CRH promueve la proliferación de

células de cáncer de colon humano

a través de
Vía de señalización IL-6 / JAK2 /
STAT3 e inducida por VEGF
angiogénesis tumoral
 El 20% de personas con cáncer
de colon tienen mutaciones
familiares o congénitas en genes
que desencadenar la
Cáncer de colon carcinogénesis a una edad
temprana.

El 80% 20%

restante
desarrollar
cáncer de
colon más
adelante en la
vida no exhibe 80%
ninguna
genética obvia
Hormona liberadora de
corticotropina
Resultados
 Para comprender el papel del eje CRH /
CRHR1 en la progresión del CCR, caracterizó
las expresiones de CRHR1 y sus ligandos CRH
y UCN en tejidos humanos de CCR por
inmunohistoquímica.
 Descubrimos que todos CRHR1, CRH y UCN
se expresaron altamente en carcinomatosos
tejidos en comparación con tejidos normales y
pericarcinomatosos
Análisis de PCR en tiempo real para ARNm de UCN, CRH y CRHR1 en tres tipos de colon líneas
celulares cancerosas (HT29, DLD1 y HCT116) y línea celular epitelial colónica inmortalizada
FHC. El nivel de ARNm de CRH y CRHR1 fue mayor en células DLD1 y HCT116 que en células
FHC.
Análisis de transferencia Western para la proteína CRHR1. La palanca de
proteína de CRHR1 fue mayor en líneas celulares de cáncer de colon que la
línea celular epitelial colónica. Los datos se expresaron en las medias ± S.E.M
.; * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001 versus FHC
El tratamiento con
CRH en células de
cáncer de colon
promovió el
crecimiento celular
y la formación de
colonias.
La viabilidad
celular se detectó
mediante el ensayo
CCK8. El
tratamiento de
CRH durante 48 h
aumentó
significativamente
la viabilidad celular.
El tratamiento de CRH 10 nM promovió la viabilidad celular de ambas dos líneas
celulares, y Antalarmin revirtió el efecto de promoción inducido por CRH.
Tanto las células DLD1 como las HCT116 tratadas con CRH fueron más eficientes en formando
colonias que los controles. Antalarmin atenuó la formación de colonias inducida por CRH. Los
datos se expresaron en las medias ± S.E.M .; * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001 versus
controles; ^ P ≤ 0,05 frente a CRH. Anta, Antalarmin
Análisis de Western blot para expresión y fosforilación de STAT3 en células
DLD1. El tratamiento con CRH indujo un aumento dependiente del tiempo en la
fosforilación de STAT3.
Análisis de transferencia Western para la expresión y fosforilación de JAK2 y
STAT3 en células DLD1 y HCT116. CRH promovió la fosforilación de JAK2 y
STAT3, y Antalarmin podría revertir el efecto de promoción inducido por CRH.
Las células se trataron con el inhibidor de STAT3 Stattic. La acción
inhibidora de Stattic sobre la fosforilación de STAT3 se confirmó
mediante Western blot.
La viabilidad celular
se detectó
mediante el ensayo
CCK8. La estática
inhibió
significativamente
la proliferación
celular inducida por
CRH. Los datos se
expresaron en las
medias ± S.E.M .; *
P ≤ 0.05, ** P ≤
0.01 versus control
S; ^ P ≤ 0.05, ^^ P
≤ 0.01 versus CRH.
Anta, Antalarmi
Análisis de PCR
en tiempo real
para ARNm de IL-
6 en células
DLD1 y HCT116.
CRH aumentó
significativamente
la expresión de
IL-6 en la palanca
de ARNm, y
Antalarmin podría
revertir el efecto
de CRH.
Análisis de transferencia Western para la expresión de IL-6. El
tratamiento de la expresión de IL-6 regulada al alza por CRH de forma
significativa y Antalarmin atenuó la expresión de IL-6 inducida por CRH.
La fosforilación de
JAK2 y STAT3
inducida por CRH
se atenuó cuando
estas células se
incubaron con
anticuerpo de
neutralización
anti-IL-6.
El ARNip de IL-6 se
transfectó en células
DLD1 y HCT116. RT-
PCT y tecnología
Western blot se
utilizaron para confirmar
el efecto de interferencia
del ARNip. El análisis de
transferencia Western
mostró que la
fosforilación de STAT3
inducida por CRH fue
atenuado por
transfección de ARNip
de IL-6.
El medio acondicionado de
células tratadas con CRH indujo
la fosforilación de STAT3, y el
efecto se invirtió por anticuerpo
de neutralización anti-IL-6. Los
datos se expresaron en las
medias ± S.E.M .; * P ≤ 0.05, **
P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001 versus
controles; ^ P ≤ 0,05, ^^ P ≤
0.01, ^^^ P ≤ 0.001 versus
CRH. Anta, Antalarmin;
anticuerpo de neutralización
anti-IL-6, anti-IL-6; siIL-6, IL-6
siARN
Análisis de transferencia
Western para la
fosforilación de la
subunidad P65 en células
HCT116. CRH aumentó la
fosforilación de P65 de
una manera dependiente
del tiempo.
La
fosforilación
de P65
inducida por
CRH fue
atenuada por
el
pretratamiento
con
Antalarmin.
Las células se
trataron con el
inhibidor de NFκB
CAPE, que
disminuyó
significativamente
la expresión de IL-
6 inducida por
CRH.
La extracción nuclear y la
inmunotransferencia contra
NF-κB en células DLD1 y
HCT116 mostraron una
translocación nuclear de
NFκB significativamente
disminuida en células
tratadas con CAPE. Los
datos se expresaron en las
medias ± S.E.M .; * P ≤ 0.05,
** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001
versus controles; ^ P ≤ 0.01,
^^ P ≤ 0.01, ^^^ P ≤ 0.001
versus CRH. Anta, Antalarmin
Análisis de PCR
en tiempo real
para ARNm de
VEGF expresión
en células DLD1
y HCT116. El
tratamiento con
CRH aumentó
de forma
dependiente del
tiempo la
expresión de
VEGF en el nivel
de ARNm.
La CRH inducida La expresión de ARNm de VEGF fue atenuada por
Antalarmin.
El análisis ELISA
para VEGF mostró
que CRH aumentó
significativamente
el VEGF secreción
en medio celular.
Tanto el
pretratamiento con
Antalarmin como
con CAPE
atenuaron
significativamente
la secreción de
VEGF inducida por
CRH. (RE)
Se mostraron ejemplos representativos de formación de tubos. El medio
acondicionado de células HCT116 tratado con CRH promovió la formación de
tubos de HUVEC y Antalarmin revirtieron el efecto de promoción inducido por
CRH
Las células se transfectaron con ARNip de VEGF. La eficacia de la interferencia del ARN se
examinó mediante RT-PCR. La transfección de ARNip de VEGF inhibió la formación de tubos
inducida por CRH. Los datos se expresaron en las medias ± S.E.M .; * P ≤ 0.01, ** P ≤ 0.001
versus controles; ^ P ≤ 0.01, ^^ P ≤ 0.01, ^^^ P ≤ 0.001 versus CRH. Anta, Antalarmin; siVEGF,
VEGF siARN; CM, medio acondicionado.
Modelo esquemático de
crecimiento celular inducido
por CRH y angiogénesis
tumoral en células de
cáncer de colon. IL6 y
VEGF inducidos por CRH
expresión activando NF-κB.
La IL-6 inducida por CRH
desencadenó la activación
de la vía de señalización
JAK2 / STAT3, lo que
resultó en un
aumentoproliferación.
Angiogénesis tumoral
acelerada por VEGF
potenciada con CRH
Bibliografía

 1. Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A. Global cancer
statistics. CA Cancer J Clin. 2012;65:87–108.
 2. Rao CV, Yamada HY. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the
perspective of genes. Front Oncol. 2013;3:130.
 3. Perrin MH, Vale WW. Corticotropin releasing factor receptors and their ligand family.
Ann NY Acad Sci. 1999;885:312–328.
 4. Orth DN. Corticotropin-releasing hormone in humans. Endocr Rev. 1992;13:164–
191.
 5. Paschos KA, Kolios G, Chatzaki E. The corticotropin-releasing factor system in
inflammatory bowel disease: prospects for new therapeutic approaches. Drug Discov
Today. 2009;14:713–720.