Une en Iso 21149 2010

norma UNE-EN
N ISO 21149
españolla
Febrero 2010
TÍTULO Cosm
méticos
Microobiología
Detección y recuento de bacterias aerobias meesófilas
(ISO 21149:2006)
2
Cosmeticss. Microbiology. Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria (ISO 21149:2006).
Cosmétiquues. Microbiologie. Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles

m (ISO 21149:2006)
CORRESPONDENCIA Esta norrma es la versión oficial, en español, de la Norma Europpea EN ISO 21149:2009,
que a suu vez adopta la Norma Internacional ISO 21149:2006.
OBSERVACIONES
ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

N 84 Aceites esenciales y
producttos cosméticos cuya Secretaría desempeña STANPA.
Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

ERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 5383:2010
30 Páginas
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Este documento ha sido adquirido por LABORATORIOS RECAMIER LTDA el 30 de Noviembre de 2013.
Para poder utilizarlo en un sistema de red interno, deberá disponer de la correspondiente licencia de AENOR
S
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN ISO 21149
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Junio 2009
ICS 07.100.99; 71.100.70
Versión en español
Cosméticos
Microbiología
Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas
(ISO 21149:2006)
Cosmetics. Microbiology. Enumeration Cosmétiques. Microbiologie. Kosmetik. Mikrobiologie. Zählung und

and detection of aerobic mesophilic Dénombrement et détection des bactéries Nachweis von aeroben mesophilen
bacteria. (ISO 21149:2006) aérobies mésophiles. (ISO 21149:2006) Bakterien. (ISO 21149:2006)
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-23.
Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de
las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas
actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de
Gestión de CEN, o a través de sus miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismo
rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,
Bélgica, Bulgaria, Chipre, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría,
Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles
© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.
ISO 21149:2009 -4-
PRÓLOGO
El texto de la Norma ISO 21149:2006 del Comité Técnico ISO/TC 217 Cosméticos, de la Organización
Internacional de Normalización (ISO), ha sido adoptado como Norma EN ISO 21149:2009 por el Comité
Técnico CEN/SS H99 Productos para el hogar y ocio - Indeterminado, cuya Secretaría desempeña CMC.
Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico
a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2009, y todas las normas nacionales técni-
camente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2009.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos
a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichos
derechos de patente.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia,
Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
DECLARACIÓN
El texto de la Norma ISO 21149:2006 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 21149:2009 sin
ninguna modificación.
-5- ISO 21149:2006
ÍNDICE
Página
PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 7
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................... 8
2 NORMAS PARA CONSULTA ................................................................................................ 8
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES ............................................................................................. 8
4 PRINCIPIO ............................................................................................................................... 9
4.1 Generalidades ............................................................................................................................ 9
4.2 Recuento en placa...................................................................................................................... 9
4.3 Filtración a través de membrana ............................................................................................. 9
4.4 Detección de bacterias por enriquecimiento ........................................................................... 9
5 DILUYENTES, NEUTRALIZANTES Y MEDIOS DE CULTIVO ................................... 10

5.1 Generalidades .......................................................................................................................... 10
5.2 Diluyentes y diluyentes neutralizantes .................................................................................. 10
5.3 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico) ............. 11
5.4 Medio de cultivo ...................................................................................................................... 11
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO ............................................................................ 13
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS .................................................................................... 13
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS

MUESTRAS DE LABORATORIO ....................................................................................... 14
9 PROCEDIMIENTO ................................................................................................................ 14
9.1 Recomendaciones generales ................................................................................................... 14
9.2 Preparación de la suspensión inicial ...................................................................................... 14
9.3 Métodos de recuento ............................................................................................................... 15
9.4 Enriquecimiento ...................................................................................................................... 16
10 RECUENTO DE COLONIAS (MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA

Y DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA) ......................................................... 16
11 DETECCIÓN DEL CRECIMIENTO (MÉTODO DE ENRIQUECIMIENTO) .............. 16
12 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ................................................................................ 16

12.1 Método para el cálculo del recuento de colonias .................................................................. 16
12.2 Interpretación .......................................................................................................................... 17
12.3 Ejemplos ................................................................................................................................... 18
12.4 Detección después del enriquecimiento ................................................................................. 20
13 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

DEL PRODUCTO ................................................................................................................... 20
13.1 Generalidades .......................................................................................................................... 20
13.2 Preparación del inóculo .......................................................................................................... 20
ISO 21149:2006 -6-
13.3 Validación de los métodos de recuento .................................................................................. 20

13.4 Validación del método de detección por enriquecimiento ................................................... 21
13.5 Interpretación de los resultados de la validación. ................................................................ 22
14 INFORME DE ENSAYO ....................................................................................................... 22
ANEXO A (Informativo) OTROS DILUYENTES NEUTRALIZANTES .................................. 23
ANEXO B (Informativo) OTROS DILUYENTES ........................................................................ 25
ANEXO C (Informativo) OTROS MEDIOS DE CULTIVO ........................................................ 26
ANEXO D (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE LOS CONSERVANTES
Y LÍQUIDOS DE LAVADO ................................................................ 29
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 30
-7- ISO 21149:2006
PRÓLOGO
ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionales
normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en
una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado en
dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también
participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC)
en todas las materias de normalización electrotécnica.
Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas
ISO/IEC.
La tarea principal de los comités técnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normas
internacionales adoptados por los comités técnicos se envían a los organismos miembros para votación.
La publicación como norma internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismos
miembros que emiten voto.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar
sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todos
los derechos de patente.
La Norma ISO 21149 fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 217, Cosméticos.
ISO 21149:2006 -8-
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma internacional proporciona unas directrices generales para la enumeración y detección de bacterias aerobias
mesófilas presentes en los productos cosméticos,
− mediante el recuento de colonias en un medio de agar después de la incubación aerobia, o
− mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después del enriquecimiento.
Debido a la gran variedad de productos cosméticos que abarca este campo de aplicación, este método puede no ser
apropiado en todos los aspectos, para algunos productos (por ejemplo ciertos productos inmiscibles en agua). Otros métodos
(por ejemplo los automatizados) pueden sustituir a los ensayos que se describen en esta norma, siempre que se haya
demostrado su equivalencia o el método se haya validado de otra manera.
Si es necesario, los microorganismos enumerados o detectados se pueden identificar mediante ensayos de identificación
adecuados descritos en las normas indicadas en la bibliografía.
Para asegurar la calidad del producto y la seguridad de los consumidores, se recomienda realizar un análisis de riesgos
microbiológicos adecuado para determinar los tipos de productos cosméticos para los que es aplicable esta norma. Los
productos considerados de bajo riesgo microbiológico incluyen los que presentan una baja actividad de agua, los
productos hidro-alcohólicos, los que presentan valores extremos de pH, etc.
2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuación se indican son indispensables para la aplicación de esta norma. Para las referencias con
fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de la norma (incluyendo
cualquier modificación de ésta).
ISO 21148:2005 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes:
3.1 bacteria aerobia mesófila:

Bacteria mesófila de crecimiento aerobio en las condiciones especificadas en esta norma internacional.
NOTA En las condiciones descritas, se puede detectar otro tipo de microorganismos (por ejemplo levaduras, mohos).
3.2 producto:
Porción de un producto cosmético identificado, recibido en el laboratorio para su ensayo.
3.3 muestra:
Porción del producto (de al menos 1 g o 1 ml) que se emplea en el ensayo para preparar la suspensión inicial.
3.4 suspensión inicial:

Suspensión (o disolución) de una muestra en un volumen definido de un líquido apropiado (diluyente, neutralizante, caldo
o una combinación de ellos).
3.5 muestra diluida:

Dilución de la suspensión inicial.
-9- ISO 21149:2006
4 PRINCIPIO
4.1 Generalidades
Este método consiste en la enumeración de colonias en un medio de agar no selectivo o en determinar la presencia o
ausencia de crecimiento bacteriano después de un enriquecimiento.
Se debe neutralizar la posible inhibición del crecimiento microbiano debida a la muestra para permitir la detección de los
microorganismos viables[1]. En todos los casos, y sea cuál sea la metodología utilizada, se debe comprobar y validar la neu-
tralización de las propiedades antimicrobianas del producto [2] [3] [4].
4.2 Recuento en placa

El recuento en placa consta de los siguientes pasos:
− Preparación de placas de siembra por inclusión o placas para la siembra en superficie, utilizando un medio de cultivo
especificado, y la siembra en las placas de una cantidad definida de suspensión inicial o dilución del producto.
− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante 72 h ± 6 h.
− Recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) y cálculo del número de bacterias aerobias mesófilas
por mililitro o por gramo de producto.
4.3 Filtración a través de membrana

La filtración a través de membrana consiste en los siguientes pasos.
− Se transfiere una cantidad adecuada de la muestra, preparada de acuerdo a una validación previa, en el aparato de
filtración humedecido con un pequeño volumen de diluyente estéril apropiado, se filtra inmediatamente y se lava de
acuerdo al procedimiento validado (véase 13.3.4). Se transfiere el filtro de membrana a la superficie del medio de
agar especificado, tal como se indica en la Norma ISO 21148.
− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante 72 h ± 6 h.
− Recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) y cálculo del número de bacterias aerobias mesófilas
por mililitro o por gramo de producto.
4.4 Detección de bacterias por enriquecimiento

La detección de bacterias mediante enriquecimiento consta de los siguientes pasos:
− Incubación a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 20 h de una cantidad definida de suspensión inicial en un medio
líquido no selectivo que contenga agentes dispersantes o y/o neutralizantes adecuados.
− Se transfiere una cantidad definida de la solución anterior a un medio de agar sólido no selectivo.
− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC entre 48 h y 72 h.
− Se comprueba el crecimiento y se expresa el resultado como "presencia/ausencia" de bacterias aerobias mesófilas en la

muestra S del producto.
ISO 21149:2006 - 10 -
5 DILUYENTES, NEUTRALIZANTES Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 Generalidades
En la Norma ISO 21148 se proporcionan las instrucciones generales. Cuando se menciona al agua en una fórmula, se refiere
a agua destilada o agua purificada conforme a la Norma ISO 21148.
Los siguientes diluyentes, neutralizantes y medios de cultivo son adecuados para el recuento y detección de bacterias
aerobias mesófilas. Pueden utilizarse otros diluyentes, neutralizantes y medios de cultivo siempre que se haya demostrado
que son adecuados para este uso.
5.2 Diluyentes y diluyentes neutralizantes
5.2.1 Generalidades
El diluyente se emplea para dispersar la muestra. Puede contener neutralizantes si la muestra a ensayar tiene propiedades
antimicrobianas. Se debe demostrar la eficacia de la neutralización antes de la determinación del recuento (véase el
capítulo 13). El anexo D proporciona información relativa a neutralizantes adecuados.
5.2.2 Diluyentes neutralizantes
5.2.2.1 Medio de caseína digerida – lecitina de soja – polisorbato 20 (caldo SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Composición
− Digerido pancreático de caseína 20,0 g
− Lecitina de soja 5,0 g
− Polisorbato 20 40,0 ml
− Agua 960,0 ml
5.2.2.1.2 Preparación
Se disuelve el polisorbato 20 en 960 ml de agua, mezclándolo mientras se calienta, en un baño de agua a 49 ºC ± 2 ºC. Se
añade el digerido pancreático de caseína y la lecitina de soja. Se calienta durante unos 30 min para obtener la disolución.
Se mezcla y se dispensa el medio en recipientes adecuados Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de
la esterilización, el pH debe ser equivalente a 7,3 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.2.2.2 Otros diluyentes neutralizantes

Se pueden emplear otros diluyentes neutralizantes si son apropiados (véanse el anexo A y el anexo D).
5.2.3 Diluyente
5.2.3.1 Fluido A
− Digerido péptico de tejido animal 1,0 g
− Agua 1 000 ml
- 11 - ISO 21149:2006
Se disuelve 1 g de peptona en agua hasta llegar a 1 l. Se calienta con agitación frecuente. Se dispensa en recipientes
adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización, el pH debe ser equivalente
a 7,1 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.2.3.2 Otros diluyentes

Se pueden emplear otros diluyentes si son apropiados (véase el anexo B).
5.3 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)
5.3.1 Composición
− Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g
− Cloruro sódico 8,5 g
− Agua 1 000 ml
5.3.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, mezclándolos mientras se calienta. Se dispensa en recipientes adecuados. Se
esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando
se mide a temperatura ambiente.
5.4 Medio de cultivo
5.4.1 Generalidades
Los medios de cultivo se pueden preparar siguiendo la descripción que se proporciona a continuación, o a partir de las
instrucciones del fabricante de medios de cultivo deshidratados. Pueden utilizarse medios preparados (listos para usar)
cuando su composición o su rendimiento en crecimiento son comparables a los de las fórmulas que se indican en esta
norma.
5.4.2 Medio de cultivo para el recuento
5.4.2.1 Medio de agar de caseína y soja digeridas (SCDA) o agar de triptona y soja (TSA)
− Digerido papaínico de soja 5,0 g
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
Se disuelven los componentes o el medio deshidratado completo en agua, mezclándolo mientras se calienta. Se dispensa
el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización y enfria-
miento, el pH debe ser equivalente a 7,3 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
ISO 21149:2006 - 12 -
5.4.2.2 Otros medios para el recuento

Se pueden emplear otros medios si son apropiados (véase el anexo C).
5.4.3 Medios de cultivo para la detección
5.4.3.1 Generalidades
Cuando se elija este método, se debe emplear un caldo de enriquecimiento y un medio de agar para la detección de bacterias.
El caldo de enriquecimiento se usa para dispersar la muestra y para incrementar la población microbiana inicial. Puede
contener neutralizantes si la muestra a ensayar tiene propiedades antimicrobianas.
5.4.3.2 Caldo de enriquecimiento: caldo Eugon LT 100
5.4.3.2.1 Generalidades
Este medio contiene ingredientes:
− que neutralizan las substancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina y polisorbato 80;
− agente dispersante: octoxynol 9.
− L-cistina 0,7 g
− Sulfito sódico 0,2 g
− Glucosa 5,5 g
− Lecitina de huevo 1,0 g
− Polisorbato 80 5,0 g
− Octoxynol 9 1,0 g
− Agua 1 000 ml
Se disuelven, uno tras otro y en agua hirviendo el polisorbato 80, el oxtoxynol 9 y la lecitina de huevo hasta su completa
disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calienta. Se dispensa el medio en los reci-
pientes adecuados y se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización, el pH debe ser equi-
valente a 7,0 ± 0,2 medido a temperatura ambiente.
- 13 - ISO 21149:2006
5.4.3.3 Medio de agar para la detección
5.4.3.3.1 Agar Eugon LT 100
5.4.3.3.1.1 Composición
− L-cistina 0,7 g
− Sulfito sódico 0,2 g
− Glucosa 5,5 g
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
5.4.3.3.1.2 Preparación
Se disuelven sucesivamente polisorbato 80, el octoxynol 9 y lecitina de huevo en agua hirviendo hasta su completa
disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calienta. Se mezcla suavemente para evitar la
formación de espuma. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.4.3.3.2 Otros medios de agar para la detección

Se pueden emplear, si son apropiados, otros medios (véase el anexo C).
5.4.4 Medio de agar para el cultivo de las cepas de referencia

Se emplea un medio de agar de caseína y soja digerida (SCDA) o agar de triptona y soja (TSA) (5.4.2.1).
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

El equipo de laboratorio, aparatos y material de vidrio se describe en la Norma ISO 21148.
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS
Para ensayar la eficacia de los neutralizantes, se utilizan dos cepas representativas de microorganismos Gram negativos
y Gram positivos[2][5], respectivamente:
− Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (cepa equivalente: CIP 82.118 o NCIMB 8626 o NBRC 13275 o KCTC 2513
o cualquier cepa equivalente de una colección nacional).
ISO 21149:2006 - 14 -
− Staphylococcus aureus ATCC1) 6538 (cepa equivalente: CIP2) 4.83 o NCIMB3) 9518 o NBRC4) 13276 o KCTC5)
1916 o cualquier cepa equivalente de una colección nacional).
Alternativamente a la cepa Gram negativa, se puede usar: Escherichia coli ATCC 8739 (cepa equivalente: CIP 53.126 o
NCIMB 8545 o NBRC 3972 o KCTC 2571 o cualquier cepa equivalente de una colección nacional).
Se recomienda reconstituir el cultivo conforme a los procedimientos proporcionados por el proveedor de la cepa de
referencia.
Las cepas se pueden almacenar en el laboratorio conforme con la Norma EN 12353.
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS MUESTRAS DE LABORATORIO

Si es necesario, los productos a ensayar se almacenan a temperatura ambiente. Los productos (3.2) y muestras (3.3) no se
deben incubar, refrigerar o congelar antes o después de los análisis.
El muestreo de los productos cosméticos a analizar se debería llevar a cabo tal como se describe en la Norma ISO 21148.
Las muestras se analizan conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148, y de acuerdo con el siguiente procedimiento.
9 PROCEDIMIENTO
9.1 Recomendaciones generales

Para preparar la muestra, la suspensión inicial y las diluciones, se utiliza material y equipo estéril así como técnicas
asépticas. Cuando se prepara la suspensión inicial, el tiempo que pasa entre el final de la preparación y el momento en el
que la alícuota entra en contacto con el medio de cultivo no debe exceder de 45 min, a no ser que se mencione específica-
mente en los protocolos o documentación establecida.
9.2 Preparación de la suspensión inicial
9.2.1 Generalidades
La suspensión inicial se prepara a partir de una muestra (3.3) de al menos 1 g o 1 ml de producto (3.2) a ensayar bien
homogenizado.
Se anota como S el peso o volumen exacto de la muestra.
La suspensión inicial es normalmente 1:10. Se pueden requerir volúmenes mayores de diluyente o de caldo de enriqueci-
miento si se sospechan altos niveles de contaminación y/o si todavía no se han eliminado las propiedades antimicrobianas
en la dilución 1:10.
9.2.2 Productos miscibles en agua

Se transfiere la muestra S del producto a un volumen apropiado (por ejemplo 9 ml) de diluyente neutralizante (5.2.2) o
de diluyente (5.2.3) o de caldo de enriquecimiento (5.4.3.2), en función del método empleado (9.3 ó 9.4).
Se anota el factor de dilución d.
1) American Type Culture Collection.

2) Institut Pasteur Collection.
3) National Collection of Industrial and Marine Bacteria.
4) National Biological Resource Center.
5) Korean Collection for Type Culture.
- 15 - ISO 21149:2006
9.2.3 Productos no miscibles en agua

Se transfiere la muestra (S) del producto a un recipiente apropiado que contenga una cantidad apropiada de agente
solubilizante (por ejemplo polisorbato 80). Se dispersa la muestra en el agente solubilizante y se añade un volumen
apropiado (por ejemplo 9 ml) de diluyente neutralizante (5.2.2) o de diluyente (5.2.3) o de caldo de enriquecimiento
(5.4.3.2), en función del método empleado (9.3 ó 9.4).
Se anota el factor de dilución d.
9.3 Métodos de recuento
9.3.1 Diluciones para métodos de recuento

Normalmente la suspensión inicial es la primera dilución de la que se realiza un recuento. Si es necesario, se puede preparar
una serie de diluciones adicionales (por ejemplo diluciones 1:10) a partir de la suspensión inicial empleando el mismo
diluyente (de acuerdo a los niveles de contaminación que se sospechan en el producto).
Generalmente el recuento se realiza empleando, al menos, dos placas Petri. Es posible emplear sólo una placa Petri en
ensayos de rutina, o si el recuento se realiza en diluciones sucesivas de la misma muestra o conforme a resultados anteriores.
9.3.2 Métodos de recuento en placa
9.3.2.1 Método de siembra por inclusión

En una placa Petri de 85 mm a 100 mm de diámetro, se deposita 1 ml de la suspensión inicial y/o de la muestra diluida
preparada según el método validado (véase el capítulo 13) y se vierten 15 ml o 20 ml de medio de agar fundido (5.4.2)
mantenido en un baño de agua a no más de 48 ºC. Si se usan placas Petri más grandes, se incrementa la cantidad de medio
de agar de una manera acorde.
Se mezcla la suspensión inicial y/o la muestra diluida con el medio, rotando o agitando cuidadosamente las placas lo
suficiente para dispersarla. Se deja solidificar la mezcla en la placa Petri sobre una superficie horizontal a temperatura
ambiente.
9.3.2.2 Método de siembra en superficie

En una placa Petri de 85 mm a 100 mm de diámetro, se añaden 15 ml o 20 ml de medio de agar fundido (5.4.2) mantenido
en un baño de agua a no más de 48 ºC. Si se usan placas Petri más grandes, se debe incrementar el volumen de medio de
agar de una manera acorde. Las placas se dejan enfriar y solidificar, por ejemplo, en una cabina microbiológica o en una
estufa incubadora. Se dispersa sobre la superficie del medio un volumen definido de al menos 0,1 ml de la suspensión
inicial y/o de la muestra diluida preparada conforme al método validado (véase el capitulo 13).
9.3.2.3 Método de filtración a través de membrana

Se emplean membranas con un tamaño nominal de poro no superior a 0,45 μm.
Se transfiere una cantidad apropiada de suspensión inicial o de muestra diluida preparada conforme al método validado
(que preferiblemente represente al menos 1 g o 1 ml de producto) sobre la membrana. Se filtra e inmediatamente se lava
la membrana (siguiendo el procedimiento desarrollado durante la validación, véase el capítulo 13).
Se transfiere la membrana a la superficie del medio de agar (5.4.2).
9.3.2.4 Incubación
A no ser que se especifique lo contrario, las placas Petri sembradas se invierten y se colocan en la estufa incubadora a
32,5 ºC ± 2,5 ºC durante 72 h ± 6 h. Después de la incubación, las placas se deben examinar inmediatamente, si es posible.
De lo contrario, se deben guardar, a no ser que se especifique lo contrario, en la nevera durante un máximo de 24 h
ISO 21149:2006 - 16 -
NOTA En ciertos casos, cuando exista un riesgo potencial de confundir las partículas del producto con colonias, puede ser útil preparar un duplicado de las
placas que contengan las mismas diluciones de muestra y el medio de agar que se almacenan en la nevera, por si fuera necesario compararlas con
las placas incubadas.
9.4 Enriquecimiento
9.4.1 Generalidades
Se prepara la suspensión inicial (véase 9.2) en el caldo de enriquecimiento (5.4.3.2) siguiendo el procedimiento seleccionado
y desarrollado durante la validación (véase el capítulo 13).
9.4.2 Incubación de la muestra
9.4.2.1 Generalidades
Se incuba la suspensión inicial preparada en el caldo (5.4.3.2) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 20 h.
9.4.2.2 Subcultivos
Mediante pipetas estériles, se transfieren entre 0,1ml y 0,5 ml de la suspensión incubada a la superficie de una placa Petri
(de diámetro entre 85 mm y 100 mm) que contenga aproximadamente entre 15 ml y 20 ml del medio de agar adecuado
para la detección (5.4.2.1). Si se emplean placas Petri mayores, se debe incrementar el volumen de agar de una manera
acorde.
9.4.2.3 Incubación de los subcultivos

No se invierten las placas inoculadas (o se espera a la absorción de la suspensión sembrada en el agar antes de invertirlas),
y se incuban a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 48 h a 72 h.
10 RECUENTO DE COLONIAS (MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA Y DE FILTRACIÓN A TRAVÉS

DE MEMBRANA)
Después de la incubación, se efectúa un recuento de las colonias:
− en placas Petri que contengan entre 30 colonias y 300 colonias; si se cuentan menos de 30 colonias, véase el apartado
12.2.3;
− en membranas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias; si se cuentan menos de 15 colonias, véase el apartado
12.2.3.
11 DETECCIÓN DEL CRECIMIENTO (MÉTODO DE ENRIQUECIMIENTO)

Después de la incubación del subcultivo, se comprueba la superficie del agar y se registra la presencia o ausencia de
crecimiento.
12 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
12.1 Método para el cálculo del recuento de colonias

Se calcula el número N de microorganismos presentes en la muestra S, mediante:
− m, la media aritmética de los recuentos obtenidos de los duplicados en la ecuación (1);
− c, el número de colonias obtenidas a partir del recuento de una sola placa en la ecuación (2); o
− xc , la media ponderada de los recuentos obtenidos en dos diluciones sucesivas en la ecuación (3);
- 17 - ISO 21149:2006
conforme a las siguientes ecuaciones:
N = m / (V × d ) (1)
N = c / (V × d ) (2)
N = xc / (V × d ) (3)
donde
m es la media aritmética de los recuentos obtenidos de los duplicados;
V es el volumen de la alícuota sembrada en cada placa, en mililitros;
d es el factor de dilución correspondiente a la dilución realizada para la preparación de la suspensión inicial (9.2) o para
la primera dilución en la que se ha efectuado el recuento;
c es el número de colonias obtenidas a partir del recuento de una sola placa;
xc la media ponderada de los recuentos obtenidos en dos diluciones sucesivas, calculado conforme a:
xc =
c
n1 + 0,1n 2
donde
c es la suma del número de colonias obtenida en el recuento de las placas provenientes de dos diluciones sucesivas;
n1 es el número de placas contadas a partir de la suspensión inicial (o a partir de la primera dilución);
n2 es el número de placas contadas a partir de la dilución 1/10 de la suspensión inicial (o a partir de la segunda
dilución).
Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra es menor a 5, no se modifica
la cifra anterior; si la última cifra es superior a 5, se incrementa en una unidad la cifra anterior. Se procede de este modo
hasta que se obtienen dos cifras significativas. Se anota el número obtenido como N.
12.2 Interpretación
12.2.1 Se debería tener en cuenta la variabilidad inherente al método de recuento en placa. Sólo se deberían considerar
diferentes dos resultados si difieren en más de un 50%, o, si se expresa como logaritmo, la diferencia excede de 0,3.
Para que un recuento sea preciso, sólo deberían considerarse las placas con más de 30 colonias pero con menos de 300
colonias, y membranas con más de 15 colonias pero menos de 150 colonias. Se comprueba que el recuento se obtiene de
diluciones validadas conforme al método elegido (véase el capítulo 13).
12.2.2 Cuando el número de UFC está entre 30 y 300 en placas, o entre 15 y 150 en membranas, y si S es la masa o el
volumen de la muestra (9.2), se expresa el resultado como sigue:
− Si S es al menos 1 g o 1 ml, y V es al menos 1 ml:
el número de bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra es = N/S;
ISO 21149:2006 - 18 -
− Si S es menor que 1 g o 1 ml, y/o V es menor que 1 ml:
el número de bacterias aerobias mesófilas en la muestra (se anota la cantidad de la muestra ensayada teniendo en
cuenta S y V) es = N;
Se expresa el resultado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada (véanse el ejemplo 1,
ejemplo 2, ejemplo 3 y ejemplo 7).
12.2.3 Cuando el número de UFC es menor de 30 en placas o menor de 15 en membranas, se expresa el resultado como
sigue:
− Si S es al menos 1 g o 1 ml, y V es al menos 1 ml:
el número estimado de bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra es = N/S;
− Si S es menor que 1 g o 1ml, o V es menor que 1 ml:
el número estimado de bacterias aerobias mesófilas en la muestra es = N;
donde S es la masa o volumen de la muestra (9.2).
Se expresa el resultado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada (véanse el ejemplo 4,
ejemplo 5 y ejemplo 6).
12.2.4 Cuando no se observan colonias, el resultado se anota como:
− menos de 1/d × V × S bacterias aerobias mesófilas por gramo o mililitro de producto (S es al menos 1 g o 1 ml);
− menos de 1/d × V bacterias aerobias mesófilas en la muestra S (se anota la cantidad de la muestra ensayada teniendo
en cuenta S y V) (S es menor de 1 g o 1 ml).
donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial (9.2) y V es 1 (para el recuento por los métodos de filtración a
través de membrana o de siembra por inclusión) o 0,1 (para el método de siembra en superficie) (véase el ejemplo 8).
12.3 Ejemplos
12.3.1 EJEMPLO 1 Dos placas de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 38 y 42.
Para la ecuación (1):
N = m/(V × d) = 40/(1 × 10-1) = 40/0,1 = 400 ó 4 × 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.2 EJEMPLO 2 Una placa de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1: 60.
N = c/(V × d) = 60/(1 × 10-1) = 60/0,1 = 600 ó 6 × 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.3 EJEMPLO 3 Dos placas de dos diluciones

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-2, 235 y 282; de la dilución 10-3, 31 y 39.
- 19 - ISO 21149:2006
N = xc /(V × d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1 × 2) × 10-2 = 587/0,022 = 26 682.
Redondeando el resultado como se especifica arriba, se obtiene 27 000 ó 2,7 × 104 bacterias aerobias mesófilas por mililitro
o por gramo de muestra.
12.3.4 EJEMPLO 4 Dos filtros de membrana de una dilución

N = m/(V × d) = 20/(1 × 10-1) = 20/0,1 = 200 ó 2 × 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.5 EJEMPLO 5 Un filtro de membrana de una dilución

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 65.
N = c/(V × d) = 65/(1 × 10-1) = 65/0,1 = 650 ó 6,5 × 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.6 EJEMPLO 6 Dos filtros de membrana de dos diluciones

S = 1 g o 1 ml; V = 1; recuento obtenido: de la dilución 10-1, 121 y 105; de la dilución 10-2, 15 y 25.
N = xc /(V × d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1 × 2) × (110-1) = 266/0,22 = 1 209.
Redondeando el resultado como se especifica arriba, se obtiene 1 200 ó 1,2 × 103 bacterias aerobias mesófilas por mililitro
o por gramo de muestra.
12.3.7 EJEMPLO 7 Dos placas de una dilución

N = m/(V × d) = 25/(1 × 10-1) = 25/0,1 = 250.
El número estimado es 250 ó 2,5 × 102 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.8 EJEMPLO 8
N ≤ 1/(V × d),
≤ 1/(1 × 10-1),
≤ 1/0,1,
≤ 10.
ISO 21149:2006 - 20 -
El número estimado es menor de 10 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.3.9 EJEMPLO 9
N ≤ m (V × d),
≤ 1,5/(1 × 10-1),
≤ 1,5/0,1,
≤ 15.
El número estimado es menor de 15 bacterias aerobias mesófilas por mililitro o por gramo de muestra.
12.4 Detección después del enriquecimiento

En el caso de detectar crecimiento (véase el capítulo 11), se expresa el resultado como:
"Presencia de bacterias aerobias mesófilas en la muestra S".
y se procede al recuento de la muestra mediante uno de los métodos propuestos (véase 9.3).
Si no se detecta crecimiento (véase el capítulo 11), se expresa el resultado como:
"Ausencia de bacterias aerobias mesófilas en la muestra S".
13 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DEL PRODUCTO
13.1 Generalidades
Los diferentes ensayos que se describen a continuación demuestran que los microorganismos pueden crecer en las condi-
ciones del análisis.
Las dos cepas (véase el capítulo 7) utilizadas para demostrar la validez de estas propiedades generalmente son sensibles
a los agentes antimicrobianos.
13.2 Preparación del inóculo

Antes del ensayo, se siembra cada cepa en la superficie del agar de caseína y soja digerida (SCDA) u otro medio adecuado
(no selectivo y sin neutralizantes). Se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 18 h a 24 h. Para preparar el cultivo bacteriano, se utiliza
un asa estéril, se raspa la superficie del cultivo y se vuelve a suspender en un diluyente adecuado para suspensiones bacteria-
nas (5.3) para obtener una suspensión estandarizada de unas 1 × 108 UFC/ml (por ejemplo mediante un espectrofotómetro,
Norma ISO 21148, anexo C). Esta suspensión estandarizada y sus diluciones se usan dentro de las siguientes 2 h.
13.3 Validación de los métodos de recuento
13.3.1 Principio
Para cada cepa, se mezcla la muestra neutralizada (suspensión inicial o muestra diluida de acuerdo a la actividad anti-
microbiana o la baja solubilidad del producto) con una dilución del microorganismo. Se transfiere a una placa Petri o se
filtra a través de una membrana. Después de la incubación, se comprueba la naturaleza de las colonias y se compara el
recuento con un control (sin muestra).
- 21 - ISO 21149:2006
Si el recuento es menor del 50% (0,3 log) respecto al control, se modifica el procedimiento (diluyentes, agentes neutra-
lizantes o una combinación de ambos, véase el anexo D). Se debería tener en cuenta la variabilidad inherente del recuento
en placa. Sólo se deberían considerar diferentes dos resultados si difieren en más de un 50%, o, si se expresa como loga-
ritmo, la diferencia excede de 0,3. El fallo en el crecimiento del inóculo invalida el ensayo, a menos que pueda
considerarse como poco probable la contaminación del producto con este microorganismo.
13.3.2 Validación del método de siembra por inclusión

Se mezclan 9 ml de la suspensión inicial y/o de la(s) muestra(s) diluida(s) en el diluyente neutralizante (o en otro, véase
el apartado 5.2) con 1 ml de la suspensión del microorganismo que contenga entre 1 000 UFC/ml y 3 000 UFC/ml. Se
transfiere 1 ml a una placa Petri (preferiblemente por duplicado) y se vierten entre 15 ml y 20 ml del medio de agar
fundido (5.4.2) que se ha mantenido en un baño de agua a no más de 48 ºC. En paralelo, se prepara una placa de control
con el mismo diluyente y la misma suspensión del microorganismo, pero sin muestra.
Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 ºC ± 2,5 ºC, se cuentan las colonias de las placas y se comparan los
recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El diluyente y el método de recuento quedan validados a una dilución
1:10 (cuando se utiliza 1 ml de la suspensión inicial) si el recuento de la validación es de, al menos, el 50% (0,3 log) del
recuento del control.
13.3.3 Validación del método de la siembra en superficie

Se mezclan 9 ml de la suspensión inicial en el diluyente neutralizante (o en otro, véase el apartado 5.1) con 1 ml de la sus-
pensión del microorganismo que contenga entre 10 000 UFC/ml y 30 000 UFC/ml (o menos, si se dispersan 0,5 ml o 1 ml).
Se siembran al menos 0,1 ml en la superficie de una placa de agar solidificado (5.4.2) (preferiblemente por duplicado). En
paralelo, se prepara una placa de control con el mismo diluyente y la misma suspensión del microorganismo, pero sin muestra.
Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 ºC ± 2,5 ºC, se cuentan las colonias de las placas y se comparan los
recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El diluyente y el método de recuento quedan validados a una dilución
1:10 (cuando se emplea 1 ml de la suspensión inicial) si el recuento de la validación es de, al menos, el 50% (0,3 log) del
recuento del control.
13.3.4 Validación del método de filtración a través de membrana

Se mezcla con el volumen de la suspensión inicial o de la muestra diluida empleada en el ensayo (véase 9.3.2.3) una
cantidad adecuada de suspensión estandarizada de microorganismos, que corresponda aproximadamente a 100 UFC.
Se filtra inmediatamente todo el volumen y se lava la membrana usando volúmenes definidos de agua (5.1), diluyente
(5.2.3) o diluyente neutralizante (5.2.2). Se transfiere la membrana a la superficie de un medio de agar adecuado (5.4.2).
En paralelo, se prepara un control en las mismas condiciones, pero sin producto. El control se filtra y se lava en las mismas
condiciones.
Después de la incubación entre 24 h y 72 h a 32,5 ºC ± 2,5 ºC, se cuentan las colonias en las placas y se comparan los
recuentos obtenidos para el ensayo y para el control. El método de filtración a través de membrana y el diluyente quedan
validados si el recuento de la validación es de, al menos, el 50% (0,3 log) del recuento del control.
13.4 Validación del método de detección por enriquecimiento
13.4.1 Procedimiento
Se prepara, en tubos que contengan 9 ml de diluyente adecuado para suspensiones bacterianas (5.3), una suspensión
estandarizada de cada cepa para obtener un recuento final entre 100 UFC/ml y 500 UFC/ml. Para determinar la concentra-
ción final de microorganismos viables en dicha suspensión estandarizada se transfiere 1 ml de la suspensión a una placa
Petri y se vierten entre 15 ml y 20 ml del medio de agar fundido (5.4.2), que se ha mantenido en un baño de agua a no más
de 48 ºC.
Se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC entre 20 h y 24 h.
ISO 21149:2006 - 22 -
Se prepara por duplicado la suspensión inicial de la muestra (3.3) en las condiciones seleccionadas para el ensayo (al
menos 1 g o 1 ml de producto, volumen definido de caldo de enriquecimiento (5.4.3.2)) en tubos o recipientes. En un tubo
(ensayo de validación), se introducen asépticamente 0,1 ml de suspensión estandarizada de microorganismos. Se mezclan y
se incuba cada tubo (ensayo de validación y control) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC entre 20 h y 24 h.
Para cada tubo o recipiente, y con una pipeta estéril, se transfieren entre 0,1 ml y 0,5 ml (en las mismas condiciones del
ensayo) de mezcla incubada sobre la superficie de una placa Petri (diámetro de 85 mm a 100 mm) que contenga
aproximadamente entre 15 ml y 20 ml de medio de agar adecuado.
Se incuban las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC entre 24 h y 72 h.
13.4.2 Interpretación de los resultados

Para cada cepa, se comprueba que la suspensión estandarizada de bacterias contiene entre 100 UFC/ml y 500 UFC/ml.
La neutralización y el método de detección quedan validados si se produce un crecimiento característico, definido como:
− para Staphylococcus aureus: cultivo pigmentado en amarillo;
− para Pseudomonas aeruginosa: crecimiento del cultivo entre amarillento y verdoso en la placa de validación y sin
crecimiento en la placa de control.
Cuando se detecta crecimiento en la placa de control (productos contaminados), la neutralización y el método de detección
quedan validados si se recupera el microorganismo inoculado en la placa de validación.
13.5 Interpretación de los resultados de la validación

La falta de crecimiento en la placa de validación indica que todavía existe actividad antimicrobiana y que es necesaria
una modificación en las condiciones del método. Las modificaciones pueden realizarse mediante un incremento en el
volumen de caldo nutritivo manteniendo la misma cantidad de producto, o con la incorporación de una cantidad suficiente
de agente neutralizante en el caldo nutritivo, o mediante una combinación adecuada de estas modificaciones que permita el
crecimiento de las bacterias.
Si, a pesar de la incorporación de una cantidad adecuada de agente neutralizante y el incremento sustancial en el volumen
de caldo, todavía no es posible recuperar un cultivo viable como se ha definido anteriormente, todo indica que no es
probable que el producto pueda contaminarse con las especies de microorganismos indicadas.
14 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe contener la siguiente información:
a) toda la información necesaria para una completa identificación del producto.
b) el método empleado;
c) los resultados obtenidos;
d) todos los detalles operativos para la preparación de la suspensión inicial;
e) la descripción del método de neutralización junto con la descripción de los neutralizantes y medios empleados;
f) la validación del método, incluso si el ensayo se ha realizado por separado;
g) cualquier punto no especificado en este documento, o considerado como opcional, junto con los detalles de cualquier
incidencia que pudiera haber influido en los resultados.
- 23 - ISO 21149:2006
ANEXO A (Informativo)
OTROS DILUYENTES NEUTRALIZANTES
A.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier agente neutralizante para preparar la suspensión inicial si se ha comprobado y validado. Los
siguientes diluyentes neutralizantes son ejemplo de fórmulas adecuadas. En el anexo D se proporciona información
general sobre neutralizantes.
A.2 Caldo Eugon LT100 líquido

Véase el apartado 5.4.3.2.
A.3 Diluyente de lecitina y polisorbato (LP)
A.3.1 Composición
− Polipeptona 1,0 g
− Agua 980 ml
A.3.2 Preparación
Se mezclan y disuelven los ingredientes mezclándolos mientras se calientan. Se enfría a 25 ºC antes de dispensar la
disolución en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización el pH
debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
A.4 Caldo Letheen modificado[5]
A.4.1 Composición
− Digerido peptídico de carne 20,0 g
− Extracto de carne 5,0 g
− Extracto de levadura 2,0 g
− Lecitina 0,7 g
− Bisulfito sódico 0,1 g
− Agua 1 000 ml
ISO 21149:2006 - 24 -
A.4.2 Preparación
Se disuelven en agua hirviendo, sucesivamente, el polisorbato 80 y la lecitina hasta su completa disolución. Se disuelve el
resto de componentes mezclándolos bien mientras se calientan. Se mezcla suavemente para evitar la formación de espuma.
Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la este-
rilización el pH debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
- 25 - ISO 21149:2006
ANEXO B (Informativo)
OTROS DILUYENTES
B.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier diluyente para preparar la suspensión inicial si se ha comprobado y validado. El siguiente
diluyente es un ejemplo de fórmula adecuada.
B.2 Solución de peptona tamponada a pH 7
B.2.1 Composición
− Peptona de carne 1,0 g
− Fosfato monopotásico 3,6 g
− Fosfato disódico dihidratado 7,2 g
− Agua 1 000 ml
B.2.2 Preparación
Se disuelven los ingredientes en agua hirviendo. Se mezclan. Se enfría a 25 ºC antes de dispensar la disolución en recipientes
adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización el pH debe ser equivalente a
7,1 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
ISO 21149:2006 - 26 -
ANEXO C (Informativo)
OTROS MEDIOS DE CULTIVO
C.1 Generalidades
Se puede emplear cualquier medio de cultivo si se ha comprobado y validado. Los siguientes medios son ejemplos de
fórmulas adecuadas.
C.2 Medio de agar para recuento
C.2.1 Medio de agar de Eugon LT 100

Véase el apartado 5.4.3.3.1.
C.2.2 Agar LT 100
C.2.2.1 Composición
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
C.2.2.2 Preparación
Se disuelven el polisorbato 80, el octoxynol 9 y la lecitina de huevo en agua hirviendo, sucesivamente, hasta que su
completa disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calientan. Se mezcla suavemente
para evitar la formación de espuma. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC
durante 15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a
temperatura ambiente.
- 27 - ISO 21149:2006
C.2.3 Medio de agar sobre medio de caseína y soja (agar añadido al caldo SCD)
− Peptona de caseína 17,0 g
− Peptona de soja 3,0 g
− Fosfato dipotásico hidrogenado 2,5 g
− Glucosa 2,5 g
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua hirviendo hasta su
completa disolución. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
C.3 Caldos de enriquecimiento
C.3.1 Caldo Letheen modificado [5]

Véase el anexo A.4.
C.3.2 Medio de caseína y soja digeridas – lecitina – polisorbato 80 (caldo SCDLP 80)
− Fosfato de hidrógeno dipotásico 2,5 g
− Glucosa 2,5 g
− Lecitina 1,0 g
− Agua 1 000 ml
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua hirviendo hasta su com-
pleta disolución. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después
de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
ISO 21149:2006 - 28 -
C.3.3 Caldo neutralizante D/E (caldo neutralizante Dey/Engley) [5]
− Glucosa 10,0 g
− Na2S2O3·5H2O 6,0 g
− NaHSO3 2,5 g
− Extracto de levadura 2,5 g
− Tioglicolato sódico 1,0 g
− Púrpura de bromocresol 0,02 g
− Agua 1 000 ml
Se disuelven sucesivamente todos los componentes, o el medio completo deshidratado, en agua hirviendo hasta su completa
disolución. El medio se dispensa en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la
esterilización y enfriamiento , el pH debe ser equivalente a 7,6 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
C.4 Medio de agar de caseína y soja digeridas – lecitina – polisorbato 80 (medio SCDLPA) para la detección
C.4.1 Composición
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
C.4.2 Preparación
Se mezclan y disuelven todos los componentes por calentamiento. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se
esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente
a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
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ANEXO D (Informativo)
NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

DE LOS CONSERVANTES Y LÍQUIDOS DE LAVADO
Compuesto químico capaz de neutralizar Ejemplos de neutralizantes y líquidos

Conservante la actividad antimicrobiana del de lavado adecuados[6][7] (para los métodos
conservante de filtración a través de membrana)
Compuestos fenólicos: Lecitina, Polisorbato 80, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
parabenos, Polisorbato 80, Óxido de etileno condensado en alcohol graso, 7 g/l + lecitina,
fenoxietanol, Óxido de etileno condensado en alcohol 20 g/l + polisorbato 80, 4 g/l
feniletanol, graso, Caldo neutralizante D/E a
etc. Tensoactivos no iónicos Líquido de lavado: agua destilada; triptona
1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Anilidas
Compuestos de amonio Lecitina, saponina, polisorbato 80, dodecil Polisorbato 80, 30 g/l + dodecil sulfato sódico, 4 g/l + lecitina,
cuaternario sulfato sódico 3 g/l.
Tensoactivos catiónicos Óxido de etileno condensado en alcohol Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
graso, Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: agua destilada; triptona 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polisorbato 80, 5 g/l.
Aldehídos Glicina, histidina Lecitina, 3 g/l + polisorbato 80, 30 g/l + L-histidina, 1 g/l.
Agentes liberadores de Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + L-histidina, 1 g/l +
formaldehído L-cisteína, 1 g/l
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: polisorbato 80, 3 g/l+ L-histidina, 0,5 g/l.
Compuestos oxidantes Tiosulfato sódico Tiosulfato sódico, 5 g/l.
Líquido de lavado: tiosulfato sódico, 3 g/l.
Isotiazolinonas, Imidazoles Lecitina, saponina Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
Aminas, sulfatos, mercaptanos, bisulfito Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80,
sódico, tioglicolato sódico. 5 g/l.
Biguanidas Lecitina, saponina, polisorbato 80 Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80,
5 g/l.
Sales metálicas (Cu, Zn, Hg) Bisulfato sódico, L-cisteína Tioglicolato sódico, 0,5 g/l o 5 g/l.
Compuestos órgano-mercuriales Compuestos sulfhidrilos, ácido tioglicólico L-cisteína, 0,8 g/l o 1,5 g/l.
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: tioglicolato sódico, 0,5 g/l.
a
El caldo neutralizante D/E (Caldo neutralizante de Dey/Engley), véase el anexo C.
ISO 21149:2006 - 30 -
BIBLIOGRAFÍA
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[4] USP 28, Microbial limit test 61, 2005 published by the U.S. Pharmacopoeia.
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December 1987, p. 55.
[7] EN 1040:—6), Chemical disinfectants and antiseptics. Basic bactericidal activity. Test method and requirements
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[8] ISO 18415:—7), Cosmetics. Microbiology. Detection of specified microorganisms (Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) and non-specified microorganisms.
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[10] ISO 21150:—7), Cosmetics. Microbiology. Detection of Escherichia coli.
[11] ISO 22717:2006, Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa.
[12] ISO 22718:2006, Cosmetics. Microbiology. Detection of Staphylococcus aureus.
[13] EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics. Preservation of microbial strains used for the determination
of bactericidal and fungicidal activity.
[14] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, 1997 published by the European Cosmetic, Toiletry
and Perfumery Association (COLIPA).
[15] ATLAS, R.M. Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993.
6) Pendiente de publicación.
Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201
28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032

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norma UNE-EN

Detección y recuento de bacterias aerobias meesófilas

Cosmétiquues. Microbiologie. Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles

ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

© AENOR 2010 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201 Grupo 19

ICS 07.100.99; 71.100.70

Cosmetics. Microbiology. Enumeration Cosmétiques. Microbiologie. Kosmetik. Mikrobiologie. Zählung und

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-23.

© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................... 8

2 NORMAS PARA CONSULTA ................................................................................................ 8

3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES ............................................................................................. 8

5 DILUYENTES, NEUTRALIZANTES Y MEDIOS DE CULTIVO ................................... 10

6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO ............................................................................ 13

7 CEPAS DE MICROORGANISMOS .................................................................................... 13

8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS

10 RECUENTO DE COLONIAS (MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA

11 DETECCIÓN DEL CRECIMIENTO (MÉTODO DE ENRIQUECIMIENTO) .............. 16

12 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ................................................................................ 16

13 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

13.3 Validación de los métodos de recuento .................................................................................. 20

14 INFORME DE ENSAYO ....................................................................................................... 22

ANEXO A (Informativo) OTROS DILUYENTES NEUTRALIZANTES .................................. 23

ANEXO B (Informativo) OTROS DILUYENTES ........................................................................ 25

ANEXO C (Informativo) OTROS MEDIOS DE CULTIVO ........................................................ 26

ANEXO D (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

− mediante el recuento de colonias en un medio de agar después de la incubación aerobia, o

− mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después del enriquecimiento.

2 NORMAS PARA CONSULTA

ISO 21148:2005 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

3.1 bacteria aerobia mesófila:

3.4 suspensión inicial:

3.5 muestra diluida:

4.2 Recuento en placa

− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante 72 h ± 6 h.

4.3 Filtración a través de membrana

− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante 72 h ± 6 h.

4.4 Detección de bacterias por enriquecimiento

− Incubación aerobia de las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC entre 48 h y 72 h.

− Se comprueba el crecimiento y se expresa el resultado como "presencia/ausencia" de bacterias aerobias mesófilas en la

5 DILUYENTES, NEUTRALIZANTES Y MEDIOS DE CULTIVO

5.2 Diluyentes y diluyentes neutralizantes

5.2.2 Diluyentes neutralizantes

− Digerido pancreático de caseína 20,0 g

− Lecitina de soja 5,0 g

5.2.2.2 Otros diluyentes neutralizantes

− Digerido péptico de tejido animal 1,0 g

5.2.3.2 Otros diluyentes

5.3 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)

− Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g

− Cloruro sódico 8,5 g

5.4 Medio de cultivo

5.4.2 Medio de cultivo para el recuento

− Digerido pancreático de caseína 15,0 g

− Digerido papaínico de soja 5,0 g

− Cloruro sódico 5,0 g

5.4.2.2 Otros medios para el recuento

5.4.3 Medios de cultivo para la detección

5.4.3.2 Caldo de enriquecimiento: caldo Eugon LT 100

− agente dispersante: octoxynol 9.

− Digerido pancreático de caseína 15,0 g