1.

Introducción

El principal problema de un bioquímico es determinar lo que tengo en una muestra, es decir,

su composición, puede ser una sustancia pura o una mezcla.

Antes de las técnicas instrumentales, se determinaba mediante la composición centesimal de

C, H, O, N, P… En el siglo XX surgieron las técnicas instrumentales de análisis, gracias al
descubrimiento de la interacción entre la Radiación ElectroMagnética (REM) con la materia.

La radiación genera efectos sobre la materia. Como ejemplo tenemos a los rayos X (radiación
ionizante), que entre otros efectos produce desordenes celulares.

Fosforescencia. Absorben REM, y la emiten más lentamente. La REM permanece durante un

tiempo.

Fluorescencia. Para emitir necesitan una constante absorción de REM.

2. Características de las técnicas instrumentales de análisis.

Una técnica instrumental es una metodología de trabajo para determinar la composición.

Dicha metodología puede ser de dos tipos:

- Cuantitativa, donde consigo saber la cantidad de muestra.

- Cualitativa. Aquella que determina la presencia o no de una determinada sustancia en la

muestra.

2.1 Parámetros de calidad de un método

Analito. Sustancia a identificar (ión, moléculas, macromoléculas…). El analito puede ser

estudiado de manera analítica cualitativa, si lo que medimos es su presencia, o cuantitativa, si
medimos su cantidad o concentración.

Técnica. Principio científico genérico que se utiliza para extraer cierta información.

Método. Aplicación de una técnica analítica para determinar un analito o mezcla de una
muestra definida.

Procedimiento. Descripción del método analítico

Protocolo. Conjunto de normas definitivas que deben seguirse sin ningún tipo de excepción
cuando se pretende que los resultados analíticos puedan utilizarse con un propósito específico.
Son preescritos por un organismo oficial para su uso en una situación dada.

Precisión. Grado de concordancia mutua entre los datos de una misma muestra. Entre los
parámetros de precisión se encuentra la media, la varianza, desviación típica, desviación
estándar, etc.

Exactitud. Diferencia entre el valor verdadero y el valor que medimos.

Sesgo. Diferencia entre la población que existe y la población que yo mido. La diferencia con la
exactitud es el error sistemático del método. Exactitud misma técnica, sesgo distintas técnicas
para ver el mismo error.

Sensibilidad. Capacidad de un método para diferenciar pequeñas variación en la

concentración de un analito. Depende de dos factores: la pendiente de la curva de calibrado, y
la precisión del sistema de medida.

S = m [C] + Sblanco

S: señal

m: pendiente. Cuanto mayor es, mñas sensible es el método.

C: concentración

Sblanco : señal del blanco

Sensibilidad analítica. Cociente de la pendiente de la recta entre la desviación estándar de los

datos con los que se ha obtenido la recta.

m
=
SS

SS: desviación estándar

Límite de detección. Concentración más baja de un analito que se puede detectar.

Cm: (Sm - Sblanco ) / m

Sm : señal que mido

Señal medible mínima. Es la señal del blanco más 3 veces la desviación estándar de ese blanco

Sm : Sblanco + 3 SSblanco

Señal medible óptima.

Sm : Sblanco + 10 SSblanco

Intervalo útil de curva de calibrado. Comienza en el límite de cuantificación y termina en el

límite de linealidad

Selectividad. Capacidad de un método para diferenciar e identificar en una mezcla de varios

analitos.

3. Clasificación de las técnicas instrumentales

Las técnicas de análisis clásicas, empleadas con anterioridad al siglo XIX, se basan en
interacción materia-materia, esto es, en reacciones químicas. Se diferenciaban técnicas
analíticas cuantitativas como la volumetría y técnicas analíticas cualitativas como el punto de
fusión.
En el siglo XX, surgen las técnicas instrumentales de análisis. Estas se basan en interacciones
materia-energía, utilizan un instrumento más o menos complejo para evaluar una propiedad
física o físico-química del sistema objeto de estudio. No es esencial el concurso de una
reacción química.

Existen ciertas ventajas respectos a las técnicas clásicas: detectar concentraciones muy bajas
de analitos; y rapidez, puedes determinar distintas concentraciones en poco tiempo.

La señal de la respuesta debe estar en función del analito, para ello se necesita una constante,
para obtener una curva de calibrado.

S=k·C

3.1 Técnicas ópticas

Son aquellas que derivan de la interacción con la radiación electromagnética. Dentro de las
ópticas están:

- Aquellas donde la REM es absorbida.

- Aquellas donde la REM es dispersada.

La segunda clasificación es:

- Técnicas espectroscópicas. La técnica siempre me va a dar un espectro donde la

representación de la intensidad frente a la frecuencia me da información acerca de la muestra.
Se basa en la absorción cuantizada de energía.

- Técnicas no espectroscópicas. Desvía la REM, no la absorbe. No existen transiciones

cuantizadas (cambios de dirección).

La tercera clasificación es:

- Grupo A. Absorbe la REM. Ej: técnicas del ultravioleta, visible, infrarrojo.

- Grupo B. Son procesos fotoluminiscentes. Excito la muestra con REM. Ej: fluorescencia,
fosforescencia.

- Grupo C. Emisión por parte de la muestra. No hace falta excitar la muestra con REM. Ej: rayos
X.

- Grupo D. Aquellas en las que ocurren cambios en las propiedades de la REM pero no es
absorbida o dispersada.

- Grupo E. Microscopía.

3.2 Técnicas electroanalíticas.

Son aquellas que están relacionadas directamente con la energía eléctrica. Las más habituales
son la potenciometría, las técnicas voltamperometrías y culombimetrias.

Clasificación en base a la cantidad de muestra analizada:

- Macroreacción. La muestra nos va a dar una señal, la cual será función de toda concentración
de analito, pero todo el analito se ha electro oxidado o electro-reducido

- Microreacción. Solo analizamos una pequeña parte de la muestra, es decir, se oxida o se

reduce una parte de la muestra que será proporcional a la concentración global de toda la
muestra. Algunas son las potenciometrías, las amperiometrías y las voltaperometría.

- El tercer grupo. No hay reacción en la muestra. Si no hay reacción en la muestra, ni se oxida

ni se reduce. La más característica es la electroforesis.

4. Calibración del equipo

En todos los equipos quiero medir una señal, ya sea eléctrica, de REM… Esa señal debe ser en
función de la concentración.

La proporcionalidad se toma en igualdad que vienen dada por:

S= k*C

K=cte C=CONCENTRACION

Hay tres tipos:

4.1 Calibrado directo

Consiste en la preparación de diferentes muestras de concentraciones conocidas a las que

denominamos patrones y medimos la señal de cada una de esas muestras.

Al representar la señal frente a la concentración de sus patrones obtengo una línea recta cuya
pendiente es la cte de proporcionalidad. Una vez que conozco la función, mido la señal de mi
problema y por extrapolación saco su concentración.

4.2 Calibración por adición estándar

Este método es útil para matrices complejas. Se adicionan distintos volúmenes de muestras
conocidas de un patrón sobre las alícuotas de la muestra (spiking)

S1 = k∙Cm

Cm∙ Vm Cp∙ Vp
Ss =k ( + )
Vm+Vp Vm+Vp

4.3 Calibrado con patrón interno.

En este caso, adiciono un patrón interno a la muestra que yo quiero medir con la diferencia de
que el patrón interno tiene que ser distinto al analito pero que su señal sea parecida a la del
analito que quiero medir sin solapar la señal del analito. Esto se hace en la determinación de
Na/K en sangre.
Se emplean en aquellas técnicas en la que la señal depebde de factores poco reproducibles y
que pueden variar en el curso del análisis. La variable analítica es el cociente de señales del
analito y del patrón interno.

El patrón interno es una sustancia que no está presente en la muestra a analizar, con un
comportamiento similar al del analito y que no interfiere en la determinación de éste.