UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA VIDA

Manual de Prácticas para

Bioquímica I

(I6140)

Fecha de Actualización 20.01.2020

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Índice

I. Reglamento General del Laboratorio.............................................................................................3

II. Seguridad .......................................................................................................................................4
III. Comportamiento en el Laboratorio en General .............................................................................5
IV. Manejar Sustancias Peligrosas.......................................................................................................6
V. Reglamento Interno........................................................................................................................7
VI. Evaluación de las Prácticas............................................................................................................7
VII. Reporte.......................................................................................................................................8
Práctica No. 1 Espectrofotómetro........................................................................................................10
Práctica No. 2 Desnaturalización de Enzimas .....................................................................................12
Práctica No. 3 Cinética enzimática......................................................................................................15
Práctica alterna.................................................................................................................................18
iPráctica No. 4 Cinética enzimática II .................................................................................................20
Práctica No. 5 Azúcares reductores .....................................................................................................23
Práctica No. 6 Fermentation ................................................................................................................25

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I. Reglamento General del Laboratorio
El profesor de la práctica deberá:
- Estar presente durante todo el desarrollo de la práctica
- Mantener la disciplina de sus estudiantes durante la práctica
Todo el personal que ingrese al laboratorio deberá portar el material de protección personal como:
- Bata (blanca, limpia, de algodón y manga larga)
- Pantalones (largos)
- Zapatos cerrados y de piso; preferiblemente de cuero
- Guantes adecuados dependiendo de los reactivos y de las actividades. Con guantes nunca se toca
algo fuera del experimento. Véase a las "IdS Guantes"
- Cubre-bocas, cofias, mascarillas y/o gafas de seguridad en casos necesarios
Además deberá:
- Familiarizarse con la ubicación de los elementos de seguridad como extintor, puertas de
emergencia, duchas de emergencia, lava-ojos, botiquín de primeros auxilios etc., así como los
números telefónicos de emergencia
- Sujetar el cabello y no usar gorra
- Traer uñas cortas y sin esmalte
- No maquillarse durante el desarrollo de la práctica ni manipular lentes de contacto
- No comer, beber, masticar chicle
- No fumar
- No llevarse objetos a la boca como lápices o dedos
- Lavarse las manos antes de entrar y de salir del laboratorio
Está prohibido portar la indumentaria de protección personal fuera del laboratorio
No almacenar alimentos o bebidas para el consumo humano en el laboratorio
Está prohibido el ingreso al laboratorio a personas no autorizadas, p.ej. niños o visitas
Cualquier incidente en el laboratorio reportarlo inmediatamente al responsable
Los estudiantes no podrán salir del laboratorio durante la práctica a menos que sea muy necesario
Está prohibido bloquear las rutas de evacuación
Toda sustancia química será etiquetada, clasificada y almacenada de acuerdo a la normatividad
existente (véase "Registro de Sustancias Peligrosas")
Toda sustancia química no deberá ser eliminada directamente al desagüe sin antes consultar las
Fichas de Datos de Seguridad (véase "Registro Residuos Peligrosos")
El responsable del laboratorio levantará un reporte cuando no se cumple con lo indicado en este
reglamento

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II. Seguridad
Para entrar a las prácticas de bioquímica, cada estudiante tiene que conocer y cumplir las reglas de
seguridad en el laboratorio. Información sobre el comportamiento en general se puede encontrar muy
detallado en la página web
http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html y breve en los puntos
"III: Comportamiento en el Laboratorio en General" y
"IV: Manejar Sustancias Peligrosas" de este manual.
También es obligatorio para el estudiante de informarse sobre los riesgos potenciales que provienen
de los reactivos y procedimientos que se aplicarán *antes* de que se lleven a cabo las prácticas.
Información y documentos de pdf para bajar e imprimir se encuentra también en dicha página de
internet como el "Registro de Sustancias Peligrosas", "Instrucciones de Seguridad (IdS)" y "Fichas de
Datos de Seguridad" (FDS) para las sustancias que se utilizarán.

En el caso de no cumplir las reglas de seguridad, el estudiante tiene que salir de la práctica
inmediatamente y se evaluará este práctica con cero puntos. En caso de causar accidentes
graves o actuar con mala intención el estudiante puede ser excluido de las prácticas para todo
el semestre.

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III. Comportamiento en el Laboratorio en General
Usar una bata de algodón, manga larga, abotonada y limpia para protegernos
contra contaminaciones
" para no contaminar el exterior, nunca se utiliza la bata fuera del laboratorio
" batas sucias traen el peligro de contaminarse uno mismo

Usar zapatos cerrados (no sandalias) y seguros para caminar (sin tacón)
" en verano se puede traer un par de zapatos adicionales adecuados para el
laboratorio

Usar material de seguridad personal (gafas, guantes, etc.), cuando es indicado

NO fumar
NO comer, beber, maquillarse
NO alcohol u otras drogas
NO móvil/celular

No desarrollar experimentos peligrosos solos en el laboratorio

No correr ni jugar en el laboratorio
No recibir visitas personales en el laboratorio
No dejar bolsas o ropa en el laboratorio
Siempre dejar el laboratorio limpio y ordenado
- su material (quitar escrituras y adhesivos)
- los equipos (p.ej. centrífuga)
- su lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo)
Avisar:
- situaciones peligrosas
- mal funcionamiento de equipos y/o
- terminación de reactivos
al Responsable del Laboratorio

Lavarse las manos después del trabajo y ponerse crema para la piel

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IV. Manejar Sustancias Peligrosas
Es obligatorio informarse sobre los riesgos específicos de sustancias peligrosas
" Ver las Fichas de Datos de Seguridad (FDS)
http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/SDB.html
" Ver al Registro de Sustancias Peligrosas
http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/Anweisungen.html

Mujeres embarazadas y madres amamantando

NO pueden trabajar en el laboratorio con sustancias peligrosas

Almacenar:
En recipientes adecuados y en una manera adecuada
Marcado conforme a su contenido
- contenido (sustancia, mezcla, concentración)
- fecha
- propietario
- símbolo de peligro
No en cantidades grandes
Sustancias que producen polvos, gases, vapores, aerosoles etc tóxicos, nocivos,
cancerígenos, corrosivos o inflamables almacenar en un lugar ventilado

Nunca almacenar alimentos en el laboratorio

Nunca almacenar reactivos en contenedores de alimentos

Manejar:
No tocar químicos
Trasvasar mediante un medio aplicable (e.je. embudo)
Nunca poner las tapas boca abajo sobre la mesa
- dejar químicos sobre la mesa
- traer contaminación al recipiente
No dañar las etiquetas mientras se trasvasa (p.ej. por goteo)
Nunca devolver reactivos en su envase original
- traer contaminación al recipiente
No llenar recipientes más del 90% de su capacidad máxima
Cerrar bien los recipientes no usados
Sustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles tóxicos, nocivos,
cancerígenos, corrosivos o inflamables se maneja en una campana de
extracción

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V. Reglamento Interno
El estudiante tiene que entrar preparado a las prácticas, es decir con:
- Ropa adecuada cumpliendo las reglas de seguridad (pantalones largos, zapatos cerados y seguros,
cabello corto o recogido, bata limpia; gafas de seguridad y guantes según necesidad)
- Material necesario para llevar a cabo la práctica según el manual o el anuncio del profesor
- Material estandar con que debe contar cada equipo: 70% EtOH en atomizador para limpiar
meseta, cerillos, perilla/bulbo, bisturí, guantes, portaobjetos, cubreobjetos, varilla de madera,
algodón, gasa
- Método: Diagrama de flujo (escrito a mano) para llevar a cabo la práctica
ordenado, fácil de leer = fácil para captar la información necesaria, sin distractores (sólo
esquemas/dibujos necesarios), con espacio para anotar resultados crudos.
Hay que enseñar este equema al profesor dentro de los primeros 15 min de la PR.
- Conocer la base teórica para entender el objetivo de la práctica
En el caso de no cumplir algún punto de los anteriores, el estudiante puede ser excluido de esta
práctica y se evaluará con cero puntos.

VI. Evaluación de las Prácticas

En cada práctica se evaluará al estudiante según el siguiente esquema:
50 % Comportamiento en el laboratorio (actitud, preparación, desempeño, limpieza)
50 % Reporte

La calificación final de las prácticas se calculará del promedio de todas las prácticas ofrecidas, donde
cada práctica tiene el mismo peso. Prácticas ofrecidas no se repite; se evaluará una falta de asistencia
no justificada con cero puntos.

La evaluación de la materia será:

Exámenes 60 %
Tarea 10 %
Participación 5%
Prácticas 25 %
Se tiene que aprobar la teoría (= exámenes + tareas + participación) y las prácticas
independientemente para aprobar la materia.

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VII. Reporte
Cada equipo tiene que entregar el reporte de la práctica (impreso) al profesor responsable a más
tardar 6 días hábiles después de la práctica. Reportes de tipo "copy & paste" no son aceptables.

Generalmente, se evalua de reportes (detalles - ver abajo):

* Expresión clara, precisa y concisa - es decir, no innecesariamente larga
* Escritura sin faltas ortográficas o errores gramaticales
* Contenido completo - por eso, el reporte debe cumplir con los siguientes puntos:

- Nombre, Apellido y código del estudiante, número del equipo, fecha, curso, tema de la práctica
- Introducción (5): Pequeña introducción en la teoría en que se basa la práctica (la base para la
*discusión*; no tanto respuesta al cuestionario o una discusión anticipada)
- Material (2): - Material (especial) usado (sin material estándar como tubo de ensayo, gradilla, ...)
- Soluciones, reactivos usados (pureza, conc., marca si es relevante - no la preparación)
- Equipos (marca, modelo)
- Método (10): - Anexar "Diagrama de flujo para llevar a cabo la práctica" (véase V. Regl. interno)
- Procedimiento (8): - Pasos que realizaron para llevar a cabo la práctica
tomar fotos puede ayudar a ilustrar el procedimiento
copiar el método del protocolo y apuntar "aclaraciones" no será aceptable.
- Resultados (10): - Tabla (p.ej. de lecturas), fotos (con descripción) de los resultados primarios
(p.ej. colores de soluciones)
- NO hay un rubro propio de "observaciones"
(20) - Cálculos y resultados elaborados, gráficas (p.ej. Excel), explicación
- Discusión (20): - Qué se ha esperado (en base de la teoría como explicado en la introducción)?
- Explicación de las reacciónes y relacionarlas con observaciones y resultados
- Resultados cumplen con la expectativa?
- En el caso de no: discusión de errores
- Qué significan los resultados?
- NO hay un rubro propio de "conclusiones". Es parte final de la discusión.
- Cuestionario (20): - Contestado
- Bibliografia: Autor1, N1, N2 Autor2 & N3 Autor3 (año): Título. Revista, Volumen: páginas
http://www.domain-name.de/link/al/documento.pdf
- Formato del reporte (5)

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En la escritura no hay de desapreciar el espacio para producir más páginas, p.ej. no se requiere una hoja
de portada, no hay que dejar partes grandes en blanco; se recomienda usar los dos lados de una hoja.
Se evalua también:
- Normalmente se escribe textos con fuentes con serifas/gracias (p.ej. Times) - mientras leyendas y
textos en gráficas son escritos con fuentes sin serifas/gracias (p.ej. Arial).
- Las páginas deben ser enumeradas (sin tomar en cuenta los anexos).
- Hay que hacer saltos de página útiles/lógicas, p.ej. celdas de tablas no deben ser separados por un salto
de página. Igualmente, un título no debe ser separado de su texto por un salto de página.
- Uso de mayúsculas (textos no se escribe en mayúsculas o cursiva) y de puntos (después de una oración)
- Expresión científica y uso de termini technici: p.ej. desdoblar vs hidrolizar. Hay que evitar palabras
con conotaciones emociaónales (p.ej. apreciar).
- Unidades: su uso correcto, las abreviaciones correctas, espacios, puntos
- Formulas químicas: uso correcto de mayúsculas, minúsculas, superíndice, subíndice
Es recomendable escribir el método en infinitivo; media oraciones facilitan capar el contenido, p.ej.:
1) Añadir 3 ml H2O en tubo de ensayo 1) Se añadará 3 milílitros de agua en un tubo de ensayo.
2) Medir Abs. a λ = 620 nm 2) Se medirá la absorbancia de la muestra a 620 nanó-
metros con el espectrofotómetro.
El texto hay que escribir en forma impersonal (se ha observado, se medió) y no en forma personal
(obersvé, medimos).
Fotos, tablas, graficas deben contar con una descripción entendible por si mismo (i.e. sin necesidad
de leer el texto) y tener referencia en el texto.
Gráficas de coordenadas cartesianas deben iniciar con el valor cero y se debe indicar las unidades en
los ejes. La variable independiente se grafica en la eje X (abscisa), la dependiente en la eje Y
(ordenada). Hay que especificar la muestra graficada (no "muestra 1" sino p.ej. conc. 1 mM). La
distribución de los puntos debe ser proporcional (Excel: dispersión).
En la discusión o introducción hay que explicar, que se está esperando. Esto incluye reacciones
químicas, que deben ser representados (es posible dibujarlas a mano).
Aunque gramaticalmente correcto, oraciones pueden ser falsos por su lógica, p.ej.: "La cinética
enzimática estudia la velocidad..." - el sujeto de la oración es cinética, pero cinéticas NO pueden
estudiar algo. Normalmente son seres humanos, que pueden estudiar...

Otras sugerencias en la escritura de textos científicos se puede encontrar en:

http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/Paper.html

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 Práctica No. 1
Espectrofotómetro
Tipo de práctica: Por equipo Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Conocer el fundamento del espectrofotómetro para determinar la absorción y concentración de una
sustancia en solución.

Introducción
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una
muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto permite dar información
sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra y también indicar indirectamente que cantidad de la
sustancia que nos interesa está presente en dicha muestra. El color de las sustancias se debe a que
estas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y sólo vemos
aquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas.

Material
Material Cantidad Reactivos Cantidad
Celdas de plástico (semi-micro) 3 Solución madre de FeCl3 (50 mM) # 2 m$
Tubos de ensayo, 10 m$ 6 Aqua destillata (A. dest.)
Gradilla 1
Micropipetas de 100, 1000 µ$, puntas 2 / grp 1 muestra de FeCl3 de concentración 1 m$
Equipo desconocida
Espectrofotómetro 2 / grp

Método
1. Preparar un banco de diluciones (1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50) de la solución madre
2. Calibrar el espectrofotómetro a λ = 400 nm contra A. dest.
3. Determinar la absorbancia de cada solución a λ = 400 nm
4. Determinar la absorbancia de la muestra a λ = 400 nm

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Resultados
Diluciones A. dest. 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:50 muestra
Dilución
Conc. [mM]
Conc. [g/$]
Abs (400 nm)
- Calcular (y dibujar) una regresión lineal por los estándares (banco de dilución)
- Calcular en base a esto la concentración de la muestra

Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).
Calcule la preparación de las soluciones [g/l].
2. Indique detalladamente el principio del espectrofotómetro.
3. ¿Cuál es la Ley de Lambert-Beer?
4. ¿Cuál es la diferencia entre extinción (atenuación), absorción y transmisión?

Bibliografía
1. Spectro Educational Booklet 07, Biochrome: http://www.biochrom.co.uk/download/72/
2. Edwards, K (2014): Visible Spectroscopy. University of California, Irvine:
https://faculty.sites.uci.edu/chem2l/files/2011/04/RDGVISSpec.pdf
3. https://pharmaxchange.info/2012/04/ultraviolet-visible-uv-vis-spectroscopy-%E2%80%93-
derivation-of-beer-lambert-law/

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

El FeCl3 irrita la piel, se debe usar guantes de caucho butílico o PVC. En contacto con los ojos, lavar
con abundante agua manteniendo los párpados abiertos (mínimo 10 min), hay un riesgo de lesiones
oculares graves; se debe usar gafas de seguridad. Llamar al oftalmólogo. En caso de ingestión, beber
abundante agua y evitar vómito. Tras inhalación, tomar aire fresco. En contacto con la piel, lavar con
agua. Quitar ropa contaminada. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

Los desechos se depositan al contenedor de sales de metales pesados.

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 Práctica No. 2
Desnaturalización de Enzimas
Tipo de práctica: Por equipo Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Demostrar como el calor y/o pH pueden influir en la estructura terciara de una enzima, así como su
funcionalidad.

Introducción
Cada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que provoca continuos cambios en su estado
bioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar y
agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos. La temperatura Influye en la actividad de las
enzimas. El punto óptimo es aquel que representa el máximo de actividad. A temperaturas bajas las
enzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50 ºC) la
actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.
El pH puede afectar de varias maneras:
- El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH
- La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede provocar modificaciones en la
conformación de la enzima
- El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH

Material
Material Cantidad Reactivos Cantidad
Trozo de hígado fresco 1 Agua oxigenada (H2O2, 3-5 %) 15 m$
(trae el estudiante) (trae el estudiante) %
Tubos de ensayo de 15 m$ 4 1 M HCl # 5 m$
Pinza para tubo de ensayo 1 1 M NaOH # 5 m$
Gradilla 1 Aqua destillata (A. dest.) 5 m$
Pipetas de 5 m$ 4
Mortero & pilón 1 Arena (trae el estudiante)
Mechero de Bunsen 1
Equipo
Balanza 1 / grp

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Método
Hay que usar gafas de seguridad. Gafas ópticas no son adecuadas.

1) Normal
1.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)
1.2 Añadir 3 m$ de agua oxigenada
1.3 Anotar y documentar las observaciones
1.4 Después de la reacción retirar el agua oxigenada y añadir otra vez 3 m$ de agua oxigenada

2) Superficie
2.1 Moler ~2 g de hígado con arena
2.2 Transferir el hígado molido en un tubo de ensayo
2.3 Añadir 3 m$ de agua oxigenada

3) Temperatura
3.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)
3.2 Añadir 5 m$ de A. dest. y hervir la muestra durante 5 min
3.3 Dejar enfriar y retirar el agua sobrante
3.4 Añadir 3 m$ agua oxigenada

4) pH
4.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)
4.2 Añadir 5 m$ 1 M HCl e incubar a temperatura ambiente la muestra durante 5 min (mezclándola)
4.3 Neutralizar con unos 5 m$ 1 M NaOH y retirar el sobrenadante
4.4 Añadir 3 m$ agua oxigenada

Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).
Calcule la preparación de las soluciones [g/$ resp.ml/$].
2. Explique el funcionamiento del Mechero de Bunsen.
3. Diferencie entre las estructuras 1a, 2a, 3a y 4a de proteínas y *las fuerzas que las estabilizan*.
4. Explique como 3 *otros* factores favorecen a la desnaturalización de las enzimas.

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Bibliografía
1. Dechemax-Schülerwettbewerb (2015): Enzyme - Katalysatoren des Lebens. Dechema.
https://dechemax.de/dechemax_media/Bilder/Wettbewerbe_Archiv/Wettbewerb+2014/enzyme_
musterlösung-p-1560.pdf
2. Science Buddies (2012): The Liver: Helping Enzymes help You. Scientific American.
https://www.scientificamerican.com/article/bring-science-home-liver-helping-enzymes/

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

En el manejo del hígado, no se requiere medidas de seguridad especiales. Durante el corte del hígado
con las tijeras no se debe cortar sus dedos. Al hervir las muestras, la boca de los tubos debe estar
dirigida al contrario de cualquier persona por si el burbujeo al hervir es fuerte. Para evitar que se
derrame el líquido en el tubo al hervir, se recomienda que el tubo tenga 3/4 partes de espacio libre.
El HCl provoca quemaduras e irrita las vías respiratorias puesto que es una sustancia muy corrosiva
y se tiene que usar guantes de caucho nitrilo. En caso de perdida del conocimiento nunca dar a beber
ni provocar el vomito. Si se inhala, trasladar a la persona al aire libre. Si se tiene contacto con la piel
lavar abundantemente con agua. Quitar ropa contaminada. En caso de contacto con los ojos, lavar
abundantemente con agua manteniendo los parpados abiertos. Si se llega a ingerir, beber abundante
agua. Evitar el vómito. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.
NaOH es corrosivo y se debe usar guantes de caucho butílico. En caso de derrame neutralice con
carbonato hidrogenado, para situaciones en las que entre en contacto con piel y ojos enjuagar con
abundante agua y llamar al servicio médico de emergencias.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

En este caso la neutralización del HCl se realiza con 1 M NaOH. Una vez neutralizado los desechos
se pueden tirar al desagüe. Si existen residuos de hígado, se depositan en una bolsa de plástico, se
cierra bien y se tira en la basura.

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 Práctica No. 3
Cinética enzimática
Tipo de práctica: Grupal Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Aprender el funcionamiento y la influencia en la velocidad de reacción de las enzimas, que tienen
una posición central en el metabolismo de los seres vivos.

Introducción
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizan
los procesos fisiológicos, producidos por los organismos vivos. En los sistemas biológicos
constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales.
La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los
vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están dotados de
las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las del
metabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la
división celular, la reproducción, etc., están regidas por la actividad de innumerables enzimas
responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin
liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, entre
otras, prácticamente constante.
Las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción o
solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcada que en general actúan
exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa.

Material
Material Cantidad Reactivos Cantidad
por assay
Celda de cuarzo 1 PBS, 100 mM, pH 7,4:
Micropipeta de 100 µl y puntas 2 / grp Na2HPO4 * 2 H2O: 13,78 g/l 2,0 m$
NaH2PO4 * 2 H2O: 3,52 g/l
Micropipeta de 1000 µl y puntas 2 / grp 0,13 mM Na-NAD+ in PBS 1,7 m$
Contenedor para basura 2 / grp 25 mM Na-Lactate in PBS 0,2 m$
1% BSA (Bovine Serum Albumin)
Equipo in PBS
Espectrofotómetro 2 / grp 0,50 unit/ml LDH in BSA 0,1 m$

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Método
1. Pipetar según el siguiente esquema en la celda:
- 850 µ$ NAD+ soln
- 50 µ$ LDH
- Mezclar (tapar celda con plástico para mezclarla)
2. Determinar E0 (340 nm): blanco (auto cero)
- 100 µ$ Sustrato (diferentes concentraciones según la Tabla 1)
3. Mezclar rápido (tapar celda con plástico para mezclarla)
4. Determinar ∆E340 por 1-2 min cada 10 s
5. Después por 3-4 min cada 15 s (o hasta que no haya más ∆E340 significativo)
6. Cada concentración se determina por duplicado (entre todo el grupo)

Tabla 1. Preparación de la soln. sustrato y mediciones de las diferentes concentraciones de lactato

No. Equipo Vol Lactato Vol H2O conc. Lactato v0 [∆E/min]
[µ$] [µ$] [mM]
0 0 100
1 10 90
2 20 80
3 30 70
4 40 60
5 50 50
6 60 40
7 70 30
8 80 20
9 90 10
10 100 0
- Calcule v0 para cada concentración (PR grupal!)
- Dibuje la cinética enzimática según Michaelis Menten y estime el KM para Lactato y vmax.

Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla). Calcule
la preparación de las soluciones [mg/ml o µg/ml]. Anote el coeficiente de extinción de NADH.
2. Explique el significado del KM en la equación de Michaelis-Menten.
3. Compare los valores estimadas con valores de la literatura.
4. ¿Cómo puede la enzima bajar la entalpía (energía) de activación?

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Bibliografía
Bergmeyer, H.U., and Bernt, E., (1974) In Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer, H.U., 2nd
ed.; Academic Press: New York, NY, Volume II, 574-579

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

Los reactivos utilizados en esta práctica no son tóxicos.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

Los desechos líquidos se pueden tirar al desagüe.

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 Práctica 3 - alterna
Si por el Departamento no se ha comprado los reactivos necesarios para llevar a cabo la práctica
como debe ser, hay esta alternativa...

Material
Material Cantidad Reactivos Cantidad
Celda de plástico 2 Saliva (ayuno: estudiante no debe 1 m$
Micropipeta de 100 µl y puntas 2 / grp comer por lo menos 4 h antes)
Micropipeta de 1000 µl y puntas 2 / grp Lugol 1 m$
Contenedor para basura 2 / grp Agua (potable) o PBS
Solución de almidón (1 %) 1 m$
Equipo por Grupo
Espectrofotómetro 2

Método
1. Recolectar suficiente saliva (1 estudiante en ayuno por equipo).
La saliva debe ser líquida y sin espuma.
2. Pipetar según el siguiente esquema en un tubo de ensayo:
- 700 µ$ Agua o PBS
- 100 µ$ Lugol
- 100 µ$ sustrato (véase Tabla 1) directamente en la celda
3. Determinar E0 (660 nm) blanco contra A. dest.
- 100 µ$ Saliva
4. Mezclar rápido
5. Determinar ∆E660 por 5 min cada 30 s
6. Después por 10 min cada 60 s (o hasta que no haya más ∆E660 significativo)
7. Cada concentración se determina por duplicado

Resultados
Grafique ∆E/t vs t para cada concentración de sustrato determinada.
Calcule la velocidad inicial de la reacción para cada concentración de sustrato.

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Tabla 1. Preparación solución sustrato a diferentes concentraciones
No. Equipo Vol alm. Vol H2O conc. almidón v0 [∆E/min]
[µ$] [µ$] [mg/m$]
1 0 100
2 10 90
3 20 80
4 35 65
5 50 50
6 75 25
7 100 0

Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).
Calcule la preparación de las soluciones.
2. Explique el significado del KM en la equación de Michaelis-Menten.
3. ¿Cómo puede la enzima bajar la entalpía (energía) de activación?

Bibliografía
1. Hohmann, K. (2008): Hydrolyse von Stärke mit Speichel. Organisches Grundpraktikum.
Universität Marburg. https://www.chids.de/dachs/praktikumsprotokolle/PP0089Hydrolyse_
Staerke.pdf

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

La concentración de yodo utilizada en esta práctica es similar a utilizada para desinfectantes. Por lo
tanto las soluciones en esta práctica no son tóxicas. Sin embargo, se recomienda utilizar guantes para
evitar colorear la piel por el yodo.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

Los desechos líquidos se pueden tirar al desagüe.

- 19 - !
 iPráctica No. 4
Cinética enzimática II
Tipo de práctica: Individual Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Aprender de calcular KM según Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y Cornish
Bowden-Eisenthal.

Introducción
La ventaja del Michaelis-Menten plot - es muy ilustrativo - es al mismo tiempo su mayor desventaja:
no se puede determinar exactamente la velocidad maximal (vmax) y por ende no se puede calcular la
KM, la afinidad de la enzima a su sustrato.
Por eso otros investigadores transformaron la ecuación de Michaelis-Menten para lograr su
linealización con el fin de calcular así las constantes características de la enzima, su velocidad
maximal (vmax) y su afinidad al sustrato (KM). Igualmente, cada transformación tiene sus ventajas y
desventajas. A parte de la ecuación original, las transformaciones más comunes son los siguientes:

Michaelis Menten:

v = vmax * [S] / (KM - [S])

Lineweaver-Burk:

1 / v = KM / vmax * 1/[S] + 1 / vmax

- 20 - !
Eadie-Hofstee:

v = -KM * v / [S] + vmax

Hanes-Wilkinson = Hanes-Woolf:

[S] / v = 1 / vmax * [S] + KM / vmax

Cornish Bowden-Eisenthal:

Dibujar: vn vs. -[S]n

vmax = (v / [S]) * KM + v

Material
Ordenador y el programa Excel. Es importante tener los datos crudos ya en una tabla al inicio de la
práctica.

Método
Calcular en/con el programa Excel los datos necesarios para las gráficas y regresiones lineales de
Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y Cornish Bowden-
Eisenthal.

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Resultados
Dibuje las gráficas de Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y
Cornish Bowden-Eisenthal y representa los datos graficados en una tabla para la reacción de la
práctica 3. Indique también la ecuación para cada gráfica.
Calcule según Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y Cornish
Bowden-Eisenthal los valores vmax y KM para la reacción de la práctica 3; indique, cómo se
calcula estos valores.

Adicional
Traducciones de Excel
ES EN DE
Celda Cell Zelle
Fila Row Zeile
Columna Column Spalte

Pronostico Forecast Schätzer

Pendiente Slope Steigung
Estimacion.lineal Linest RGP

Suma Sum Summe

Promedio Average Mittelwert
Desvest Stdev Stabw
Raiz Sqrt Wurzel
Contar Count Anzahl

eje x (abscisa) x-axis (abscissa) x-Achse (Abszisse)

eje y (ordenada) y-axis (ordinate) y-Achse (Ordinate)
intersección intersection Schnittpunkt

Cuestionario
1. Compare tus resultados con valores de la literatura. ¿Cuál transformación dió el mejor resultado?
2. Discute "los pros" y "las contras" de cada transformación.
3. ¿Qué es la diferencia entre Standard-Deviation (SD) y Standard Error of Mean (SEM)?

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

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 Práctica No. 5
Azúcares reductores
Tipo de práctica: Por equipo Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Familiarizarse con las propiedades químicas de los azúcares determinando los azúcares reductores
por la reacción de Fehling.

Introducción
Los azúcares reductores pueden, en determinadas condiciones, reducir a las sales cúpricas.
Típicamente se dice, que el ensayo de Fehling se funda en el poder reductor del grupo aldehído. Éste
se oxida al ácido carboxílico y al mismo tiempo se reduce la sal de cobre (II) al óxido de cobre (I),
que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es, que se puede
detectar la forma aldehído fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Al azúcar, que reduce
la solución de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice azúcar reductor.

Material
Fehling I: 0,27 M CuSO4 * 5 H2O en Aqua destillata (A. dest.)
Fehling II: 1,205 M Na-K-tartrato * 4 H2O (sal de Seignette) + 2,5 M NaOH en A. dest. #

Material Cantidad Reactivos Cantidad

Pipetas (2 ml), perilla 3 Reactivo de Fehling I 9 m$
Tubos de ensayo de 15 m$ 6 Reactivo de Fehling II # 9 m$
Gradilla 1 Soln. glucosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$
Soln. fructosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$
Equipo Soln. sacarosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$
Baño María (60 ºC) 2 / grp Soln. lactosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$
Vortex 2 / grp Soln. almidón (1,0 %) - gotero 0,5 m$
Termómetro 1 / grp A. dest. - gotero 0,5 m$

Método
1. Poner 1,5 m$ de reactivo Fehling I en un tubo de ensayo
2. Añadir 1,5 m$ de reactivo Fehling II y mezclarlo (vortex)
3. Añadir 5 gotas de muestra y mezclarlo (vortex)
4. Calentar el tubo en el Baño María (60 °C) y documentar un cambio de color a los tiempos
0 s; 15 s; 30 s; 60 s; 120 s; 300 s
Repetirlo con cada muestra - i.e. secuencial, NO hay que trabajar las muestras en paralelo!

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Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).
Calcule la preparación de las soluciones [g/$].
2. Define "carbohidrato" y diferencie entre aldosa y cetosa.
3. Explique anillo intramolecular, las proyecciones Fischer & Haworth y la mutarrotación.
4. Describa reacciones de reducción y oxidación: alditol, ácido aldónico, ácido urónico, lactona,
ácido aldárico.

Bibliografía
1. https://chemdemos.uoregon.edu/demos/Fehling-Test
2. Kuhn I. (2006): Nachweis für reduzierende Zucker - Fehling Reaktion. Organisch Chemisches
Grundpraktikum. https://www.chids.de/dachs/praktikumsprotokolle/PP0060Fehling-Reaktion.pdf
3. Fleischer H. (2017): Fehlinterpretation der Fehling-Probe auf reduzierende Zucker. Chemkon, vol.
24, p. 27-30

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

El CuSO4 puede producir irritaciones en ojos y piel en personas predispuestas. Lávese
inmediatamente con agua abundante. Usar guantes y gafas de seguridad. Contamina al medio
ambiente por ser bioacumulativo y no es intrínsecamente biodegradable por lo que no se debe tirar al
alcantarillado.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

Todos los desechos que contengan CuSO4 (como aquellos tubos que contengan el reactivo de Fehling
I), se depositan al contenedor de sales de metales pesados.

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 Práctica No. 6
Fermentation
Tipo de práctica: Por equipo Tiempo de duración: 2 h

Objetivo
Entender la differencia en el rendimiento energético entre la respiración (aeróbica) y la fermentación
(anaeróbica).

Introducción
La glucólisis es una ruta metabólica altamente conservada que se encuentra en todos los seres vivos.
La función principal es proveer ATP a la célula; para lograrlo se requiere una reacción de oxidación
(Gra-3-Pi-DH). Al mismo tiempo se reduce NAD+ a NADH, que se tiene que reoxidar para que la
célula pueda seguir con la glucólisis. La reoxidación del NADH puede occurir transferiendo los
electrones vía la cadena respiratoria finalmente a O2 (= aeróbico). Si no hay oxígeno (= anaeróbico)
se puede reducir piruvato, el producto final de la glucólisis, para reoxidar el NADH; estas rutas
metabólicas son conocidas como fermentación. Levaduras descarboxilan piruvato a acetaldehído
(Piruvato-Descarboxilasa), que se reduce a etanol (Alcohol-Deshidrogenasa).

Material
Material Cantidad Equipo
Pipetas (1 m$; 5 m$) 2+2 Baño María (25 °C) 1 / grp
Tubos de ensayo de 15 m$, estéril 2 o temperatura ambiente
Gradilla 1 Mechero Bunsen 1
Micropipeta de 100 µl 2 / grp
Puntas amarillas, estériles
tapón de goma con 2 agujeros 1
Tubo de vidrio doblado (Fig. 1) 1
Tubo de vidrio con tubo de goma 1
Clip para cerrar el tubo de goma 1
Reactivos Cantidad
YNB (6,7 g/$) medio con Glc (20 g/$) 6 m$
Cultivo de levadura 1 m$
Methylene blue (0,2 g/$) 0,2 m$
Aceite comestible (trae estudiante) 1 m$
Jarbón 2 gotas Fig. 1: Tubo de vidrio doblado, tubo corto y tapón de
goma para tubos de ensayo de 15 m$ con 2
Agua
agujeros

- 25 - !
Método
1. Transferir estéril 3 m$ medio YNB con Glc en 1 tubo
de ensayo
2. Transferir 0,5 m$ cultivo de levadura estéril en este
tubo de ensayo
3. Añadir 100 µ$ Methylen blue y mezclarlo
4. Colocar el tubo doblado y el tubo corto con su goma
en los agujeros del tapón de goma
5. Poner agua en el tubo doblado
6. Colocar este conjunto sobre el tubo de ensayo. Los
niveles de agua deben ser equilibrados
7. Cerrar el tubo de goma con un clip (Fig. 2) e incubar
el tubo a 25 °C
8. Tomar el tiempo y observar/documentar el nivel de
agua en el tubo doblado

9. Repetir pasos 1-3 con otro tubo de ensayo

10. Añadir 1 ml de aceite sobre el cultivo
11. Seguir con el paso 6 tomando el conjunto del otro
tubo
Fig. 2: Tubo de ensayo con medio, levaduras,
methylene blue y una capa de aceite. Por la
formación de gas cambió el nivel del agua en el
tubo doblado (manómetro)

Discute el cambio de color en el cultivo y el tiempo en que los niveles de agua cambian,
dependiendo de las condiciones de incubación.

Adicional
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],
densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).
Describe la composición de Yeast Nitrogen Broth (YNB).
2. Diferencia entre respiración aeróbica, respiración anaeróbica y fermentación.
3. Compare el redimiento energético entre respiración (aeróbica) y fermentación (alcohólica).
4. ¿Qué resultado esperarías si se hubiese usado miocitos humanos en vez de levaduras? ¿Cómo
variaría el experimento si la fuente de carbono en vez de glucosa hubiese sido a) piruvato, b)
acetato o c) succinato?

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Bibliografía
1. Measurement of anaerobic respiration in yeast. Supporting practical science & technology.
Cleapss, GL 98 MP 12/09, 2009

Mecanismo de Evaluación
Véase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud Ocupacional

Los medios de crecimiento son son nocivos.
Methylene blue: Nocivo en caso de ingestión. En caso de ingestión lavar la boca con agua e ingerir
agua y pedir asistencia médica. Para su manipulasión usar guantes de nitrilo; en caso de contacto con
la piel, ojos o boca lavar con abundante agua, en caso de inhalación respirar aire fresco. En caso de
que persista el malestar, pedir atención médica. Methylene blue en agua (0,05%) no es considerado
nocivo.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y Biológicos

Todos los desechos que contengan levaduras hay que esterilizar acorde el método aplicable des
laboratorio (p.ej. autoclavar).

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 Práctica 6 - alterna
Si por el Departamento no se ha comprado los reactivos necesarios para llevar a cabo la práctica
como debe ser, se cancelará esta práctica.

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