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1. Objetivo y Alcance
Método Analito Matriz(ces) Rango de trabajo Modificaciones Acción

Método para la determinación

cafeína en café tostado por
cromatografía liquida de alta Café tostado
Cafeína 20 ppm – 150 ppm ------ ------
resolución acoplada a un molido
detector de arreglo de diodos
(HPLC-DAD)

2. Responsables
Asignación Responsable(s) Asignación Responsable(s)

Ejecución de
Planeación Astrid Mirada experimentos por Scarlett Hernández
parámetro a realizar

Revisión del plan Sarah Fajardo Evaluación de resultados Sara fajardo

Declaración de
Aprobación del plan Scarlett Hernández Astrid Miralda
conformidad

3. Ítems de ensayo
Nº Descripción Especificaciones de manejo

Café tostado Molido Una vez que haya adquirido el café molido debes almacenarlo
en un espacio libre de humedad, y alejado de fuentes de calor,
1
estos son dos elementos peligrosos, que pueden echarlo a
perder antes del tiempo.

4. Recursos
4.1 Software
Nº Nombre Especificaciones

1 Microsoft office profesional plus 2010 Versión 14.0.4763.1000

2 Calculadora CASIO fx-82 MS 2nd edition
4.2 Reactivos y solventes
Nº Nombre Especificaciones

1 Ácido acético 1 % Reactivo

Carrez I 15% Reactivo
2
Carrez II 30% Reactivo
3 Agua HPLC
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4. Recursos
4.3 Patrones y materiales de referencia
Nº Nombre Especificaciones

1 Cafeína anhidra pura USP pureza 100%

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4.4 Aparatos y equipos de medición

Nº Nombre Especificaciones

1. Marca: OHAUS
Modelo: ER214C
Serie: L1071127481253 P
Marca capacidad máxima: 210 g
1 Balanza
d: 0.1 mg
e: 1
clase: III

Especificaciones:
Marca: shimadzu corporation
Modelo: UV-1700
Espectrofotómetro UV-VIS (UV-VIS 1700 Pharmaspec)
2 Serie: A11024436902 CS
SHIDMADZU
Voltaje: 120V-50/60HZ 130 VA
CAT. N.: 206-24201-92
Longitud de onda: 190.0 nm a 1100 nm
Columna: C18 fase reversa
Fase móvil: ácido acético al 1% / acetonitrilo (95:5)
Método isocratico:
3 HPLC Flujo presión: 1 ml/min,1200 psi
Detector: UV 273 nm
Temperatura del Horno: 30°C
Volumen de inyección: 10 uL
LW scientific C5, por 20 minutos a 4500 revoluciones por
4 Centrifuga
minuto.
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
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4.5 Otros insumos

Nº Nombre Especificaciones

Marca: Marienfeld
Tipo: clase A
Matraz volumétrico de 25 ml Valor nominal: 25 ml
Tolerancia: +, - 0.040 ml
Especificaciones: IN 20 C

Marca: Marienfeld
Tipo: clase A
1 Matraz volumétrico de 50 ml Valor nominal: 50 ml
Tolerancia: 0.060 ml
Especificaciones: NS12

Marca: Marienfeld
Tipo: clase A
Matraz volumétrico de 250 ml Valor nominal: 250 ml
Tolerancia: +, -0.150 ml
Especificaciones: 20 C
Marca: IMS GERMANY
Valor nominal: 2 ml
2 Pipeta volumétrica de 2 ml Tipo: clase B
Tolerancia: +,.0.05
Especificaciones: 20 C
Especificaciones:
Vidrio de reloj El vidrio de reloj es una pieza de vidrio compacto, la cual
tiene que ser firme para soportar los líquidos químicos,
para que no haya filtración de ellos. Tiene forma circular
cóncava convexa, la cual permite contener las sustancias
3 para luego mazarlas o pesarlas en la balanza.
Varilla de agitación No aplica
Frasco lavador en polietileno, capacidad 250ml,500
piseta ml,1000 ml

Pipeta volumétrica de 5 ml Marca: schot Mainz

Valor nominal: 5 ml
4
Beaker de 100 ml Tipo: clase
Tolerancia: +, -0.06
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Especificaciones: NS12

Marca: Marienfeld
Valor nominal: 100 ml
Tipo: clase A
Especificaciones: Boro 3.3
Beaker de 50 ml
Marca: Marienfeld
Valor nominal: 50 ml
Tipo: clase A
Especificaciones DIN, Boro 3.3

4.6 Equipo de protección personal

Nº Nombre Especificaciones

Bata Blanca, debe tener un largo que llegue debajo de las

1 Gabacha (bata de laboratorio)
rodillas y manga larga utilizarse abrochada.
Impedir el contacto, penetración de sustancias toxicas,
corrosivas o irritantes a través de la piel, las manos, puede
2 Guantes
entrar en contacto con los productos químicos. Guantes
de nitrilo a la medida
Gafas proteger los ojos, ofrece protección frontal y lateral,
3 Gafas ya que es obligatorio en los laboratorios químicos.
Policarbonato de alta resistencia a impacto.
Evitar el riesgo a los agentes, alta protección contra
4 Mascarilla de gases partículas sólidas, liquidas, toxicas. Con válvula de
exhalación.
4.7 Instalaciones y condiciones ambientales
No. Especificaciones
Espectrofotómetro UV-VIS (UV-VIS 1700 pharmaspec) SHIDMADZU
Recomendaciones de uso – cuidados del equipo
- De estar en un laboratorio donde se cuente con todos los requisitos para su uso correcto manejo.
- Coloque el instrumento en un lugar en donde no este a vibraciones, calor excesivo, humedad o luz directa.
1 - Proteja el instrumento del polvo
- Nunca toque las superficies ópticas (lentes y filtros). Siga las instrucciones que da el fabricante para la
limpieza de tales componentes.
- Controlar la temperatura.
- Debe estar en un área limpia y ordenada.
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5. Fundamento del método

Nº Método

La Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) es una técnica analítica que permite
separar mezclas complejas de sustancias de procedencia diversa, con el propósito de identificarlas, cuantificarlas
y purificarlas. Esta técnica es considerada una de las técnicas de purificación más versátiles y confiables teniendo
una amplia aplicación en la investigación química, bioquímica y clínica, entre otras, para la determinación de la
pureza de sustancias, la detección de metabolitos de interés farmacológico de plantas, la detección de metabolitos
de drogas en fluidos biológicos, el aseguramiento de la calidad de productos farmacéuticos, etc. El Instituto de
Química Aplicada cuenta con tres cromatógrafos de líquidos de alta resolución con diversos detectores.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) – Instituto de Química Aplicada [Internet]. www.uv.mx. Available
from: https://www.uv.mx/sara/equipamiento/hplc/

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un

1 compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea
un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

(S/f-b). Studocu.com. Recuperado el 22 de noviembre de 2022, de https://www.studocu.com/es-

ar/document/instituto-universitario-isedet/quimica/espectrofotometria-la-espectrofotometria-uv-visible-es-una-
tecnica-analitica-que-permite-determinar/31569353

6. Procedimiento de ensayo
Nombre/referencia del método

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN CAFEÍNA EN CAFÉ TOSTADO POR CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN ACOPLADA A UN DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS(HPLC-DAD)

Preparación de Reactivos:
Carrez I: Preparar una solución de Hexacianoferrato (II) de potasio trihidrato (K4[Fe (CN)6] x 3H20) al 15 % (p/v).
Carrez II: Preparar una solución de Sulfato de zinc heptahidrato (ZnSO4x7H2O) al 30 % (p/v).
Ácido Acético al 1%: Preparar 2 L de ácido acético glacial al 1%.
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6. Procedimiento de ensayo
Nombre/referencia del método

Preparación de la Curva Estándar

Solución Patrón A: Pesar 25 mg de cafeína anhidra pura en un matraz aforado de 25 ml y ácido
Acético al 1%. [ 1000ppm ó 1000mg/L]
Diluciones
• 0,20 ml / 200 uL de la solución patrón A + aforo con ácido acético al 1%/ 10 ml [20 ppm]
• 0,25ml / 250 uL de la solución patrón A + aforo con ácido acético al 1%/ 10 ml [25 ppm]
• 0,50ml / 500 uL de la solución patrón A + aforo con ácido acético al 1%/ 10 ml [50 ppm]
• 1ml / 1000 uL de la solución patrón A + aforo con ácido acético al 1%/ 10 ml [100 ppm]
• 1,5ml / 1500 uL de la solución patrón A + aforo con ácido acético al 1%/ 10 ml [150 ppm]
Preparación de la Muestra: Extracción de Cafeína presente en Café Tostado
1. Pesar 0,1 g ó 100mg de muestra de café tostado molido finamente en un tubo de centrifuga.
2. Añadir 10 ml de agua grado HPLC.
3. Añadir 0,75 ml / 750 uL de hexacianoferrato (II) de potasio trihidrato (Carrez I) y agitar.
4. Añadir 0,75 ml / 750 uL de sulfato de zinc heptahidrato (Carrez II) y agitar.
5. Centrifugar por 20 minutos a 4500rpm.
6. El sobrenadante obtenido filtrarlo por acrodisco de nylon de 0,22 um.
7. Tomar 0,25 ml / 250 uL del filtrado y adicionarlo al vial.
8. Tomar 0,75 ml / 750 uL de ácido acético al 1% al vial.
9. Determinar por Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a un detector de arreglo de Diodos.
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6. Procedimiento de ensayo
Nombre/referencia del método

Espectrofotometría:
1. Pesar 100mg de una muestra de café molido.
2. Llevar a un tubo de centrifuga
3. Adicionar 10mL de agua destilada al tubo de centrifuga
4. adicionar 0.75mL de Carrez 1 y 0.75mL de Carrez 2 al tubo de centrifuga.
5. Llevarlo a la centrifuga por 20 minutos a 4500 revoluciones por minuto.
6. Recolectar y filtrar el sobrenadante con una jeringa con el acrodisco.
7. Del filtrado obtenido tomar 0.5 mL y llevarlo a un matraz de 10ml
8. Aforar con HCl al 0.1 N
9. Realizar los pasos del 1 al 8 por triplicado
10. Leer el espectrofotómetro a 273 nm (por duplicado)
Condiciones Instrumentales:
• Columna: C18 Fase Reversa
• Fase Móvil: Ácido acético al 1% / acetonitrilo (95:5)
• Método Isocrático
• Flujo / Presión: 1 ml/min, 1200 psi
• Detector: UV 273 nm
• Temperatura del Horno: 30°C
• Volumen de Inyección: 10 uL

7. Instrucciones de seguridad
a) Coloque el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor excesivo, humedad o
luz directa.
1
b) Proteja el instrumento del polvo. Nunca toque las superficies ópticas tales como lentes y filtros. Siga las
instrucciones que da el fabricante para la limpieza de tales componentes.
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7. Instrucciones de seguridad
c) Permita que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento.
d) Se debe hacer un chequeo periódico (cada semana) del ajuste de la longitud de onda, cuando se
sospeche que ha variado, con el Tubo de Didimium.
e) Verifique el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando varíe la longitud de onda.
f) Asegúrese de que las cubetas estén limpias y libres de ralladuras y huellas digitales. Esto debe hacerse
cada vez que va a usarse.
Artedinamico. (s/f). RECOMENDACIONES Y CUIDADOS DE LOS ESPECTROFOTÓMETRO. Recuperado el 22 de
noviembre de 2022, de https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/recomendaciones-y-
cuidados-de-los-espectrofotOmetro

8. Especificación de parámetros de desempeño

Método(s)

Nº Observaciones
Parámetro Criterio Referencia
Experimento / Responsable

Linealidad - Evaluación del gráfico de calibración La

lineal concentración,
- Ecuación de la recta dentro del
- Coeficientes de correlación (r) ≥0.998 y USP 2 rango
determinación (r2) ≥0.9998. establecido.
Sara fajardo

Rango de trabajo - Obtenido del ítem anterior, donde se Las lecturas de

cumplan los criterios de exactitud, las 5 muestras,
precisión y linealidad. dentro del
USP 2 rango
establecido.
Scarlett
Hernández
Límite de Detección y - Obtenidos a partir del análisis de 10 Se realizaron
Límite de Cuantificación blancos de reactivo. los cálculos
USP 1
pertinentes.
Astrid Miralda
Repetibilidad Análisis de precisión en corto intervalo de Se realizo por
tiempo: duplicado.
Mismo día, analista, instrumento. Métodos no Las tres
La evaluación de DER (%CV). El criterio normalizado 3 muestras. Sara
será 2% para DER s fardo
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Método(s)

Nº Observaciones
Parámetro Criterio Referencia
Experimento / Responsable

Precisión intermedia
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Exclusiones de parámetros de desempeño

1
2

9. Diseños experimentales
Linealidad y Rango de trabajo
Nº de experimento 1
Preparación de calibración con 5 niveles de concentración, en días diferentes

Límite de Detección y Cuantificación

Nº de experimento 2 obtenido a partir del análisis de 10 blancos de reactivo, en el día de la práctica.

Nº de experimento 3 Repetibilidad

Repitiendo el procedimiento por triplicado muestra 1,2,3, repitiendo por duplicado, proporcionar la menor
variabilidad.

Nº de experimento 4 Precisión Intermedia

10. Registros
Todos los registros, cromatogramas, hojas de cálculo y cualquier documento generado del proceso de validación
quedarán almacenados en una carpeta correspondiente, además de resguardarse de forma digital.
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11. Programa de actividades

Mes octubre Noviembre

Día 7 14 21 28 11 18 25

Planeación x

Experimento 1 X

Experimento 2 x

Avance 1 x

Experimento 3 x

Avance 2 x

Experimento 4

Evaluación de Resultados

Entrega de informe

12. Documentos relacionados

Documentos externos

Manuales
Procedimientos
Balanza analítica
Instructivos Centrífuga
HPLC
Formatos de trabajo

13. Resultados
Nº de experimento 1: Linealidad y Rango de Trabajo
Fecha de Ejecución: 21/10/2022
Responsable: Scarlett Hernández

Alícuotas Concentración Señal

0,20 ml 20 ppm 389320
0,25 ml 25 ppm 293128
0,50 ml 50 ppm 518509
1 ml 100 ppm 475539
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1,5 ml 150 ppm 733836

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Nº de experimento 1: Linealidad y Rango de Trabajo

Fecha de Ejecución: 11/11/2022 (cafeína citrato)
Responsable: scarlett Hernandez

Alícuotas Concentración Señal

2.5 ml 0.1 N 0.0085
3.5 ml 0.014 N 0.0092
4.5 ml 0.018 N 0.0054
5.5 ml 0.022 N 0.0067
6.5 ml 0.026 N 0.0067

Ecuación de la Recta
Fecha de Ejecución: 27/10/2022 Fecha de Ejecución: 11/11/2022
B= 299366.3592 B= 0.006721231
M= 2647.826678 M= 0.016076923
R= 0.886331049 R= 0.378532512
R2 = 0.785582729 R2 = 0.143286862
Rango de Linealidad 20 ppm – 150 ppm Rango de Linealidad 0.1 N-0.026 N

Nº de experimento 2: Límite de Detección y Límite de Cuantificación

Fecha de Ejecución: 11/11/2022
Responsable: scarlett Hernandez

Repeticiones Señal
1. 0.0085
2. 0.0092
3. 0.0054
4, 0.0067
5. 0.0067
6, 0.0071
7. 0.0135
8. 0.0160
9. 0.0115
10. 0.0129
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Promedio Blanco 0.00975

Pendiente 0.000785

Desviación Estándar 0.003536

Límite de Detección 11.67742

Límite de Cuantificación 35.38613

Criterio de Aceptación LOQ 11.67742 LOQ 35.38613

Si cumple 11.67742 < 35.38613

Nº de experimento 3: Repetibilidad
Fecha de Ejecución: 18/11/2022
Responsable: Scarlett hernandez

Muestra Repetición Señal

1 1. 0.6580
2. 0.6692
2 1. 0.6720
2. 0.6637
3 1. 0.6633
2. 0.6433

Responsable: scarlett hernandez

Muestra Promedio Señal S RSD CV Criterio de Aceptación

0.6636 0.00792 0.00792 1.193429 1.1934 < 2 %
1
0.6678 0.00594 0.008894 0.889442 0.8892 < 2%
2
0.6536 0.014142 0.021647 2.164723 2.1647 < 2 % no cumple
3
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Nº de experimento 4: Precisión Intermedia

Fecha de Ejecución:
Responsable:
Muestra Replica Señal Muestra Replica Señal Muestra Replica Señal

Responsable:

Muestra Promedio Señal S RSD CV Criterio de Aceptación

Responsable:

Muestra Promedio Señal S RSD CV Criterio de Aceptación

Responsable:

Muestra Promedio Señal S RSD CV Criterio de Aceptación

3
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ANEXOS
Experimento 1: 21/10/2022
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Experimentó 2 : límite detección y cuantificación

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Experimento 3: Repetibilidad
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NOTA: El método UV-Visible, ya no en HPLC,debido a problemas con el

equipo se está cambiando de técnica,pero no de metodología.