Efecto de la ciclodextrina cargada de colesterol en la

criopreservación de semen de perros pastores Aksaray Malakli

de diferentes edades

El objetivo del estudio fue determinar el efecto de la ciclodextrina cargada

de colesterol (CLC) sobre los parámetros de calidad del semen de perros
pastor Aksaray Malakli de diferentes grupos de edad. Cuarenta y ocho
perros machos se dividieron en 3 grupos según sus edades (edad joven
(Y): ≤3 años, n: 20; edad media (M): 4–6 años, n: 20; edad avanzada (O):
≥7 años; n: 8). La porción rica en esperma del eyaculado de cada perro se
dividió en cuatro alícuotas y se extendió con tris como control (C) o tris
cargado con 0,5, 1,0 y 1,5 mg/120 × 10 6CLC como dosis baja (L),
intermedia (I) y alta (H), respectivamente. Después del equilibrio durante
al menos media hora, las pajuelas se congelaron en vapor de nitrógeno y
luego se almacenaron en nitrógeno líquido durante al menos 48
h. Posteriormente, las pajuelas congeladas fueron descongeladas en baño
maría para su evaluación espermatológica. Se observaron diferencias
significativas entre los distintos grupos de edad en cuanto a los
parámetros espermatológico (p < 0,05). La evidencia sugiere que el
aumento de la edad se asocia con parámetros espermatológico in vitro
deficientes y CLC pudo proteger la integridad del acrosoma del daño
criogénico durante el proceso de congelación y descongelación. Se
obtuvieron mejores características de congelabilidad del semen a edades
jóvenes, considerando los parámetros generales.

 Introducción
La congelación de esperma es crucial para la preservación del material
genético de toros con un valor reproductivo superior y especies en peligro
de extinción ( Schafer-Somi et al., 2006 ). En los perros, el uso de semen
congelado reduce el tiempo, el peligro y el costo del transporte de
animales y permite el almacenamiento de los espermatozoides de perros
genéticamente superiores cuya reproducción natural es imposible
( Michael et al., 2007 ). Sin embargo, el éxito de
la criopreservación depende de la calidad del semen ., que puede verse
afectado por muchos factores, como la edad y condición física del animal y
la criorresistencia de los espermatozoides. En tales situaciones, la edad es
un factor muy importante para determinar la calidad del semen. Aunque
hay algunos informes sobre la relación entre el envejecimiento y la
fertilidad masculina en humanos, hay muy pocos informes disponibles
sobre la fertilidad canina. En un estudio en humanos, se encontró que la
capacidad de fertilización del semen, la tasa de espermatozoides vivos, el
nivel de la hormona testosterona , el número de sertoli y células
germinales y el volumen del semen disminuyen con la edad. (Eskenazi et
al., 2003;Gunes et al., 2016). Después de los 40 a 45 años, la tasa de
espermatozoides anormales aumenta y el volumen de semen disminuye
gradualmente en los hombres. Además, algunos estudios sobre
diferentesLas razas de perros demostraron que la edad tiene una
correlación negativa significativa con la proporción de espermatozoides
normales ( Rijsselaere et al., 2007 ; Stone et al., 2013 ; Rota et al.,
2016 ). Sin embargo, el efecto del envejecimiento en la calidad del semen
de los perros pastores Malakli necesita más investigación para una mejor
comprensión de estos factores.
Carreira et al. (2017 ) informaron que un espermatozoide tiene un núcleo
muy peculiar en comparación con el núcleo de la célula somática . La
espermatogénesis es un proceso muy complejo, especialmente cuando se
consideran la espermiogénesis y el transporte de espermatozoides
durante el paso por el epidídimo. Zubkova et al. (2005 ) informaron que el
nivel de puentes de disulfuro y la perturbación de la protaminación
disminuyeron en animales mayores en comparación con animales
adultos. Así, con el envejecimiento, la motilidad, el ADN y la integridad
morfológica de los animales pueden verse afectados. También se sabe que
la congelación afecta las alteraciones en la relación fosfolípidos-colesterol,
que es un factor importante en la estabilización de las membranas
plasmáticas.a bajas temperaturas, lo que conduce a una reducción de la
fertilidad de los espermatozoides ( Khan et al., 2017 ).
El colesterol juega un papel importante en la protección de la función, la
estructura y la fluidez de las membranas celulares a la temperatura
corporal fisiológica. Tiene un efecto complejo sobre las propiedades de la
membrana plasmática; disminuye la permeabilidad de la membrana y
reduce los cambios de fase, proporciona un microambiente físico y/o
químico adecuado para las proteínas de membrana , regula las
características morfológicas y actúa como un antioxidante de membrana
( Aksoy et al., 2010 ; Moce et al., 2010a ). En cuanto a la ciclodextrina , es
un oligosacárido cíclico.producido por la degradación del almidón. La
metil-β-ciclodextrina, una de las ciclodextrinas más utilizadas, puede
solubilizar moléculas hidrófobas, como el colesterol. Algunos estudios han
informado que agregar CLC a diluyentes de semen  de toros, carneros
y sementales puede duplicar o incluso triplicar el contenido de colesterol
en el esperma (Peters et al., 2000;Moce et al., 2010a;Murphy et al., 2014),
así como induciendo un aumento en la relación colesterol-
fosfolípidos. Como resultado de este aumento, los espermatozoides están
protegidos contra daños debidos a los cambios de temperatura durante la
congelación. Se informa que la adición de CLC en diluyentes de semen
generalmente aumenta la motilidad total, la actividad mitocondrial, la
integridad de la membrana y la viabilidad de los espermatozoides.Peters
et al., 2000 ; Moce et al., 2010b ). Además, varios informes afirman que el
tratamiento de los espermatozoides con CLC disminuye el daño
del acrosoma , la proporción anormal de espermatozoides ( Mansour,
2009 ) y la fragmentación del ADN ( Katanbafzadeh et al., 2014 ). Durante
las últimas décadas, los investigadores han estudiado los efectos de la CLC
en la prevención de lesiones en los espermatozoides debido a la
congelación en diferentes especies animales ( Naseer et al., 2015 ). La raza
de perro Aksaray Malakli es una raza local importante en Turquía y la
conservación de su material genético es muy importante, ya que podría
ser necesaria para recuperar la diversidad genética perdida y decodificar
información genética importante (Inanc et al., 2015 ). Hasta el momento,
no ha habido estudios sobre la criopreservación del semen de Aksaray
Malakli. Además, no existe información disponible sobre la relación entre
la edad y la calidad del semen congelado de esta raza y existen pocos
reportes sobre la criopreservación de semen canino con aditivos CLC; por
lo tanto, se necesita más investigación para optimizar las condiciones y la
cantidad de adición de CLC.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto de CLC en
los parámetros de calidad del semen después de la congelación y
descongelación de semen de perro pastor Aksaray Malakli obtenido de
perros de diferentes edades.
2 . Materiales y métodos
2.1 . Preparación de ciclodextrina
Se cargó metil-β-ciclodextrina con colesterol según el procedimiento adoptado por Purdy y
Graham (2004) . Inicialmente, se disolvió 1 g de metil-β-ciclodextrina en 2 mL de
metanol. En un tubo de vidrio separado, se disolvieron 200 mg de colesterol en 1 mL de
cloroformo. Posteriormente, se mezclaron 450 μL de la solución de colesterol con la
solución de ciclodextrina. El solvente se evaporó utilizando vapor de nitrógeno para
obtener un polvo blanco de CLC; A continuación, se preparó una solución de CLC
añadiendo 50 mg del polvo de CLC a 1 ml de Tris madre (50 mg/ml) a 37 °C y agitando la
solución con un mezclador vórtex.
2.2 . animales
Cuarenta y ocho perros pastores Aksaray Malakli machos de diferentes grupos de edad
(edad joven (Y): ≤3 años; n: 20, mediana edad (M): 4–6 años; n: 20 y edad avanzada (O): ≥
7 años; n: 8) se utilizaron en este estudio. Los eyaculados se recogieron mediante
manipulación digital como se describió previamente por Akcay y Tekin (2002) . Las tres
fracciones se recolectaron por separado en diferentes tubos de recolección que fueron
previamente esterilizados y precalentados. Solo se procesó la segunda fracción rica en
espermatozoides. Inicialmente, los eyaculados se examinaron en términos de parámetros
espermatológico frescos. La motilidad del semen fresco (%) se evaluó mediante un
microscopio de contraste de fase con platina templada a 37 °C; La concentración de
espermatozoides (× 10 6 ) se determinó por el método Hemositométrico ( Bearden et al.,
2004). Los espermatozoides anormales (%) se examinaron utilizando una solución de
Hancock ( Schafer y Holzmann, 2000 ), mientras que los espermatozoides muertos (%) se
determinaron mediante el método de tinción con eosina ( Akalin et al., 2015 ) y el pH del
esperma se examinó mediante un tira de pH Los eyaculados que contenían más de 250 ×
10 6 espermatozoides/mL con > 70 % de motilidad hacia adelante se usaron para estudios
adicionales. Después de la evaluación inicial, los eyaculados se mantuvieron en un baño de
agua a 35 °C hasta su posterior procesamiento. Todos los experimentos se realizaron de
manera humana y este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Facultad
de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ankara, Turquía.
2.3 . Procesamiento de semen
Los eyaculados se dividieron en cuatro grupos para cada animal; un grupo sin el aditivo en
un diluyente a base de tris (30,0 g de tris, 17,0 g de ácido cítrico , 12,5 g de fructosa, 5 %
v/v de glicerol, 20 % v/v de yema de huevo con 1000 ml de agua destilada a pH 6,8; grupo
de control ) y tres grupos de tratamiento, primero se diluyeron con soluciones de CLC de
0,5, 1,0 o 1,5 mg/120 × 10 6 en dosis baja (L), intermedia (I) y alta (H),
respectivamente. Luego de una incubación de 15 min a 22 °C, se extendieron con un
diluyente a base de tris hasta una concentración final de 50 × 10 6espermatozoides/mL. La
concentración se calculó utilizando un hemocitómetro. Las muestras diluidas se llenaron en
minipajuelas de 0,25 ml y se equilibraron durante 1,5 horas a 4 °C. Posteriormente, las
muestras se congelaron a -100 °C durante 15 min con vapor de nitrógeno y se almacenaron
en nitrógeno líquido. Después de al menos 48 h, se descongelaron en un baño de agua (37
°C/30 s) para su posterior examen espermatológico.
2.4 . Evaluación de semen post-descongelado
2.4.1 . Análisis de motilidad CASA
Se utilizó un sistema de análisis de semen asistido por computadora (CASA; SCA,
Microptic ® , España) para examinar los parámetros cinéticos y la motilidad de los
espermatozoides. La motilidad de los espermatozoides se clasificó como rápida (>80 μm/s),
media (>50 μm/s), lenta (>20 μm/s) o estática. El semen descongelado (6 μL) se colocó en
un portaobjetos y se montó con un cubreobjetos para el análisis de motilidad a 37 °C con un
objetivo de 10 ×. Motilidad total de espermatozoides (%), motilidad progresiva (%), Línea
recta de velocidad (VSL, μm s –1 ), Curva lineal de velocidad (VCL, μm s –1 ), Oscilación
(WOB, %), Linealidad (LIN, VSL/ VCL × 100), trayectoria promedio de velocidad (VAP,
μm s –1), se registraron la rectitud (STR, VSL/VAP × 100), la amplitud del desplazamiento
lateral de la cabeza (ALH, μm), la frecuencia cruzada del latido (BCF, Hz) y la
hiperactividad (%). Para cada muestra se analizaron un mínimo de 200 y un máximo de 300
espermatozoides en siete campos diferentes.
3 . Resultados
Después de descongelar las pajuelas, tanto la relación de edad como
la CLC se evaluaron juntas para cada parámetro. Como se muestra en la
Tabla 1 , la proporción más baja de espermatozoides anormales totales se
identificó en el grupo de animales jóvenes (p < 0,05). No hubo diferencias
significativas en otros parámetros espermatológico fresco (p >
0,05). Como se muestra en la Tabla 2 , la motilidad total fue mayor en el
grupo de edad joven (p < 0,05). La motilidad total más alta de 62,7% ±
15,6% se obtuvo en el  grupo Y L, mientras que la motilidad total más
baja (33,7% ± 17,4%) fue en el grupo O grupo C. No hubo diferencias
significativas en la motilidad progresiva y total entre los diferentes grupos
de edad, cuando cada grupo de edad se evaluó por separado (p >
0,05). Como se muestra en la Tabla 2 , Tabla 3 , hubo diferencias
significativas entre los grupos de tratamiento en términos de
los parámetros cinéticos de CASA (p < 0,05). VCL y VSL fueron los
parámetros más afectados por la edad. En general, los resultados del
grupo de edad joven fueron mejores que los de los grupos de edad media y
avanzada. Un análisis general de los parámetros cinéticos indicó una
reducción cuando los perros tenían más de 4 años. No hubo una relación
significativa entre los grupos control y CLC con respecto a los parámetros
cinéticos cuando los grupos Y, M y O se evaluaron por separado. Además,
desdeTabla 2 , Tabla 3 , se pudieron detectar interacciones entre la edad y
la motilidad progresiva, motilidad total, VCL, VSL, VAP, LIN, WOB, ALH
e hiperactividad (p < 0,05).
Como se muestra en la Tabla 5 , los grupos Y y M exhibieron un
mayor porcentaje de integridad morfológica total que el grupo
O. La mayor proporción de espermatozoides anormales totales
de 50,7% ± 0,9% se observó en el  grupo O H, mientras que la
proporción más baja de 25,5% Se obtuvo ± 14,6% en el  grupo
M L (p < 0,05). Además, CLC no ejerció un efecto protector
sobre la integridad morfológica total. De la Tabla 5 se puede
inferir que la edad fisiológica influyó en la cabeza, cola y
anormalidad total del espermatozoide (p < 0,05). Como se
muestra en la Tabla 6, hubo diferencias significativas entre los
grupos de tratamiento, con respecto a la longitud de la cola de
ADN. Se observó que la longitud de la cola aumentaba con la
edad. De acuerdo con este parámetro, la integridad de ADN
más baja se determinó en el grupo O, mientras que los grupos Y
y M exhibieron la integridad de ADN más alta (p <
0.05). Además, de la Tabla 6 se puede deducir que existe una
relación entre la edad y la longitud de la cola y el momento de la
cola (p < 0,05). 4 . Discusión
Hoy en día, la crianza de pedigrí está recibiendo una mayor atención y existe una necesidad
creciente de técnicas de biotecnología reproductiva para uso de los clínicos de animales
pequeños ( Pena et al., 2006 ). En el presente estudio, la tasa total más baja de
espermatozoides anormales (13,2 % ± 9,5 %) se observó en animales jóvenes (p <
0,05). No hubo diferencias significativas en otros parámetros espermatológico fresco
(motilidad, tasa de espermatozoides muertos, pH o concentración; p > 0,05). En la
evaluación espermatológica en fresco, la motilidad, la concentración, la tasa de
espermatozoides muertos y el pH se detectaron dentro de los límites normales. Estos
resultados están de acuerdo con el informe de Gunay et al. (2003)en semen de perro pastor
alemán. Además, la tasa total más baja de espermatozoides anormales también se detectó
en animales jóvenes. Con el aumento de la edad de los animales, puede haber un aumento
en la tasa anormal de espermatozoides, que puede ser causado por causas primarias
(interrupciones en la producción de espermatozoides en tubulus seminiferus contortus) o
secundarias (transporte de espermatozoides al epidídimo , almacenamiento en el epidídimo,
eyaculación e infecciones genitales) anomalías en el tracto reproductivo. Sin embargo, se
encontró que estos parámetros estaban dentro de los rangos normales en comparación con
estudios previos ( Baran et al., 2000 ).
En el presente estudio, el porcentaje más bajo de motilidad total posterior a la
descongelación (33,7% ± 17,4%) se observó en el  grupo O C en comparación con los
grupos de tratamiento de animales jóvenes (p < 0,05). De acuerdo con el presente
estudio, Gungor y Bucak (2016) utilizaron animales de 1 a 3 años para optimizar
la criopreservación de semen de Kangal (raza pastor turco). Akcay y Tekin (2002) plantean
el efecto de diferentes diluyentes en la criopreservación de semen de Kangal (alrededor de
4 años). En ese estudio, se comparó el efecto de los extensores de tris y lactosa sobre
la motilidad de los espermatozoides después de la descongelación; Se obtuvieron
motilidades del 42 % al 61 % y del 27 % al 38 %, respectivamente, con los extensores de
tris y lactosa.
De manera similar a nuestros hallazgos, algunos investigadores informaron que la calidad
del semen disminuye a medida que el animal envejece ( Eskenazi et al., 2003 ; Rijsselaere
et al., 2007 ). De hecho, se ha revelado que, debido al envejecimiento, es bastante probable
un tamaño de camada más pequeño y una disminución de la fertilidad después de los 7 años
de edad en los perros ( Johnston et al., 2001 ). Por el contrario, existen varios estudios en
los que no se ha podido encontrar una relación significativa entre la edad y la motilidad
( Berling and Wölner-Hanssen, 1997 ; Van Der Westerlaken et al., 1998).). Aunque no
hubo diferencias significativas entre los grupos de edad en cuanto a la motilidad, se
determinó que los espermatozoides recolectados de perros más jóvenes eran más resistentes
al daño inducido por el proceso de criopreservación que los espermatozoides obtenidos de
perros mayores. En su estudio sobre la criopreservación de semen canino , Khan et
al. (2017) observaron un efecto protector de CLC sobre la motilidad espermática, mientras
que Belala et al. (2016) informó que la adición de CLC (un nivel de 5 mg/120 × 10 6)
condujo a una disminución de la motilidad progresiva pero aumentó la motilidad total. En
el presente estudio, no observamos ningún efecto positivo de CLC sobre la
motilidad. Nuestros resultados fueron comparables a otros estudios realizados con semen de
diferentes razas animales ( Purdy y Graham, 2004 ; Moraes et al., 2010 ; Oliveira et al.,
2014 ; Inanc et al., 2018 ).
En cuanto a los parámetros cinéticos , hubo diferencias significativas entre los diferentes
grupos de edad. Pudimos observar que VCL y VSL se vieron particularmente afectados por
la edad. Estos parámetros disminuyeron cuando los perros tenían más de 4 años. Algunos
estudios informaron que VSL y VCL están directamente relacionados con la fertilidad en
humanos ( Krause, 1995 ; Garrett et al., 2003 ). La importancia de VSL para la evaluación
de la fertilidad también se ha observado en toros ( Gillan et al., 2008 ). VSL, VAP y VCL
son medidas de la velocidad de los espermatozoides en rutas específicas; estos valores
indican que los espermatozoides con alta movilidad nadan más rápido que aquellos con
menor movilidad ( King et al., 2000). Por otro lado, no hubo un efecto significativo de CLC
en los grupos de control con respecto a los parámetros cinéticos, cuando los grupos de edad
se evaluaron por separado.
Los resultados de viabilidad fueron significativamente diferentes entre los diferentes grupos
de edad. De manera similar a los resultados de motilidad frescos y posdescongelados, la
viabilidad disminuyó cuando aumentó la edad del perro (p < 0,05). Durante la evaluación
de los parámetros de calidad posteriores a la descongelación, se encontró que el grupo de
edad joven exhibió la mejor motilidad y viabilidad. Por lo tanto, se concluyó que la
capacidad de congelación del semen obtenido de animales más jóvenes era mejor que la del
semen obtenido de perros pastores Aksaray Malakli mayores. A diferencia de nuestro
estudio, Khan et al. (2017) encontraron un efecto positivo de CLC en la viabilidad del
esperma de perro posdescongelado. Se ha demostrado que CLC mejora la viabilidad de los
espermatozoides de toro ( Purdy y Graham, 2004 ) y carnero ( Moce et al., 2010b).). Los
tratamientos CLC aumentan el contenido de colesterol y, por lo tanto, mejoran la
resistencia de los espermatozoides al choque por frío. Las integridades del acrosoma de los
grupos CLC fueron superiores a las de los grupos C cuando los grupos de edad se evaluaron
por separado. No hubo un efecto significativo de la edad sobre este parámetro; sin embargo,
de manera similar a nuestro estudio, Khan et al. (2017) encontraron efectos beneficiosos de
CLC en la integridad del acrosoma con respecto a la edad. Esta mejora puede estar asociada
con el efecto del colesterol sobre la fluidez de la membrana . Los resultados de la motilidad
y la activación mitocondrial fueron paralelos a la neutralización de los radicales deficientes
en oxígeno y la inhibición del daño celular ( De Lamirande y Gagnon et al.,
1992 ; Cummins et al., 1994).). Se ha informado una interacción positiva entre la activación
mitocondrial y la motilidad ( Kasai et al., 2002 ; Martinez-Pastor et al., 2004 ). Similar a
estos informes, en el presente estudio, la motilidad fue mejor en los grupos jóvenes que en
los grupos de mediana edad. Además, la activación mitocondrial en animales jóvenes fue
mayor que en otros grupos excepto en los grupos M  L y O  I. A pesar de las
diferencias metodológicas entre estos parámetros, en el presente estudio se obtuvieron
resultados paralelos.
En muchos estudios sobre especies caninas, se demostró que la mala morfología del semen
es un indicador importante de infertilidad ( Oettle, 1993 ). En el presente estudio, las tasas
de espermatozoides anormales totales fueron menores en los grupos Y y M que en el grupo
O, tanto en las muestras de semen fresco como posdescongelado (p <
0,05). Asimismo, Auger et al. (1995) afirmaron que el porcentaje de espermatozoides
normales disminuía un 0,9% con cada año de envejecimiento. Anteriormente, se había
evaluado que, si bien la edad no afectaba la motilidad, la tasa normal de espermatozoides
cambiaba con el envejecimiento, observándose una tasa más baja en perros mayores de 9
años ( Hendrikse y Antonisse, 1984 ). Además, Schwartz et al. (1983)notaron que las colas
enrolladas y las cabezas microcefálicas se vieron afectadas con la edad. La disminución de
la tasa normal de espermatozoides con el envejecimiento podría deberse a
una espermatogénesis alterada o incompleta en los túbulos seminíferos contortus ( Losweth
et al., 1990 ), degeneración testicular o falta de espermátides maduras ( James y Heywood,
1979 ). Según nuestros resultados, CLC no tuvo un efecto protector sobre la integridad
morfológica total. Similar a estos resultados, Khan et al. (2017) no pudo encontrar ninguna
relación significativa entre CLC y la tasa anormal de espermatozoides. Las diferencias en
espermatozoides anormales determinadas en varios estudios ( Moce et al., 2010a , 2010b)
puede deberse a diferencias genotípicas y de raza , así como a diferencias en el contenido
de los diluyentes del semen y las técnicas utilizadas para la evaluación después de la
congelación y descongelación.
Se sabe que la integridad del ADN espermático es necesaria para el correcto desarrollo del
embrión y el crecimiento fetal . El método COMET es un ensayo ampliamente utilizado
para analizar la rotura del ADN en células individuales ( Ostling y Johanson, 1984 ). Es un
método ideal para evaluar células, manteniendo la integridad de su material genético en
estudios biológicos ( Novotna et al., 2007 ). En el presente estudio, de acuerdo con la
longitud de la cola, la mayor integridad de ADN se obtuvo en los grupos Y y M, mientras
que la menor integridad de ADN se encontró en el grupo O.
De acuerdo con nuestro estudio, los estudios de semen humano ( Nie et al.,
2012 ; Moskovtsev et al., 2007 ) y bovino ( Carreira et al., 2017 ) revelaron que la
integridad del ADN se ve afectada negativamente por el aumento de la edad. Por lo tanto,
los resultados relacionados con la edad pueden afectar tanto la fertilidad como los
parámetros espermatológico durante el proceso de criopreservación. Aunque Peters et
al. (2000 ) realizaron un examen histopatológico en los testículos de 74 perros, no
detectaron ninguna disminución en la espermatogénesis. Sin embargo, la aparición de
tumores testiculares aumentó con la edad. Por otro lado, Khan et al. (2017) estudiaron los
efectos de CLC en la integridad del ADN utilizando una naranja de acridinamétodo de
tinción; las manchas se observaron usando un microscopio de fluorescencia y no hubo
diferencias significativas entre los grupos control y CLC. En contraste con el estudio
actual, Katanbafzadeh et al. (2014) sugirieron que CLC tiene un efecto positivo en la
integridad del ADN. La diferencia entre estos resultados puede deberse a la selección de
diferentes métodos para evaluar el daño del ADN.
5 . Conclusiones
En conclusión, la evidencia sugiere que el aumento de la edad en los perros se asocia con
una disminución de los parámetros espermatológico in vitro , como la motilidad, la
viabilidad, la activación mitocondrial, la morfología normal y la integridad del ADN. La
adición de CLC tiene un efecto protector sobre la integridad del acrosoma de los
espermatozoides y los protege del daño criogénico durante la congelación y
descongelación. Se observaron mejores características de congelabilidad cuando los perros
pastor Aksaray Malakli eran jóvenes.