Método de tinción de raíces de Phillips y Hayman (1970) modificada:

Protocolo de tinción con azul tripán

 Lavar las raíces con abundante agua a efectos de eliminar todas las partículas
de suelo. Se recomienda utilizar un colador o tamiz a efectos de evitar pérdidas
de material radical

 Colocar las raíces en un recipiente con tapa, resistente a la temperatura en el

cual las raíces se distribuyan en las soluciones sin estar comprimidas

 Colocar KOH 10% (de modo tal que las raíces estén totalmente cubiertas)
durante 30 min, 60 °C (o toda la noche a temperatura ambiente). Puede
utilizarse baño Maria o estufa.

 Retirar las raíces del KOH y lavar con abundante agua cuidando de no perder
el material radical

 Acidificar las raíces con (HCl 0,1 N), opcional

 Colocar las raíces nuevamente en el recipiente y agregarles solución de azul

tripán (0,05%) en lactoglicerol (ácido láctico, glicerol, agua destilada 1:1:1) (de
modo tal que las raíces estén totalmente cubiertas) durante 15 min a 90 °C).

 Las raíces teñidas pueden ser conservadas en la solución de tinción. Otra

alternativa es retirar la solución de tinción y agregarles agua destilada (quedará
entonces una solución de tinción diluida).

Preparación de las soluciones

- KOH 10%= Pesar 100 g de KOH en escamas o perlas y adicionarlos en un frasco de

vidrio con 800 mL de agua destilada. Luego de la completa disolución del soluto,
completar con agua destilada hasta alcanzar 1 L. Tener cuidado que la reacción es
exotérmica, por lo tanto, la solución aumentará su temperatura.

- HCl 0,1 N: colocar 8,3 mL de solución concentrada de HCl (37% en 800 mL de agua
destilada, homogeneizar la solución, completar con agua destilada hasta alcanzar 1 L.
Para el pipeteado de HCl incorporar una perilla de Pipeteado de seguridad en la pipeta
de vidrio (no pipetear con la boca)

- Azul tripán en lactoglicerol: preparar una solución de lactoglicerol conformada por

ácido láctico, glicerol, agua destilada (1:1:1 V:V:V); homogeneizar la solución. Colocar
azul tripán en proporción 0,05 g/100 mL solución. Se recomienda preparar esta
solución con anterioridad a la tinción ya que las partículas de azul tripán pueden
demorar en disolverse. Puede requerirse mezclado de la solución para una mejor
disolución.
_ Raíces finas y de plántulas de pocos días de emergencia requerirán menos
tiempo de clarificación (3-5 minutos). Raíces viejas y suberizadas de plantas
adultas requerirán más tiempo de clarificación.
_ Si luego de la clarificación con KOH las raíces aún permanecen pigmentadas,
es probable que se requier adicionalmente una clarificación con H2O2 al 10% o
20% dependiendo del grado de suberización de las raíces, de
aproximadamente 5 minutos. Puede utilizarse también NaOCl de uso
doméstico, diluido al 50% o diferentes concentraciones dependiendo de la
pigmentación de las raíces. Este procedimiento se realiza luego de la
clarificación con KOH y antes de la tinción.
Antes y después de la utilización de H2O2 o NaOCl las raíces deben ser
enjuagadas con agua. La decoloración con H2O2 es más lenta que con NaOCl,
pero con H2O2 hay menos riesgo de destrucción total de los tejidos fúngicos y
vegetales.
_ Tiempo aproximado de duración del proceso de tinción: 1Hora.