Une en Iso 21150 2010

norma UNE-EN
N ISO 21150
españolla
Febrero 2010
TÍTULO Cosm
méticos
Microobiología
Detección de Escherichia coli
(ISO 21150:2006)
2
Cosmeticss. Microbiology. Detection of Escherichia coli (ISO 21150:2006).
Cosmétiquues. Microbiologie. Détection d'Escherichia coli (ISO 21150:2006).
CORRESPONDENCIA Esta norrma es la versión oficial, en español, de la Norma Europpea EN ISO 21150:2009,
que a suu vez adopta la Norma Internacional ISO 21150:2006.
OBSERVACIONES
ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

N 84 Aceites esenciales y
producttos cosméticos cuya Secretaría desempeña STANPA.
Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

ERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 5384:2010
21 Páginas
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Reproducción prohibida 28004 MADRID-Españña www.aenor.es Fax: 913 104 032
Este documento ha sido adquirido por LABORATORIOS RECAMIER LTDA el 30 de Noviembre de 2013.
Para poder utilizarlo en un sistema de red interno, deberá disponer de la correspondiente licencia de AENOR
S
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN ISO 21150
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Junio 2009
ICS 07.100.99; 71.100.70
Versión en español
Cosméticos
Microbiología
Detección de Escherichia coli
(ISO 21150:2006)
Cosmetics. Microbiology. Detection of Cosmétiques. Microbiologie. Détection Kosmetik. Mikrobiologie. Nachweis von
Escherichia coli. (ISO 21150:2006) d'Escherichia coli. (ISO 21150:2006) Escherichia coli. (ISO 21150:2006)
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-30.
Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de
las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas
actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de
Gestión de CEN, o a través de sus miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismo
rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,
Bélgica, Bulgaria, Chipre, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría,
Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles
© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.
EN ISO 21150:2009 -4-
PRÓLOGO
El texto de la Norma ISO 21150:2006 del Comité Técnico ISO/TC 217 Cosméticos, de la Organización
Internacional de Normalización (ISO), ha sido adoptado como Norma EN ISO 21150:2009.
Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico
a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2009, y todas las normas nacionales técni-
camente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2009.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos
a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichos
derechos de patente.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia,
Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
DECLARACIÓN
El texto de la Norma ISO 21150:2006 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 21150:2009 sin
ninguna modificación.
-5- ISO 21150:2006
ÍNDICE
Página
PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 6
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 7
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................. 7
2 NORMAS PARA CONSULTA ............................................................................................. 7
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES .......................................................................................... 8
4 PRINCIPIO............................................................................................................................. 8
5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO ......................................................................... 8

5.1 Generalidades ......................................................................................................................... 8
5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)............. 9
5.3 Medios de cultivo .................................................................................................................... 9
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO ......................................................................... 12
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS ................................................................................. 12
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS

MUESTRAS DE LABORATORIO .................................................................................... 12
9 PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 13
9.1 Recomendaciones generales ................................................................................................. 13
9.2 Preparación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento ............................... 13
9.3 Incubación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento ................................. 13
9.4 Detección e identificación de Escherichia coli .................................................................... 13
10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI) .... 14
11 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

DEL PRODUCTO ................................................................................................................ 15
11.1 Generalidades ....................................................................................................................... 15
11.2 Preparación del inóculo ....................................................................................................... 15
11.3 Validación del método de detección .................................................................................... 15
12 INFORME DE ENSAYO .................................................................................................... 16
ANEXO A (Informativo) OTROS CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO .................................. 17
ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE LOS CONSERVANTES
Y LÍQUIDOS DE LAVADO ................................................................ 20
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 21
ISO 21150:2006 -6-
PRÓLOGO
ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionales
normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en
una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado en
dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también
participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC)
en todas las materias de normalización electrotécnica.
Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas
ISO/IEC.
La tarea principal de los comités técnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normas
internacionales adoptados por los comités técnicos se envían a los organismos miembros para votación.
La publicación como norma internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismos
miembros que emiten voto.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar
sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todos
los derechos de patente.
La Norma ISO 21150 fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 217, Cosméticos.
-7- ISO 21150:2006
INTRODUCCIÓN
Los exámenes microbiológicos de los productos cosméticos se deben realizar conforme a un análisis adecuado de los
riesgos microbiológicos, para asegurar su calidad y la seguridad de los consumidores.
El análisis de riesgos microbiológicos depende de varios parámetros, como:
− alteración potencial de los productos cosméticos;
− la patogenicidad de los microorganismos;
− el lugar de aplicación del producto cosmético (pelo, piel, ojos, membranas mucosas, etc.);
− el tipo de usuario (adulto, niños menores de tres años, etc.).
Para los cosméticos, y otros productos tópicos, la detección de los patógenos de la piel como Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans puede ser relevante. La detección de otro tipo de microorganismos (inclu-
yendo los indicadores de contaminación fecal, por ejemplo Escherichia coli) podría ser de interés dado que estos microor-
ganismos indican falta de higiene durante el proceso de fabricación.
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma internacional proporciona unas directrices generales para la detección e identificación del microorganismo
específico Escherichia coli en los productos cosméticos. Los microorganismos considerados como específicos en esta
norma internacional podrían variar de país a país, de acuerdo con las prácticas o reglamentos nacionales.
Para asegurar la calidad del producto y la seguridad de los consumidores, se recomienda realizar un análisis de riesgos
microbiológicos adecuado para determinar los tipos de productos cosméticos para los que es aplicable esta norma
internacional. Los productos que se considera que presentan un bajo riesgo microbiológico incluyen los que presentan
una baja actividad de agua, los productos hidroalcohólicos, los que tienen valores extremos de pH, etc.
El método descrito en esta norma internacional se basa en la detección de Escherichia coli en un medio líquido no
selectivo (caldo de enriquecimiento), seguido de un aislamiento en un medio selectivo de agar. Otros métodos pueden ser
apropiados en función del nivel de detección requerido.
NOTA Para la detección de Escherichia coli se pueden realizar subcultivos en medios de cultivo no selectivos, seguidos de las etapas de identificación
adecuadas (por ejemplo, usando kits de identificación).
Debido a la gran variedad de productos cosméticos dentro de este campo de aplicación, este método podria no ser apropiado
en todos los aspectos, para algunos productos (por ejemplo, ciertos productos inmiscibles en agua). Otras normas
internacionales pueden ser apropiadas. Otros métodos (por ejemplo, los automatizados) pueden sustituir a los ensayos que se
describen en esta norma, siempre que se haya demostrado su equivalencia o que el método se haya validado de otra manera.
2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuación se indican son indispensables para la aplicación de esta norma. Para las referencias con
fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de la norma (incluyendo
cualquier modificación de ésta).
ISO 21148:1) *Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.
1) Pendiente de publicación.
* NOTA NACIONAL La Norma ISO 21148 fue publicada en el año 2005.
ISO 21150:2006 -8-
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes:
3.1 producto:
Porción de un producto cosmético identificado, recibido en el laboratorio para su ensayo.
3.2 muestra:
Porción del producto (de al menos 1 g o 1 ml) que se emplea en el ensayo para preparar la suspensión inicial.
3.3 suspensión inicial:

Suspensión (o disolución) de una muestra en un volumen definido del caldo de enriquecimiento apropiado.
3.4 muestra diluida:

Disolución de la suspensión inicial.
3.5 microorganismo específico:

Bacteria aerobia mesófila o levadura que no es deseable en un producto cosmético y que puede causar infecciones en la
piel y ojos, o puede ser indicativa de falta de higiene en el proceso de fabricación.
3.6 Escherichia coli:

Bacilo Gram negativo, móvil, forma colonias lisas.
NOTA 1 Las principales características para la identificación son: catalasa positiva, oxidasa negativa, fermentación de lactosa, producción de indol, creci-
miento en medio selectivo que contenga sales biliares formando colonias características.
NOTA 2 Escherichia coli se puede aislar a partir de fuentes ambientales húmedas (aire, agua, suelo) y es un indicador de contaminación fecal.
3.7 caldo de enriquecimiento:

Medio líquido no selectivo que contiene los neutralizantes y/ o agentes dispersantes adecuados y que se ha validado
para el producto sometido a ensayo.
4 PRINCIPIO
El primer paso del procedimiento es realizar un enriquecimiento mediante un caldo de cultivo no selectivo para incrementar
el número de microorganismos sin riesgo de inhibición por los ingredientes selectivos que se encuentran presentes en los
medios de cultivo selectivos/diferenciales.
El segundo paso del ensayo (aislamiento) se realiza en un medio selectivo, y a continuación se llevan a cabo los ensayos
de identificación.
Se debe neutralizar la posible inhibición del crecimiento microbiano en la muestra, para permitir la detección de los microor-
ganismos viables [5]. En todos los casos, y sin importar la metodología, se debe comprobar y validar la neutralización de las
propiedades antimicrobianas del producto [6], [7], [8].
5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 Generalidades
En la Norma ISO 21148 se proporcionan las instrucciones generales. Cuando en este documento se menciona el agua,
se refiere a agua destilada o agua purificada conforme a la Norma ISO 21148.
-9- ISO 21150:2006
El caldo de enriquecimiento se usa para dispersar la muestra y para incrementar la población microbiana inicial. Puede
contener neutralizantes si la muestra a ensayar tiene propiedades antimicrobianas. Se debe demostrar la eficacia de la
neutralización (véase el capítulo 11). El anexo B proporciona información relativa a los neutralizantes adecuados.
El siguiente caldo de enriquecimiento es adecuado para comprobar la presencia de Escherichia coli conforme a esta norma
internacional siempre que se haya validado conforme al capítulo 11.
Pueden emplearse otros diluyentes y medios de cultivo, si se puede demostrar que son adecuados para este uso.
5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)

El diluyente se emplea para la preparación de la suspensión bacteriana que se utiliza en el procedimiento de validación
(véase el capítulo 11).
5.2.1 Composición
− Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g
− Cloruro sódico 8,5 g
− Agua 1 000 ml
5.2.2 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, mezclándolos mientras se calientan. Se dispensa en recipientes adecuados. Se
esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.3 Medios de cultivo
5.3.1 Generalidades
Los medios de cultivo se pueden preparar siguiendo las indicaciones que se proporcionan a continuación, o a partir de un
medio de cultivo deshidratado, conforme a las instrucciones del fabricante. Se recomienda seguir las instrucciones propor-
cionadas por el proveedor de los medios.
NOTA Los medios preparados (listos para su uso) se pueden utilizar cuando su composición y/o su rendimiento en crecimiento sean comparables a los de
las fórmulas que se indican en esta norma.
5.3.2 Medio de agar para la validación [agar de caseína y soja digeridas (SCDA) o agar de triptona y soja (TSA)]
5.3.2.1 Composición
− Digerido pancreático de caseína 15,0 g
− Digerido papaínico de soja 5,0 g
− Agar 15,0 g
− Agua 1 000 ml
ISO 21150:2006 - 10 -
5.3.2.2 Preparación
Se disuelven los componentes o el medio deshidratado completo en agua, mezclándolos mientras se calientan. Se dispensa
el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
5.3.3 Caldo de enriquecimiento
5.3.3.1 Caldo Eugon LT 100
5.3.3.1.1 Generalidades
Este medio contiene ingredientes
− que neutralizan las sustancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina y polisorbato 80;
− un agente dispersante: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composición
− Digerido papaínico de soja 5,0 g
− L-cistina 0,7 g
− Sulfito sódico 0,2 g
− Glucosa 5,5 g
− Lecitina de huevo 1,0 g
− Polisorbato 80 5,0 g
− Octoxynol 9 1,0 g
− Agua 1 000 ml
5.3.3.1.3 Preparación
Se disuelven los componentes, polisorbato 80, octoxynol 9 y lecitina de huevo sucesivamente, en agua hirviendo, hasta su
completa disolución. Se disuelve el resto de componentes mezclándolo todo mientras se calienta.
Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la este-
rilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.3.3.2 Otros caldos de enriquecimiento

Se pueden emplear, si son apropiados, otros caldos de enriquecimiento (véase el anexo A).
- 11 - ISO 21150:2006
5.3.4 Medio de agar selectivo para el aislamiento de Escherichia coli
5.3.4.1 Medio de agar MacConkey
− Digerido pancreático de gelatina 17,0 g
− Digerido péptico de tejido animal 1,5 g
− Lactosa 10,0 g
− Mezcla de sales biliares 1,5 g
− Agar 13,5 g
− Rojo neutro 30,0 mg
− Cristal violeta 1,0 mg
− Agua 1 000 ml
Se disuelven todos los componentes sólidos en agua y se hierve durante 1 min para su total disolución.
Se dispensa en recipientes adecuados y se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.
5.3.5 Medio de agar selectivo para la confirmación de Escherichia coli
5.3.5.1 Medio de agar Levine con eosina y azul de metileno
− Fosfato potásico dihidrogenado (KH2PO4) 2,0 g
− Agar 15,0 g
− Lactosa 10,0 g
− Eosina Y 400 mg
− Azul de metileno 65 mg
− Agua 1 000 ml
ISO 21150:2006 - 12 -
Se disuelve el digerido pancreático de gelatina, el fosfato potásico dibásico y el agar en el agua, calentando, y se deja
enfriar. Justo antes de su uso, se licúa la solución de agar gelificada, se añaden los ingredientes restantes, a modo de
soluciones, en las siguientes cantidades, y se mezcla; por cada 100 ml de solución de agar licuado.
− 5 ml de la solución de lactosa al 20%;
− 2 ml de la solución de eosina Y al 2%; y
− 2 ml de solución de azul de metileno al 0,033%.
El medio acabado puede quedar turbio.
Se dispensa en recipientes adecuados y se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

Se debe emplear equipo de laboratorio, aparatos y material de vidrio conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148.
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS
Se usa la siguiente cepa representativa para la validación de las condiciones de ensayo:
Escherichia coli ATCC2) 8739

(cepa equivalente: CIP3) 53.126 o NCIMB4) 8545 o NBRC5) 3972 o KCTC6) 2571 o cualquier cepa equivalente de
una colección nacional).
El cultivo se debería reconstituir conforme a los procedimientos proporcionados por el suministrador de la cepa de referencia.
La cepa se puede almacenar en el laboratorio conforme a la Norma EN 12353[4].
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS MUESTRAS DE LABORATORIO

Si es necesario, los productos a ensayar se almacenan a temperatura ambiente.
Los productos (3.1) y muestras (3.2) no se deben incubar, refrigerar o congelar antes o después de los análisis.
El muestreo de los productos cosméticos a analizar se lleva a cabo conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148. Se
analizan las muestras según se describe en la Norma ISO 21148, y conforme al procedimiento descrito en el capítulo 9.
2) ATCC = American Type Culture Collection.

3) CIP = Collection de l’Institut Pasteur.
4) NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria.
5) NBRC = National Biological Resource Center.
6) KCTC = Korean Collection for Type Culture.
- 13 - ISO 21150:2006
9 PROCEDIMIENTO
9.1 Recomendaciones generales

Para preparar la muestra, la suspensión inicial y las diluciones, se usa material y equipo estéril y técnicas asépticas. En el
caso de preparar la suspensión inicial en un agente solubilizante apropiado, el tiempo que pasa entre el final de la prepara-
ción y el momento en el que la alícuota entra en contacto con el caldo de enriquecimiento no debe exceder de 45 min, a no
ser que se mencione específicamente en los protocolos o documentación establecida.
9.2 Preparación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento
9.2.1 Generalidades
El enriquecimiento se prepara a partir de una muestra (3.2) de al menos 1 g o 1 ml del producto a ensayar bien homoge-
neizado, que se dispersa en, al menos, 9 ml del caldo de enriquecimiento.
Se anota como S el peso o volumen exacto de la muestra.
Se debe comprobar el método para asegurar que la composición (incluyendo los posibles neutralizantes añadidos) y el
volumen del caldo son adecuados para realizar el ensayo satisfactoriamente (véase 11.3).
NOTA En algunos casos, y cuando sea posible, la filtración del producto cosmético a través de una membrana que después se sumerge en el caldo de
enriquecimiento favorece la neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto (véase 11.3).
9.2.2 Productos miscibles en agua

Se transfiere la muestra S del producto a un recipiente que contenga un volumen adecuado de caldo (5.3.3).
9.2.3 Productos no miscibles en agua

Se transfiere la muestra S del producto a un recipiente apropiado que contenga una cantidad adecuada de agente solubili-
zante (por ejemplo, polisorbato 80).
Se dispersa la muestra en el agente solubilizante y se añade un volumen adecuado de caldo (5.3.3).
9.2.4 Productos filtrables

Se usa un filtro de membrana que tenga un tamaño de poro nominal no superior a 0,45 μm.
Se transfiere la muestra S sobre la membrana en un aparato de filtración (véase la Norma ISO 21148). Se filtra inmediata-
mente y se lava la membrana con volúmenes definidos de agua (5.1) y/o diluyente (5.2).
Se transfiere y se sumerge la membrana en un tubo o un recipiente del tamaño adecuado que contenga un volumen
apropiado de caldo (5.3.3).
9.3 Incubación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento

Se incuba la suspensión inicial preparada en el caldo (véase 9.2) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 20 h (máximo 72 h).
9.4 Detección e identificación de Escherichia coli
9.4.1 Aislamiento
Con un asa estéril se toma una alícuota del caldo de enriquecimiento incubado (9.3) y se pasa por la superficie de agar
MacConkey (5.3.4.1) para obtener colonias aisladas.
Se invierte la placa Petri y se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 24 h (máximo 48 h).
ISO 21150:2006 - 14 -
Se comprueban las características de las colonias (véase la tabla 1).
Tabla 1 – Características morfológicas de Escherichia coli en un medio de agar MacConkey
Medio selectivo Morfología característica de las colonias de Escherichia coli

Agar MacConkey Color rojo ladrillo, pueden estar rodeadas por una zona de precipitado de sales biliares
9.4.2 Identificación de Escherichia coli
9.4.2.1 Generalidades
Se procede con los siguientes ensayos en las colonias sospechosas, aisladas en el medio de agar MacConkey. La presencia
de Escherichia coli se puede confirmar con otros ensayos en medios de cultivo o bioquímicos adecuados.
9.4.2.2 Tinción de Gram

Se realiza el ensayo especificado en la Norma ISO 21148. Se comprueba la presencia de bacilos Gram negativos.
9.4.2.3 Cultivo en medio de agar Levine con eosina y azul de metileno. (Medio de agar EMB)
Se inocula la superficie del medio de agar Levine con eosina y azul de metileno con las colonias sospechosas aisladas que
han crecido en el medio de agar MacConkey, de modo que se desarrollen colonias aisladas. Se invierte la placa Petri e
incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 24 h (máximo 48 h).
Se comprueban las características de las colonias tal como se especifica en la tabla 2.
Tabla 2 – Características morfológicas de Escherichia coli

en un Medio de agar Levine con eosina y azul de metileno
Medio selectivo Morfologia característica de las colonias de Escherichia coli

Agar Levine con eosina Brillo metálico bajo luz reflejada y apariencia
y azul de metileno negra-azulada bajo luz transmitida.
10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI)

Si la identificación de las colonias confirma la presencia de esta especie, se expresa el resultado como:
"Presencia de Escherichia coli en la muestra S."
Si no se ha producido crecimiento después del enriquecimiento y/o si la identificación de las colonias no confirma la
presencia de esta especie, se expresa el resultado como:
"Ausencia de Escherichia coli en la muestra S."
- 15 - ISO 21150:2006
11 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DEL PRODUCTO
11.1 Generalidades
Los diferentes ensayos descritos en 11.2 y 11.3 demuestran que el microorganismo puede crecer en las condiciones del
análisis.
11.2 Preparación del inóculo

Antes del ensayo, se inocula la superficie de agar de caseína y soja digerida (SCDA), o agar de triptona y soja (TSA) (5.3.2)
u otro medio adecuado (no selectivo y no neutralizante) con Escherichia coli. Se incuba la placa a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 18 h
a 24 h.
Se recoge el cultivo con un asa estéril, pasándola por la superficie del cultivo y se vuelve a suspender en el diluyente (5.2)
para obtener una suspensión estandarizada de aproximadamente 1 × 108 UFC por ml (por ejemplo mediante un espec-
trofotómetro, Norma ISO 21148, anexo C).
Esta suspensión estandarizada y sus diluciones se usan dentro de las siguientes 2 h.
11.3 Validación del método de detección
11.3.1 Procedimiento
11.3.1.1 Se prepara una dilución de la suspensión estandarizada (11.2) en tubos con 9 ml de diluyente (5.2) para obtener
un recuento final de entre 100 UFC por ml y 500 UFC por ml. Para el recuento de la concentración final de microor-
ganismos viables en la suspensión estandarizada diluida, se transfiere 1 ml de la suspensión a una placa Petri y se vierten
de 15 ml a 20 ml del medio de agar fundido (5.3.2) mantenido en un baño de agua a no más de 48º C. Se deja solidificar y
se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 20 h a 24 h.
11.3.1.2 Se prepara por duplicado la suspensión inicial (9.2) en las condiciones seleccionadas para el ensayo (al menos
1 g o 1 ml del producto a ensayar, volumen definido de caldo de enriquecimiento) en un tubo o recipiente. Cuando se
emplee el método de filtración a través membrana (9.2.4) se filtra, por duplicado, al menos 1 ml del producto a ensayar y
se transfiere cada membrana a un tubo o recipiente que contenga el caldo de enriquecimiento en las condiciones seleccio-
nadas para el ensayo.
11.3.1.3 Se introduce, asépticamente, 0,1 ml de la suspensión estandarizada diluida de los microorganismos en un tubo
o recipiente (ensayo de validación). Se mezcla e incuban ambos tubos o recipientes (ensayo de validación y control sin
inocular) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 20 h a 24 h.
11.3.1.4 Se realiza un aislamiento de cada tubo o recipiente (ensayo de validación y control sin inocular). Con un asa
estéril se siembra una alícuota (en las mismas condiciones que en el ensayo) de la mezcla incubada sobre la superficie
de medio de agar MacConkey (aproximadamente entre 15 ml y 20 ml) en una placa Petri (diámetro comprendido entre
85 mm y 100 mm). Se incuban las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 24 h a 48 h.
11.3.2 Interpretación de los resultados de la validación

Se comprueba que la dilución de la suspensión estandarizada de bacterias contenga entre 100 UFC por ml y 500 UFC
por ml.
La neutralización y el método de detección quedan validados si se produce un crecimiento característico de Escherichia coli
en la placa de validación y no hay ningún crecimiento en la placa de control.
Cuando se detecta crecimiento en la placa de control (productos contaminados), la neutralización y el método de detección
quedan validados si se recupera Escherichia coli de la placa de validación.
ISO 21150:2006 - 16 -
La falta de crecimiento en la placa de validación indica que todavía existe actividad antimicrobiana y es necesario modificar
las condiciones del método mediante un incremento en el volumen del caldo de enriquecimiento manteniendo la misma
cantidad de producto, o con la incorporación de una cantidad suficiente de agente neutralizante en el caldo de enriqueci-
miento, o mediante una combinación de modificaciones que permita el crecimiento de Escherichia coli.
Si a pesar de la incorporación de una cantidad adecuada de agente neutralizante y el incremento sustancial en el volumen
del caldo todavía no es posible recuperar un cultivo viable como se ha definido anteriormente, indica que no es probable
que el producto se contamine con Escherichia coli.
12 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar lo siguiente:
a) una referencia a esta Norma ISO 21150:2006;
b) toda la información necesaria para una completa identificación del producto;
c) el método empleado;
d) los resultados obtenidos;
e) todos los detalles operativos para la preparación de la suspensión inicial;
f) la descripción del método con los neutralizantes y los medios empleados;
g) la validación del método, incluso si el ensayo se ha realizado por separado;
h) cualquier punto no especificado en este documento, o considerado como opcional, junto con los detalles de cualquier
incidencia que pudiera haber influido en los resultados.
- 17 - ISO 21150:2006
ANEXO A (Informativo)
OTROS CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO
A.1 Medio líquido de lactosa con agentes neutralizantes y dispersantes

Este medio contiene ingredientes:
− que neutralizan las substancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina y polisorbato 80; y
− un agente dispersante: octoxynol 9.
A.1.1 Composición
− Extracto de carne 3,0 g
− Lactosa 5,0 g
− Lecitina de huevo 1,0 g
− Octoxynol 9 1,0 g
− Agua 1 000 ml
A.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes, polisorbato 80, octoxynol 9 y lecitina de huevo sucesivamente en agua hirviendo hasta su
completa disolución. Se disuelven el resto de componentes mezclándolos mientras se calientan. Se dispensa el medio en
recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Se enfría el medio lo más rápido posible después
de la esterilización. El pH debe ser equivalente a 6,9 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
A.2 Medio líquido de lactosa
A.2.1 Composición
− Lactosa 5,0 g
− Agua 1 000 ml
A.2.2 Preparación
Se disuelven los componentes en agua. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC
durante 15 min. Se enfría el medio lo más rápido posible después de la esterilización. El pH debe ser equivalente a 6,9 ± 0,2
cuando se mide a temperatura ambiente.
ISO 21150:2006 - 18 -
A.3 Medio de caseína y soja digeridas – lecitina – polisorbato 80 (caldo SCDLP 80)
A.3.1 Composición
− Peptona de caseína 17,0 g
− Peptona de soja 3,0 g
− Hidrogeno fosfato dipotásico 2,5 g
− Glucosa 2,5 g
− Lecitina 1,0 g
− Agua 1 000 ml
A.3.2 Preparación
Se disuelven todos los componentes o el medio completo deshidratado, sucesivamente en agua hirviendo hasta su
disolución completa. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
A.4 Caldo neutralizante D/E (Caldo neutralizante Dey/Engley) [11]
A.4.1 Composición
− Glucosa 10,0 g
− Lecitina de soja 7,0 g
− Tiosulfato sódico pentahidratado 6,0 g
− Bisulfito sódico 2,5 g
− Extracto de levadura 2,5 g
− Tioglicolato sódico 1,0 g
− Púrpura de bromocresol 0,02 g
− Agua 1 000 ml
- 19 - ISO 21150:2006
A.4.2 Preparación
Se disuelven todos los componentes o el medio completo deshidratado, sucesivamente en agua hirviendo hasta su
disolución completa. Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
A.5 Caldo Letheen modificado
A.5.1 Composición
− Digerido péptico de carne 20,0 g
− Extracto de levadura 2,0 g
− Lecitina 0,7 g
− Bisulfito sódico 0,1 g
− Agua 1 000 ml
A.5.2 Preparación
En agua hirviendo se disuelven sucesivamente, el polisorbato 80 y la lecitina hasta su completa disolución. Se disuelve
el resto de componentes mezclando bien mientras se calientan. Se mezcla suavemente para evitar la formación de espuma.
Se dispensa el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Después de la este-
rilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
ISO 21150:2006 - 20 -
ANEXO B (Informativo)
NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

DE LOS CONSERVANTES Y LÍQUIDOS DE LAVADO
Compuesto químico capaz de Ejemplos de neutralizantes y

Conservante neutralizar la actividad líquidos[3] [12] de lavado adecuados (para los
antimicrobiana del conservante métodos de filtración a través de membrana)
Compuestos Lecitina Polisorbato 80, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
fenólicos, Polisorbato 80 Óxido de etileno condensado en alcohol graso, 7 g/l + lecitina,
parabenos, Óxido de etileno condensado en alcohol 20 g/l + polisorbato 80, 4 g/l
fenoxietanol, feniletanol, graso Caldo neutralizante D/E a
etc. Tensoactivos no iónicos Líquido de lavado: agua destilada; triptona 1 g/l + NaCl,
9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Anilidas
Compuestos de amonio cuaternario Lecitina, saponina, polisorbato 80, dodecil Polisorbato 80, 30 g/l + dodecil sulfato sódico,
Tensoactivos catiónicos sulfato sódico 4 g/l + lecitina, 3 g/l.
Óxido de etileno condensado en alcohol Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
graso Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: agua destilada; triptona 1 g/l + NaCl,
9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Aldehídos Glicina, histidina Lecitina, 3 g/l + polisorbato 80, 30 g/l + L-histidina, 1 g/l.
Agentes liberadores de Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + L-histidina,
formaldehído 1 g/l + L-cisteína, 1 g/l
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: Polisorbato 80, 3 g/l+ L-histidina, 0,5 g/l.
Compuestos oxidantes Tiosulfato sódico Tiosulfato sódico, 5 g/l.
Líquido de lavado: Tiosulfato sódico, 3 g/l.
Isotiazolinonas, imidazoles Lecitina, saponina Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
Aminas, sulfatos, mercaptanos, bisulfito Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80,
sódico, tioglicolato sódico. 5 g/l.
Biguanidas Lecitina, saponina, polisorbato 80 Polisorbato 80, 30 g/l + saponina 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l; polisorbato 80,
5 g/l.
Sales metálicas (Cu, Zn, Hg) Bisulfato de sodio, L-cisteína Tioglicolato sódico, 0,5 g/l o 5 g/l.
Compuestos órgano- mercuriales Compuestos sulfhidrilos, ácido tioglicólico. L-cisteína, 0,8 g/l o 1,5 g/l.
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: tioglicolato sódico, 0,5 g/l.
a
El caldo neutralizante D/E (Caldo neutralizante de Dey/Engley), véase el anexo A.
- 21 - ISO 21150:2006
BIBLIOGRAFÍA
[1] ISO 18415:—7), Cosmetics. Microbiology. Detection of specified microorganisms (Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) and non-specified microorganisms.
[2] ISO 21149:—7), Cosmetics. Microbiology. Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria.
[3] EN 1040:—7), Chemical disinfectants and antiseptics. Basic bactericidal activity. Test method and requirements
(phase 1).
[4] EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics. Preservation of microbial strains used for the determination
of bactericidal and fungicidal activity.
[5] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, 1997 published by the European Cosmetic, Toiletry
and Perfumery Association (COLIPA).
[6] CTFA, Microbiology Guidelines, 2001 published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association ISBN
1-882621-32-8.
[7] E P, Microbiological Examination of non-sterile products, 4th edition, 2002 published by the European
Pharmacopoeia.
[8] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, 1995 published by the U.S. Food and Drug
Administration.
[9] J.P 14, General Tests. Microbial limit test, 2001 published by the Japanese Pharmacopoeia.
[10] USP 28, Microbial limit test 61, 2005 published by the U.S. Pharmacopoeia.
[11] ATLAS, R.M. Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993.
[12] SINGER, S. The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media, Cosmetics and Toiletries, 102,
December 1987, p. 55.
7) A publicar.
Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201
28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032

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norma UNE-EN

Detección de Escherichia coli

Cosmeticss. Microbiology. Detection of Escherichia coli (ISO 21150:2006).

Cosmétiquues. Microbiologie. Détection d'Escherichia coli (ISO 21150:2006).

ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

© AENOR 2010 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201 Grupo 15

ICS 07.100.99; 71.100.70

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-30.

© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................. 7

2 NORMAS PARA CONSULTA ............................................................................................. 7

3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES .......................................................................................... 8

5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO ......................................................................... 8

6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO ......................................................................... 12

7 CEPAS DE MICROORGANISMOS ................................................................................. 12

8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS

10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI) .... 14

11 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

12 INFORME DE ENSAYO .................................................................................................... 16

ANEXO A (Informativo) OTROS CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO .................................. 17

ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

El análisis de riesgos microbiológicos depende de varios parámetros, como:

− alteración potencial de los productos cosméticos;

− la patogenicidad de los microorganismos;

− el tipo de usuario (adulto, niños menores de tres años, etc.).

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

2 NORMAS PARA CONSULTA

ISO 21148:1) *Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

3.3 suspensión inicial:

3.4 muestra diluida:

3.5 microorganismo específico:

3.6 Escherichia coli:

3.7 caldo de enriquecimiento:

5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO

5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)

− Triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g

− Cloruro sódico 8,5 g

5.3 Medios de cultivo

− Digerido pancreático de caseína 15,0 g

− Digerido papaínico de soja 5,0 g

− Cloruro sódico 5,0 g

5.3.3 Caldo de enriquecimiento

5.3.3.1 Caldo Eugon LT 100

− un agente dispersante: octoxynol 9.

− Digerido pancreático de caseína 15,0 g

− Digerido papaínico de soja 5,0 g

− Cloruro sódico 4,0 g

− Sulfito sódico 0,2 g

− Lecitina de huevo 1,0 g

5.3.3.2 Otros caldos de enriquecimiento

5.3.4 Medio de agar selectivo para el aislamiento de Escherichia coli

5.3.4.1 Medio de agar MacConkey

− Digerido pancreático de gelatina 17,0 g

− Digerido pancreático de caseína 1,5 g

− Digerido péptico de tejido animal 1,5 g

− Mezcla de sales biliares 1,5 g

− Cloruro sódico 5,0 g

− Rojo neutro 30,0 mg

− Cristal violeta 1,0 mg

Se dispensa en recipientes adecuados y se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.

5.3.5 Medio de agar selectivo para la confirmación de Escherichia coli

5.3.5.1 Medio de agar Levine con eosina y azul de metileno