INFORME - Proyecto de Investigación 2021A

LIC.
EN BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
Fraccionamiento y análisis de los extractos crudos de Prosopis juliflora y Vachellia
farnesiana por cromatografía
1. Introducción
Los productos naturales de origen vegetal han sido fuente de agentes terapéuticos durante miles de años, una
cantidad impresionante de drogas modernas se han derivado de estas fuentes. Para el año 2000,
aproximadamente el 60-80% de todas las sustancias empleadas en los ensayos como antibacterianos y anti
cáncer tuvo origen natural (Craag, 2000). Las plantas poseen la capacidad de sintetizar metabolitos
secundarios como resultado de su metabolismo, que se pueden extraer como fitoquímicos. Los metabolitos
secundarios son producto de numerosas rutas biosintéticas a través de las cuales se sintetizan y acumulan en
los órganos de las plantas. Estos metabolitos comprenden una rama muy extensa de compuestos y especies
químicas que van desde terpenoides, flavonoides, compuestos aromáticos, cumarinas, alcaloides, entre otros.
(Zacoma-Montañez et al., 2010). La presencia de alcaloides en diferentes partes de las plantas puede explicar
las propiedades medicinales que se le atribuyen como anticancerígeno y, su actividad antimicrobiana, entre
otras. (Chang et al., 2003). De acuerdo con Alonso-Castro et al., (2011), las fabáceas son una de las familias
registradas que contienen una mayor cantidad de especies vegetales con actividad anticancerígena probada
in vitro. Diferentes especies del género Prosopis que pertenece a las Fabáceas, se han asociado a diversas
bioactividades, se ha reportado que extractos de P. alpataco, P. argentina y P. chilensis, tienen propiedades
de unión al DNA debido a la presencia de alcaloides (Henciya et al., 2016). Un estudio de un extracto alcaloideo
de P. Juliflora, mostró actividad antibacterial (Ahmad, 1995) y una alta actividad citotóxica contra células Molt-
4 (células T de leucemia humana), y baja toxicidad en células linfocíticas normales (Sathiya & Muthuchelian,
2011). Para el caso del género Vachellia, hay menor información respecto a la composición química de las
especies, debido a la extensión del género. En el caso particular de V. farnesiana, se reporta su empleo en la
medicina tradicional para tratar casos de dispepsia, inflamaciones de la piel, trastornos del sistema nervioso,
disentería, tuberculosis, dolor abdominal, ictericia, dolor de muelas, fiebre tifoidea, hemorragias, artritis,
conjuntivitis y malaria (Willd, 1806). Sin embargo, se ha reportado la presencia de alcaloides, flavonoides,
terpenoides y saponinas principalmente en las hojas y los tallos (Sanjay et al., 2013). Vachellia farnesiana y
Prosopis juliflora, son plantas reportadas con uso en la medicina tradicional y adicionalmente, pertenecen a
una de las familias con mayor número de reportes de bioactividades in vitro, y el género al que pertenecen han
presentado evidencia de actividad anticancerígena, haciendo de estas especies vegetales excelentes
candidatas para la obtención de metabolitos secundarios bioactivos.
2. Objetivos
2.1 Objetivo general: Obtener fracciones enriquecidas de alcaloides derivadas de extractos crudos de P.
juliflora y V. farnesiana.
2.2 Objetivos particulares:

● Obtener extractos clorofórmicos de P. juliflora y V. farnesiana.
● Evaluar diferentes sistemas de solventes para la obtención de fracciones enriquecidas en alcaloides.
● Determinar e identificar el contenido de alcaloides presentes en los extractos y sus fracciones por
medio de agentes reveladores.
3. Metodología
3.1 Material vegetal. Los foliolos de ejemplares adultos de P. juliflora y V. farnesiana serán colectadas y
ultracongeladas por 24 horas, posteriormente serán secadas por liofilización durante 24 horas.
3.2 Elaboración del extracto crudo. Muestras secas de biomasa (foliolos), serán pulverizadas con ayuda de un
mortero, posteriormente las muestras se mezclarán con etanol en una proporción 1:30 (p/v) y, se mantendrán
en agitación constante a 100 rpm durante 24 h. Al término del periodo, se realizará una extracción asistida con
baño ultrasónico a 40 °C y 53 KHz durante 40 minutos. Esta mezcla se filtrará y se recuperará el sobrenadante,
el cual pasará por un proceso de desengrasado, en un embudo de separación, empleando hexano en
volúmenes iguales, recuperándose la parte inferior que contendrá el extracto libre de lípidos. El extracto será
www.uaemex.mx/fciencias
Facultad de Ciencias
Campus Universitario “El Cerrillo”, El Cerrillo Piedras Blancas, Carretera Toluca-Ixtlahuaca km. 15.5 C.P. 50200 Toluca, Estado de México
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
LIC. EN BIOTECNOLOGÍA
concentrado en presión reducida y reconstituido en agua, después será particionado en un embudo de
separación para remover los compuestos más polares, empleando cloroformo en volúmenes iguales,
colectándose la fracción orgánica, este proceso se repetirá por triplicado y se mezclarán los extractos
obtenidos, la mezcla será concentrada al vacío. El extracto orgánico será particionado con una solución al 1%
de NaCl para parcialmente remover taninos, el extracto resultante será llevado a sequedad con presión
reducida y a peso constante, éste se almacenará en frascos ámbar a 4 °C, hasta su uso.
3.3 Fraccionamiento del extracto crudo. Los extractos serán fraccionados por cromatografía en columna
empleando como adsorbente gel de sílice de 60-200 mallas. El proceso de elución se efectuará con una mezcla
de cloroformo:metanol iniciando con proporciones 99:1 hasta 70:30. Se recuperarán fracciones de 5 mL las
cuales se analizarán por cromatografía en capa fina y se combinarán aquellas que tengan perfiles
cromatográficos similares.
3.4 Análisis de las fracciones. Cada fracción será analizada por cromatografía en capa fina, empleando como
sistema de elución una mezcla cloroformo-metanol en proporciones 80:20, 85:15, 90:10, 95:5 y usando como
agentes reveladores a la luz ultravioleta de onda corta y larga, vapores de yodo, reactivo de Dragendorff,
reactivo de Mayer y reactivo de Wegner, combinándose aquellas fracciones cromatográficamente similares,
finalmente, se llevarán a sequedad y se almacenarán en frasco ámbar para su posterior uso.
3.5 Cuantificación de alcaloides en el extracto crudo y sus fracciones. A los extractos crudos y las fracciones,
se les determinará el contenido de alcaloides empleando una solución de verde de bromocresol, dando lugar
a la formación de un complejo de transferencia de carga alcaloide-verde de bromocresol, a pH 4.7 de color
amarillo, susceptible de una determinación espectrofotométrica a 470 nm, el cual será expresado en miligramos
de equivalentes de atropina por g de biomasa (mg EC g-1), para la curva de calibración se empleará una
solución patrón de atropina.
3.6 Análisis estadístico. Las determinaciones del contenido de alcaloides se realizarán por triplicado, y los datos
resultantes serán sujetos a un análisis de varianza y la comparación de medias por la prueba de Tukey
(p<0.05).
4. Calendario de actividades:
Actividad Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5
Revisión bibliográfica
Colecta y secado de materia vegetal
Elaboración de extractos
Fraccionamiento de los extractos
Análisis de las fracciones con agentes reveladores
Cuantificación de alcaloides
Escritura del informe
5. INFORME
Gran parte de los medicamentos se obtiene por síntesis química la mayoría de las estructuras principales están
basadas en productos naturales (Bermúdez et al., 2005). Aproximadamente el 60% de los compuestos
anticancerígenos y el 75% de los antimicrobianos son productos naturales o derivados de éstos (Cragg y Newman,
2005).
En el metabolismo de las plantas hay una variedad de moléculas orgánicas que no tienen una función directa en
procesos como respiración, fotosíntesis o transporte de nutrientes; conocidas como metabolitos secundarios (Ávalos
García y Pérez-Urria Carril, 2009).
Estos compuestos del metabolismo son sintetizados por las plantas y utilizados como protección química.
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
Los metabolitos secundarios no están presentes en todas las partes de la especie vegetal en igual concentración, ni
de igual manera en todas las especies vegetales, su producción suele estar acotada a un grupo taxonómico en
particular (Pérez Alonso y Jiménez, 2011).
Existe también una variedad estructural dentro de un mismo grupo de metabolitos secundarios, originadas por distintas
reacciones químicas, lo que lleva a que aparezcan diferentes concentraciones de los mismos entre especies, entre
individuos de una población y hasta entre distintos órganos de una planta (Sepúlveda Jiménez et al., 2003).
Estos metabolitos secundarios se pueden extraer como fitoquímicos, como lo son terpenoides, flavonoides,
compuestos aromáticos, cumarinas, alcaloides, entre otros.
Este procedimiento incluye una serie de métodos de detección de los diferentes grupos químicos de la especie vegetal
a estudiar basados en extracciones con solventes y la posterior aplicación de pruebas cuantitativas para confirmar la
presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas (Lock de Ugaz, 2001).
Estudios realizados con alcaloides presentes en extractos de Prosopis juliflora han demostrado el efecto antimicrobiano
de éstos sobre Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli, Pseudomona
aeruginosa y Salmonella choleraesuis (dos Santos et al., 2013); sin olvidar que también presentan actividad
antimicrobiana y anticancerígena.
Para Vachellia farnesiana se reporta su empleo en la medicina tradicional para tratar casos de inflamaciones de la piel,
trastornos del sistema nervioso, tuberculosis, dolor abdominal, dolor de muelas, fiebre tifoidea, hemorragias, artritis,
conjuntivitis y malaria.
5.1 COLECTA Y SECADO DEL MATERIAL VEGETAL

Una vez que se consiguieron los foliolos de P. juliflora y V. farnesiana fueron ultracongelados y secados por liofilización,
ambos por 24 horas, lo que nos da un total de 48 horas.
Para así conservar a nuestro material vegetal junto con sus propiedades.
*En este informe se hablará sobre Vachellia farnesiana, debido a que se realizó el extracto de esta*
5.2 ELABORACIÓN DE EXTRACTOS

Una vez obtenida la biomasa seca, se utilizaron 10 mg de las especies vegetales que posteriormente fueron
pulverizadas y después se mezclaron con etanol (1:30 (p/v)), manteniéndose en agitación constante a 100 rpm durante
24 h.; para después obtener la primera extracción con baño ultrasónico a 40 °C y 53 KHz durante 40 minutos.
La mezcla se filtró al vacío utilizando 35 mL de agua destilada y 20 mL de etanol, y se recuperó el sobrenadante, que
pasó por un un proceso de desengrasado con ayuda de un embudo de separación, empleando hexano en volúmenes
iguales, esto con el fin de quitar grasas y ceras, recuperando la parte inferior. (Imagen 1)
Imagen 1. Extracto con hexano

de Vachellia farnesiana
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
El extracto se concentró en presión reducida y reconstituido en agua con ayuda de un rotavapor y de las condiciones
específicas para extraer el etanol. (Imagen 2)
Imagen 2. Extracto de Vachellia farnesiana

después de extracción de etanol
Se realizaron más extracciones, que son explicadas en la tabla 1, así como la metodología que sigue para el siguiente
informe (infome 2).
Tabla 1. Extracciones de Vachellia farnesiana con diferentes solventes.

SOLVENTE UTILIZADO INFORMACIÓN SOBRE ESTA IMAGEN DEL EXTRACTO
PARA LA EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN Y DISCUSIÓN DE ESTA
Cloroformo - Utilizado para remover los
compuestos más polares.
- 1:10
- Se realizó por triplicado (40 mL,
30 mL, 30 mL).
- Volúmenes iguales de cloroformo
y agua.
- Finalmente, se extrajo con agua
debido a que fue más exitosa así
la extracción. Estos lavados
ayudaron a que se quitaran los
compuestos más polares en un
menor tiempo comparado a si
solo se esperaba a que se
separaran; incluso se agregó
poca sal para hacerlo aún más
eficientemente.
- Se colectó fracción orgánica.
Imagen 3. Extracto con cloroformo

de Vachellia farnesiana
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
NaCl 1% - Se utiliza el extracto orgánico
recuperado de la extracción con
cloroformo.
- Utilizado para remover taninos.
- La obtención de este extracto
duró mucho más, esto también se
debe a las propiedades de
Vachellia farnesiana.
- Aquí el solvente se estuvo
usando para realizar lavados, y
poco a poco ir quitando partes
que no nos interesaban, como los
que son solubles en agua.
- Finalmente, después de muchos
lavados con NaCl, se pudo
extraer una gran porción de este
extracto.
- Este extracto se llevó a sequedad
con presión reducida y a peso
constante, para finalmente ser Imagen 4. Extracto con Nacl (1%)
almacenado en un frasco ámbar. de Vachellia farnesiana
5.3 FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS

El extracto de Vachellia farnesiana fue fraccionado por cromatografía en columna. Se recolectaron aproximadamente
35 fracciones de 4 mL cada una; las cuales se analizaron por cromatografía en capa fina y se observó que varias de
estas fracciones tenían los mismos perfiles cromatográficos, por lo que se combinaron dejando solo 8 fracciones.
Imagen 5. Fraccionamiento por cromatografía en capa fina de Vachellia farnesiana
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
5.4 ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES

Seis eluyentes con proporciones diferentes de cloroformo-metanol fueron analizados por cromatografía en capa fina.
Se analizaron los extractos de las dos especies vegetales y se determinó que el mejor sistema de elución fue de 97:3,
debido a que este separó de una mejor forma a los diferentes grupos presentes en el extracto.
Imagen 6. Análisis de eluyentes por TLC de extractos de Prosopis julifora y Vachellia farnesiana
Las placas fueron sometidas con agentes reveladores, el primero fue luz ultravioleta de onda larga y de onda corta. En
la imagen 7 en el inciso a se observa que los alcaloides tienen propiedad de ser fluorescentes.
a) b)
Imagen 7. TLC sometida a luz ultravioleta a) onda larga b) onda corta
El reactivo de Dragendorff fue utilizado como el segundo agente revelador. El precipitado color naranja indica resultados
positivos para alcaloides. Este reactivo se utilizó en las fracciones de las dos especies vegetales, donde se puede
observar en la imagen 8 que el resultado fue positivo para ambas especies.
Cada fracción fue comparada con un control positivo y uno negativo, esto para verificar los resultados del reactivo.
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
a) b)
Imagen 8. Reactivo de Dragendorff en fracciones de a) Prosopis juliflora y b) Vachellia farnesiana
El tercer revelador fue el reactivo de Mayer, donde la formación de un precipitado blanco indicaba un resultado positivo
para alcaloides. En la imagen 9 se observa que hubo ausencia de la formación de este precipitado blanco, por lo que
el resultado fue negativo para este reactivo. Se cree que la preparación del reactivo fue incorrecta; aunque por el otro
lado está la posibilidad de que sea un falso negativo en el resultad, que es común para este reactivo.
Imagen 9. Reactivo de Mayer en fracciones de a) Prosopis juliflora y b) Vachellia farnesiana
5.5 CUANTIFICACIÓN DE ALCALOIDES

1 mL de cada fracción de Vachellia farnesiana se puso en embudos de separación diferentes, a los cuales se les añadió
5 mL de verde de bromocresol y 5 mL de buffer con pH 4.7. Se formó el complejo alcaloide-verde y se extrajo con
cloroformo hasta obtener 10 mL del complejo. El cual fue determinado espectrofotométricamente con absorbancia
máxima de 470 nm.
Imagen 10. Reacción de alcaloides con verde de bromocresol
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
En la tabla 2 se muestra la cantidad de alcaloides en mg EA g-1 del extracto de Vachellia farnesiana y sus fracciones.
Donde se observa que la fracción con mayor cantidad de alcaloides fue la fracción 5. A la derecha de esta tabla, se
encuentra la tabla 3, en donde solo se muestra la cantidad de alcaloides totales en mg EA g-1 del extracto de Prosopis
juliflora, donde por motivos de tiempo no fueron cuantificadas las fracciones de esta especie.
Para ambos extractos, no se realizó ninguna repetición; por lo que en ambas tablas (2 y 3) solo se muestran resultados
de la única cuantificación.
mg EA g-1 mg EA g-1
Extracto V. Extracto P.
9.8 14.37
farnesiana juliflora
Tabla 3. Cuantificación de alcaloides (mg EA g-1)

Fracción 1 0.02 del extracto de Prosopis juliflora
Fracción 2 0.63
Fracción 3 0.42
Fracción 4 0.28
Fracción 5 2.27
Fracción 6 1.34
Fracción 7 0.30
Fracción 8 0.13
Tabla 2. Cuantificación de alcaloides (mg EA g-1) del

extracto y fracciones de Vachellia farnesiana
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556
En el gráfico 1 está representada la curva de calibración donde se utilizó una solución patrón de atropina con una
R2=0.9945
Curva de calibración
0.25
Absorbancia (470 nm)
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 5 10 15 20 25
Concentración (μg/mL)
Gráfico 1. Curva de calibración (solución patrón de atropina)
CONCLUSIONES
✓ Se obtuvieron 8 fracciones representativas en columna cromatográfica de los extractos crudos.
✓ El sistema de eluyente para los extractos crudos que muestra una mayor separación entre las bandas es una
mezcla cloroformo-metanol en una proporción 97:3.
✓ Los extractos crudos, así como las fracciones obtenidas de estos extractos, muestran la presencia de
alcaloides.
✓ El extracto crudo de P.juliflora tiene un contenido de alcaloides de 14.37 mg EA g -1 .Por otra parte el
contenido de alcaloides en V. farnesiana es de 9.8 mg EA g-1; el cual es menor que el de P. juliflora.
✓ De las fracciones determinadas, la fracción número 5 del extracto de Vachellia farnesiana es la que contiene
el mayor contenido de alcaloides (2.27 mg EA g-1).
6 Referencias bibliográficas
Ahmad A, Ahmad V, Khalid SM, Siddiqui SA, Khan KA (1995). Study of the antibacterial therapeutic efficacy of juliflorine, julifloricine and a benzene insoluble alkaloidal.
Journal of Islamic of Sciences 8(3): 131-136.
Alonso-Castro AJ, Salazar-Olivo LM, Gómez-Sánchez LA, Domínguez F & García-Carranca A (2011) Mexican medicinal plants used for cancer treatment:
Pharmacological, phytochemical and ethnobotanical studies. Journal of Ethnopharmacology, 133(3), 945–972
Ávalos García, A.; Pérez-Urria Carril, E. 2009. Metabolismo secundario de plantas. Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3): 119-145.
Bermudez, A.; Oliveira-Miranda, M.A.; Velazquez, D. 2005. La Investigación etnobotánica sobre plantas medicinales: Una revisión de sus objetivos y enfoques actuales.
INCI [online], vol. 30, n. 8 pp. 453-459. Disponible en: . ISSN 0378-1844.
Cragg GM, Newman DJ (2001) Natural product drug discovery in the next millennium. Pharm. Biol. 39, 8–17.
Cragg, G.M.; Newman, D.J. 2005. Plants as a source of anti-cancer agents. J. Ethnopharmacol. 100(1-2):72-79.
Chang YC, Chang FR, Khalil AT, Hsieh PW, Wu YC (2003) Cytotoxic benzophenanthridine and benzylisoquinoline alkaloids from Argemone mexicana. Z. Naturforsch-C.
58, 521-526.
Henciya S, Seturaman P, James AR, Tsai Y-H, Nikam R, Wu Y-C, … Chang FR (2017) Biopharmaceutical potentials of Prosopis spp. (Mimosaceae, Leguminosa). Journal
of Food and Drug Analysis, 25(1): 187-196.
dos Santos, E.; Pereira, M. L.; da Silva, C.; Souza-Neta, L.; Geris, R.; Martins, D.; Santana, A.; Barbosa, L.; Silva, H.; Freitas, G.; Figueiredo, M.; de Oliveira, F.; Batista,
R. 2013. Antibacterial activity of the alakaloid-enriched extract from Prosopis juliflora pods and its influence on in vitro ruminal digestion. Int. J. Mol. Sci 14:8496- 8516.
Lock de Ugaz, O. 2001. Análisis fotoquímico y metabolitos secundarios. En: Manual de Fitoterapia. Revisoras: Villar López, M.; Mesa Ramos, M.; Pimentel, O.G.
Organización Panamericana de la Salud. EsSalud. Lima; Perú. ISBN 9972-785-34-3. OPS/ PER/01,11. 41-43.
Pérez-Alonso, N.; Jiménez, E. 2011. Producción de metabolitos secundarios de plantas mediante el cultivo in Vitro. Biotecnología Vegetal Vol. 11, No. 4: 195-211.
Sanjay RB, Bhagyashri D (2013) Extraction of some secondary metabolites & thin layer chromatography from different parts of Acacia fernesiana L. Journal of Pharmacy
and Biological Sciences, 7 (5).
Sathiya M, Muthuchelian K (2011) Anti-tumor potential of total alkaloid extract of Prosopis juliflora DC. leaves against Molt-4 cells in vitro. African Journal of Biotechnology,
10(44), 8881–8888.
Sepúlveda Jiménez, G.; Porta Ducoing, H.; Rocha Sosa, M. 2003. La participación de los metabolitos secundarios en la defensa de las plantas. Revista Mexicana de
Fitopatología, A.C. 21 (003):355-363.
Willd L (1806) Acacia fernesiana, Species Plantarum. Editio quarta 4 (2): 1083-1084.
Zamacon XX, Castro E (2010) Identificación y obtención de alcaloides en variedades de mezquite (Prosopis juliflora y Prosopis pallida). Verano de la Ciencia. Universidad
Autónoma de Guanajuato. Recuperado de https://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-
2010/12%20Verano%20Ciencia%20Region%20Centro/UAQ%20Zamacona%20Montannez.pdf
Tel/fax (722) 2965554 y 2965556

INFORME - Proyecto de Investigación 2021A

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

INFORME - Proyecto de Investigación 2021A

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

LIC.

2.2 Objetivos particulares:

5.1 COLECTA Y SECADO DEL MATERIAL VEGETAL

5.2 ELABORACIÓN DE EXTRACTOS

Imagen 1. Extracto con hexano

Imagen 2. Extracto de Vachellia farnesiana

Tabla 1. Extracciones de Vachellia farnesiana con diferentes solventes.

Imagen 3. Extracto con cloroformo

5.3 FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS

Imagen 5. Fraccionamiento por cromatografía en capa fina de Vachellia farnesiana

5.4 ANÁLISIS DE LAS FRACCIONES

Imagen 7. TLC sometida a luz ultravioleta a) onda larga b) onda corta

Imagen 8. Reactivo de Dragendorff en fracciones de a) Prosopis juliflora y b) Vachellia farnesiana

Imagen 9. Reactivo de Mayer en fracciones de a) Prosopis juliflora y b) Vachellia farnesiana

5.5 CUANTIFICACIÓN DE ALCALOIDES

Imagen 10. Reacción de alcaloides con verde de bromocresol

Tabla 3. Cuantificación de alcaloides (mg EA g-1)

Tabla 2. Cuantificación de alcaloides (mg EA g-1) del

También podría gustarte