusiones
Resume o discute No se relacionan con los Se relacionan sólo con Son originales y se
Elaboración de los resultados objetivos planteados o son algunos de los objetivos relacionan con los
conclusiones obtenidos. erróneas. planteados. objetivos planteados y la
(0 pto) (0,2 discusión.
ptos) (0,3 (0,5 ptos)
ptos)
Referencias
Escribe referencias sin considerar el formato solicitado.
Escribe todas las referencias de acuerdo al formato.
Referencias bibliográficas
(0 (0,5
pto) ptos)
TOTAL
Nombres _____________________________________ ____________________________________ Carrera:______________ (Suma de puntaje)
_____________________________________ ____________________________________
PRELABORATORIO BIOQUIMICA
I.- UTENSILIOS DE LABORATORIO
Identifique los siguientes materiales e instrumentos de laboratorio, indicando

su tipo y función.
Material Nombre Función Material Nombre Función

Material Nombre Función Material Nombre Función
Equipo Nombre Función Equipo Nombre Función
II.- GRÁFICAS: RELACIÓN ENTRE DOS VARIABLES
Realice el gráfico de la actividad enzimática de la catalasa con los

siguientes datos entregados, y reconozca la variable dependiente e
independiente.
x y
pH Velocidad
de Reacción
(µmoles/min)
4,0 75
5,0 143
6,0 240
7,0 410
8,0 330
9,0 210
Variable dependiente:
_______________________________
Variable independiente:
________________________________
Según los datos entregados, ¿Cuál es el pH óptimo para la catalasa?

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
III.- REGRESIÓN LINEAL
a) Con los siguientes datos realice el gráfico de la relación entre la Absorbancia y
la concentración del ácido tánico (ppm), determine la ecuación de la recta y
coeficiente de correlación.
x y (A) Ecuación de la recta:

(ppm) ______________________________________________
1 0,050 Valor de R2:
2 0,097 ______________________________________________
4 0,182
6 0,278
8 0,383
10 0,464
12 0,533
14 0,617
16 0,702
18 0,708
20 0,870
b) Se aplican dos tratamientos de purificación a una misma solución con
polifenoles, realice su gráfico y determine la ecuación de la recta y coeficiente
de correlación. ¿Cuál de los dos tratamientos sería mejor para lograr conservar
la mayor cantidad de polifenoles?
Ensayo A:
Ensayo A Ensayo B
Ecuación de la recta:
x y x y
___________________________________________
(mg/L) (A) (mg/L) (A)
1 0,143 1 0,024 Valor de
2
2 0,270 2 0,044 R :_________________________________________
3 0,392 3 0,067 __________________
4 0,532 4 0,096
Ensayo B:
5 0,639 5 0,109
Ecuación de la recta:
_____________________________________________
Valor de
2
R :___________________________________________
c) Se pretende cuantificar la cantidad de proteína de una muestra problema de
caseína, la proteína presente en la leche. Para ello se dispuso de una batería
de tubos que contienen una concentración conocida de dicha proteína y se
midió su absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda óptima,
obteniéndose los siguientes resultados.
Tubo B 1 2 3 4 5 MP
Concentración
(mg/ml) 0 1 2 4 8 10 X
Absorbancia a 540
nm 0 0,034 0,071 0,142 0,277 0,345 0,176
Ecuación de la recta:____________________________________________________
Valor de R2:_____________________________________________________________
Concentración muestra problema: ______________________________________
IV.- Tutorial para el uso de Regresión Lineal en Calculadora Científica CASIO
fx-82 MS o similar
1.- Formatear Calculadora: SHIFT + MODE, luego ALL. (Deberá aparecer

RESET ALL)
2.- Modo Regresión Lineal: MODE+REG+LIN. (En la parte superior de la X Y
pantalla, deberá aparecer REG). 1 2
3.- Ingreso de Datos: Ingresar los datos como par ordenado X, Y . Por 2 4
ejemplo (ver tabla del costado derecho): 1, 2 M+ (Aparecerá en la 3 6
pantalla n=1), luego seguir ingresando 2, 4 M+, 3, 6 M+, 4, 8 M+, 5, 10 4 8
M+. (el n final deberá de ser n=5). 5 10
4.- Calculo de Coeficiente correlación r: SHIFT + 2, luego r y presionar =.
Deberá de obtener un r=1. (Según este ejemplo).
5.- Ecuación de la Recta: SHIFT + 2, luego A y presionar =. SHIFT + 2, luego B
y presionar =. De esta forma usted puede representar la ecuación de la
recta: y= A+Bx, Y= 0+2X (Según el ejemplo).
6.- Obtención de X o Y esperado: Si usted desea saber el valor Y posible si
tiene un X de 3, debe de poner 3 en la calculadora y luego SHIFT + 2 ŷ ,
deberá de obtener un y de 3.
V.- BIBLIOGRAFÍA
Realice una búsqueda bibliográfica de los 2 temas que les importen

referentes a su futura profesión y que se relacionen con los contenidos a
tratar en el curso de Bioquímica. Realice referencia de 1 trabajo para cada
tema según las normas APA.
Página 1: http://www.scielo.cl
Tema:
_________________________________________________________________________
Artículos encontrados:
_________________________________________________________________________
Referencia:
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
Página 2: http://www.pubmed.org
Tema:
_________________________________________________________________________
Artículos encontrados:
_________________________________________________________________________
Referencia:
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
Laboratorio 1: Espectrofotometría de Proteínas
1.1. INTRODUCCIÓN
La espectroscopia estudia la capacidad que poseen las moléculas para

absorber y emitir radiación electromagnética (luz).
1.1.1. Naturaleza de la luz
Las radiaciones o energía electromagnéticas se propagan, según la teoría

ondulatoria, mediante ondas, y podemos definirlas con dos parámetros: su
longitud de onda y su frecuencia.
La longitud de onda (λ) es la distancia lineal entre dos crestas de onda, y se

expresa en nanómetros (nm) o angstroms (Å) (Figura. 1.1).
Figura 1.1. Representación de una longitud de onda,
La Frecuencia (f) es el número de ondas que se producen en un segundo, y

la unidad es el Hertz (Hz), que equivale a los ciclos/seg-1.
La relación entre estos parámetros se establece como lo muestra la siguiente

fórmula:
c _ (1)
Donde corresponde a la longitud de onda; c corresponde a la velocidad

de la radiación, que varía según el medio que esté atravesando y
corresponde a la frecuencia de una onda .
El espectro electromagnético cubre un intervalo muy amplio de longitudes
de onda (Figura 1.2).
Figura. 1.2. Espectro electromagnético.
En los laboratorios de investigación se trabaja fundamentalmente con las

regiones visible y ultravioleta del espectro, en el rango de longitudes de
onda que va desde los 180nm a 700nm.
La región visible es un conjunto de radiaciones que conocemos como luz
blanca, pero es capaz de descomponerse es los colores que figuran en la
siguiente tabla:
Longitud de onda (nm) Color

350- 430 Violeta
430- 495 Azul
495- 555 Verde
555- 600 Amarillo
600- 650 Naranja
650- 700 Rojo
1.1.2. Interacción de la luz con la materia
Cuando se hace incidir un haz de luz sobre un átomo, molécula o ion, se

produce una alteración en su estructura electrónica de acuerdo con la
energía de la radiación. Los cambios que se pueden producir son:
- Transición de un electrón a un nivel energético superior.
- Cambios vibracionales en los enlaces covalentes.
- Cambios rotacionales sobre los enlaces covalentes.
El cambio que necesita mayor energía para producirse es la transición de
electrones, y el que necesita menos energía es la alteración en el modo de
rotación electrónica.
Cada uno de estos cambios necesita una cantidad exacta de energía para
producirse y varía según la composición atómica y el tipo de unión química
de átomos o moléculas.
Existe una serie de grupos químicos llamados cromóforos que, al estar

presentes en la molécula, le confieren color y presentan absorción a
longitudes de onda características. Es el caso del grupo C=C, que tiene un
pico de absorción a 190nm, o del grupo N=O, a 320nm. Los compuestos que
posean estos grupos pueden medirse de manera directa.
Otros grupos, llamados auxócromos, no producen color por sí mismos, pero

pueden desplazar la longitud de onda de un cromóforo hacia valores
mayores o menores, las moléculas que poseen estos grupos pueden medirse
en el espectro visible sólo de manera indirecta. Es el caso del grupo C-Br, C-
I, C-OH, etc.
En una molécula compleja, su espectro de

absorción refleja la suma de las energías
necesarias para producir los cambios
electrónicos en su estructura. Podemos
representar el espectro de absorción, por
ejemplo, el azul de metileno, enfrentando la
energía absorbida y las longitudes de onda del
haz de luz incidente (Figura 1.3).
Esto permite identificar la presencia de una
Figura 1.3. Espectro de absorción del azul
molécula en una solución problema, ya que los
de metileno.
picos de absorción son característicos para
cada especie molecular.
1.1.3. Ley de Lamber-Beer
Cuando un haz de luz incide sobre una muestra en disolución (medio

homogéneo), parte de esa energía queda retenida en la muestra
(absorción) y parte de ella se transmite.
Por tanto, la intensidad de esa radiación en el inicio (Io) es mayor que su

intensidad después de atravesar la muestra (I) (Figura 1.4).
Figura 1.4. La intensidad de la radiación
disminuye al atravesar la muestra.
La relación numérica entre estas intensidades, inicial y final, se llama

Transmitancia (T).
𝐼
𝑇= (2)
𝐼𝑜
Normalmente se expresa en porcentaje de transmitancia:
𝐼
% 𝑇 = × 100 (3)
𝐼𝑜
Existe una relación logarítmica entre la cantidad de energía transmitida
(transmitancia) y la cantidad de energía absorbida (Absorbancia).
1
𝐴 = − log 𝑇 (4) 𝐴 = l og (5)
𝑇
Esto es importante, ya que la energía que podemos detectar es la

transmitida, y no la absorbida.
Lambert demostró que la cantidad de luz absorbida por la muestra es

proporcional al camino recorrido por la luz (espesor del recipiente) y Beer
demostró que la absorbancia de una muestra en disolución es directamente
proporcional a su concentración.
De esta manera, la ley Lambert-Beer queda como sigue:
𝐼𝑜
𝐴 = 𝐿𝑜𝑔 = 𝑎 × 𝑏 × 𝑐 (6)
𝐼
Dónde:
a = (coeficiente de absorción específico o absortividad). Es la absorción que
presenta la muestra en disolución cuando su concentración es 1g/L y el
espesor del recipiente es de 1 cm. Cuando la concentración de la
muestra se expresa en moles/L, este coeficiente de denomina
absortividad molar o coeficiente de absorción molar (e).
b = espesor del recipiente o cubeta, se expresa en cm.

c = concentración de la muestra en disolución.
1.1.4 Limitaciones de la ley Lambert-Beer
1.1.4.1. Radiación monocromática

Esta técnica debe realizarse empleando haces de luz monocromática, es
decir, de una única longitud de onda, ya que si se emplean varias longitudes
de onda se producirán diferencias en los coeficientes de absorción dando
lugar a variaciones significativas en la absorbancia.
1.1.4.2. Linealidad
Si representamos gráficamente la absorbancia de una muestra problema a
distintas concentraciones, obtendremos una curva lineal que parte del eje
de las ordenadas y las abscisas (Figura 1.5).
Absorbancia "
Concentración " Concentración "
Figura 1.5. Diferencias entre la relación logarítmica del porcentaje de transmitancia y la

concentración y la relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra.
Sin embargo, a elevadas concentraciones, se producen interacciones

moleculares, que impiden la absorción de energía igual que en la muestra
diluida. Por ello, al trabajar debemos asegurarnos de que nos encontramos
en el rango de concentraciones que presentan una relación lineal con la
absorbancia (linealidad).
1.1.4.3. Asociaciones
La asociación de un soluto y un disolvente puede dar lugar a reacciones

que produzcan dos o más especies moleculares absorbentes. En este caso
se producirán interferencias y no se cumpliría la ley Lambert-Beer.
1.2. Instrumentación de la espectroscopía ultravioleta-visible
1.2.1 Componentes de un espectrofotómetro
La Figura 1.6 muestra los componentes fundamentales de un

espectrofotómetro de forma esquemática. Básicamente son cinco:
1. Fuente de radiación.
2. Selector de longitud de
onda
3. Recipiente para la
muestra.
4. Detector.
5. Dispositivo de lectura.
Figura 1.6. Componentes de un espectrofotómetro.
Tabla 1. Componentes de los espectrofotómetros y sus características

Component Características Tipos Ejemplos
e
Fuente de Las lámparas deben: Para trabajos en región visible
Lámpara de
radiación - Ser de intensidad del espectro se emplean
Tungsteno
(lámparas) elevada. lámparas con un filamento de
- Cubrir un rango de tungsteno, ya que cubren un
longitudes de onda rango de longitudes de onda
amplio entre 350 y 950nm.
-Permanecer En la región UV se utilizan
estables, es decir, lámparas de descarga de
mantener una hidrógeno o deuterio. Son Lámpara de
intensidad constante lámparas con un arco de Deuterio
a lo largo del tiempo. descarga relleno de uno de
- Tener un tiempo de esos dos gases. Alcanzan
vida largo. longitudes de onda entre 190 y
- Ser de bajo costo. 370nm. Su vida es más corta que
la de las lámparas de tungsteno
y deben mantenerse unas
precauciones al ser
encendidas.
Selector de La luz que se obtiene Pueden ser filtros o
longitud de no es estrictamente monocromadores y,
onda monocromática, con dependiendo del sistema
una sola longitud de elegido, el aparato recibe el Luz
onda, sino que nombre de foto-colorímetro, si Blanca
comprende un lleva filtros (dispositivos que
intervalo de detienen por absorción ciertas
longitudes de onda radiaciones, siendo
que se denomina transparentes para otras), o
Prisma
(sistema de dispersión)
ancho de banda, y espectro-fotómetro, si lleva
que consta de una monocromador. Los selectores
longitud de onda pueden ser de gelatina o de
nominal, que es vidrio coloreado, y realizan una
donde se halla la transmisión selectica de
máxima intensidad radiaciones. Otros son
de luz. Cuanto más interferenciales, y consisten en
estrecho sea este una fina película sobre la que se
ancho de la banda releja el haz de luz y da lugar a
mejor será el la destrucción de unos colores
monocromador. Se mientras otros aumentan su
re-quiere un sistema intensidad.
de dispersión y una
red de difracción.
Recipiente Reciben el nombre Las de vidrio se utilizan Dispersión de la luz en una
red de difracción
para las de cubetas y puedennormalmente para la región
muestras ser de sección
visible del espectro, pero no
cuadrada o redonda sirven en la región ultravioleta,
(tubos). ya que estas longitudes de
Generalmente, onda no atraviesan el vidrio.
tienen un ancho
Las cubetas de cuarzo sirven
interior (camino
indistintamente para laCubetas
región de Cubetas de
óptico) de 1cm, porvisible o ultravioleta, pero tienen
Vidrio Cuarzo
eso se prefieren las de
el inconveniente de ser muy
sección cuadrada,
caras y de rayarse con
que al tener los lados
facilidad.
paralelos, ofrecen
Las más utilizadas son de
Cubetas de
mayor exactitud en material plástico. Son Plástico
las medidas. desechables y con ello se
Pueden ser de
eliminan las interferencias por
distintos materiales.
ralladuras en la cubeta o una
mala limpieza de las mismas.
Esquema de un tubo
Detector Es el sistema que Suelen ser tubos fotomultiplicador
convierte la señal fotomultiplicadores. Están
luminosa en señal formados por un cátodo de un
eléctrica. metal sensible a la luz, que es
capaz de emitir electrones en
forma proporcional a la
cantidad de energía radiante
incidente.
La señal se amplifica por una
serie de dínodos (electrodos
utilizados para lograr la emisión
secundaria de electrones), de
manera que aumenta
considerablemente la
sensibilidad del aparato.
Dispositivo Una vez que la señal En modelo de haz sencillo es
de lectura eléctrica amplificada necesario realizar un pre-ajuste Luz
sale del detector de la señal de referencia,
pasa a los sistemas de haciendo pasar el haz de luz por
lectura. Pueden ser la cubeta vacía, con agua
galvanómetros o destilada o con el diluyente
sistemas de lectura empleado en la técnica; de
digital. También esta manera obtenemos el cero
pueden procesarse de absorbancia o el 100% de
en un ordenador y transmitancia. Posteriormente,
pasar a la impresora. podemos realizar la medida de Disolvente Muestra
la muestra problema. Cada vez puro problema
que se modifica la longitud de
onda seleccionada, podemos
repetir esta operación.
Los aparatos de doble haz
incorporan un sistema que
desdobla el haz de luz
Fotomultiplicador
procedente de la fuente de ò
radiación, de manera que uno
incide sobre la cubeta de Lectura
referencia y otro sobre la
cubeta con la muestra
Espectrofotómetro de
problema. Estos aparatos doble haz.
permiten la realización de un
barrido automático de
longitudes de onda, cosa que
no es posible en los de has
sencillo. Como ventaja estos
últimos son más sencillos y su
costo es menor que los de doble
haz.
1.3. APLICACIONES DE LA ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
1.3.1. Detección e identificación de compuestos
Basándose en la capacidad de algunos grupos químicos para absorber luz

de determinada longitud de onda (cromóforos), podemos realizar la
detección de estos grupos en un compuesto desconocido y asignarle una
estructura. Esto se emplea, por ejemplo, en el análisis cualitativo de
barbitúricos y aminoácidos.
Es importante tener en cuenta que las impurezas presentes en el compuesto
también pueden absorber luz y dar lugar a errores de interpretación. Por ello,
es conveniente emplear previamente una técnica de extracción o
separación selectiva antes de realizar el análisis espectrofotométrico.
1.3.2. Control de purificación
El fundamento es el mismo que en el aparato anterior, pero en este caso

conocemos la estructura del compuesto que se va a purificar y la banda de
absorción máxima a una determinada longitud de onda.
La presencia de impurezas se detecta por las interferencias producidas en
las bandas de absorción. Continuaremos el proceso de purificación hasta
que el coeficiente de absorción molar alcance un valor constante. Esto se
realiza habitualmente para controlar la pureza de los preparados
terapéuticos a base de vitaminas A, C y D.
1.3.3. Análisis cuantitativo
Es una de las aplicaciones más empleadas en el laboratorio de diagnóstico

clínico. Consiste en determinar la concentración de una sustancia en una
muestra problema, siempre que se cumplan las condiciones de la ley de
Lambert-Beer.
Podemos realizarlo con dos métodos: La curva de calibración o el método
de punto final con estándar.
1.3.4. Curva de calibración
Consiste en realizar distintas diluciones de concentración conocida de la

sustancia que vamos a analizar. Hallamos la absorbancia que corresponde
a cada una de las concentraciones y representamos gráficamente.
Obtendremos lo que se llama curva de calibración, aunque un trozo de la
misma debe ser una recta.
Hallamos la absorbancia de la muestra problema y extrapolamos en la
curva para ver su concentración. La concentración de la muestra problema
debe estar incluida en la zona recta de la curva de calibración, lo cual
indica que se cumple la ley Lambert-Beer.
Si la concentración se sale de esta zona, debemos diluir la muestra problema
hasta que se encuentre en el intervalo correcto.
1.3.5. Punto final con estándar
Consiste en utilizar una dilución patrón o estándar de la sustancia que

vamos a analizar, con una concentración conocida.
Hallamos la absorbancia de este patrón, de modo que se cumple la

expresión:
𝐴𝑝 = 𝜀 × 𝑏 × 𝐶𝑝 (7)
Ap = Absorbancia del patrón.
Cp = Concentración del patrón.
Hallamos la absorbancia de la muestra problema y también se cumplirá la
ecuación:
𝐴𝑝𝑟 = 𝜀 × 𝑏 × 𝐶𝑝𝑟 (8)
Apr = Absorbancia de la muestra problema.
Cpr = Concentración de la muestra problema.
? ×@ ×AB
Si relacionamos las ecuaciones (7) y (8), tendremos: 𝐴𝑝 = ? ×@ ×ABC (9)
Teniendo en cuenta que ε y b son iguales en ambas ecuaciones, podemos
despejar y obtenemos:
𝐴𝑝 𝐶𝑝 𝐶𝑝 × 𝐴𝑝𝑟
= → 𝐶𝑝𝑟 = (10)
𝐴𝑝𝑟 𝐶𝑝𝑟 𝐴𝑝
Como vemos, es un método rápido y sencillo para calcular la concentración
de una muestra problema, pero el error es mayor que en el método de la
curva de calibración, ya que el patrón puede estar degradado o no tener
la concentración que indica el envase.
Espectrofotometria y proteinas
Las proteínas organizan la mayor parte de los procesos vitales a todos los
niveles (celular, tisular y orgánico), constituyendo alrededor del 50% del peso
seco del organismo. De hecho, la identidad de un individuo viene
determinada por el conjunto de proteínas. La forma externa, el color y tipo
de cabello, la estatura, la forma de la cara, etc., son circunstancias escritas
de algún modo en el mensaje genético de cada organismo y expresadas
mediante proteínas.
ESTRUCTURA Y NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS:
Las proteínas son polímeros de unidades sencillas

llamadas aminoácidos (aa). Dos moléculas de aa
pueden unirse de forma covalente a través de un
enlace amida sustituido, denominado enlace
peptídico, formando un dipéptido. Este enlace se
forma por la eliminación de moléculas de agua
(deshidratación) del grupo α carboxilo de un aa y el
grupo α amino de otro aa (Figura.1.7). Por lo tanto,
mediante este enlace de condensación, es posible Figura .1.7 Reacción de condensación
formar cadenas de aa, las que van desde un simple para la formación de un enlace
peptídico entre aminoácidos.
dipéptido, oligopéptido o un complejo polipéptido
(Figura.1.8).
La reacción inversa a la condensación es la hidrólisis de los enlaces
peptídicos, esta aunque corresponde a una reacción exergónica, tiene
lugar lentamente debido a su alta energía de activación. Por lo tanto los
enlaces peptídicos de las proteínas son bastante estables con una vida
media de alrededor de 7 años en condiciones extracelulares.
Los grupos α amino y α carboxilo libres de los

péptidos se ionizan de la misma forma que los
aa, pudiendo encontrarse protonado, de ion
doble (“zwitterión”) y desprotonado. De esta
forma es posible formar largas cadenas de aa,
Cuando un polipéptido está formado por
muchas unidades de aminoácidos se habla ya
de una holoproteína. En esta, la cadena de
monómeros se pliega sobre si misma de un Figura .1.8. Unión de dos aminoácidos mediante
un enlace peptídico.
modo especial. La forma que adquiere una
proteína después de su plegamiento determina
el tipo de molécula con la cual va interaccionar, por lo tanto determina su
función. Además, una holoproteína se puede unir a una molécula no
proteica, llamada grupo prostético, para formar una heteroproteína: si el
grupo prostético es un glúcido, la proteína se denominara glicoproteína; si
es un lípido, lipoproteína; si es un ácido nucleico, nucleoproteína.
En la gran mayoría de los aminoácidos naturales el grupo amino se

encuentra enlazado con el carbono, que lleva también el grupo carboxilo.
Este carbono se denomina alfa, el cual es asimétrico ya que posee cuatro
constituyentes diferentes entre sí: grupo carboxilo, un radical y un grupo
amino (Figura .1.9).
Figura.1.9. Estructura de un aminoácido
Figura.1.10. Estructura de un polipéptido
La forma definitiva que adquiere una proteína es la consecuencia de

sucesivos plegamientos de la cadena polipeptídica (Figura.1.10). Cada uno
de dichos plegamientos se denomina estructura, y existe un orden
jerárquico, de tal modo que la estructura primaria condiciona la secundaria,
esta a su vez la terciaria, la cual lo hace a la cuaternaria.
ACTIVIDADES EXPERIMENTALES
OBJETIVOS:
- Conocer distintos métodos directos e indirectos de detección y
cuantificación de proteínas.
- Realizar curvas de calibración para cada método.
- Compara métodos para cuantificación de proteínas (ventajas y
desventajas).
- Determinar la concentración de proteínas para una muestra desconocida.
- Conocer el grado de pureza de una muestra problema.
I. MÉTODO DE BIURET
INTRODUCCIÓN
El método de Biuret se fundamenta en que al
añadir una solución fuertemente alcalina de
sulfato cúprico (CuSO4) a una solución de
proteína, se obtiene como resultado la
formando enlaces de coordinación y
estableciendo un complejo entre el ion cúprico
y los enlaces peptídico (nitrógenos amídicos),
expresado en la aparición de una coloración
violeta-púrpura (Figura 1.11). La
Figura 1.11. Formación complejo de Biuret
determinación de proteína se realiza midiendo
la absorbancia en espectro visible a una
longitud de onda 540 nm.
MÉTODO: Realización curva de calibración a diferentes concentraciones de

Seroalbúmina bovina (BSA) por medio del método colorimétrico de Biuret.
MATERIALES E INSTRUMENTOS:
- Pipetas
- Tubos de ensayo
- Gradilla
- Baño Termoregulador
- Espectofotómetro
- Cubetas de Espectofotómetro
REACTIVOS:
- Reactivo de Biuret
- Seroalbúmina bóvina (BSA) 10 mg/ml
- Muestra problema de proteína
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1) Prepare cada tubo según la tabla de formulación entre la albúmina

patrón (10 mg/ml) y el disolvente luego agregue el reactivo de Biuret
según lo indica la tabla.
Concentración
N° V (mL) albúmina V (mL) V (mL) de reactivo
albúmina
Tubo patrón disolvente de Biuret
(mg/ml)
1 0 3,0 3,0
2 0,3 2,7 3,0
3 0,6 2,4 3,0
4 0,9 2,1 3,0
5 1,2 1,8 3,0
6 1,5 1,5 3,0
7 1,8 1,2 3,0
MP 3,0 3,0
2) Colocar cada tubo en el baño térmico a 37°C durante 10 min.

3) Mezclar y distribuir cada muestra en una celda fotométrica
4) Medir a 540nm de longitud de onda.
5) Repita la medición a la misma longitud de onda para la solución
proteica desconocida cuantificada por el método de Biuret.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
1. Graficar la curva de calibración del método de Biuret (Concentración
BSA v/s Absorbancia).
2. Calcular la concentración de proteínas de la muestra problema a través
de este método.
3. Calcular la absortividad de la muestra problema.
II. MÉTODO DE BRADFORD
El método de Bradford se fundamenta en que el reactivo de Bradford es un
colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido
fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno
hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se
puede medir fácilmente. Debido a su forma de reconocimiento es
relativamente sensible a la presencia de contaminantes en la muestra tales
como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol, los que
podrían alterar la medición. Su principal ventaja es que resulta más rápido y
fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la
medida de directa de absorbancia a 280nm. La sensibilidad del método
varía entre 1-15 µg de proteína.
MATERIALES E INSTRUMENTOS:
- Pipetas
- Tubos de ensayo
- Gradilla
- Espectofotómetro
- Cubetas de Espectofotómetro
REACTIVOS:
- Reactivo de Bradford
- Seroalbúmina bóvina (BSA) 1 mg/ml
- Muestra problema de proteína
1) Prepare cada tubo según la siguiente tabla entre la albúmina patrón (1

mg/ml) y el disolvente. Finalmente agregue el reactivo de Bradford
según lo indica la tabla.
Concentración
N° V (µL) albúmina V (µL) V (mL) de reactivo
albúmina
Tubo patrón disolvente de Bradford
(mg/ml)
1 0 300 3
2 10 290 3
3 20 280 3
4 30 270 3
5 40 260 3
6 50 250 3
7 60 240 3
MP 300 3
2) Mezclar bien cada tubo y dejar incubar por 10 minutos a temperatura
ambiente.
3) Medir absorbancia a 595nm.
1. Graficar la curva de calibración del método de Bradford (Concentración
BSA v/s Absorbancia).
2. Calcular la concentración de proteínas de la muestra problema a través
de este método.
3. Calcular la absortividad de la muestra problema.
LABORATORIO 2: PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
Dependiendo de la composición y secuencia aminoacídica, estructura

tridimensional de las proteínas, o formación de proteínas conjugadas es que
estas poseen diversas propiedades en cuanto a solubilidad, estructura,
estabilidad, etc.
Especificidad y Variabilidad
Cada proteína es específica de cada individuo o grupo de individuos. Es
decir, las características de un organismo se deben a su constitución
proteica. La especificidad se establece según ciertos niveles. Algunas
proteínas, de hecho, han conservado su estructura a lo largo de la
evolución, es como es el caso de la histona, proteína presente en gran parte
del reino animal. Otras en cambio, parecen presentarse únicamente en
algunas líneas evolutivas y ser específicas de algunos taxones, por ejemplo,
la hemoglobina solo se encuentra en los vertebrados.
Amortiguadora del pH
De acuerdo a la composición de las proteínas, podemos decir que poseen
un carácter anfótero: se pueden comportar como ácidos o como bases
liberando o captando protones del medio. De esta forma pueden
neutralizar las variaciones del pH que se produzcan en el medio acuoso
donde se encuentren.
Solubilidad
En muchos casos, las proteínas son macromoléculas de elevado peso
molecular, solubles en soluciones acuosas a base de aguay soluciones
salinas diluidas (en algunos casos de proteínas de membrana es necesaria
la presencia de algún jabón o agente solubilizante). En estas condiciones las
proteínas forman soluciones coloidales traslucidas u opalescentes cuya
viscosidad depende de la concentración y del tamaño de las proteínas que
forman dichas soluciones. En solventes orgánicos tienden a interactuar más
entre sí que con el medio.
Comportamiento eléctrico
Los aminoácidos polares con carga (positiva o negativa) confieren a las
proteínas, a su vez, una carga eléctrica que le permite moverse en un
campo eléctrico. La carga neta de la proteína es la suma aritmética de las
cargas positivas y negativas; por ejemplo, una proteína con tres unidades
de ácido aspártico, dos de ácido glutámico y una lisina tendrá a pH 7 una
carga neta de -4, por lo que en un campo eléctrico se desplazaría hacia el
polo positivo. Este movimiento hace posible la separación de los distintos
componentes proteicos de un extracto, por medio de electroforesis de
proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida.
Estabilidad
La estructura final de una proteína, denominada estructura nativa, es su
conformación más estable en las condiciones llamadas fisiológicas
(temperatura entre 20 y 37 °C y pH próximo al neutro). Esta estructura se
mantiene en virtud de enlaces e interacciones débiles (puentes de
hidrogeno, fuerzas de Van der Waals). Si las condiciones de temperatura y
pH cambian, elevando la temperatura por encima de 70°C o haciendo el
medio muy acido o muy alcalino, los enlaces que mantienen unida la
estructura final se desestabilizan y se rompen. Este proceso se conoce como
desnaturalización.
Las proteínas dependiendo de su composición química, pueden

desempeñar un sin número de funciones, tales como: estructural (queratina,
colágeno, elastina), enzimática (enzimas), reguladora (Proteína G),
mensajeros química (hormonas), motora (miosina y actina), defensiva
(inmunoglobulinas), transporte (hemoglobina) y reserva energética
(ovoalbúmina).
Actividades Experimentales
2.1. EFECTO DEL pH EN LA CARGA DE UN AMINOÁCIDO BÁSICO
OBJETIVO: - Determinar los pKa y el punto isoeléctrico del aminoácido

Lisina.
INTRODUCCIÓN
Las curvas de titulación, también

llamadas curvas de valoraión se
realizan modificando el pH de la
solución. Por lo general se utiliza un
compuesto básico como el hidróxido
de sodio para aumentar el pH. Al
adicionar la misma concentración de
una base en un volumen constante su
forma de representarlo en como los
equivalentes de los moles añadidos de Figura 2.1. Curva de titulación de la Lisina
OH-. El aumento de pH no es
directamente proporcional si la solución contiene soluciones
amortiguadoras, o un o varios compuestos anfóteros como los aminoácidos
o las proteínas.
Las curvas de titilación de aminoácidos proporcionan la siguiente

información:
- Medida del pKa de los grupos ionizables: corresponde a la misma
concentración de dos formas iónicas de un mismo compuesto o solución
amortiguadora.
- Regiones de capacidad amortiguadora: mesetas donde se localizan los pKa,
dichas regiones se encuentran en el intervalo de una unidad sobre y una unidad
bajo el valor del pKa.
- Formas ionizables del aminoácido en cada rango de pH.
- Carga eléctrica del aminoácido en cada rango del pH
-Punto isoeléctrico (pI): se localiza entre los pKa. De existir dos formas iónicas
corresponde al valor intermedio de estos, de existir tres o más formas iónicas
corresponde el pH en el cual la carga neta es cero.
- Solubilidad relativa del aminoácido en cada rango de pH.
MÉTODO: Curva de titulación del aminoácido básico lisina
1) Preparar una solución de lisina 1% a pH 1.3.

2) Titular con 10mL de NaOH 0,1M.
3) Registrar el cambio de pH con pHmetro.
4) Repetir pasos 2 y 3 hasta alcanzar un pH 13.
- Completar la siguiente tabla y calcular los milieqivalentes de base
adicionada
CONCENTRACIÓN GASTO DE NaOH (ML) MILIEQUIVALENTES DE PH

NaOH (M) NaOH
- Graficar datos e interpretar valores de pI y pKa.

2.2. PROPIEDAD AMORTIGUADORA DEL pH DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
OBJETIVO: - Evaluar la capacidad amortiguadora de las proteínas.
INTRODUCCIÓN:
En las cadenas polipeptídicas de las proteínas los grupos alfa - carboxilo de los
aminoácidos, (salvo los terminales) se encuentran constituyendo los enlaces
peptídicos. De este modo los grupos que pueden cargarse eléctricamente son:
Carboxilos libres de los aminoácidos dicarboxílicos, cuyo pK fluctúa alrededor de 4;
delta-amino de la lisina, guanidina de la arginina, fenol de la tirosina, sulfhidrilo de
la cisteína, cuyos pK son superiores a 9 e imidazol de la histidina cuyo pK en las
proteínas es de 5,6 a 7,0. Estos grupos se comportan como ácidos débiles y
confieren a las proteínas la capacidad de actuar como amortiguadores del pH.
MÉTODO: Titulación con ácido en presencia de indicador que vira entre límites
donde se supone que existe propiedad amortiguadora.
SUERO SANGUÍNEO
1) Depositar en vaso precipitado 2ml de Agua destilada y 1ml de Suero Sanguíneo.
2) Agitar la solución.
3) Añadir 3 gotas de Rojo de Metilo.
4) Titular con HCl 0,01 N hasta que se logre distinga un cambio en la coloración
(amarillo - anaranjado).
5) Registrar el Gasto de HCl utilizado en la titulación.
SUERO DESPROTEINIZADO
1) Depositar 1 ml de suero sanguíneo en un tubo de ensayo y llevar a baño
termorregulador (100°C) durante 2 minutos. (Se logrará apreciar un precipitado
de color amarillo)
2) Añadir al tubo de ensayo 2ml de Agua destilada.
3) Moler precipitado con una varilla y Filtrar.
4) Adicionar 3 gotas de Rojo de Metilo
5) Titular el filtrado con HCl 0,01 N hasta que se aprecie un cambio en la coloración
(amarillo - anaranjado).
6) Registrar el Gasto de HCl en mL utilizado en la titulación.
CONTROL
1) Tomar 3mL de Agua destilada y adicionar 3 gotas de Rojo de Metilo
2) Titular con HCl 0,01N hasta que se note un cambio en la coloración
(intensificación del color rojo)
3) Registrar el Gasto de HCl utilizado en la titulación.
1. Completar la siguiente tabla con los valores obtenidos del gasto y los
miliequivalentes de HCl.
MUESTRA CONCENTRACIÓN HCL (N) GASTO DE HCl (ML) MILIEQUIVALENTES DE HCl
Suero Sanguíneo
Suero
desproteinizado
Control
2.3. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA.
OBJETIVO: - Determinar el punto isoeléctrico de la caseína.
INTRODUCCIÓN
La caseína representa el 80% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida, existen cuatro tipos de caseína: a, b, g y k, todas
estas precipitan del líquido cuando este cambia a un pH determinado. En este
estado, se dice que la proteína se encuentra en su punto isoeléctrico.
Los grupos ácidos o básicos libres de las cadenas polipeptídicas se ionizan en
función del pH del medio. De su número y su grado de ionización depende la carga
neta de la proteína. Al pH en que el número de cargas eléctricas positivas y
negativas es igual, la proteína está eléctricamente neutra y se dice que se
encuentra en su punto isoeléctrico (pI). A este pH, correspondiente al pI, la
solubilidad de la proteína es mínima. La caseína tiene un pI definido, cuyo valor se
encuentra entre 3,5 y 6,2.
Figura 2.2. Aminoácidos, en forma catiónica (izquierda), aniónica (izquierda) y sin carga (centro).
MÉTODO: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína
1) Enumerar 9 tubos de ensayo.

2) Al tubo N° 1, añadir 3,2 ml de Ácido Acético 1N
y 6,8 ml de agua destilada. (Agitar)
3) Añadir 5ml de H2O destilada a los 8 tubos
restantes.
4) Obtener 5ml del tubo N°1 y depositar en el tubo
N°2. (Agitar).
5) Continuar del mismo modo hasta llegar al tubo
9 del cual se sacan 5 mL y se eliminan.
6) Agregar rápidamente, 1ml de solución de
Caseína en Acetato de Sodio 0,1N a todos los
tubos. Mezclar al instante. Nota:
7) Registrar el efecto inmediato y el que se produce
después de 30 minutos en los diferentes tubos. Ecuación de Henderson–
Hasselbalch
[IJK]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log [áNOPQ]
EXPRESIÓN DE RESULTADOS:
1. A partir de los datos obtenidos calcule la concentración en miliequivalentes de

ácido, base y el pH de cada tubo, teniendo en cuenta que el ácido acético
tiene un pKα de 4,7.
Obs. Obs.
Tubo Meq [Ácido] Meq [Base] pH
iniciales Finales
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2. Indicar el pI aproximado en función de la solubilidad observada.

2.4. ACCIÓN DEL ALCOHOL A DIFERENTES TEMPERATURAS SOBRE LAS
PROTEÍNAS DEL SUERO SANGUÍNEO.
OBJETIVOS: - Estudiar la precipitabilidad de las proteínas por solventes

orgánicos.
- Estudiar el efecto de la temperatura sobre la desnaturalización
de las proteínas en presencia de solventes orgánicos.
MÉTODO: Precipitación y re- disolución de las proteínas séricas.
1) Tomar tres muestras de suero sanguíneo y depositarlas en tubos de ensayo.

2) Agregar a una de ellas 3 volúmenes de etanol de 95º equilibrado a temperatura
ambiente. A la otra agregar etanol 95º equilibrando a la temperatura de una
mezcla frigorífica (-10ºC aproximadamente) y la última con una mezcla a 40°C.
3) Mantener cada muestra durante 30 minutos a la temperatura del alcohol
utilizado.
4) Diluir 1: 4 cada muestra con solución de NaCl 0,15 M. Llevar a temperatura
ambiente.
5) Variar las condiciones del experimento: volúmenes de etanol, temperatura,
tiempo de incubación, cantidad y composición del diluyente final.
1. Anotar el efecto del etanol sobre la solubilidad y desnaturalización (puesto en

evidencia por la coagulación) de las proteínas del suero sanguíneo a las
temperaturas elegidas.
Tubo Temperatura (°C) Observaciones

1
2
3
2.5. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS CON CATIONES Y ANIONES.
OBJETIVO: - Evaluar la solubilidad de proteínas frente a diferentes tipos de

soluciones iónicas.
La mayor parte de las proteínas pueden precipitarse en las soluciones acuosas por
la adición de ciertos ácidos, tales como el tricloroacético y el perclórico, los cuales
forman con la proteína sales insolubles en ácido. Estos reactivos se emplean
comúnmente para “aclarar” los fluidos biológicos o extractos celulares de proteínas
antes de realizar los análisis para determinar la existencia de moléculas de bajo
peso molecular, tales como la glucosa y los aminoácidos.
Otros precipitantes análogos de las proteínas son los ácidos túngstico, ortotúngstico
y metafosfórico. Las proteínas también pueden ser precipitadas por cationes, tales
como Zn+2 y el Pb+2.
Las proteínas se pueden precipitar de las soluciones mediante un agente
precipitante de carga opuesta a la de las proteínas; esto requiere que el pH de la
solución debe ser controlado de tal modo que la proteína quede en el lado ácido
o básico de su punto isoeléctrico.
MÉTODO: Precipitación y redisolución de la proteína con ácido y base.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
1) Enumerar 4 tubos de ensayo.
2) Adicionar a los tubos del 1-4 1ml de HCl 0,1N y a los tubos del 5-8 1ml de NaOH
0,1N.
3) Añadir 1ml de Albúmina a todos los tubos.
4) Agregar a los tubo 1 y 5: 1 ml de Acetato de plomo 10%
5) Agregar a los tubo 2 y 6: 1 ml de Sulfato de Zinc 10%
6) Agregar a los tubo 3 y 7: 1 ml de Tungstato de Sodio 10%
7) Agregar a los tubo 4 y 8: 1 ml de Ferrocianuro de Potasio 1,0%
8) Observar la presencia de precipitado en cada tubo.
1. Registrar en las siguientes tablas la presencia de precipitado con un signo

positivo o la ausencia de este con un signo negativo.
HCL 0,1N NaOH 0,1 N
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO 8
ACETATO DE PLOMO 10% - - - - - -
SULFATO DE ZINC 10% - - - - - -
TUNGSTATO DE SODIO 10% - - - - -
FERROCIANURO DE POTASIO
- - - - - - -
1,0%
2. Determine la carga de proteína en cada medio y la relación entre esta y su
precipitación con iones.
2.6. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
La separación de proteínas en un gel de

poliacrilamida, en placa, vertical se realiza de
acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con
la longitud de la cadena polipeptídíca).
La muestra se trata con SDS (dodecilsulfato sódico),
a mayor concentración que en la composición del
gel y se calienta brevemente a 90-100°C, para
provocar la desnaturalización. Se suele añadir
también β-mercaptoetanol para reducir los puentes
disulfuro, separando así las subunidades de la
proteína y permitiendo que se extiendan por efecto
del SDS.
Permite obtener una estimación de la masa
Figura .2.3. Electroforesis revelada de
molecular de las proteínas separadas. Para ello es proteínas
preciso analizar en la misma electroforesis unas
proteínas patrón, de tamaño conocido, con las que se construye una curva
de calibrado, representando movilidad frente a logaritmo de masa
molecular (Figura.2.3).
Para controlar el avance del frente de electroforesis (posición de máxima
movilidad) se añade a la muestra un colorante marcador.
Ánodo Cátodo
Figura.2.4. Procedimiento para realizar una electroforesis de proteínas

1) Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque

conteniendo buffer de electroforesis o de resolución para proteínas 1x.
asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el
buffer.
2) Depositar una muestra patrón mezclada en el primer pocillo del gel, con
la ayuda de la micropipeta (este permitirá la medición del peso
molecular de la proteína).
3) Depositar una muestra con buffer de corrida en los pocillos restantes
evitando la contaminación del pocillo contiguo.
4) Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del gel,
cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de
los electrodos en la fuente de poder.
5) Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje de 70 V
hasta que el frente haya entrado en el gel separador.
6) Después incrementar el amperaje a 200 V, durante 45 a 60 minutos ó
hasta que se estime conveniente.
7) Desprender el gel de las placas y se realiza la tinción depositando el gel
en una recipiente que contenga colorante (Azul de Coomasie) y
colocarlo la bandeja en agitación constante durante 15 minutos.
8) Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir
la solución desteñidora (Metanol y Ácido Acético 9:1). Poner a agitar
suavemente durante 15 minutos.
9) Observar la electroforesis revelada
1. Dibuje los resultados obtenidos en la electroforesis.

2. Con la información de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis,
realizar la curva de log. movilidad electroforética relativa (Rf) vs log. peso
molecular.
2. Discuta a cerca de la composición de la proteína en función con los

resultados obtenidos.
Laboratorio 3: Factores que influyen en la Actividad enzimática
Las reacciones químicas requieren de catalizadores. Las enzimas son

catalizadores biológicos de naturaleza proteica que poseen una estructura
compleja determinada. Su forma de acción es la reducción de la energía
de activación (energía mínima para desencadenar una reacción
química), de manera tal que aceleran las reacciones que tendrían lugar
de manera espontánea sin perderse ni modificarse en su acción,
permitiendo las reacciones bioquímicas celulares indispensables para los
seres vivos (Figura 3.1.). El incremento en la velocidad de la reacción se
encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reacción en ausencia
del catalizador.
Figura 3.1. Comparación entre la energía de activación

de una reacción química catalizada y una no catalizada.
Las enzimas poseen la propiedad de tener un alto grado de especificidad,

una enzima cataliza una reacción en que participa un sustrato
determinado, lo que se conoce como especificidad absoluta o bien, y de
forma más común, puede actuar sobre una serie más o menos variada de
sustratos semejantes, lo que se conoce como especificidad de grupo. La
enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor
eficacia sobre los sustratos análogos. Por ejemplo, para la enzima sacarasa,
la sacarosa es su sustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa son
sustratos análogos.
La enzima, al ser una proteína, tiene una estructura tridimensional

característica, la porción de la enzima que se une específicamente o
reacciona con el sustrato se denomina centro catalítico o sitio activo. Para
muchas enzimas sus residuos de aminoácidos son suficientes para efectuar
la catálisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en
ausencia de éste no actúa la enzima. El cofactor es un ion metálico como
el Fe2+, Zn2+, Mo2+.
Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molécula
orgánica con características no proteicas, que generalmente se sintetiza a
partir de vitaminas. La coenzima funciona como un co-sustrato cuando se
une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera
al medio durante cada ciclo catalítico.
Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de
enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de
grupo prostético.
La actividad enzimática se encuentra determinada por las condiciones

tales como la cantidad de enzima, sustrato, la temperatura, el pH, el
tiempo de reacción, presencia de cofactores, presencia de moduladores,
presencia de inhibidores, etc.
Actividades Experimentales:
3.1. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
β FRUCTOFURANOSIDASA.
OBJETIVOS: Estudiar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una

reacción enzimática.
INTRODUCCIÓN:
La temperatura es un factor que puede favorecer o perjudicar las
reacciones catalizadas por enzimas, puesto que menos dentro de cierto
margen, las reacciones enzimáticas se comportan como reacciones
químicas ordinarias, en donde su velocidad aumenta con la temperatura
(Figura 3.2). La diferencia que existe con las enzimas es que se llega a un
punto en el que a temperaturas altas, la enzima se inactiva por el calor. El
rango de temperatura en el cual una enzima mantiene una conformación
estable, competente desde el punto de vista catalítico, depende de (y, por
lo general, excede de manera moderada) la temperatura normal de las
células en las cuales reside.
Velocidad de reacción
Temperatura
Figura. 3.2 Relación entre velocidad de reacción y temperatura de una reacción química catalizada.
La razón entre las velocidades de reacción a dos temperaturas que difieren

en 10 grados se denomina coeficiente de temperatura o Q10 y en las
reacciones enzimáticas las enzimas se inactivan por desnaturalización, la
magnitud de ésta, a una determinada temperatura depende del tiempo de
incubación, por lo cual no puede hablarse de “temperaturas óptimas”
como caracterización cinética de una enzima.
FUNDAMENTO: Determinación de la velocidad de la hidrólisis de la sacarosa por la

β-fructofuranosidasa a diferentes temperaturas.
REACTIVOS:
- Glucosa-Fructosa 0,01 M
- Sacarosa 0,45 M
- Preparación enzimática
- Buffer Citrato 0,2 M
- Reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS)
1. Preparar baños de incubación a 0ºC, 10°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C y 70°C.
2. Disponer una serie de 7 tubos de ensayo, en el que tres tubos estarán en
cada temperatura. Agregar los componentes del sistema enzimático,
excepto el sustrato. Mezclar
3. Equilibrar cada tubo con sus respectivos controles a las diferentes
temperaturas de incubación elegidos a iniciar la reacción con el sustrato.
4. Incubar exactamente durante 40 minutos. Detener la reacción con 3,5-
dinitrosalicilato. Completar volumen a 20 mL con agua.
5. Medir absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 540
nm.
Tabular los datos consignados: números del tubo, temperaturas de incubación,

lectura espectrofotométrica, µmoles de productos aparecidos y la velocidad de
la reacción.
Gráficar de la velocidad de la reacción en función de la temperatura.
3.2. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA β -FRUCTOFURANOSIDASA
OBJETIVO: Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción

enzimática.
INTRODUCCIÓN:
El efecto del pH en la cinética enzimática se debe a cambios en el estado de
ionización de los componentes del sistema enzimático (enzima libre, complejo
enzima-sustrato, sustrato). Es imposible que la enzima reaccione sólo con una
especie iónica de un sustrato ionizable o tenga diferente afinidad con las diferentes
especies iónicas del sustrato, sino que la enzima posee numerosos grupos ionizables
que se ven afectados por el pH al que se encuentren sometidas. Si se varía la
ionización de estos grupos a nivel del sitio activo o en algún punto lejano, pero que
de algún modo altere el sitio activo se afecta el tipo de unión y estabilidad del
complejo enzima-sustrato o la actividad catalítica misma.
Dentro de los grupos ionizables, los que se encuentran mayormente cargados son
los grupos carboxilos (negativos) y las aminas protonadas (positivos). La ganancia
o pérdida de grupos cargados cruciales afecta de manera negativa la unión al
sustrato, de modo tal, que atrasa o anula la reacción.
Las enzimas son activas en un rango limitado de pH y la mayoría de los casos, se
puede encontrar un pH o una zona de pH en la cual la actividad enzimática es
mayor, lo que se denomina pH óptimo (por lo general un pH entre 5 y 9). Hay que
considerar además, que la enzima puede inactivarse por desnaturalización a pH
extremos y que la estabilidad de la enzima o los sustratos frente a diversos agentes
desnaturalizantes puede variar en función del pH. La naturaleza de la solución
amortiguadora también puede interferir.
FUNDAMENTO:
Determinación de la velocidad de la hidrólisis de la sacarosa por la β-
fructofuranosidasa, a diferentes pH.
REACTIVOS:
- Glucosa-Fructosa 0,01 M
- Sacarosa 0,45 M
- Preparación enzimática
- Buffer Citrato 0,2 M
- Reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS)
1. Preparar soluciones amortiguadoras a partir de citrato 0,2 M con pH 2,4; 3,4;

4,4; 5,4; 6,4 y 7,4. Tomar como centro de la escala de pH el pK del ácido de
la solución amortiguadora.
2. Rotular 6 tubos de ensayo con los pH anteriormente mencionados,
adicionar 1ml de buffer (diferente a cada tubo), añadir 1ml de sacarosa
0,45 M y 1ml de enzima diluida (1/100)
3. Equilibrar los tubos a temperatura de incubación obtenida a partir del
experimento anterior e iniciar la reacción con el sustrato.
4. Incubar exactamente durante 40 minutos y a la temperatura previamente
establecida.
5. Detener la reacción agregando 2,0 mL de solución 3,5-dinitrosalicilato.
6. Desarrollar el color incubando todos los tubos en baño hirviente durante 5
minutos. Enfriar.
7. Completar con agua destilada a volumen de 20 mL.
8. Leer la Absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda de
540 nm.
Tabular los datos considerando: Nº de tubo, pH, lectura colorimétrica, µmoles de

producto producidos y la velocidad de reacción.
Confeccionar una gráfica de velocidad de la reacción en función del pH.
3.3. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE SACAROSA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA β -FRUCTOFURANOSIDASA.
OBJETIVOS:
- Estudiar la relación de la concentración de sustrato en la velocidad de una
reacción enzimática.
- Calcular constante de Michaelis-Menten
INTRODUCCIÓN:
La concentración de sustrato determina la actividad enzimática medida como
la velocidad de la catálisis enzimática. Si la concentración de la enzima se
mantiene saturada, la producción de producto será a una velocidad máxima.
Según la cinética micheliana las enzimas que poseen este comportamiento en que
la velocidad de reacción depende principalmente de la concentración de sustrato
pueden representarse en una gráfica descrita por la
ecuación de Michaelis-Menten que corresponde a
una hipérbole rectangular (Figura 3.3):
Los ejes representan a la velocidad de reacción v en
la ordenada y la concentración de sustrato [S] en la
abscisa.
Donde Km (constante de Michaelis-Menten)
representa a la concentración del sustrato que se
encuentra a la mitad de la velocidad máxima Figura. 3.3.
Km Representación gráfica de la
experimentada por la reacción. Km (constante de Ecuación de Michaelis-Menten.
Michaelis) es una constante propia de cada enzima
bajo condiciones determinadas.
La ecuación que representa a la recta es la ecuación de Michaelis-Menten:
𝑉𝑚á𝑥 × [𝑆]
𝑣=
𝐾𝑚 + [𝑆]
Las condiciones en que ocurren estas reacciones
enzimáticas, rara vez son saturadas de sustrato, por
lo cual esta relación nos permite calcular los
parámetros bajo estas condiciones cambiantes de
sustrato y enzima en un tiempo determinado.
A veces los datos cinéticos experimentales no

permiten graficar con precisión la cinética
micheliana. Existen variadas formas de graficar en
esos casos, con el fin de determinar los parámetros
de Vmáx y Km se utiliza la doble recíproca de la
ecuación de Michaelis, conocida como expresión Figura 3.4. Representación gráfica de la
de Lineweaver-Burk (Figura 3.4), cuyos ejes doble reciproca o Lineweaver-Burk.
representan a la reciproca de la velocidad (1/v) y la
reciproca de la concentración de sustrato (1/[S]).
La ecuación que determina esta recta proviene del lineamiento de la ecuación
de Michaelis-Menten:
1 𝐾𝑚 1 1
= × +
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚á𝑥
La representación gráfica de ésta ecuación corresponde a la recta anterior, cuya
WX [
pendiente es YXáZ , su ordenada en el origen es YXáZ , y su abscisa en el origen
[
corresponde a - WX .
La gráfica de Eadie-Hofstee que se basa en el

reordenamiento algebraico de la ecuación de Michaelis-
Menten para transformarla en una recta (Figura 3.5):
𝑣
𝑣 = −𝐾𝑚 × × 𝑉𝑚á𝑥
[𝑆]
Donde los ejes son v en la ordenada y v/[S] en la abscisa.
Mientras que la pendiente es negativa y corresponde a -
Km, el intercepto es Vmáx y la intersección con la abscisa
Figura 3.5. Representación YXáZ
gráfica de Eadie-Hofstee.
equivale a WX .
La gráfica de Hanes-Woolf posee como ejes a [S]/v en la ordenada y [S] en la

abscisa (Figura3.6). La ecuación que la determina es:
[𝑆] 1 𝐾𝑚
= × [𝑆] + (16)
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 𝑉𝑚á𝑥
[
En donde la pendiente es YX, el punto que
intersecta al eje de la abscisa corresponde a la
-Km, y el que intersecta al eje de la ordenada
WX
corresponde a YX .
Figura 3.6. Representación gráfica de
Hanes-Woolf
FUNDAMENTO: Determinar de la actividad enzimática de una preparación de

β-fructofuranosidasa en presencia de diferentes concentraciones de sacarosa
como sustrato.
REACTIVOS:
- Solución de glucosa-fructosa 0,01 M.
- Soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones.
- Reactivo 3,5-dinitrosalicilato.
- Buffer acetato pH = 4,7 0,05 M
- Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un
producto 5 moles/min.
Enumerar tubos del 1 al 6 y adicionar concentraciones de sacarosa: 0,45M; 0,3M;

0,2M; 0,1M; 0,05M; y 0,03M.
Agregar a cada tubo el resto de los componentes del sistema enzimático,
excepto la preparación enzimática. Mezclar. Equilibrar los tubos a la temperatura
de incubación e iniciar la reacción agregando la preparación enzimática.
Incubar exactamente durante el tiempo y a la temperatura previamente
establecida.
Detener la reacción agregando 2 mL de reactivo 3,5-dinitrosalicilato.
Desarrollar el color de todos los tubos, llevándolos a un baño de agua hirviente
durante 5 minutos. Enfríe.
Complete con agua hasta el volumen de 20 mL
Medir la absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda de 540
nm.
Tabular los resultados consignando número de tubo, concentración molar de

sustrato agregado, concentración molar de sustrato en el volumen interno de
reacción, valor recíproco de la concentración molar de sustrato del volumen de
reacción, relación entre v/S, relación entre s/v, lecturas del espectrofotómetro,
micromoles de producto producido, valor recíproco de la velocidad.
Hacer una gráfica de la velocidad de reacción en función de la concentración
del sustrato (concentración en volumen de reacción). Determinar el valor de
Vmáx y de Km.
Hacer una gráfica del valor recíproco de la v en función del valor recíproco de la
concentración del sustrato (Lineweaver-Burk). Determinar el valor de Vmáx y de
Km.
Hacer una gráfica de la v en la ordenada en función de v/S en la abscisa (gráfica
de Eadie-Hofstee). Determinar el valor de Vmáx y de Km.
Hacer la representación gráfica de Hanes-Wolff
Compare los valores obtenidos y puntualice sus conclusiones.
ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN POR YODOACETATO DE LA HIDRÓLISIS DE LA

SACAROSA CATALIZADA POR LA β -FRUCTOFURANOSIDASA.
OBJETIVOS: Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la

velocidad de una reacción enzimática.
INTRODUCCIÓN:
La velocidad de una reacción enzimática puede ser modificada por
diversas sustancias. Cuando estas disminuyen la velocidad de reacción, se
denominan inhibidores o efectores (moduladores) negativos, y cuando la
estimulan se les llama activadores o efectores (modificadores,
moduladores) positivos.
Dependiendo de la relación con la enzima y su efecto en ella se pueden
clasificar a los inhibidores en principio en dos tipos: reversible e irreversible.
La forma de representar la inhibición gráficamente es doble recíproca de
Lineweaver-Burk.
La inhibición irreversible es la unión covalente del inhibidor con la enzima, lo

que cambia su conformación impidiendo o bloqueando su actividad de
manera permanente, pues su acción es a nivel de sitio activo. Como
ejemplo de un inhibidor irreversible se conoce al diisopropilfluorfosfato.
La inhibición reversible es una unión inhibidor-enzima no covalente, y por

ende sólo es temporal. El complejo enzima-inhibidor se forma y se destruye
de acuerdo con las leyes de los equilibrios químicos. Se han descrito tres tipos
de inhibiciones reversibles de acuerdo con el cambio que experimentan sus
valores de Km y Vmáx: competitiva, no competitiva y acompetitiva.
La inhibición competitiva el inhibidor se

une al centro activo de la enzima,
compitiendo con el sustrato, e
impidiendo la unión del sustrato con la
enzima. En relación con los parámetros
cinéticos, Km aumenta, mientras que la
Vmáx se mantiene constante (Figura 3.7).
La inhibición competitiva puede
compensarse con el incremento de la
Figura3.7. Representación gráfica del efecto concentración de sustrato.
de un inhibidor competitivo. Un ejemplo se este tipo de inhibición en
la reacción de la succinato
deshidrogenasa el sustrato natural en el succinato, mientras que el malonato
actúa como inhibidor.
En la inhibición no competitiva el inhibidor

se une en un sitio diferente al centro activo
en que se une el sustrato. Pueden formarse
compuestos binarios enzima-inhibidor (EI) o
ternarios enzima-inhibidor-sustrato (EIS) los
que no poseen actividad catalítica. Por lo
tanto Km no cambia, pero Vmáx se ve
disminuida (Figura 3.8).
Cualquier tipo de inhibición que no puede Figura 3.8. Representación gráfica del efecto
ser anulada por el simple expediente de de un inhibidor no competitivo.
elevar la concentración de sustrato se designa como no competitiva. En
este caso el sustrato no puede impedir la combinación del inhibidor con la
enzima.
La magnitud de la inhibición, de acuerdo con esto dependerá de la

concentración del inhibidor y de la Ki, y no será influida por la concentración
del sustrato. En general los inhibidores no competitivos son más o menos
específicos. En términos de cinética, los inhibidores no competitivos típicos
disminuyen la velocidad máxima (Vmáx) de la reacción, pero no afectan
Km de la enzima.
La inhibición acompetitiva se caracteríza porque el inhibidor sólo se une al

complejo enzima-sustrato (ES). El resultado es un cambio es proporcional en
la Km y la Vmáx (Figura 3.9).
Figura 3.9. Representación gráfica del efecto de un inhibidor acompetitivo.
El tema inhibición de suficiente importancia como para requerir especial

consideración; así tenemos que los más potentes venenos de los organismos
vivos, ejercen su acción por inhibición de determinadas enzimas. El uso
juicioso de inhibidores en células intactas, extractos homogeneizados, cortes
de tejidos, etc., ha producido un gran volumen de información detallada
sobre el mecanismo íntimo de acción de sistemas enzimáticos complejos.
FUNDAMENTO: Determinar de la velocidad de la hidrólisis de sacarosa a diferentes

concentraciones por la β-fructofuranosidasa, en presencia de una concentración
constante de yodoacetato.
REACTIVOS:
- Yodoacetato 0,001 M
- Solución de glucosa-fructosa 0,01 M.
- Soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones.
- Reactivo 3,5-dinitrosalicilato.
- Buffer acetato pH = 4,7 0,05 M
- Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un
producto 5 moles/ minuto.
1. A partir de seis concentraciones conocidas de sustrato iniciales: 0,45 M; 0,3
M; 0,2 M; 0,1M; 0,05M y 0,03M (con concentraciones finales entre 3M y
0,01M, en el volumen de incubación).
2. Calcular una concentración de yodoacetato que en la mezcla final de
reacción quede entre 1x10-4 y 1x10-3 M.
3. Colocar una serie de tubos la cantidad de yodoacetato calculada, el
amortiguador y la preparación enzimática, disponer para cada tubo de
una concentración de sacarosa determinada.
4. Disponer de una segunda serie semejante a la anterior con iguales
componentes del sistema enzimático, pero con agua en lugar de
yodoacetato.
5. Pre-incubar ambas series de tubos durante 3 minutos a la temperatura que
se usará en la reacción enzimática.
6. Hacer los controles más indispensables.
7. Iniciar la reacción en cada tubo, agregando las cantidades calculadas de
sustrato. Permitir que ocurra la reacción controlando el tiempo en cada
tubo.
8. Al término del tiempo detener la reacción con 2,0 mL de reactivo 3,5-
dinitrosalicilato.
9. Desarrollar el color de todos los tubos, llevándolos a un baño de agua
hirviente durante 5 minutos. Enfriar.
10. Complete con agua hasta el volumen de 20 mL
11. Medir la absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda
más adecuada.
1. Tabular los resultados consignando número de tubo, concentración molar
de sustrato agregado, concentración molar de sustrato en el volumen
interno de reacción, valor recíproco de la concentración molar de sustrato
del volumen de reacción, concentración del inhibidor, lecturas del
colorímetro, micromoles de producto producido, valor recíproco de la
velocidad.
2. Hacer una gráfica de la velocidad de reacción en función de la
concentración del sustrato para ambas reacciones con y sin inhibidor.
Determinar el valor de V y de Km con y sin inhibidor.
3. Hacer una gráfica del valor recíproco de la velocidad en función del valor
recíproco de la concentración del sustrato (gráfica de Lineweaver-Burk)
para las reacciones con y sin inhibidor. Determinar el valor de V y de Km con
y sin inhibidor.
4. Comparar Km y Vmáx de la reacción en presencia y ausencia del inhibidor.
5. Determinar tipo de inhibicion.
LABORATORIO 4: METABOLISMO DE LOS Glúcidos
INTRODUCCIÓN
TRANSPORTE DE NUTRIENTES
La absorción que se produce en el intestino consiste en el pasaje de las
sustancias nutritivas a la sangre, a través del epitelio intestinal y los capilares
sanguíneos. En este proceso, es muy importante la intervención de las
membranas de la célula que constituyen los tejidos.
Algunas sustancias, como el agua, pueden atravesar las membranas

simplemente por difusión; otras, en cambio, necesitan ser transportadas por
proteínas especiales, cuya actividad requiere de un aporte extra de
energía. La glucosa, los aminoácidos y algunos componentes de las sales
minerales, como el sodio, el potasio, el calcio y el hierro, son transportados
de esta segunda manera. Los nutrientes son transportados en el plasma, el
componente líquido de la sangre.
Pero los productos de la digestión no llegan a todas las células del organismo
directamente, sino que pasan por el hígado. Los capilares sanguíneos de las
vellosidades intestinales se reúnen en la vena porta, que llevan la sangre
desde el intestino hacia el hígado. Las sustancias procesadas en él salen a
través de la vena hepática.
Algunos productos de la digestión de los lípidos, como los ácidos grasos y el

glicerol, no pasan directamente a la sangre. Son absorbidos por los capilares
linfáticos, que se unen y forman vasos de mayor calibre. El contenido de
estos vasos se vuelca en el torrente circulatorio a través de la vena subclavia.
Ciertas vitaminas también son
absorbidas por las vías linfáticas,
que las transportan al hígado para
su almacenamiento o
redistribución.
Finalmente, los productos de la

digestión llegan a las células de los
diferentes tejidos corporales. El
pasaje se produce, nuevamente,
a través de las membranas
celulares (Figura 4.1). Figura. 4.1. Representación esquemática de los procesos
Una vez dentro de cada célula, metabólicos celulares.
los nutrientes serán utilizados-según
su tipo- como fuente de energía, para construir las estructuras celulares que
deben ser reemplazadas o para regular procesos metabólicos. Algunos de
ellos serán transformados en sustancias de reserva.
METABOLISMO
El metabolismo celular es la suma de los procesos físicos y químicos que

ocurren en la célula, mediante los cuales ésta obtiene y usa materia y
energía para realizar trabajos, automantenerse y reproducirse. Está
integrado por numerosas reacciones individuales (por lo general,
catalizadas por enzimas), que interactúan en un circuito complejo,
mantenido y controlado por diversos mecanismos de regulación. Las
reacciones metabólicas se diferencias en dos tipos principales:
Catabólicas: Son reacciones de degradación de moléculas relativamente

complejas (por ejemplo, aminoácidos, monosacáridos, lípidos,
polisacáridos), procedentes del medio extracelular o de sus depósitos de
reservas propios; esas sustancias son transformadas en moléculas más
simples (por ejemplo, ácido acético, dióxido de carbono, agua, amoníaco).
Estas reacciones son, por lo general, de naturaleza oxidativa. Debido a que
las moléculas complejos poseen una cierta cantidad de energía (que se
requirió para su construcción), la degradación de las mismas libera esa
energía; por lo tanto, son reacciones de tipo exergónico. El conjunto de las
reacciones catabólicas recibe el nombre de catabolismo.
La oxidación en los sistemas biológicos es en general una deshidrogenación,
es decir, la pérdida de un átomo de hidrógeno (H) o lo que es equivalente,
la pérdida de un protón (H+) más su electrón (e-) correspondiente. Las
enzimas que catalizan la deshidrogenación de una sustancia deben hacerlo
en conjunto con una coenzima (por ejemplo el NAD) capaz de aceptar los
hidrógenos, porque éstos no pueden circular libremente en el medio
extracelular).
Anabólicas: Son reacciones de síntesis de moléculas relativamente
complejas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos) y de sus
monómeros (aminoácidos, monosacáridos, nucleótidos), a partir de
moléculas precursoras más sencillas, como dióxido de carbono, agua y
nitratos. Son generalmente, reacciones de naturaleza reductiva. Además,
necesitan que se les proporcione energía, por lo cual son endergónico. El
conjunto de las reacciones anabólicas se denominan anabolismo.
La reducción en los sistemas biológicos es, en general una hidrogenación,
es decir la ganancia de un átomo de hidrógeno o, lo que es equivalente, la
ganancia de un protón más un electrón correspondiente. Las enzimas que
catalizan la hidrogenación deben hacerlo en conjunto con una coenzima
reducida (por ejemplo, NAD reducido, representado como NADH) capaz de
ceder hidrógenos.
Por sus características energéticas, estos dos tipos de reacciones son
interdependientes o complementarias: las anabólicas se realizan a expensas
de las catabólicas, es decir, están acopladas. Como ya se ha citado, el
acoplamiento energético está a cargo de un intermediario que,
generalmente, es el ATP.
Existen procesos por los cuales las moléculas combustibles (aquellas que
poseen mucha energía química potencial) son degradadas, y de qué modo
parte de la energía que se libera es conservada en ATP. Estos procesos son:
Fermentación, Respiración aeróbica y respiración anaeróbica.
1. Fermentación: Se realiza en condiciones anaeróbicas (en ausencia de oxigeno
molecular), es el tipo más sencillo y primitivo de obtención de energía para uso
celular. Podemos distinguir la fermentación alcohólica y la lática.
2. Respiración aeróbica: Un mecanismo más complejo y evolucionado que el

anterior, y en cuyo curso las moléculas orgánicas son degradas en forma
completa hasta dióxido de carbono y agua; en este proceso, los átomos de
hidrógeno obtenidos por las oxidaciones que se llevan a cabo son aceptados,
en última instancia, por el oxígeno molecular.
3. Respiración anaeróbica: un proceso particular de algunas bacterias por el cual

las moléculas orgánicas son degradas por completo, pero los hidrógenos
obtenidos en estas oxidaciones son aceptados por iones nitrato (NO3-) o sulfato
(SO42-) en ausencia de oxígeno.
Estos procesos de degradaciones se efectúan en pasos sucesivos, de

manera gradual, para poder acoplar con mayor eficiencia esas reacciones
a las de formación de ATP.
Además, de este modo es más fácil controlar la marcha del proceso. La
fermentación y la respiración aeróbica comienzan con una serie común de
reacciones que denominaremos glucólisis (expresando generalmente la
degradación parcial de la glucosa).
8.1.1. FUNCIONES DE HÍGADO
La producción de bilis es solo una de las múltiples funciones que cumple el

hígado en el proceso de transformación de los alimentos. En el hígado se
transforman, almacenan y distribuyen los productos de la digestión que se
producen en el hígado: se sintetizan ciertas grasas que son distribuidas por
la sangre a todo el cuerpo; se degradan los aminoácidos que no son
utilizados por las células; se sintetizan ciertas proteínas que componen el
plasma; se degradan sustancias tóxicas y algunos componentes de los
glóbulos rojos.
Otra función importante del hígado es el procesamiento y almacenamiento
de la glucosa. Este monosacárido es el principal producto de la digestión de
los carbohidratos y resulta indispensable para la obtención de energía. En el
hígado se sintetiza un polisacárido de almacenamiento llamado glucógeno,
a partir de glucosa. Por degradación del glucógeno es posible obtener
glucosa en el momento en que el organismo la requiera. El hígado puede
almacenar una cantidad de glucógeno suficiente como para mantener el
funcionamiento del cuerpo durante unas seis horas sin ingerir alimentos.
Otros como, el hierro y ciertas vitaminas, también son almacenados en este
órgano. La intensa actividad del hígado, debido a los numerosos procesos
químicos que ocurren en él, lo convierte en una fuente de calor para el
organismo. Este calor, distribuido por el torrente sanguíneo, contribuye a
mantener la temperatura corporal constante.
ACTIVIDADES EXPERIMENTALES:
4.1. GLUCOGENÓLISIS EN CORTES DE HÍGADO
OBJETIVO: - Estudiar el curso de la degradación del glucógeno en un tejido

animal.
INTRODUCCIÓN
El hígado desempeña muchas funciones importantes, entre ellas el
metabolismo glucosídico de organismo animal, ya que es capaz de
almacenar glucógeno y entregar glucosa a la circulación de acuerdo a los
requerimientos del mismo organismo, de modo que se mantiene un nivel de
glucosa sanguínea aproximadamente constante (glicemia). Es importante
destacar que en la regulación de la glicemia participan otras glándulas
como las suprarrenales y el páncreas. El glucógeno hepático puede
formarse a expensas de glucosa (Glucogenogénesis), como también de
residuos provenientes del metabolismo de hidratos de carbonos, proteínas y
lípidos (Gluconeogénesis). La degradación del glucógeno hasta glucosa se
llama glucogenólisis y se realiza en el hígado, riñones e intestino. Requiere
que la Glucosa.1 fosfato (G1P), producida en la fosforilación del glucógeno,
se convierta a glucosa por acción de la glucosa-6 fosfatasa, liberándose
glucosa al torrente sanguíneo. Esta fosfatasa no ha sido hallada en el
músculo, lo que explica la incapacidad de este tejido para entregar glucosa
a la sangre.
Si se extrae el hígado de un animal bien alimentado, no sometido a un ayuno
previo, y que incube, ya sea en forma de papilla o de cortes, en un medio
salino apropiado desprovisto de sustrato, predomina el fenómeno de la
glucogenólisis. La técnica de los cortes de tejido fue desarrollada
principalmente por Warburg y colaboradores en 1926, en sus estudios sobre
metabolismo tumoral. Entiéndase por corte un trozo de tejido vivo que
conserva la estructura y organización del órgano de origen. El corte está
desprovisto de circulación sanguínea, debe tener un espesor no mayor que
0,3 - 0,5µm para permitir la difusión libre del oxígeno y de metabolitos. Esta
técnica permite efectuar variaciones controladas en el medio de
incubación, y además, analizar químicamente el tejido y el medio para
detectar cambios en los metabolitos.
La glucogenólisis puede estudiarse fácilmente in vitro, incubando cortes de
hígado en soluciones salinas (solución de Krebs) y midiendo la desaparición
de glucógeno del tejido y la aparición de glucosa en el medio de
incubación catiónica; es menor si se remplaza por potasio. La adición de
adrenalina o glucagón estimula la glucogenólisis. Para conocer el contenido
de glucógeno se aprovecha la propiedad del polisacárido de ser extraído
fácilmente con ácido tricloroacético. La concentración de glucógeno así
aislado puede determinarse usando el método del yodo. La cantidad de
glucosa formada se medirá con el método de Somogyi-Nelson.
FUNDAMENTO:
Es posible determinar el curso de la glucogenólisis en cortes de hígado de
un mamífero o un ave, incubados en solución salina de Krebs para esto se
lleva a cabo la cuantificación del glucógeno presente en los cortes
mediante su reacción con el yodo. La cuantificación de glucosa presente
en los líquidos de incubación es cuantificada por el método de Somogyi-
Nelson.
REACTIVOS
- Trozos de hígado.
- Solución de cloruro de sodio a 0,9%
- Solución de Krebs.
- Ácido tricloroacético (TCA) al 5%.
- Reactivo de yodo.
- Solución de glicógeno 0,025%.
- Solución de glucosa al 0,1%.
- Solución de Ba (OH)2 0,3%.
- Solución de ZnSO4 al 5%.
- Reactivo de Somogyi
- Reactivo de Nelson.
- Agua destilada.
MATERIALES
- Tubos de ensayo.
- Placa Petri
- Corcho.
- Papel filtro.
- Mortero
- Hielo.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO Y GLUCOSA
1) Rotular un círculo de papel absorbente delimitando 3 regiones enumeradas
cada una y colocar dentro de una cápsula de Petri (Humedecer con solución
de Krebs).
2) Cortar los trozos de hígado sobre un corcho humedecido con solución de Krebs.
3) Pesar porciones de cortes de hígado de 150mL. Es conveniente que las diversas
porciones no difieran en más de 10mg.
4) Colocar cada porción pesada, dentro de tubos de ensayo que contienen 2mL
de solución de Krebs. Incubar los tubos a 37°C.
5) El primer tubo no se incubará y se utilizará como tiempo cero de la reacción.
Incubar los otros tubos durante 30 y 60 minutos a la temperatura indicada
(37°C).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: CUANTIFICACIÓN DEL GLUCÓGENO

1) Sacar los cortes de hígado y colocar en un mortero que debe contener 5mL de
TCA al 5%. (conservar el líquido en el tubo).
2) Triturar el tejido cuidadosamente y filtrar.
3) El filtrado debe ser guardado en tubos nuevos, enumerados cuidadosamente.
4) Obtenido los filtrados de los tres tiempos de incubación (0, 30 y 60 minutos)
prepare una batería nueva de cinco tubos.
5) El tubo número uno corresponde al blanco y contiene: 2mL de TCA al 5%.
6) El tubo número dos corresponde al patrón y contiene: 1mL de TCA al 5% más
1mL de una solución de glucógeno patrón.
7) El tubo número tres corresponde a 2mL de filtrado que contiene la muestra
incubada a 0 minutos.
8) El tubo número cuatro corresponde a 2mL de filtrado que contiene la muestra
9) El tubo número cinco corresponde a 2mL de filtrado que contiene la muestra
10) Agregar a cada uno de los cincos tubos, 3mL de la solución de yodo y agitar
cuidadosamente.
11) Después de tres minutos, determinar la Absorbancia de cada uno de los tubos
a 540nm.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: CUANTIFICACIÓN DE LA GLUCOSA
ENTREGADA AL MEDIO POR EL HÍGADO
1) Trabajar con (Los líquidos conservados en el procedimiento anterior, paso 1.)

2) Preparar un blanco que contiene: 4,6mL de agua destilada, 0,2mL de Ba(OH)2
0,3N y 0,2mL de ZnSO4 al 5%. Mezclar, filtrar y conservar a temperatura ambiente.
3) Preparar un patrón que contiene: 1mL de una solución de glucosa patrón, 3,6mL
de agua destilada, 0,2mL de Ba(OH)2 0,3N y 0,2mL de ZnSO4 al 5%. Mezclar, filtrar
y conservar a temperatura ambiente.
4) Preparar una batería de cinco tubos de ensayo utilizando los cinco filtrados
(blanco, patrón y las tres muestras incubadas a 0, 30 y 60minutos)
5) El tubo número uno contiene: 1mL del blanco y 1mL de reactivo de Somogyi.
6) El tubo número dos contiene: 1mL del patrón y 1mL de reactivo de Somogyi.
7) El tubo número tres contiene: 1mL de filtrado que contiene la muestra incubada
a 0 minutos y 1mL de reactivo de Somogyi.
8) El tubo número cuatro contiene: 1mL de filtrado que contiene la muestra
incubada a 30 minutos y 1mL de reactivo de Somogyi.
9) El tubo número cinco contiene: 1mL de filtrado que contiene la muestra
incubada a 60 minutos y 1mL de reactivo Somogyi.
10) Colocar todo los tubos en un baño maría a ebullición durante 10 minutos. Enfriar
posteriormente.
11) Agregar a todos los tubos 1mL de reactivo de Nelson, mezclar.
12) Diluir con agua destilada (10mL volumen final), mezclar.
13) Medir absorbancia a 540nm.
1. Tabular los resultados indicando el peso de los cortes, el tiempo de incubación
de cada corte, las lecturas espectrofotométricas, cantidad de glucógeno de
los cortes y de glucosa liberada.
2. Confeccionar una gráfica de los µmoles de glucosa liberada y glucógeno
presente en el medio en función del tiempo de incubación.
3. Hacer un balance entre el glucógeno desaparecido de los cortes y la glucosa
aparecida en el medio de incubación, en términos porcentuales.
4.2. HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ENZIMÁTICA DE UNA DISOLUCIÓN DE GLUCÓGENO
OBJETIVO: - Cuantificar los productos generados por cada una de las

hidrólisis.
INTRODUCCIÓN
La hidrólisis de los enlaces glucosídico del glucógeno pueden ser catalizados
por ácidos o por enzimas. En la hidrólisis con un ácido fuerte hay un
rompimiento de enlaces al azar, formándose inicialmente, además de
glucosa, polisacáridos de menor tamaño molecular (dextrinas) y
oligosacáridos, los cuales finalmente se convierten en glucosa.
La velocidad de la hidrólisis depende de la naturaleza y concentración del
ácido así como la temperatura y tiempo de reacción.
La hidrólisis enzimática del glucógeno se logra con varias enzimas más o
menos específicas, por ejemplo la amilasa salival humana. En esta enzima
también se encuentra en una variedad de tejidos vegetales como también
en el jugo pancreático (amilasa pancreática). La amilasa cataliza la
hidrólisis de los enlaces alfa 1-4, pero no los 1-6, obteniéndose finalmente
maltosa, isomaltosa y glucosa como productos.
FUNDAMENTO:
Los productos generados en la catálisis total del glucógeno pueden ser
cuantificados por espectrofotometría al realizarles el método de Somogyi-
Nelson.
REACTIVOS
- Solución de glucógeno 8mg/mL
- Solución de glucosa al 0,001M.
- HCl 0,6N
- NaOH 0,6N
- Reactivo de Somogyi
- Reactivo de Nelson.
- Una disolución de saliva 1:80
MATERIALES:
- Tubos de ensayo.
- Propipeta.
- Calculadora.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: HIDRÓLISIS ÁCIDA DEL GLUCÓGENO
1) Preparar una serie de ocho tubos de ensayo enumerados correctamente.
2) El tubo número uno corresponde al blanco y contiene: 0,4mL de agua destilada,
0,6mL de HCL 1N y 1mL NaOH 0,6 N.
3) El tubo número dos contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL 1N,
inmediatamente agregar 1mL NaOH 0,6 N.
4) El tubo número tres contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL 1N,
colocar a baño hirviendo por dos minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
5) El tubo número cuatro contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL
1N, colocar a baño hirviendo por cuatro minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
6) El tubo número cinco contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL 1N,
colocar a baño hirviendo por seis minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
7) El tubo número seis contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL 1N,
colocar a baño hirviendo por ocho minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
8) El tubo número siente contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de HCL 1N
colocar a baño hirviendo por diez minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
9) El tubo número ocho contiene: 0,4mL de solución de glucógeno, 0,6mL de HCL
1N colocar a baño hirviendo por quince minutos y agregar 1mL NaOH 0,6 N.
10) Enfriar los tubos expuestos al baño hirviendo.
11) A todos los tubos agregar 1mL de reactivo de Somogyi y se calientan en baño
de agua hirviente durante 10 minutos. Enfriar.
12) Agregar 1mL de reactivo de Nelson y agitar.
13) Diluir los tubos completar 10mL con agua destilada. Agitar.
14) Medir Absorbancia de sus muestras a 540nm.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL GLUCÓGENO

1) Preparar una serie de ocho tubos de ensayo enumerados correctamente.
2) El tubo número uno corresponde al blanco y contiene: 0,4mL de agua destilada,
0,6mL de saliva.
3) El tubo número dos contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL saliva,
inmediatamente agregar 1mL de reactivo de Somogyi.
4) El tubo número tres contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de saliva,
colocar a temperatura ambiente por dos minutos.
5) El tubo número cuatro contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de saliva,
colocar a temperatura ambiente por cuatro minutos.
6) El tubo número cinco contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de saliva,
colocar a temperatura ambiente por seis minutos.
7) El tubo número seis contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de saliva,
colocar a temperatura ambiente por ocho minutos.
8) El tubo número siente contiene: 0,4mL de solución glucógeno, 0,6mL de saliva,
colocar a temperatura ambiente por diez minutos.
9) El tubo número ocho contiene: 0,4mL de solución de glucógeno, 0,6mL de
saliva, colocar a temperatura ambiente por quince minutos.
10) Enfriar los tubos expuestos al baño hirviendo.
11) A todos los tubos agregar 1mL de reactivo de Somogyi y se calientan en baño
de agua hirviente durante 10 minutos. Enfriar.
12) Agregar 1mL de reactivo de Nelson para detener la reacción y agitar.
13) Diluir los tubos, completar hasta 10mL, con agua destilada. Agitar.
14) Medir Absorbancia de sus muestras a 540nm.
1. Calcule la cantidad de glucosa liberada de cada uno de los individuos,
considerando que para un patrón de glucosa 0,02g/L se obtiene una
absorbancia de 0,335 cumpliéndose la ley de Lambert-Beer para una celda de
1cm.
2. Calcule el grado de hidrólisis en cada una de las hidrólisis, tomando en
consideración que el tubo corresponde al 100% de hidrólisis.
3. Confeccione un gráfico de porcentaje de hidrólisis (ácida y enzimática) versus
tiempo de incubación.
4. Compare la eficiencia de la hidrólisis ácida sobre la enzimática y explique esta
eficiencia de catálisis.
Laboratorio 5: Transformación genética
La transformación genética de un organismo implica la incorporación

de un DNA externo a su genoma de manera estable y se utiliza en muchas
áreas de la biotecnología. En agricultura, las plantas se transforman
genéticamente para adquirir características ventajosas tales como la
resistencia al frío, al deterioro y a ciertas plagas. En bioremediación se utilizan
bacterias modificadas para degradar contaminantes del ambiente. En
medicina, algunas enfermedades genéticas podrían tratarse por la
transformación genética del individuo enfermo con copias saludables del
gen defectuoso. Sin embargo, las terapias génicas están aún en fase
experimental.
Para transformar genéticamente un organismo completo, el nuevo
gen debe insertarse en cada célula del organismo. Las bacterias, por ser
organismo unicelulares, son los más fáciles de transformar. Muchas bacterias
son capaces de tomar DNA externo en sus ambientes naturales y adquirirlo
en forma permanente si le otorga alguna ventaja adaptativa. La capacidad
de tomar DNA del ambiente se llama “competencia”.
En condiciones de laboratorio, la competencia se puede inducir

generando una condición de permeabilidad transiente de la membrana
que permita a la bacteria incorporar DNA. El enfriamiento de las células en
presencia de iones Ca2+ prepara a las membranas para aumentar su
permeabilidad en una condición de shock térmico como la que se hará en
el laboratorio.
Plasmidios
Los plasmidios son elementos de DNA extracromosomal de bacterias
y levaduras que se replican de manera independiente del DNA
cromosomal. Generalmente son circulares y de doble hebra y contienen
genes no esenciales para el crecimiento en condiciones normales. Sin
embargo estos genes pueden volverse esenciales en ciertas condiciones
ambientales, entregando a la bacteria una ventaja selectiva. Por ejemplo,
un gen de resistencia a antibiótico no es esencial para el crecimiento pero
sí le entrega a la bacteria una ventaja selectiva en presencia del antibiótico.
Figura 5.1. Mapa del plasmidio

pGFP
En biología molecular, un vector es una molécula de DNA utilizada
como vehículo para introducir material genético en una célula. Los
plasmidios son un tipo de vector muy fácil de manipular en laboratorio para
introducir genes foráneos en bacterias. La figura 5.1 representa el mapa del
plasmidio pGFP que introduciremos en la bacteria Escherichia coli. El
plasmidio tiene los siguientes elementos:
• un origen de replicación, que es un punto inicial para la duplicación

de DNA plasmidial.
• El gen ampR, que codifica para la b-lactamasa, una enzima que

rompe el anillo b-lactámico de la molécula del antibiótico ampicilina,
otorgando resistencia al mismo.
• El gen araC que codifica para la proteína reguladora C, que en

presencia del azúcar arabinosa induce la expresión de los genes bajo
el control del promotor del operón arabinosa.
• El gen gfp, que codifica para la proteína fluorescente verde, que está
ubicado bajo el control del promotor del operón arabinosa.
Regulación del operón arabinosa
El operón arabinosa en la naturaleza contiene los genes necesarios

para el catabolismo del azúcar arabinosa. La figura 5.2 muestra la
construcción artificial presente en el plasmidio pGFP donde en el operón
arabinosa los genes que codifican para las enzimas implicadas en el
catabolismo del azúcar arabinosa han sido reemplazados por el gen gfp
usando técnicas de ingeniería genética.
Figura 5.2. Regulación

del operón arabinosa
El gen araC codifica para la proteína reguladora C que funciona
como un represor o activador de gfp¸ dependiendo de la presencia de
arabinosa. El operón también es sensible a glucosa, porque si ésta baja
aumentarán los niveles de AMP cíclico y habrá mayor concentración de
CAP-AMPc que activa la transcripción del gen gfp. CAP es una proteína
activadora de genes catabólicos que al asociarse con el AMPc incrementa
la transcripción de genes involucrados en la degradación de azúcares
distintos de la glucosa (recordar que en la naturaleza en lugar de gfp están
los genes del catabolismo de arabinosa en este operón).
AraO, araI y P son sitios de control del operón. En ausencia de
arabinosa la proteína reguladora C se une a araO y araI formando un bucle
que impide la transcripción de gfp y araC, controlando la expresión de la
proteína GFP así como su propia expresión (Figura 5.2, Represión). La
represión se produce porque la RNA polimerasa no puede acceder a las
secuencias promotoras. Si el nivel de la proteína C desciende, el bucle se
deshace y en esa condición se transcribe araC hasta que se restablece el
nivel de proteína reguladora. Cuando hay arabinosa, la proteína C cambia
su conformación uniéndose solamente a araI de manera que se deshace el
bucle. Entonces araI se vuelve accesible al complejo CAP-AMPc y la RNA
polimerasa puede acceder al promotor P (Figura 2, Activación). En resumen,
para que haya transcripción de gfp deben estar presentes arabinosa,
proteína C y CAP–cAMP.
Parte experimental: TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
Materiales:
7 asas de inoculación*: sirven para transferir bacterias y para medir 10 µL de
plasmidio ya que están calibradas para retener ese volumen de líquido en
el aro.
4 pipetas de transferencia*: para transferir medio de cultivo.
*Nota: debes dejar estos materiales en la bolsa hasta el momento de su uso
porque la exposición innecesaria podría contaminarlos.
1 tubo con medio LB: para agregar a las bacterias en la fase de
recuperación.
2 tubos con solución de transformación: tienen los rótulos “+PLASMIDIO” y “-
PLASMIDIO”.
Linterna UV: para observar la fluorescencia.
Gradilla de esponja: para colocar los tubos con solución de transformación
en el hielo y en el baño a 42°C.
4 placas con medio de cultivo: tienen rótulos correspondientes a su
composición. No deben abrirse innecesariamente porque podrían
contaminarse.
Basurero: para desechar el material contaminado después de usarlo (asas
de inoculación, pipetas y tubos).
Contenedor con hielo:
para mantener los tubos
a 4° C.
Placa con Escherichia
coli: Estas son las
bacterias sin transformar,
sensibles al antibiótico
ampicilina. De aquí cada
grupo tomará las
bacterias para colocarlas
en los tubos con solución
de transformación.
DNA plasmidial: la
solución contiene el
plasmidio que cada
grupo transferirá a su
experimento usando un
asa.
Masking tape: para cerrar
las placas al finalizar el
experimento.
Baño termostático: es un
baño con agua a 42°C
donde se realizará el shock térmico colocando la gradilla de esponja con
los tubos.
Incubador: es una estufa donde la temperatura se mantiene a 37°C que
sirve para incubar placas con cultivos hasta la sesión siguiente.
Precauciones
Las bacterias con las que se trabajará son aptas para el trabajo en
laboratorio con alumnos, pero sin embargo es necesario tener precauciones
en su manejo. Se debe evitar el contacto con la piel y si esto ocurre
accidentalmente se recomienda lavarse las manos con agua y jabón,
evitando diseminar las bacterias en el ambiente de trabajo. No se deben
tocar las colonias bacterianas con las manos. Las asas de inoculación,
pipetas y tubos, después de su uso quedan contaminados y deben
desecharse en el basurero.
También se debe tener cuidado con las linternas UV, no se debe
iluminar los ojos con esta luz ya que podría resultar un daño en la vista.
Actividades DÍA 1
1. Preparación de células competentes. Los tubos rotulados como –

PLASMIDIO y +PLASMIDIO contienen solución de transformación.
Utilizando un asa estéril toma una colonia de Escherichia coli de la
placa que te dará el profesor. Toma el tubo rotulado con +PLASMIDIO
y sumerge el asa con bacterias completamente en la solución de
transformación. Luego, agita girando el asa entre tus dedos índice y
pulgar hasta que la suspensión se vuelva homogénea. Desecha el asa
en el basurero y cierra el tubo. Con una nueva asa y repite el
procedimiento para el tubo rotulado como –PLASMIDIO. Este tubo
corresponde a un experimento control, donde las bacterias serán
sometidas a todo el tratamiento, pero en ausencia de plasmidio, con
el propósito de comprobar que los resultados finales son atribuibles a
la transformación con el plasmidio.
2. Sumerge una nueva asa estéril dentro de la solución que contiene el

plasmidio que te dará el profesor. Aegúrate de que se forma una
película de líquido en el orificio del asa. Introduce el asa en el tubo
con bacterias rotulado como +PLASMIDIO. Desecha el asa en el
basurero. Cierra el tubo y no agregues DNA plasmidial al tubo –
PLASMIDIO.
3. Coloca los tubos en la gradilla de

esponja e incúbalos en hielo por 10
minutos. Asegúrate de que los tubos
estén en contacto con el hielo para
una adecuada transferencia de
calor.
4. Examina la solución de ADN plasmidial
que contiene el gen de la proteína
fluorescente verde iluminándola con la
linterna de luz UV. ¿Qué esperarías observar?
5. Shock térmico. Utiliza la gradilla de

esponja como soporte para transferir ambos
tubos al baño de agua (a 42ºC), por 50
segundos. Asegúrate que queden en contacto con el baño. Una vez
cumplidos los 50 segundos, vuelve a poner los tubos en hielo e incuba
por 2 minutos. La transferencia entre hielo-baño y baño-hielo debe
realizarse rápidamente para obtener mejores resultados de
transformación.
6. Etapa de recuperación. Saca la gradilla con los tubos del hielo y déjala
en el mesón. Abre el tubo rotulado –PLASMIDIO y utilizando una pipeta
de transferencia agrégale 250 µL de caldo LB. Cierra el tubo y repite
el procedimiento con el tubo +PLASMIDIO y usando una nueva pipeta
de transferencia. Desecha las pipetas en el basurero. Incuba durante
10 minutos a temperatura ambiente. Nota: también puedes mantener
los tubos en tus manos para que la temperatura de recuperación sea
más adecuada.
7. Selección de transformantes. Distribuye las placas de Petri con medio
de cultivo en el mesón sin abrirlas. Las placas contienen lo siguiente:
• LB (Luria Broth): medio de cultivo que provee los nutrientes para
el crecimiento bacteriano.
• Amp: antibiótico ampicilina, inhibidor del crecimiento
bacteriano.
• Ara: arabinosa, azúcar inductor de la expresión de gfp.
8. Golpea suavemente los tubos con tus dedos para mezclar la solución.
Utilizando una pipeta de transferencia para el tubo +PLASMIDIO y otra
para el -PLASMIDIO, toma 100 µL de las soluciones de los experimentos
“de transformación” y “control” y transfiérelas a las placas apropiadas
como indica la figura. Desecha las pipetas en el basurero.
9. Usando un asa para cada placa, esparce las suspensiones por todo
el agar, moviéndola rápidamente de ida y vuelta a lo largo de toda
la superficie. Desecha las asas en el basurero. NO PRESIONES MUCHO
EL AGAR, PUES PUEDE ROMPERSE. No mantengas las placas abiertas
más tiempo del necesario porque podrían contaminarse.
10. Apila tus placas y fíjalas con masking tape. Escribe el nombre de tu
grupo y luego llévalas a la estufa incubadora a 37°C donde deben
permanecer hasta el día siguiente. Durante la incubación el agar
debe estar hacia arriba, como se indica en la figura.
Responde
Apóyate en la siguiente figura para responder las preguntas a
continuación.
1. ¿En cuál de las placas encontrarás bacterias con las mismas características
de aquellas que inicialmente observaste (sin transformar)? Explica tus
predicciones.
2. Si ocurre la transformación bacteriana ¿en cuál o cuáles placas crecerán
las bacterias modificadas genéticamente? Explica tus predicciones.
3. ¿Cuáles placas debemos comparar para determinar si ha ocurrido la
transformación bacteriana? Justifica tu respuesta.
4. ¿Para qué realizamos los experimentos control?
5. Identifica cuáles son los eventos que deben ocurrir para observar el rasgo
fenotípico deseado (la fluorescencia verde)
Actividades Día 2
Una vez incubadas las placas durante toda la noche a 37°C podrás observar
el crecimiento bacteriano, su forma, cantidad, color con luz normal y color
con luz ultravioleta. Registra los resultados en la siguiente tabla.
+PLASMIDIO -PLASMIDIO
LB/amp LB/amp/ara LB/amp LB
¿Qué forma tiene el
crecimiento
bacteriano?
Crecimiento
(césped, colonia)
¿Cuántas colonias
hay?
Con luz normal

Color
Con luz UV
Calculo de la eficiencia de la transformación
La eficiencia de transformación es un dato que nos indica cuán
efectivo fue el experimento en lograr introducir las moléculas de DNA
plasmidial en las células bacterianas. Es un número que representa el
número total de bacterias que crecieron en la placa produciendo colonias
y expresan la proteína fluorescente verde dividido en la cantidad de DNA
plasmidial utilizada.
N° de colonias en la placa de agar
Eficiencia de transformación =
µg de DNA plasmidial en la placa de agar
Para el cálculo de la cantidad de DNA plasmidial en la placa de agar
deberás solicitar al profesor que te indique la concentración de la solución
que se usó en el experimento. Registra este dato a continuación:
Concentración de solución de DNA plasmidial = _ _ _ _ _ _ µg/µL
Para calcular el numerador de la expresión del cálculo de la
eficiencia de transformación tienes que contar las colonias presentes en la
placa LB/amp/ara.
Para calcular el denominador necesitas saber cuánto DNA se
colocaste en la placa. Para esto necesitas el dato de la concentración de
la solución y el volumen de esta solución que colocaste en la placa.
µg de DNA plasmidial = Concentración (en µg/µL) × Volumen (en µL)
Para esto debes tener en cuenta que colocaste 10 µL de DNA
plasmidial sobre 250 µL de solución de transformación y sobre eso
agregaste 250 µL de medio LB. Finalmente colocaste 100 µL de esa mezcla
en la placa con medio de cultivo. ¿Qué volumen de los 10 µL iniciales
están contenidos en los 100 µL que colocaste en la placa?
Cálculos
Laboratorio 6: Extracción de ADN genómico
En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos,

poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-
evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de
ADN con o sin función conocida que proporcionan inform ación sobre la
variación alélica y permiten distinguir individuos. Estos marcadores se
obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase
Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación
en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes. Los datos
moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de
diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección
natural; las interacciones biológicas; la composición, funcionamiento y
dinámica de comu nidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre
otros. La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN
y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en
gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro.
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN

y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está
constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una
doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa),
un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el
azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la
molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de
hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal
A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad

de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como
garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el
tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales,
desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las
proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por
precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la
extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los
numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos
tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del
tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y
redisolución del ADN.
A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de

extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas
positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos
del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de
inhibidores. Los Kits se venden en presentación de membranas de sílice o
perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las
segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina. La
membrana está insertada dentro de un microtubo de polipropileno y las
microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora.
Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a

la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a ésta durante
la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente
la molécula se libera de la matriz.
Los Kits también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen
fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para
precipitar al ADN. Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas
cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y,
utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una
extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del ADN como la
eliminación de contaminantes son muy eficientes.
La selección del método de extracción es un paso fundamental en las

técnicas moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido
disponible y su estado de conservación, la técnica que se aplicará
posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos
económicos y tiempo para obtener resultados. Independientemente del
método seleccionado es recomendable encontrar un equilibrio entre
pureza y rendimiento de acuerdo a la aplicación posterior.
Con la finalidad de que el usuario conozca las diferentes opciones y elija la

más apropiada, de acuerdo con sus objetivos y recursos, en los siguientes
párrafos se describen de manera general las etapas de los protocolos
tradicionales y comerciales, se explican los métodos de análisis
(concentración e integridad de la molécula) y almacenamiento del
extracto.
Protocolos de extracción tradicional y comercial
Para cualquier protocolo es indispensable una buena colecta de muestra,

de la cual dependera que la extraccion de ADN sea exitosa. Por lo tanto,
dependiendo del tipo celular a trabajar, es que hay que tener tecnicas
especiales de trabajo, tal como se detallan a continuacion:
Organismo Colecta en campo/ Almacenamiento de la
transporte de la muestra muestra previo a la
extracción
Plantas En el caso de tejido foliar, Almacenar el tejido a -80
se recomienda colectar °C y evitar ciclos de
tejido joven pues congelación y
contiene más células por descongelación antes de
unidad de peso que el proceder con la
tejido viejo y posee extracción. Se
menos polisacáridos recomienda congelar
y polifenoles que varios paquetes
dificultan la extracción. pequeños de la misma
Una vez colectado, el muestra con la cantidad
tejido debe congelarse de material que será
inmediatamente en procesada.
nitrógeno líquido para Alternativamente, el
evitar la formación de tejido puede ser liofilizado
cristales y que se y almacenado a
sinteticen metabolitos temperatura ambiente
secundarios después de entre 15 y 25 °C, aunque
la abscisión. Si el tejido es esta alternativa no es
obtenido de viable para suculentas.
invernaderos o cultivo in
vitro, no es necesario
congelar el material, se
puede hacer la
extracción directamente.
Animales Tejido Las muestras deben
Cortar el tejido en almacenarse de
pedazos pequeños acuerdo al método de
(aproximadamente colecta utilizado, en
0.5x0.5 cm o menores) etanol a 4 °C o si fue
para facilitar su congelado con
maceración posterior. El nitrógeno líquido a -80 °C
tejido se puede
deshidratar
con etanol al 70 %
(aunque esta opción
puede degradar el ADN
o acarrear
contaminantes) o bien,
congelarse con
nitrógeno líquido. Para
transportar la muestra es
recomendable utilizar un
buffer especializado que
inactive las
endonucleasas, por
ejemplo el RNAlater
(Ambion®). Otra opción
es homogenizar el tejido
en buffer de lisis que
contenga sales de
guanidina o ß-
mercaptoetanol que
inhiben DNasas y RNasas.
Las muestras pueden
mantenerse por unos
días a 4 ºC después de
Sangre su colecta. Si se congela
Utilizar agujas de calibre la muestra a -20 °C,
apropiado, respetar la debe descongelarse a
relación muestra/ temperatura ambiente y
anticoagulante y procesarse en su
homogeneizar totalidad pues una vez
correctamente la descongelada, inicia la
muestra para evitar la hemólisis, por ello es
hemólisis* y/o aconsejable hacer
coagulación**, y la alícuotas.
contaminación
bacteriana. Una vez
obtenida la muestra es
importante evitar
movimientos bruscos
durante el transporte.
Homogeneización del tejido
La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones

entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que
ayudan a liberar el material genético.
a) La homogeneización mecánica incluye el uso de:
Nitrógeno líquido
Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno líquido,

en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno
líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en
el interior de la célula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de
degradación. Este procedimiento, se puede utilizar en tejido fresco o
congelado, por ejemplo semillas, plántulas, tejidos fibrosos o viscosos y
hongos. Es importante considerar que si la muestra ya está congelada, se
deberá disgregar con nitrógeno líquido para evitar la degradación del ADN
por acción de las DNasas.
Pistilos u homogeneizadores
Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la pared del tubo que
contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material
abrasivo como vidrio pulverizado o resinas. El proceso se realiza
manualmente, con pistilos plásticos o con ayuda de dispositivos
electrónicos, conocidos como homogenizadores. Es recomendable
adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones
desnaturalizan a las proteínas y mantienen estable al ADN. Cuando se
utilizan dispositivos es necesario colocar el tubo sobre una cama de hielo, lo
cual evita que el ADN se fragmente por el calor que genera la fricción. El
uso de pistilos u homogeneizadores se recomienda en general para
muestras pequeñas y tejidos blandos, aunque también se usa para tejidos
no fibrosos como hojas jóvenes o flores. No es recomendable utilizar este
método con tejidos congelados, porque las células del interior del tejido se
descongelan antes de entrar en contacto con la solución de lisis y el ADN se
fragmenta por acción de las DNasas. En este caso se recomienda que el
tejido se disgregue en presencia de nitrógeno líquido. Alternativamente se
pueden utilizar el buffers comerciales como RNALater® ICE (Ambion®). La
muestra se sumerge en el reactivo y se mantiene a -20°C toda la noche,
posteriormente se puede descongelar la muestra y macerar sin requerir
nitrógeno líquido (http://
www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM7030M, consultado en
octubre del 2010).
b) Homogeneización química
En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene

en solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y
agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso
pueden perforar la membrana celular. La disgregación química es
recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o
sangre. En tejidos fibrosos es recomendable cortar en fragmentos pequeños
para favorece su disgregación.
Antes de iniciar la homogeneización es necesario contar con información

sobre la cantidad apropiada de tejido que debe utilizarse pues una
disgregación rápida y completa es esencial para asegurar la obtención de
ADN y evitar su degradación. Si se excede la cantidad recomendada se
puede sobresaturar el sistema, con lo que se afecta el rendimiento y
aumentan las impurezas del extracto, de manera que es aconsejable
realizar experimentos preliminares con distintas cantidades de material
inicial para determinar cuál es la cantidad apropiada, en particular en los
sistemas de extracción tradicionales. Por ejemplo, en el caso de tejido
vegetal, el material liofilizado contiene mayor cantidad de células, por lo
que se recomienda utilizar solo el 50% de peso fresco. Si el tejido contiene
una alta cantidad de polisacáridos o polifenoles, se inicia con el 25% del
peso. Sin embargo, si la especie tiene un genoma pequeño es posible
incrementar la cantidad hasta un 50%. En el caso de tejido animal, aunque
el peso o la cantidad inicial sea la misma el rendimiento puede variar
significativamente entre tejidos. En la tabla 2 se muestra la cantidad de
tejido recomendada y el rendimiento esperado cuando la extracción se
lleva a cabo utilizando combos de extracción comercial.
Material Cantidad Rendimiento de ADN (µg)

Hígado de ratón 25 mg 10-30
Vaso de ratón 10 mg 10-40
Espinaca 100 mg 2.0 - 2.5
Arabidopsis thaliana 100 mg 1.8 - 3.1
Alfalfa 100 mg 2.1 - 3.0
Girasol 100 mg 1.6 - 4.0
Hongo 100 mg 1.1 - 1.4
Lisis celular
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que

conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o
destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan
soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten
disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas
que degradan el ADN. Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA,
que forma un complejo con los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento
de las DNasas (Sambrook et al. 1989). Los componentes celulares no solubles
como el material fibroso y proteínas que permanecen en solución se
separan del ADN por centrifugación.
Tanto la homogeneización como la lisis celular son similares en los protocolos

tradicionales y comerciales. Las particularidades del resto de las etapas se
explican, a continuación, independientemente para cada uno de los
protocolos.
1. Protocolo Tradicional
Separación de proteínas y lípidos
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes

orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica
de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las
proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos.La fase acuosa y la
orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los
solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol
isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe
evitar acarrearlos en el proceso de purificación. Figura 6.1.
Figura 6.1.Obtención de ADN genomico con Fenol-isoamil-cloroformo.

(Sambrrook et al., 1989)
Precipitación del ADN
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de
iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla
reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se
pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble.Un paso de centrifugación
permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol
es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al
70% y el remanente se elimina por evaporación.
Redisolución del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN

para mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser
de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis
ácida (http://www.massey.ac.nz/~wwbioch/DNA/hydDNA/framset.htm,
consultado en agosto del 2010). Cuando se utiliza una solución
amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA
a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material. Cuando se está
disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva
pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una opción
que evita la frag mentación consiste en incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas
con agitación suave. En el anexo 3 se explica paso a paso el protocolo
tradicional CTAB.
2. Protocolo Comercial
Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado
En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la mezcla de

lisis se le añade la solución de unión que tiene un pH específico. Antes de
pasar la solución de lisis a través de la columna, se adiciona etanol a la
solución, eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus grupos
fosfato, facilitando con ello la adsorción de la molécula a la membrana
cargada positivamente. Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana
y se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de
centrifugación, mientras que el material genético permanece unido a la
matriz (2B).
El kit con perlas magnéticas además de utilizar soluciones a pH específicos,

utiliza un imán o magneto que atrae a las perlas para separarlas de las
soluciones en las que se encuentran suspendidas. En este caso, se añade a
la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite
cargar positivamente a las perlas, favoreciendo la unión de ADN. Las
proteínas y lípidos tienen baja afinidad por las perlas y son eliminados con
soluciones de lavado a pH fisiológico. Las perlas son retenidas en la pared
del microtubo con el magneto, mientras que la solución con los
contaminantes se eliminan por pipeteo (2B).
Recuperación del ADN de la matriz
En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz,. La membrana y el ADN se

deshidratan con soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después
se recomienda centrifugar nuevamente la columna para evaporar el etanol
y eliminar el exceso de las soluciones. Posteriormente, se adiciona agua o
solución amortiguadora al centro de la membrana, se espera a que el ADN
se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y resuspenderlo.
En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de Tris-

HCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa
de las perlas y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continúan siendo
retenidas por el magneto.
Es necesario saber que la mayoría de los kits tienden a ser generales a la

hora de su aplicación, pero se diseñan con un propósito específico. Por
ejemplo, un kit para extraer ADN de sangre total, considera la presencia de
hemoglobina y eritrocitos durante el proceso. Este método será más agresivo
en comparación con un kit diseñado para extraer ADN de células o tejidos
animales. En los manuales proporcionados por el fabricante se detallan,
además de los pasos a seguir en cada caso, la cantidad de muestra
recomendada y el rendimiento esperado de acuerdo al tipo de tejido
(Invitrogen 2005). Esta información debe tomarse en cuenta al momento de
elegir un kit.
Determinacion de Concentración y calidad del ADN extraido por metodos

tradicionales o comerciales.
Cuantificación del ADN
Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el

rendimiento mediante espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica
que la concentración de una molécula en solución depende de la cantidad
de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una característica del ADN es
que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su
concentración mediante espectrofotometría. Cuando la longitud de la
celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la
densidad óptica (DO). En el caso de ADN genómico o de doble cadena,
una densidad óptica equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). Se debe
considerar el factor de dilución para obtener la concentración en
nanogramos/microlitro (ng/ul). En el caso de algunos equipos como el
espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el equipo
nos proporciona directamente la concentración en ng/ul. Considerando
que para una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos
obtener al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul,
el rendimiento neto de la extracción sería de 0.25 ug. Concentraciones
menores dificultan la estandarización de la PCR u otras técnicas.
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia

a 260 nm y 280 nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro,
proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas. Una
segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos es la proporción
260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la
relación es menor indican la presencia de contaminantes como
carbohidratos o fenol.
Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis
Además de conocer la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría,

es importante conocer si el ADN obtenido está integro. La integridad del
ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa (ver
capítulo de electroforesis). Si el ADN está integro, se debe observar una
banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Si
está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho o
un sendero luminoso en el carril de la muestra. El ADN fragmentado dificulta
la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la
reproducibilidad de las técnicas.
Almacenamiento del ADN
Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y analizado mediante

electroforesis, una parte de la muestra se puede almacenar a 4 °C para los
análisis inmediatos y el material restante a -20 °C o -80 °C, para una
preservación por varios meses. En este último caso es conveniente que el
ADN se conserve en soluciones con baja concentración de sales (low TE)
para inhibir la acción de DNasas contaminantes.
Guia basada en Extracción y purificación de ADN. Laura Patricia Alejos Velázquez, María del Consuelo
Aragón Martínez,2Amelia Cornejo Romero
6.1. Parte experimental:
Extracción de ADN genomico a partir de Hongos fitopatogenos.
Materiales:
• E.Z.N.A. Tissue DNA Kit OMEGA
v Columna de Hibing.
v Tubos de 2ml
v BL Buffer
v TL Buffer
v HBC Buffer
v DNA Wash Buffer
v Elution Buffer
v OB proteasa
• Centrifuga
• Baño termoregulador 55ºC
• Baño termoregulador 70ºC
• Hielo
• Tubos Eppendorf
• Etanol absoluto
Protocolo:
1. Deposite en un tubo eppendor 30 mg de tejido liofilizado.

2. Añadir 200 µL de TL Buffer. Para muestras> 30 mg, aumente el volumen de TL
Buffer; para una muestra de 40-60 mg use 400 µL de TL Buffer.
3. Añadir 25 µL de solución de proteasa OB. Vortear para mezclar bien.
4. Incubar a 55 ° C en un baño de agua con agitación. (El tiempo promedio es
de menos de 3 horas. La lisis puede proceder de la noche a la mañana). Si
no está disponible un baño de agua con agitación, agite la muestra cada
20-30 minutos.
5. Centrifugar a la velocidad máxima (≥10,000 x g) durante 5 minutos.
6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 ml.
7. Agregue 220 µL BL Buffer. Ajuste el volumen de BL Buffer en función de la
cantidad de material de partida. Vortex para mezclar bien. Se puede formar
un precipitado tenue al agregar BL Buffer. Esto no interfiere con la
recuperación del ADN.
8. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.
9. Añadir 220 µl de etanol al 100%. Ajuste el volumen de etanol en función de
la cantidad de material de partida. Vortex para mezclar bien.
10. Inserte una mini columna de ADN HiBind® en un tubo de recolección de 2
ml (provisto).
11. Transfiera toda la muestra del Paso 9 a la columna Mini DNA de HiBind®,
incluidos los precipitados que puedan haberse formado.
12. Centrifugar a la velocidad máxima durante 1 minuto. Deseche el filtrado y
reutilice el tubo de recogida.
13. Agregue 500 µL de tampón HBC diluido con isopropanol al 100% (consulte
las instrucciones en el frasco).
14. Centrifugar a la velocidad máxima durante 30 segundos. Deseche el filtrado
y el tubo de recogida.
15. Inserte la mini columna de ADN HiBind® en un nuevo tubo de recolección
de 2 ml (provisto).
16. Agregue 700 µL de tampón de lavado de ADN diluido con etanol al 100%
(consulte las instrucciones en la botella). Centrifugar a velocidad máxima
durante 30 segundos. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recogida.
17. Repita el paso 16 para un segundo paso de lavado con tampón de lavado
de ADN.
18. Centrifugue la mini columna vacía de DNA de HiBind® a la velocidad
máxima durante 2 minutos para secar la columna. Este paso es critico para
la eliminación de trazas de etanol que pueden interferir con las aplicaciones
posteriores.
19. Transfiera la mini columna de ADN HiBind® a un tubo de microcentrífuga de
1.5 ml sin nucleasas.
20. Añadir 100-200 µl de tampón de elución calentado a 70 ° C. Dejar reposar a
temperatura ambiente durante 2 minutos. Centrifugar a la velocidad
máxima durante 1 minuto.
21. Repita el paso 20 para un segundo paso de elución.
22. Almacenar el ADN eluido a -20 ° C.
6.2. Determinación de la calidad de ADN: Gel de integridad agarosa 0,8%
Materiales:
• Agarosa
• Buffer TAE 1X
• Buffer DYE
• Gel red
• Agua destilada
• Cubeta electoforesis
• Fuente de poder
1. Pesar 0,8 gramos de agarosa.

2. Diluir la agarosa en 100 ml de TAE 1X. (llevar a microhondas por un minuto
para solubilizar).
3. Enfriar levemente y agregar 1 µl de Gel red. Mezclar.
4. Depositar la solucion en una cubeta de electroforesis y dejar polimerizar.
5. Una vez polimerizado el gel, depositar las muestras en los pocillos
correspondientes. (3 µl de muestra y 3 µl de buffer DYE 1X)
6. Conectar la fuente de poder y correr las muestras a 80 voltios durante 1
hora.
7. Revelar el gel con luz UV.
8. Registrar resultados.
Figura 6.2. Gel de electroforesis en el que se observan los fragmentos

generados mediante PCR múltiple para la detección simultánea de los
genes enterocócicos vanA y vanB y estafilocócicos femB, ileS-2 y mecA a
partir de distintas mezclas de Enterococcus sp. y Staphylococcus sp. Carriles:
M, Marcador de Peso Molecular XIV (Roche Diagnostics)

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1.1.1. Naturaleza de la luz

Las radiaciones o energía electromagnéticas se propagan, según la teoría

La longitud de onda (λ) es la distancia lineal entre dos crestas de onda, y se

Figura 1.1. Representación de una longitud de onda,

La Frecuencia (f) es el número de ondas que se producen en un segundo, y

La relación entre estos parámetros se establece como lo muestra la siguiente

Donde corresponde a la longitud de onda; c corresponde a la velocidad

Figura. 1.2. Espectro electromagnético.

En los laboratorios de investigación se trabaja fundamentalmente con las

Longitud de onda (nm) Color

1.1.2. Interacción de la luz con la materia

Cuando se hace incidir un haz de luz sobre un átomo, molécula o ion, se

Existe una serie de grupos químicos llamados cromóforos que, al estar

Otros grupos, llamados auxócromos, no producen color por sí mismos, pero

En una molécula compleja, su espectro de

1.1.3. Ley de Lamber-Beer

Cuando un haz de luz incide sobre una muestra en disolución (medio

Por tanto, la intensidad de esa radiación en el inicio (Io) es mayor que su

La relación numérica entre estas intensidades, inicial y final, se llama

Esto es importante, ya que la energía que podemos detectar es la

Lambert demostró que la cantidad de luz absorbida por la muestra es

De esta manera, la ley Lambert-Beer queda como sigue:

b = espesor del recipiente o cubeta, se expresa en cm.

1.1.4.1. Radiación monocromática

Concentración " Concentración "

Figura 1.5. Diferencias entre la relación logarítmica del porcentaje de transmitancia y la

Sin embargo, a elevadas concentraciones, se producen interacciones

La asociación de un soluto y un disolvente puede dar lugar a reacciones

1.2.1 Componentes de un espectrofotómetro

La Figura 1.6 muestra los componentes fundamentales de un

Tabla 1. Componentes de los espectrofotómetros y sus características

1.3. APLICACIONES DE LA ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

1.3.1. Detección e identificación de compuestos

Basándose en la capacidad de algunos grupos químicos para absorber luz

El fundamento es el mismo que en el aparato anterior, pero en este caso

1.3.3. Análisis cuantitativo

Es una de las aplicaciones más empleadas en el laboratorio de diagnóstico

1.3.4. Curva de calibración

Consiste en realizar distintas diluciones de concentración conocida de la

1.3.5. Punto final con estándar

Consiste en utilizar una dilución patrón o estándar de la sustancia que

Hallamos la absorbancia de este patrón, de modo que se cumple la

ESTRUCTURA Y NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS:

Las proteínas son polímeros de unidades sencillas

Los grupos α amino y α carboxilo libres de los

En la gran mayoría de los aminoácidos naturales el grupo amino se

Figura.1.9. Estructura de un aminoácido

Figura.1.10. Estructura de un polipéptido

La forma definitiva que adquiere una proteína es la consecuencia de

MÉTODO: Realización curva de calibración a diferentes concentraciones de

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