Tinte rojo del Nilo en surfactante acuoso y solución micelar

Resumen: El comportamiento de solubilización

del tinterojo ni leen soluciones acuosas de
surfactante y micelar fue estudiado por técnicas
espectroscópicas ópticas, dispersión dinámica
de la luz y microscopía de fuerza atómica. El rojo
nilo presenta una absorción considerable en la
región de concentración submicellara. Cuando
sedispersan d ensurfactante acuoso y/o
solución micelar, las moléculas rojas del nilo
tienden a formar dimers no emisivos y/o
agregados de tipo H a través de interacciones
de apilamiento. Este fenómeno puede limitar el
uso de rojo del nilo en estudios de solubilización.
En presencia demicelasSDS y CTAB con ición ión,
la solubilización del rojo del nilo parece tener
lugar principalmente en la superficie micelar
cargada dentro de la región interfacial. Del
mismo modo, los espectros en la solución
micelar de Triton X-100 no iónicos revelaron que
el tinte rojo del nilo

Introducción
El rojo nilo ha atraído un interés creciente durante las últimas décadas, debido a sus propiedades solvatocromáticas
altamente emisivas y positivas en comparación con otros colorantes. 1•9El comportamiento solvatocromático derojo del
nilo en diffLas soluciones homogéneas erent se atribuyen a un proceso de transferencia de carga intramolecular (TICT)
retorcido, que depende exponencialmente de la polaridad local del medio. 10Debido a su sensibilidad al entorno local
inmediato, el rojo nilo se ha aplicado ventajosamente para sondear la polaridad local en el estudio de varios sistemas
11
heterogéneos, incluyendo micelas, micelas inversas,4 dendrímeros,12 osomas labiales,15,16 proteínas,17,18
zeolitas,10 y líquidos iónicos.5,19
En el arco de rese de administración de fármacos, se ha discutido lasolubilización (encapsulación) de rojo nilo en
términos de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de tinte y el entorno interior no polar de los
nanoparticulados scaffolds.20•25A pesar del uso generalizado de rojo nilo comofosfobia, se ha prestado muy poca
atención a su agregación y comportamiento interfacial. Sólo pocos estudios sobre estos aspectos se han publicado
hasta ahora, y por lo tanto los fenómenos observados aún no se entienden bien. Varghese y Wagenknecht26
investigaron el autoensamblaje no valente de (rojo nilo)-modified2-desoxiuridina en agua. Descubrieron que el
espectro de absorción en metanol (570 nm, 32,7) se desplaza a una longitud de onda más corta en el agua (540
nm, a 78,4). Este inusual s hift hipsocrcórmicoha sido asignado a la formación de agregados de tipo H. Del mismo
modo, H-agregación del tinte rojo del Nilo se observó a altos niveles de carga en soluciones acuosas de
polímeros basados en azúcar-PEG-27 y nanopartículas dendríticas de núcleo multicapa. 12Un estudio
recientepor Felbeck et al.28se centró en los materiales híbridos laponite cargados de rojo del nilo. Los
resultados espectroscópicos revelaron que en solución acuosa altas concentraciones de tinte favorecen la
formación de dimers de tipo H no emisivos. Para obtener una visión más profundade la interacción vinculante
y losmecanismos involucrados, se requieren más estudios sobre el autoensamblaje rojo del nilo y la
caracterización de las estructuras supramoleculares.
La solubilización micelar de compuestos hidrofóbicos es de gran importancia práctica. 29,30Por lo tanto,
mucha atención hatanto en la medida de la solubilización como en las posibles posiciones en las que los
procesos de solubilización podrían ocurrir. El análisis espectral nos permite determinar los sitios de unión
micelar y estimar cuantitativamente la polaridad local alrededor de la sonda. Seaporque losdimers y los
agregados de tipo H no son emisivos,31 autoensamblajes espontáneos pueden limitar el uso de rojo del nilo
en estudios de solubilización.

Aquí se informa de las propiedades espectroscópicas del tinte rojo del Nilo en soluciones acuosas de surfactante y
Micellar (Figura 1). Hemos observado que en presencia de tensioactivo, el rojo del Nilo muestra una absorción
considerable en la región de concentración submicelar. Los espectros de absorción óptica suelen mostrar un máximo
en el rango de 450 500 nm (en comparación con 593 nm en agua), acompañado de un hombro intenso en la región
roja del espectro. Atribuimos el desplazamiento del pico máximo a la formación de agregados tipo-H. Curiosamente,
las dispersiones en agitación del rojo del Nilo dentro de una solución acuosa de tensioactivo y/o micelas resultan en
agregados surfactante (tinte) de 100 nm-tamaño. Nuestros resultados pueden contribuir a una comprensión más
fundamental del comportamiento interfacial, que es necesario para la aplicación exitosa del rojo del Nilo en
nanociencia y nanotecnología. En el presente estudio, se han seleccionado tensioactivos disponibles comercialmente
porque sus propiedades físicas y químicas están bien documentadas en la literatura.

Figura 1. Estructura química de rojo nilo y tensioactivos investigados

Adjunto. Entre paréntesis se encuentran los valores críticos de concentración de micelas (CMC) en agua a 25oC. 32

■ SECCION EXPERIMENTAL
Materiales. Todos los productos químicos estaban disponibles comercialmente y degrado analítico. El sulfato de
dodecilo de sodio (SDS) y el cetitrimethy-lammonium bromida (CTAB) se compraron a Fluka. El éter de polioxi-etileno (10)
tert-octilfenilo (Triton X-100) se utilizó como recibido de Sigma-Aldrich. Nile red fue comprado a ABCR GmbH & Co. Se
compraron disolventes de grado analítico alas empresas Sigma-Aldri ch yAcros Organics. Todos los productos químicos
se utilizaron sin más purification. En todos los experimentos y para la preparación de todas las muestras se utilizó agua
de un sistema Millipore (resistividad de18 Mcmcm a1) .
Estudios espectroscópicos de UV/Vis y Fluorescencia.Absorciónespectros fueron adquiridos a los 25°C utilizando un
espectrofotómetro Scinco S-3150 UV/vis (rango 187x1193 nm; resolución 1024 puntos; soporte de celda termostatizado para
cubetas cuadradas de 1 cm). Los espectros de emisión de fluorescencia se tomaron con un espectro fluorímetro
Jasco FP-6500 equipado con un soporte decelda termostatizado (1 cm), una lámpara de xenón de 150 W alimentada por
CC, un fotomultiplicador Hamamatsu R928 y un sistema de hendidura variable. Los espectros de emisión de rojo nilo se
registraron a 25oC de 575 a 800 nm después de la excitación a 550 nm. La excitación del bot h y lashendiduras de emisión
se fijaron en 5 nm.
Dispersión dinámica de la luz. Se realizaron mediciones de DLS para determinar el tamaño preciso de las micelas y agregados.
Los experimentos se llevaron a cabo en un analizador Zetasizer Nano ZS con integrado 4 mW He-Nelaser, á 633 nm (Malvern
Instruments Ltd, UK). Este aparato, que utiliza la detección de retrodispersión (ángulo de dispersión )
= 173o ) y un detector de fotodiodo deavalancha, está equipado con una fuente láser de neón de helio(longitud
de onda defuncionamiento 633 nm; potencia 4,0 mW)y una cámara de muestratermostatizada controlada por un
Peltier termoeléctrico. Se asumió que tanto la viscosidad de la solución (a 0,89 mPa s)33 como el índice de
refracción (n a 1,33)34 eran los del agua. Para todos los experimentos, se utilizaron cubetas desechables con transparente
UV (12,5 x 12,5 x 45 mm, Sarstedt AG & Co, Alemania).
= Microscopía de Fuerza Atómica (AFM). Una gota de muestra acuosasolución fue depositada en una superficie
de mica recién desnudó y giró offdespués de las 5 s. La superficie se secó bajo un fl ux de gas nitrógenoy luego fue
 fotoizada por AFM en modo de roscado en condiciones ambientales, empleando un Nanoscope 3a (Veeco, EE. UU.),
utilizando voladizos de silicio (Olympus, Japón) con una frecuencia de resonancia típica de 300 kHz y una constante de
resorte de aproximadamente 42 N ma1.
= Mediciones en elRégimen de Conceción Submicellar. Dispersiones acuosas con difflas
concentraciones de surfactante estaban recién preparadas. Se añadió rojo nilo (1 y 10 mg/ml) como polvo de
fine, y las mezclas se agitaron durante 2a3 días a temperaturaambiente. Los residuos sólidos insolubles del
tinte se eliminaron por filtration a través de un filtro dePTFE de0,45 m. Las soluciones obtenidas fueron
analizadas mediante espectroscopía UV/vis y fluorescence. El tamaño y la forma agregados se determinaron
mediante
= la dispersión dinámica de la luz y la microscopía de fuerza atómica.
= Mediciones en Soluciones Micellaras Acuosas.Aliquots of a nilesolución de stock rojo (1 mM en THF)
fueronfiprimero transferido a viales de vidrio. El disolvente se retiró cuidadosamente bajo presión reducida dejando
ladrillo rojo delgado sólido films. A continuación, se añadieron a los viales de muestra soluciones
tensioactivas acuosas conconcentraciones de surfactante. Del mismo modo, se obtuvieron espectros después de
12 h de agitación a temperatura ambiente. Debido a que la disolución del tinte era incompleta, los residuos sólidos
insolubles de los films se eliminaron por filtración. Para los estudios de la solución Triton X-100 (1,0 mM), la cantidad
de tinte varió entre 0,008 y 0,955 mg/ml. Las soluciones filtered (PTFE de 0,45 m) fueron investigadas por UV/vis
y espectroscopia de fluorescencia. Los tamaños de micelas/agregados se midieron mediante dispersión dinámica
= la luz y microscopía de fuerza atómica.
de
= Mediciones en Cosolvente-Mezclas deAgua.Spectra fueronobtenido en mezclas de agua y dioxano.
Todas las mezclas se prepararon en términos de relaciones de volumen. Se preparó una curva de calibración
para determinar la capacidad de solubilización del rojo del nilo en solución micelar. Para este propósito, una
solución de caldo rojo del nilo (1,0 mM) se preparó recién preparada en unamezcla de agua de dioxano al
70%. A continuación, se tomaron alícuotas para formar soluciones de sampl e de 1.25, 2.5, 5.0, 10, 15, 20 y 25
M. Después del equilibrio de temperatura, las muestras fueron analizadas por UV/vis espectros-copia. Los
máximos de absorción se registraron a 25oC entre 300 y 900 nm.

■ RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Rojo Nilo en soluciones surfactantes acuosas. El effect detensioactivos iónicos(SDS y CTAB) en dispersiones
acuosas de rojo nilofiestudiado por primera vez a concentraciones submicellaras mediante espectroscopia de
absorción en estado estacionario. En un experimento típico, se añadió polvo rojo del nilo a las soluciones
tensioactivas, y las mezclas resultantes seagitan vigorosamente durante 2a 3 díasatemperatura ambiente. Las
muestras fueron filtered e investigadas espectrofotométricamente como se describe en la Sección Experimental.
Encontramos que incluso cuando la concentración de surfactante formando micelas está por debajo de su
concentración crítica de células m, los espectros deabsorción óptica muestran unmáximo bien de fi ned en el
rango de450a500 nm, acompañado de un hombro intenso en la región roja del espectro (Figura 2). Este
comportamiento espectroscópico inusual antesde la formación de micelas y la aparición de un nuevo pico en el
espectro deabsorción sugieren fuertes interacciones de unión entre el tinte y/o entre el tinte y las moléculas
tensioactivas. Por lo tanto, es ciertamente concebible que tal interacción podría conducir a la formación de tinte-
surfactant (teñido) agregados en el agua mantenidas juntas por el apilamiento y interacciones hidrofóbicas.
También se realizaron experimentos similares a los descritos anteriormente en las soluciones Triton X-100. Los
resultados de las mediciones espectroscópicas se muestran en la Figura 3. Enla presencia de 0,05 mM Triton X-100
(0,19x0,21 o CMC), el rojo nilo presentaba una máxima de absorción a 499 y 484 nm para muestras que contenían
1 y 10 mg/ml de rojo nilo, respectivamente.
Figura 2. (A) La effectde tensioactivos en dispersiones acuosas (1 mg/ml) de rojo nilo. Espectros de absorción (a)ae) en 0,88,
1,76, 3,52, 5,63 y 7,04 mM SDS. (B) Las concentraciones de CTAB fueron de 0,07, 0,26, 0,52, 0,83 y 1,03 mM, respectivamente.
Todos los espectros se registraron a 25oC. Se informa que los CCM de SDS y CTAB en el agua están entre 8,1y8,4 y 0,92a1,00
mM, respectivamente.32

Figure 3. Absorption of nile red in aqueous Triton X-100 solutions. Inset: Corresponding fluorescence
emission spectra of the dye (λexc = 550 nm). Measurements were performed below and above the CMC on
solutions containing (a) 0.1 mg/mL of nile red in 1.0 mM Triton X-100, (b) 1 mg/mL of nile red in 0.05 mM
Triton X-100, and (c) 10 mg/mL of nile red in 0.05 mM Triton X-100.

Lo más llamativo, las bandas de absorción se acompañan de nuevo por bandas de hombro de cambio rojo en
alrededor de 550 nm. Además, a partir de los espectros se puede ver que la absorbancia disminuye
considerablemente a medida que aumenta la cantidad de rojo nilo. Curiosamente, se observa un ligero shif
hipsocromáticode 15 nm para la banda de absorción. Una vez más, esto sugiere fuertes interacciones de unión entre
el tinte y / o las moléculas surfactantes a la concentración submicellara. Los agregados, sin embargo, se mantienen
unidos muy probablemente por interacciones asociativas de apilamientog del sistema de anillo aromático
condensado de rojo nilo. El recuadro de la Figura 3 muestra los espectros de emisión de fluorescence
correspondientes. En línea con la expectativa, las dos soluciones de muestras rojas del nilo eran casi no emisivas en
el agua. Por el contrario, en presencia de 1,0 mM de Tritón X-100 (3,7x4,2o CMC), se observa una fluorescencia
relativamente intensa con un máximo de emisión de633 nm. Esta longitud de onda indica claramente que las
moléculas de tinte ligadas a micelar están expuestas a un entorno menos polar. En la solución micelar de Triton X-100,el
espectro UV/vis muestra una banda de absorción bien defi ned con un máximo de 549 nm(Figura3). De este
espectro de absorción, se puede inferir que la solubilización del rojo del nilo tiene lugar principalmente dentro de la capa
de poli(oxietileno) hidrófilo de la micela. Laconstante dieléctrica ectiva del microambiente es inferior a la de la ta granel
del agua (á máx. a 593 nm;"78,4) y se aproxima a la polaridad de la poli(etileno-
glicol) PEG 400 (ámáx. 550 nm;"12,4).35
Tamaño y forma del tinte-Tensioactivo (Dye) Agregados en soluciones de surfactante acuoso.Los aspectos estructurales
fueroninves técnica de dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Del mismo modo, se
realizaron experimentos en soluciones SDS de 1,0 mM (0,12 o CMC) y 0,05 mM Triton X-100 (0,19a0,21 o CMC). Antes del
análisis, el polvo rojo del nilo se suspendiód en solución tensioactiva acuosa para formar mezclas de 1 y 10 mg/ml,
respectivamente. Las suspensiones se agitaron durante 2a3 días atemperatura ambiente, y luego se filijaron para obtener
soluciones claras y de color rojo.
Las distribuciones de tamaño agregado determinadas por DLS se muestran en la Figura 4. Se encontró una amplia
distribución del tamaño de partícula en las soluciones SDS y Triton X-100. Las curvas ponderadas de intensidad suelen
mostrar picos anchos únicos con diámetros hidrodinámicos que van de 100 a 200 nm. Para las muestras preparadas a
partir de una dispersión de 1 mg/ml, los diámetros medios de Zseencontraron como 165 x 3 (PDI a 0,191) y 153 a 1
nm (PDI a 0,151) en 1,0 mM de SDS y 0,05 mM de Tritón X-100, respectivamente. Del mismo modo, se constató que los
diámetros determinados para las dispersiones de 10 mg/ml eran de 137 a 1 (PDI a0,245) y 189 a 4 nm (PDI a 0,164) en
SDS de 1,0 mM y 0,05 mM de Tritón X-100, respectivamente. Una comparación de la distribuciónde intensidad profiles
con las distribuciones devolumen correspondientes sugiere una distribución de tamaño bimodal con aproximadamente
un tamaño agregado similar.Como se ve en la Figura 4, los hombros pico son claramente visibles para todas las muestras.
Además, se encontró una cola hacia el extremo del tamaño superior en el número profiles, indicando de nuevo una
distribución de tamaño multimodal. Los datos de distribución de tamaño por intensidad, volumen y número, así como los
valores Z-promedio y PDI se presentan en la Tabla S1 de la Información de apoyo.
AFM se aplicó a lamorfología agregada. La Figura 5 muestra agregados aislados de una suspensión de 10 mg/ml
de rojo nilo en solución SDS de 1,0 mM. En la mica, los agregados tienen una longitud típica de alrededor de 120
nm, que es slightly menor que el diámetro hidrodinámico promedio determinado por DLS (137 a 1 nm). Este
resultado es consistente con la observación general de que el diámetro hidrodinámico es igual a la longitud del
eje largo establecido por AFM.
Se realizaron más experimentos en agregados aislados de un suspenso de 1 mg/mlde rojo nilo en 0,05 mM
(0,19x0,21 CMC) Solución Triton X-100. Para obtener información sobre la estructura agregada interna, la muestra
fue sometida a tratamiento ultrasónico durante 20 minutos, seguido de una manipulación de tres pasos con una
punta AFM. En mica, losregates de agg fueron fiprimera imagen de AFM en modo de roscado, a partir de
entonces manipulados con una punta AFM en modo de contacto, y finally imagen de nuevo por el modo de
tocando, para comprobar si eran estables individuales entidades. 36•38La Figura 6 muestra las imágenes de altura
de AFM y el cor responder altura profia travésde un agregado (teñido-tensioactivo). Después del tratamiento
ultrasónico, los agregados descomponeron a (múltiples) estructuras de capa. Durante el proceso de manipulación,
la capa superior en el centro fue cortada y movida por la punta AFM a la ide derechade la imagen. Como se
muestra en la Figura 6, la altura de la capa (recién formada) en el lado derecho de la imagen fue de alrededor de
1,4 nm, mientras que la altura en el centro se redujo de 3,4 a 2,2 nm.
Atribuimos una sola capa a una disposición paralela de moléculas de tinte con estructura auto-ass. Teniendo en
cuenta la longitud (dimensión larga) de las moléculas rojas del nilo,39 una sola capa es de aproximadamente 1,1 nm
de espesor. Antesde la manipulación de la punta, el centro estaba compuesto por tres capas (3,3 nm de altura),
mientras que el borde estaba compuesto por unasola capa(1,1 nm). De hecho, esto tienemuy bien con la altura
profile que se muestra en laFigura 6a. Durante la manipulación, la capa superior se movió por la punta, dejando
así dos capas (2,2nm) en el centro. Después de la manipulación, la capa superior tenía una altura de 1,4 nm,
ligeramente mayor que el ancho de una sola capa de las moléculas rojas del nilo autoensambladas (1,1 nm).
Atribuimos esto a una débil flexión de la capa después de la manipulación
igura 5. Imagen de altura de AFM de los agregados rojos del nilo depositados en unSuperficie de mica. Los agregados se
aislaron de unasuspensión de 10 mg/mlde rojo nilo en 1,0 mM de SDS (0,12 o CMC).

Rojo Nilo en solución micelar acuosa. Micelarsolubilización generalmente se trata endel modelo de separación de fases,
40•45
en el que se hace una distinción entre el solución acuosa y la pseudofase micelar. Aparte del agua a granel,
las micelas se tratan como unafase de tasa. Por lo tanto, las moléculas invitadas pequeñas (polares) se
distribuirán entre la pseudofase acuosa y la semifase micelar. El rojo del Nilo se disuelve en una amplia gama
de disolventes y mezclas de disolventes, pero exhibe muy baja solubilidad en agua (<1ág/mL). 1Por lo tanto,es
razonable suponer que en presencia de micelas el tinte está completamente solubilizado en la pseudofase
micelar. La figura S1 de la información de soporte proporciona una vista esquemática de la pseudofase micelar
y la estructura interna de las micelas en solución acuosa.
Hemos elegido Triton X-100 micelas como sistema modelo, porque las micelas de tensioactivos y polímeros no iónicos
son componentes comunes de formulaciones farmacéuticas. 46Según nuestros datos espectrométricos, el rojo del nilo
parece estar ubicado en las regiones exteriores de las micelas (véase la figura 3). Para obtener información sobre los
procesos de unión al tinte y autoensamblaje, se realizaron mediciones espectroscópicas adicionales en soluciones de 1,0
mM de Triton X-100 (3,7x4,2 o CMC). Las solucionesde muestra se prepararonmediante elmétodo dehidratación
delgada, mediante el que se obtuvieron films fi delgadas de rojo nilo a partir dealícuotas de una solución de
colorante en THF. La hidratación se logró añadiendo volúmenes iguales de tensioactivo acuoso a la films delgadaseca.
Las dispersiones se dejarona temperatura ro om y se agitaron a fondo durante la noche. Elprocedimiento de
hidratación delgada permite realizar mediciones en la región de baja concentración de tinte. Como se señaló en
la Sección Experimental, la cantidad de tinte fue variada entre 0,008 y 0,955 mg/ml. Una vez más, las concentraciones
de rojo del nilo se refieren a las alícuotas tomadas de una solución de colorante. Es importante tener en cuenta que
después de 12 h de agitación, la disolución de la films todavía estaba incompleta. Debido a que las mezclas fueron
sometidas a filtration, todas las solucionesde la muestra se expec se expec para tener concentraciones más bajas
de rojodel nilo. Como se discutirá más adelante, la concentración real de tinte solubilizado se puede estimar mediante
espectroscopia UV/vis.
Figura 6. Imagen de altura AFM y pro de alturafia travésde un agregado (A) antes de la manipulación (rojo nilo-Triton
X-100) antes de la manipulación y (B) después de la manipulación.

La Figura 7a muestra que con el aumento de la concentración de rojo nilo, se observa un gran desplazamiento
azul de la longitud de onda máxima de la banda de absorción de 553 a 499 nm. A alta concentración de tinte, los
espectros de absorción se acompañan de bandas de hombro en la región roja. Por el contrario, la forma y la longitud
de onda máxima de la banda de emisión se mantuvieron casi sin cambios, mostrando así sólo un ligero
desplazamiento al rojo por unos 3 nm de 632 a 635 nm. Lo más sorprendente, sin embargo, la intensidad de la
banda de emisión en función dela concentración de tinte muestra un máximo bien defined en el régimen de
concentración de tintebajo (0,064 mg/ml) seguido de una disminución gradual en el fl la intensidad de la
uorescencia, ya que la cantidad de tinte se incrementó aún más a 0,995 mg/ml (Figura 7b). Nuestros resultados
muestran claramente que la respuesta espectral depende en gran medida de la concentración de rojo del nilo
(solubilizado).
< La Figura 8 muestra el modelo esquemático de solubilzación micelar y la formación dependiente de la concentración
de dimers y agregados al cargarcon rojo nilo. En una solución muy diluida(0,016 mg/ml), el autoensamblaje de moléculas
rojas del nilo es menos favorecido. Por lo tanto, las moléculas de tinte solubilizado existen principalmente como
monómeros, de acuerdo con la observación de que la intensidad de la fluorescencia aumentó señalfificantly con
el aumento de laconcentración de rojo del nilo. Nuestra observación está en acuerdo razonable con los resultados
obtained de las mediciones DLS. Como se muestra en las figuras S2 y S3 de la información de apoyo, los profi les de
distribución ponderadas por volumensugieren una distribución monomodal del tamaño, con una población
predominante (>98%) de pequeñas micelas cargadas de tinte. Debido a la solubilización del tinte rojo del nilo, el tamaño
de las micelas aumenta ligeramente de 5,7 nm en solución tensioactiva ordenada a casi 10 nm en presencia de moléculas
invitadas. Como se puede ver en los espectros UV/vis de la Figura 7a, se encontró que la longitud de onda máxima
estaba constanciade t (ámáx.553 nm) dentro del rangode concentración estudiado (0,016mg/ml). Las micelas
cargadas con tinte tienden a formar agregados tras la solubiliza-ción de rojo nilo (Figuras 8). Para concentraciones de
tinte de0,032 mg/ml, las micelas Triton X-100 desaparecieron, y sólo se encontraron agregados con diámetros medios
medios de intensidad que oscilan entre 150 y 450 nm (Tabla de Información de Apoyo S2, Figuras S2-S4). Una comparación
de ladistribución de intensidad profiles con las distribuciones devolumen correspondientes sugiere una distribución
de tamaño bimodal, o más bien multimodal. Lo más probable es que este tipo de agregación sea impulsada por
interacciones hidrofóbicas. La penetración de moléculas rojas del nilo en la corona de polioxietileno hidratada sin duda
disminuirá la hidrofiliadez de la superficie micelar. Al igual que las micelas Tritón X-100, los agregados sirven como
anfitriones y pueden acomodar moléculas rojas del nilo. Como se mencionó anteriormente, la intensidad de la
fluorescencia alcanzaun máximo de0,064 mg/ml. Hasta esta concentración de tinte, se espera que la distancia media
entre las moléculas invitadas solubilizadas sea grande. Como resultado, las interacciones de los s.a. son menos
favorecidas, y las moléculas rojas del nilo solubilizadas existen principalmente como monómeros (Figure 8). Por el
contrario, a altas concentraciones de tinte, pueden existir moléculas de tinte solubilizado en una mezcla de equilibrio de
monómeros y dimers de tipo H no emisivos.28De hecho, una disminución gradual de lafl intensidad de uorescencia se
observó con el aumento de la concentración rojo del nilo (>0,064 mg/ml). Una vez más, el temple fluorescence es
causado por el apilamiento cara a cara de los anillos aromáticos, por el que el grado de temple suele actuar como
un indicador de las interacciones intermoleculares de los cromóforos. Sin embargo, sólo unacantidad de tinte limited
puede ser acomodada por los agregados. Una vez que se alcanza el nivel de saturación del contenido de tinte, la
agregación H se vuelve prominente (Figura 8). De hecho, se observó un gran desplazamiento azul de la longitud de onda
máxima de la banda de absorción para altosniveles de loading de rojo nilo (ver recuadro de la Figura 7a). Como se
observó para la intensidad de la fluorescencia, el tamaño agregado alcanzó un máximo de 0,064 mg/ml de rojo nilo
(Figura S2, Información de apoyo). Con un mayor aumento en la concentración de tinte (>0,064 mg/ml), eltamaño
agregado disminuyó para alcanzar un valor de estado estacionario alrededor de 150 nm (PDI<0.2). Este fenómeno, que
también se observó para el núcleo dendrítico-nanopartículas multiconcha,13 se puede atribuir, muy probablemente, a un
tamaño óptimo, termodinámicamente favorecido para losagregados cargados de rojo del nilo. En resumen, nuestros
findings muestran claramente que, aparte de la respuesta espectral, también el tamaño agregado depende en gran
medida de la cantidad de rojo nilo solubilizado.
Debido a la solubilización incompleta de los filmsrojos del nilo, las raciones concentede las muestras fi ltered son más
bajas que las de las alícuotas utilizadas para la preparación de film (0.008?0,955 mg/mL). Una estimación de las
concentraciones reales de tinte se hizo a partir de una curva estándar. La curva de calibración se basa en la ley de
cerveza yla leyde Lambertobtenidasmidiendo la absorbancia de varias concentraciones de rojo nilo en unamezcla de
agua de dioxano del 70%.

Figura 8. Esquema representación de micelas y agregados cargados de rojo nilo. Las concentraciones de tinte se refieren
a alícuotas tomadas de una solución de colorante.Las estructuras propuestas se basan en la suposición de que el tinte
rojo del nilo está completamente solubilizado en la pseudofase/aggregat micellares. En la solución diluida, las moléculas
invitadas solubilizadas existen principalmente como monómeros. Un aumento en la concentración de tinte favorece la
formación de dimers no emisivos. Los agregados de tipo H se vuelven prominentes en altos niveles de carga
Figura 7. (A) Espectros de absorción de rojo nilo en soluciones micelares de Triton X-100. Inset: Máximo de absorción frente a
concentración profile.
(B) Effect de concentración de rojo del nilo en la intensidad de la fluorescencia (s/s 550 nm) en la solución de Tritón X-
100. Inserción: Espectros de emisión correspondientes. Las concentraciones de rojo del Nilo se refieren a las alícuotas
tomadas de porsaciónde colorante. La concentración de surfactantes se fixed a 1,0 mM (3,7x4,2 o CMC).

Como se muestra en la Figura S5 de la Información de Apoyo, se encontró que la absorción molar a - (33 100 x 100)
M•1cm•1. Las concentraciones de tinte verdaderas se estimaron aplicando la relación c a A /l, dondeAes la absorbancia
medida en?máx., "es la absorción molar dependiente de la longitud de onda,les la longitud del camino, yces la verdadera
concentración de tinte. Como era de esperar,las soluciones de muestra mostraron concentraciones de rojo del nilo
típicamente 20a50 veces inferiores a las observadas en la Sección Experimental. La relación molar [dye]/[Triton X-100]
era típicamente de aproximadamente 1/(a800). De hecho, sólo pequeñas cantidades de moléculas de tinte fueron
acomodadas por los anfitriones. Por medio de la misma curva de calibración, estimamos ampliamente la capacidad
desolubilización, es decir, la cantidad detinte solubilizado por cantidad de tensioactivo empleado. Del mismo modo, para
las micelas y agregados cargados de rojo del nilo, se encontraron capacidades de solubilización muy pequeñas. Los valores
típicos obtenidos se encuentran en el
rango de 0,7x2,1 mgdeNR/gTX-100. Puede encontrar más detalles en la información de soporte.
Sondeo de Microdo-principales hidrófilos e hidrófobos. En solución acuosa, las micelas exhiben una
polaridad
(constante dieléctrica) entre la superficie micelar altamente hidratada y el núcleo hidrófobo. 30,45,47•51Como
consecuencia, lasmoléculas rojas del nilo solubilizadas están expuestas a un entorno menos polar. Para sondear su
entorno circundante en micelas, se registraron espectros UV/vis y fluorescence en soluciones micelares de SDS,
CTAB y Triton X-100. La Figura 9a muestra que en la presence de Triton X-100 el espectro de absorción de rojo nilo es de
14x23 nm de desplazamiento azul en comparación con los de las solucionesSDS y CTAB.

Del mismo modo, la longitud de onda de la banda de emisión máxima presenta un cambio azul en el rango de 9x13 nm.
Estos datos indican claramente que el rojo nilo experimenta un entorno menos polar en las micelas Triton X-100
que en los conjuntos micelares de SDS cargadoo o CTAB.
Para estimar cuantitativamente la polaridad local en la unión micelar, los espectrosde UV/vis y fluorescencia
(Figura S5, Información de apoyo) se registraron en mezclas de dioxano y agua y se compararon con los de
surfactante Soluciones. Cosolvente-las mezclas de agua se pueden tomar como modelo
sistemas para sondear el medio ambiente localde los dedos y drogas en las micelas. 32,50,52Seguimos el
protocolo50anteriormente
descrito por Kumbhakar y otros que investigaron el locus de solubilización de la cumarina 153 (C153) en triton X-
100 milcelas. Briefly, espectros de fluorescencia enestado estacionario deC153 were fiprimero medidos en una
serie de mezclasde etanolyagua. Los cambios observados en las máximas de emisión se trazaron entonces contra
la llamada polarización orientación.

E -1 N2-1
f- −
2e+1 2n2-1 ①
donde es la constante dieléctrica yd n es el índice de refracción del medio. El primertérmino (((1) /(2o + 1))
explica los cambios espectrales debido tanto a la reorientación de los dipolos de disolvente como a la
redistribución de los electrones en las moléculas de disolvente. El segundo término ((n 2 x 1)/(2n2 + 1)) sólo
representa la redistribución de los electrones. La difference de estos dos términos explica los cambios
espectrales debido a la reorientación de las moléculas de disolvente, y por lo tanto el término polarización de
orientación.
A partir de la curva de calibración thus obtenida, la constante dieléctrica del entorno de la sonda se estimó
en 22,4. Sobre la base de este resultado, se llegó a la conclusión de que C153 reside preferentemente en la
capa de palisade de la micela. En el presente estudio, utilizamos mezclas de dioxano y water. Debido a que
los disolventes son miscibles en todas las proporciones, las mezclas cubren una amplia gama de polaridad de
2.21 en dioxano limpio a 78.4 en agua.53Se prepararon mezclas de disolventes en términos de relaciones de
volumen. Por lo tanto, paralas mezclas de dioxano-agua, secalcularon los valores dieléctricos con stant y del
índice derefracción aplicando las relaciones:48
Mezc
la •f ?" +f ?"
E dioxano dioxano agua agua ②
n ·n
mezcla
2
•f dioxano
2
+f · nagua2 ③
Dioxan
o Agua
donde f representa las fracciones de volumen de la cosolventes utilizada. La Figura 9b ilustra la dependencia de la máxima
de emisión de rojo nilo(v-en cm-1) contra la polarización deorientación ( f) paradifferent dioxano •mezclas deagua.
En una gama limitada de composiciones solventes (10x80% de dioxano), el fluorescence maximamostró una dependencia
lineal de f (R2 0.990). El trazado de los valores máximos de emisión obtenidos inicialmente a partir de los espectros
en solución micelar (Figura 9a) en la misma línea recta permite la estimación de laconstantedieléctrica ectivaeffen las
proximidadesde la Tinte. Como se puede ver en la curva de regresión de la Figura 9b, las líneas perpendiculares se
dibujaron en el eje f,produciendo así valores individuales de 0,30, 0,29 y 0,27 para las micelas SDS, CTAB y Triton X-100,
respectivamente. La gráfica de la orientación polarizabilidad (Figura 9b) demuestra claramente un entorno menos polar
para el rojo nilo solubilizado en triton X-100 micelas. Los datos se correlacionaron de forma inal con los valores
constantes dieléctricos correspondientesutilizando la relación anterior para f. Junto con el assumption de que el
índice de refracción es similar al del agua, las constantes dieléctricas se estimaron 24.6, 18.7 y 13.9 en solución SDS,
CTAB y Triton X-100, respectivamente. Se deduce del resultado actual que en presencia de Tritón X-100, las
moléculas de color rojo del nilo penetran en la región de polietileno (capa de palisade) de la micela. En
elcontrario,en soluciones micelares de SDS iónica y CTAB, el rojo nilo reside preferentemente completamente en
la superficie micelar acuosa. Como se desprende de la Figura 9b, la longitud de onda del máximo de emisión se
mantuvo prácticamente inalterada en presencia de agregados(0,032mg/ml). Esto indica que, independientemente
del tamaño, la forma y la estructura del huésped, las moléculas invitadas solubilizadas están expuestas al mismo
microambiente polar (a 0,1).

Figura 9. (A) Espectros de emisión de absorción y fleuorescencia(aexc a 550 nm) de rojo nilo (0,008 mg/ml) en soluciones
micelares de 50 mM SDS (6,0x6,2 o CMC), 5 mM de CTAB (5,0 •5,4o CMC) y 1 mM Triton X-100 (3,7x4,2o CMC). Los espectros
con agregados presentes son shown en la Figura 7. (B) Parcela de la máxima de emisión (vaencmá1) endifferent dioxano-
mezclas de agua contra la polarización de laorientación
f. Los puntos de datos marcados con círculos completos corresponden a los espectros de la solución micelar o a las muestras
conpuertas de agresión presentes

Los resultados anteriores son consistentes con nuestro estudio anterior donde se exploraron agregados
supramoleculares de copolímeros basados en azúcar-poliglicol (PEG) para sus propiedadesde encapsulación de
fármacos ensolución acuosa buffered. 27Por medio de UV/vis yflespectroscopia de uorescencia, podríamos
mostrar que la solubilización de rojo nilo tomó plas preferentemente dentro de la corona de PEG hidrófila. Se
encontróun resultado similar para las arquitecturas multiconchas de núcleo dendríticosconstruidoa a partir
denúcleos polares de poliglicerolamina hiperbrante y una estructura de doble caparazón de cadenas de alquilo
hidrófobo lineal ypoli monometillito de lilífico hidrófilo( etilenglicol) (mPEG).13 Al igual que las vesículas
multicapa o los liposomas, los compuestos CMS tienen una estructura similar a la cebolla con dominios hidrófilos e
hidrófobos claramente separados. Aunque las nanopartículas CMS proporcionan un registro hidrófobo interno a
través delas cadenas alifáticas vinculadas, el rojo del nilo solubilizado reside preferentemente dentro de la cáscara
polar externa. 13Recientemente, el tiempo resueltofl Los estudios de uorescencia sobre arquitecturas basadas en
poligylcerol han demostrado una distribución de tinte rojo del nilo dentro del nanotranspconchas de orter.54Aparte
de la región interfacial y la cáscara mPEG hidratada externa, se demostró que las moléculas de rojo del nilo penetran
en la región apolar, es decir, muy probablemente en la capa de cadenas mPEG desprovistas de agua, así como la
capa de chaháptica alifática a pesar de esto, se desprende de los resultados anteriores que el rojo del nilo podría
ser de uso limitado para el sondeo de ambientes lipofílicos (micelares) y (micro)dominios. En otras palabras, el rojo
nilo no se comporta como una sonda hidrofóbica modelo.
 Las interacciones hidrógeno-enlacepueden desempeñar un papel importante en la unión micelar del tinte rojo
del nilo. La capa de empalizada de las micelas Triton X-100 se compone principalmente de las unidades de oxietileno
de la cabeza surfactante y un gran número de moléculas de agua.50,51Las moléculas de agua arem hidrógeno unido
entre sí o a los grupos de cabeza de surfactante. En el presente estudio, se encontró que las moléculas rojas del nilo
residen dentro de la capa de palisade. Suponemos que las moléculas rojas del nilo solubilizadas pueden participar
en la formación de enlaces de hidrógeno. En este contexto, vale la pena mencionar un estudio anterior de Cser et
al.55 que han demostrado que el tinte rojo del nilo forma enlaces H con moléculas solventes. Por ejemplo, en el
diclorometano en presencia de pequeñas cantidades de alcohol fluorinated, los espectros de absorción de rojo nilo
se desplazaron banocromocómicamente debido a las interacciones de unión al hidrógeno. La unión de hidrógeno
de rojo del nilo con alcohol puede ocurrir tanto en el suelo como en los estados excitados. 55 Se encontró que la
vida útil de la fluorescencia disminuyó con el aumento del potencia del disolvente. Actualmente se está
investigando el papel de las interacciones electrostáticas y/o de unión de hidrógeno para los sistemas micelares no
iónicos. Para investigar el estado de unión en las micelas, la espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo
es el método de elección.

■ Conclusión
El comportamiento de solubilización del tinte rojo del nilo en soluciones acuosas de surfactante y micelar fue
estudiado por espectroscopia UV/vis y flusorescencia, dispersión dinámica de la luz y microscopía de fuerza
atómica. De los estudios de solubilización described aquí, se puede inferir que la sonda roja del nilo no penetra en
la parte hidrofóbica de las micelas. En su lugar, la solubilización del rojo del nilo ocurre preferentemente en la
superficie micelar o dentro de las regiones exteriores polares. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el nilo
red debe elegirse cuidadosamente cuando se sondean entornos hidrofóbicos (micelares) y (micro)dominios. El
análisis espectral nos permite determinar los sitios de unión micelar y estimar cuantitativamente la polaridad local
alrededor de la sonda. Debido a su rapidez y facilidad, recomendamos, como primer paso, un estudio
espectroscópico de la (micro)polaridad al caracterizar y evaluar un potencial sistema de teñido/portador de drogas.
En la solución acuosa submicellara, el tinte rojo del nilo exhibe una absorción considerable. La adición sucesiva
del tinte a las soluciones tensioactivas provoca un cambio azul, lo que indica la formación de agregados H. En la
solución micelar de Triton X-100, el tinte rojo del nilo está completamente solubilizado en la pseudofase micelar. A
baja concentración de huéspedes, las moléculasde tinteson emisivas y existen principalmente como monómeros.
Un aumento en la concentración de tinte favorece la formación de dimers y agregados de tipo H a través de
interacciones de apilamiento de . Debido a su comportamiento no emisivo, el autoensamblaje espontáneo puede
limitar el uso de rojo nilo en estudios de solubilización. Tras la solubilización del tinte, las micelas Triton X-100
tienden a acumularse a medida que la corona de polioxietileno hidratada se vuelve más hidrófoba. Tanto la
respuesta espectral como el tamaño agregado dependen en gran medida de la cantidad de tinte. Nile red exhibe
interesantes propiedades interfaciales. Los fenómenos observados merecen ciertamente más atención.

■ CONTENIDO ASOCIADO
*S Información de apoyo
Representación esquemática de micelas en solución acuosa. Datos de distribución de tamaño yprofesionales.
Espectrosde emisión de fluorescence de rojo del nilo enmezclas de agua different dioxano. Curva de calibración
de tinte rojo del nilo en unamezcla de agua de dioxano 70%. Determinación de las capacidades de solubilización.
Tabla de constantes físicas seleccionadas de disolventes comunes. Longitud de onda larga visibleabsorción máxima
valores y las energías de transición correspondientes para el tinte rojo del nilo en disolventes different. Este
material está disponible de forma gratuita a través de Internet en http://pubs.acs.org.