Los colorantes

Prof. Dra. MARÍA ELENA SAMAR

Histotecnología: es la ciencia que estudia tanto los fundamentos
técnicos como la secuencia de manipulaciones que se realizan para
analizar los tejidos de los seres vivo.

Técnicas histológicas: procedimientos especiales que permiten

obtener un preparado histológico para el estudio de los tejidos al
microscopio.

Preparado histológico: porción de tejido de escaso espesor

(micrómetros = µm) lista para observar al microscopio. Se lo
obtiene de un bloque de tejido cortado con un instrumento
llamado micrótomo.
PASOS DE LA TÉCNICA HISTOLÓGICA

* obtención del material

* fijación
* deshidratación, aclaramiento e inclusión
* obtención de cortes histológicos
* coloración
COLORANTES: sustancias coloreadas,
generalmente compuestos orgánicos aromáticos,
usados para dar color a papeles, pieles, cueros,
ceras, madera y aceites, grasas y otros productos,
así como para producir color en tejidos animales y
vegetales para estudiar su estructura anatómica y
microscópica y su naturaleza.
Reactivos colorantes
Colorean las estructuras histológicas en
superficie, sin dar cambios en su composición
química.
Los colorantes poseen:
a) un grupo auxocromo, que le confiere la
capacidad de teñir y determina si un
colorante es básico (posee radical
amino NH+), o ácido (posee radical
carboxilo COOH- ).
b) un grupo cromóforo: le confiere el color.
Coloración de control (testigo):
Corte histológico de composición conocida
que se colorea junto al corte problema y
que permite verificar la presencia o no de
algún componente tisular.
 Coloraciones estructurales
Ponen en evidencia los componentes íntimos
de ciertos tejidos: fibras elásticas (coloración
de Weigert); fibras colágenas tipo III (impregnación
argéntica); fibras colágenas
(tricrómico de Mallory, de Masson, de Cason,
etc.), (fibras colágenas de color azul y musculares
de rojo).

Coloraciones topográficas
Dan una visión integral de la estructura de
un tejido. Su técnica es, generalmente, fácil y
rápida. Son las coloraciones de rutina. La
Hematoxilina y Eosina son el prototipo de estas
coloraciones.
Coloraciones histoquímicas Impregnación argéntica
Ponen en evidencia una sustancia determinada Métodos que emplean sales metálicas tales como
en el tejido examinado. Son específicas el cloruro de oro, el nitrato de plata, etc. Estas
originan precipitados en las estructuras tisulares y
para cada sustancia.
celulares. La precipitación se realiza
Ejemplos: Técnica de PAS, para glucógeno
selectivamente sobre determinadas estructuras.
(inclusión intracelular), glucoproteínas (presentes Son ideales para el estudio del tejido nervioso
en membranas basales, cubiertas celulares y del estroma de ciertos órganos.
y secreciones), histoquímica enzimática:
fosfatasa alcalina (enzima marcadora del
plasmalema). Alcian blue: para identificar
glucosaminoglucanos ácidos, etc.
 Los colorantes, arte y ciencia
El hombre ha usado el color desde la prehistoria, para teñir sus ropas o dejar
maravillosas improntas en las paredes de las cavernas.

Los colorantes han acompañado a los hombres en toda su evolución.

Una amplia gama de colorantes y pigmentos aparecen en la industria textil,
los alimentos y en la microscopía.

Cueva de las manos.

Provincia de Santa Cruz.
Argentina. Patrimonio
Cultural de la
Humanidad.
 Origen de los colorantes en Histología:
La industria textil

• ÍNDIGO: el colorante más antiguo, de origen tanto vegetal

como animal. Usado unos 3000 años antes de Cristo.
• ANIL: equivalente arábigo contemporáneo del índigo. Es el origen
de la palabra anilina.

• Colorante índigo: de color azul . En la antigüedad se extraía del caracol

Hexaplex trunculus y de diferentes especies de plantas, como la Indigofera
tinctoria, originaria de Asia y África. Actualmente se produce por síntesis
química.
ANTECEDENTES HISTÓRICOS
Los pioneros de la microscopía utilizaron colorantes que se obtenían
de la naturaleza:
• Púrpura de Tyran (Tiro), de un marisco del Mediterráneo
• Alizarina, de la raíz de la planta rubia. Rubia Tinctorum
• Azafrán del estambre de crocus
• Carmín de la hembra de cochinilla

El azafrán es un colorante que se emplea en biología para elaborar la safranina.

Bergarws (1505-1550) fue el primero en emplear

los colorantes en anatomía microscópica.
ANTECEDENTES HISTÓRICOS

• Comienzos del siglo XVIII: ya se habla de morfología

macroscópica y microscópica.
• Gracias al microscopio, nacen nuevas disciplinas, entre ellas
la Histología.

ZACHARIAS JANSEN
• Microscopistas de la época sientan las bases de la
HISTOLOGÍA, rama de las ciencias morfológicas,
cuyo desarrollo y crecimiento depende del
desarrollo de las técnicas: fijación de órganos y
tejidos, el empleo de colorantes, y el
perfeccionamiento de las herramientas de
observación, como el microscopio.
• Siglo XIX: El empleo cada vez más variado de los
colorantes permitió un extraordinario avance de la
Histología como ciencia.
 ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Técnicas de coloración: surgen de manera rudimentaria.

Belchier (1706-1785) tiñe el tejido óseo
Serrabat de la Baisse (1733): emplea sustancias coloreadas
para estudiar la savia de los vegetales.
Leeuwenhoeck: (1714) aplica azafrán a los músculos.
Sir John Hil: microscopista inglés. Colorea con carmín
tejidos vegetales con muy buenos resultados.
Raspail (1825): demuestra almidón en células vegetales
usando ioduros y Claude Bernard (1849) glucógeno
hepático con el mismo “colorante”.
LA APARICIÓN DE LOS COLORANTES DE ANILINA

• EL químico inglés HENRY

PERKIN sintetiza en 1856 el
primer colorante de anilina, el
púrpura de anilina,
posteriormente denominado
malva de Perkin. De importancia
primero en la industria textil, y
luego en la coloración de los
tejidos en el estudio histológico.
• Síntesis de: fucsina básica (1858), pardo
de Bismarck (1862); azul de anilina y
verde de metilo (1871), verde de
Malaquita y Violeta cristal (1877);
escarlata de Biebrich (1878) y azul de
metileno (1890).
• Ranvier (1875): emplea cianina, colorante
metacromático para cartílago.
Colorantes metacromáticos
Son los colorantes que tiñen diversas estructuras histológicas con una tonalidad distinta
a la de la solución. Por ejemplo, el Azul de toluidina (de color azul) tiñe en rojo
púrpura la sustancia fundamental del cartílago hialino, y los gránulos de heparina del
citoplasma de los mastocitos (célula del tejido conectivo).
Los glucosaminoglucanos ácidos sulfatados dan metacromasia fuertemente alcohol-
resistente. Dentro de estas sustancias podemos mencionar a la heparina, el
dermatansulfato, el queratansulfato, el condroitinsulfato, etc. El grado de metacromasia
aumenta en el siguiente orden: carboximetil < carboxil < fosfato < sulfato
La técnica tiene por consiguiente un valor diagnóstico para los glucosaminoglucanos
ácidos sulfatados.
Los glucosaminoglucanos ácidos no sulfatados y las nucleoproteínas dan una
metacromasia mucho menos intensa, susceptible a la extracción alcohólica.
.

ERLICH (1854-1915) Premio Nobel de Medicina

1908
Realizó su tesis doctoral en 1878 sobre la teoría y práctica de la tinción
histológica. En ese momento ya se conocía que, según la afinidad de los tejidos
por un determinado colorantes se podía estudiar su estructura. A mediados del
siglo XIX los estudios histológicos eran frecuentes. Sin embargo, la cantidad de
colorantes disponibles era escasa. Cuando Ehrlich estudiaba medicina, empezaron
a aparecer más colorantes derivados de la anilina.

Erlich clasificó a las células como basófilas, acidófilas o neutrófilas al

colorearse con colorantes básicos, ácidos o neutros.
LAS IMPREGNACIONES CON METALES PESADOS
Krause (1844). el primero en usar
una solución de nitrato de plata.

El método se generaliza a partir del

artículo publicado por von
Recklinghausen en 1860.

Conheim(1866) usa por vez primera el cloruro de oro.

Ranvier (1880) y Golgi (1873): dan un fuerte impulso a
estas técnicas.
Camilo Golgi: estudia el sistema nervioso central con su
revolucionario método de impregnación cromoargéntica.
Posteriormente, los histólogos españoles, y entre ellos
Cajal y del Río Hortega, dan su brillante impronta a las
impregnaciones con sales de plata y oro, perfeccionando y
desarrollando nuevas variantes.
 LA HEMATOXILINA
De aparición muy próxima a la época del
descubrimiento de Perkin. Perdura en el
diagnóstico morfológico desde entonces. Es
actualmente el colorante más utilizado en el
mundo.

• Origen: palo de Campeche, Haematoxylun campechiano,

arbusto espinoso del orden de las leguminosas. Nativo de
México, Guatemala y Bélice.
• Uso primitivo: colorante para lana y cuero.
• Unico uso actual: la microscopía
• Reichel (1840): utiliza por primera vez extractos del palo de
Campeche para coloraciones microscópicas.
• Waldeyer (1863) sería para otros quien primero usó la
Hematoxilina.
 LA HEMATOXILINA
• La fórmula de la hematoxilina más antigua: de Delafield,
quien nunca llegó a publicarla formalmente.
• Ehrlich (1886): publica su fórmula de la hematoxilina.
• Uso actual: las antiguas soluciones de alumbre-
hematoxilina de Ehrlich (alemán, 1886), Harris
(americano, 1900), modificada por Mallory en 1938
(hematoxilina fosfotúngstica de Mallory) y hemalumbre
de Mayer (italo-alemán, 1903) modificada por Lillie en
1965.
LA EOSINA
• Dereschfeld y Fischer (1870) informan sobre la
eosina como colorante tisular general.

• Coloración morfológica de hematoxilina y

eosina: introducida por Wissowsky (1875), Carl
Wilhem Busch (1877) y Raynaud (1879), y
continúa utilizándose en todos los laboratorios de
histología del mundo.
• Azul violáceo: Hematoxilina, citoplasma basófilo y
núcleos. Rosado: Eosina, citoplasma, fibras colágenas,
mitocondrias. Para la observación general de las
estructuras histológicas.
Técnica de inclusión en parafina y coloración con H/E:
síntesis
1. Obtención del material (biopsia, etc.).
2. Fijación (formol al 10%).
3. Deshidratación (alcoholes etílicos de escala ascendente).
4. Aclaración (xilol, toluol, etc.).
5. Inclusión (parafina).
6. Preparación del taco.
7. Cortes (con micrótomos) recogidos en láminas de vidrio
(portaobjetos).
8. Desparafinización (xilol).
9. Hidratación (alcoholes etílicos de escala descendente,
agua destilada).
10. Coloración con hematoxilina (se colorean los núcleos).
11. Virado (lavado en agua corriente).
12. Coloración con eosina (se colorea el citoplasma).
13. Deshidratación (ídem a 3).
14. Aclaración (ídem a 4).
15. Montaje final (Bálsamo de Canadá, Entellán, etc.).
Clasificación de la H/E
según su grupo auxocromo y
afinidad tintorial
Hematoxilina. Colorante básico
Tiñe grupos ácidos, es un colorante que actúa como
básico que tiñe el núcleo (rico en ácidos nucleicos) de
color violeta, por lo que se dice que el núcleo es
basófilo (apetencia por el colorante básico).
Eosina. Colorante ácido
Tiñe grupos básicos, es un colorante ácido que tiñe
el citoplasma (rico en proteínas) de color rosado. Se
dice que el citoplasma es acidófilo o eosinófilo.
 EL DESARROLLO DE NUEVAS
TÉCNICAS DE COLORACIÓN

Técnicas de Ziehl-Nielsen (ZN), Gram y Van Gieson. De uso

actual, se desarrollan en 1880.

Frank Mallory: introduce una técnica tricrómica que

actualmente lleva su nombre.

Pierre Masson presenta otro tricrómico en 1929.

Paul Unna: presenta en 1890 la técnica de orceína para

colorear la elastina y Weigert (1899) la resorcina-fucsina.
 COLORACIONES TRICRÓMICAS

Métodos que emplean al menos dos o más colorantes de colores contrastantes, más
comúnmente usados para diferenciar colágeno de tejido muscular.
Estas técnicas, compuestas o combinadas, tiñen de manera diferencial diversas estructuras
histológicas de un tejido u órgano por su apetencia por un colorante específico.
Mallory Azán Dane

Masson Cason

TRICRÓMICOS
 EL DESARROLLO DE NUEVAS
TÉCNICAS DE COLORACIÓN

•Técnica de Unna-Pappenheim (1899): para plasmocitos.

• Ehrlich: define metacromasia, fenómeno ya observado

con anterioridad.
• Dimitri Romanowsky (1892): describe la famosa técnica
de coloración hematológica.
• Leishman (1901), Giemsa (1902) y Wright (1902):
modifican la técnica original de Romanowsky.
 EL DESARROLLO DE
NUEVAS TÉCNICAS DE
COLORACIÓN

• Rojo Congo: En 1884 se introduce en la industria

textil
• Griesbach (1886): lo usa para la tinción de los
axones.
• Bennhold (1922): lo utiliza y demuestra su valor
diagnóstico en la identificación del amiloide.
• Regaud introduce una técnica para la coloración de
mitocondrias.
• Michaelis (1900): usa el verde Jano para coloraciones
vitales.
 EL DESARROLLO DE
NUEVAS TÉCNICAS
DE COLORACIÓN
Southgate (1927): publica una modificación de la técnica de
mucicarmín original de Mayer para demostrar mucinas.
Gomori (1950): publica una técnica tricrómica de un solo paso,
y la técnica de fucsina aldehído para mastocitos y fibras elásticas.
Gomori Se destacó principalmente por sus técnicas de
histoquímica enzimática.
Papanicolaou (1941): introduce una técnica sencilla para efectuar
extendidos vaginales en el diagnóstico precoz del cáncer genital
femenino.
 EL NACIMIENTO DE LA
HISTOQUÍMICA

• Histoquímica: surge como una herramienta que

permitía aproximarse al estudio de la fisiología tisular,
detectando in situ constituyentes y metabolitos
normales y sus alteraciones.
• Raspail (1825 y 1829): fundador de la histoquímica.
• Daddi (1896): demuestra la presencia de lípidos
tisulares por medio del Sudan III.
 LA HISTOQUÍMICA
•Verne: indica que la histoquímica equivale a
histología razonada y a bioquímica topográfica.

•Robin y Verdell (1856): definen la histoquímica

como anatomía química.

• Histoquímica: gran desarrollo en el siglo XX con Fasal,

Pearse, Gomori, Lison, Lillie, Barka, McMannus, Spicer,
Steedman y Feulgen, cuyas técnicas se han
transformado actualmente en rutina.
• Brachet: introduce en 1940 en histoquímica, la
digestión con ribonucleasa como procedimiento de
control.
 LA HISTOQUÍMICA

• Gomori y Takamatsu (1939): primer método

histoquímico para enzimas hidrolíticas.
• Ultracitoquímica enzimática: gran avance en
la década del 60 por el glutaraldehido como
fijador.
• Radioautografía en cortes de tejidos: En las
décadas del 60 y 70 , permitió avanzar en los
conocimientos de los procesos dinámicos en
Biología Celular.
Técnicas histoquímicas
Se utilizan para la identificación de
sustancias o grupos de sustancias químicas
en las células o espacios extracelulares de un
tejido, mediante la aplicación de reacciones
químicas bien determinadas. Se localiza la
sustancia química pero no dan detalles
estructurales.
Técnica de PAS: es de fundamental importancia en la histoquímica de los hidratos de
carbono. Se colorean las glucoproteínas y el glucógeno. Fundamento: Demostración de
grupos aldehidos. Se realiza una oxidación con ácido periódico que rompe la unión de los
grupos glicoles de los azúcares y forma aldehidos que reaccionan con el reactivo de Schiff
(leucofucsina básica o fucsina básica previamente decolorada).
La función aldehídica recolora en rojo magenta la fucsina decolorada o reactivo de
Schiff.
Técnica del Alcian blue: El Alcian blue es un colorante básico que pone de manifiesto los
glucosaminoglucanos ácidos. Se une al grupo carboxilo del ácido siálico, a aniones sulfato y
a los ácidos urónicos. Cuando se lo emplea a pH 2,5 se colorean los glucosaminoglucanos
sulfatados y no sulfatados. A pH 1,0 se tiñen específicamente los
glucosaminoglucanos ácidos sulfatados, que son los únicos grupos disociados a este pH.
Técnica del Azul de toluidina: Es un colorante básico empleado para identificar estructuras
metacromáticas (rojo púrpura), tales como los glucosaminoglucanos sulfatados, y estructuras
basófilas (azul) como la sustancia cromidial (organela citoplasmática con elevado contenido
de ácido ribonucleico ribosomal).
Histoquímica Convencional
* Demostración de glucógeno y glucoproteínas:
Técnica de PAS
* Demostración de glucosaminoglucanos ácidos:
Técnica de Alcian blue
* Demostración de ADN: Técnica de Feulgen
* Demostración de grasas neutras: Técnicas de
Sudanes
LA INMUNOHISTOQUÍMICA

Inmunohistoquímica: metodología alternativa. Variedad de

histoquímica en donde la identificación depende de una reacción
AG/AC.
Orígenes: se hizo posible en el siglo XX, década del 40 con las
técnicas de inmunofluorescencia, gracias a un microbiólogo de
Harvard, Albert Coons.
 LA APARICIÓN DE OTRAS TÉCNICAS
•Lectinhistoquímica:
importante herramienta
para identificar y localizar
azúcares en cortes de
tejidos.

• Cuantificación de la intensidad de las reacciones

histoquímicas: En los 70, con microdensitómetros
integrados.
• Actualmente reemplazados por el analizador de imágenes
computarizado.
Lectinhistoquímica
Se emplean proteínas o glucoproteínas de origen no inmune extraídas generalmente de
vegetales denominadas lectinas, las que se unen de manera específica a determinados hidratos
de carbono presentes en la cubierta celular, secreciones celulares y matriz extracelular.
La unión se realiza principalmente con el azúcar terminal de las glucoproteínas aunque
también pueden establecerse uniones entre la lectina y los glúcidos localizados en las cadenas
laterales ramificadas de las moléculas.
Debido a la especificidad con que las lectinas se unen a los diferentes hidratos de carbono,
han contribuido al conocimiento de su distribución y localización en los tejidos y sus
modificaciones durante los procesos de maduración y diferenciación celular y en las
transformaciones neoplásicas.
 ANÁLISIS DE IMAGEN

• Técnica asistida por computadora que

permite obtener datos cuantitativos de
imágenes microscópicas
 TISSUE
MICROARRAY
(micromatrices
de tejidos)

Examen de muchos
cortes histológicos al
mismo tiempo por
almacenamiento
de los mismos en un solo
bloque de parafina:
el array.
 Conclusión Final

• Las técnicas de coloración de tipo morfológico siguen

cumpliendo una importante e insustituible función
debido a que complementan y enriquecen la
información que nos brindan la inmunohistoquímica y el
análisis digital de imagen en investigación, docencia y
resolución de problemas biológicos.