Máster en Biotecnología para la Salud y la Sostenibilidad

Biotecnología Ambiental

Informe de prácticas
Biorremediación de ecosistemas contaminados con petróleo
mediante el uso de Pseudomonas aeruginosa y su capacidad
para producir biosurfactantes

Oriana Cárdenas González

Rim Zerrouki

Junio, 2020
ÍNDICE
1. Introducción y justificación.......................................................................................................
1.1. Planteamiento del problema...............................................................................................
1.2. Biorremediación.................................................................................................................
1.3. Biosurfactantes...................................................................................................................
1.4. Pseudomonas aeruginosa..................................................................................................
1.5. Genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa...............................................................
1.6. Justificación.......................................................................................................................
2. Objetivos.................................................................................................................................
2.1. Objetivo general...............................................................................................................
2.2. Objetivos específicos.......................................................................................................
3. Diseño de trabajo.....................................................................................................................
3.1. Recolección de las muestras............................................................................................
3.2. Diseño del medio de cultivo y condiciones de cultivo....................................................
3.3. Aislamiento de microorganismos....................................................................................
3.3.1. Aislamiento y cribado de cepas productoras de biosurfactantes y degradantes
del petróleo..............................................................................................................................
3.4. Medición de producción de biosurfactantes....................................................................
3.4.1. Dispersión de aceite..................................................................................................
3.4.2. Tensión superficial...................................................................................................
3.5. Producción de biosurfactantes de interés (ramnolípidos)................................................
3.6. Aislamiento de RNA y trascripción inversa....................................................................
3.7. Comprobación de identidad del microorganismo y análisis de expresión génica
utilizando PCR cuantitativa........................................................................................................
3.8. Análisis de los datos de expresión génica........................................................................
3.9. Análisis estadístico..........................................................................................................
4. Discusión.................................................................................................................................
5. Referencias bibliográficas.......................................................................................................

2
 1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN
1.1. Planteamiento del problema
Una gran variedad de productos químicos orgánicos tóxicos, como los hidrocarburos
que se encuentran en el petróleo, se introducen inadvertidamente o deliberadamente en el
medio ambiente. Estos ingresan al medio ambiente con frecuencia y en grandes cantidades a
través de numerosas rutas que conducen a desastres ecológicos (Pao-Wen et al., 2011).

1.2. Biorremediación
Una de las áreas donde la biotecnología es muy importante es la biorremediación
(Landa-Acuña et al., 2020), donde la biorremediación se define como un proceso natural
donde los microrganismos transforman contaminantes ambientales en productos finales
inofensivos, y que contribuye al desarrollo sostenible (Abdulsalam, Bugaje, Adefila y
Ibrahim, 2011; Landa-Acuña et al., 2020). Para que la biorremediación sea efectiva, los
microorganismos deben atacar enzimáticamente a los contaminantes y convertirlos en
productos inofensivos (generalmente dióxido de carbono y agua) (Abdulsalam et al., 2011).
La biorremediación implica el uso de mecanismos que han demostrado ser hasta un
80% más económicos que los métodos químicos tradicionales (Benítez-Campo, 2011). Esta
consiste es un conjunto de procedimientos para el tratamiento biológico de contaminantes
ambientales que requieren organismos vivos como plantas y microorganismos (en particular
bacterias y hongos) que degradan y/o transforman contaminantes peligrosos para el medio
ambiente (Benítez-Campo, 2011).
Existen dos enfoques principales para la biorremediación de suelos contaminados con
petróleo, la bioestimulación y la bioaugmentación. La bioestimulación implica el ajuste de
factores físicos y químicos, entre estos el pH, temperatura, contenido de humedad, contenido
de nutrientes, entre otros, del suelo, los cuales pueden impedir la tasa de biodegradación de
contaminantes por parte de los microorganismos autóctonos del sitio afectado. La
bioaugmentación, en cambio, considera la adición de poblaciones de altas concentraciones de
microbios en un sitio contaminado para mejorar la tasa de biodegradación de contaminantes
en el suelo o agua afectados (Abdulsalam et al., 2011).
La concentración y diversidad de la comunidad microbiana, así como la velocidad de
transformación de los contaminantes está influenciada por diversos factores (León, 2008),
entre los cuales se mencionan los siguientes:
 Necesidad de nutrientes: el metabolismo estrictamente microbiano está orientado al
cumplimiento de sus funciones vitales y requiere que los constituyentes químicos se

3
 encuentren disponibles para su acumulación y síntesis. Los nutrientes principales
requeridos son el fósforo y el nitrógeno (León, 2008).
 pH del suelo: afecta significativamente en la actividad microbiana. El crecimiento de
la mayor parte de los microorganismos heterotróficos es óptimo dentro de un intervalo
de pH entre 6 y 8. Así mismo, el pH también afecta directamente la solubilidad del
fósforo y el transporte de los metales pesados en el suelo (León, 2008).
 Temperatura: generalmente las especies bacterianas crecen a intervalos amplios de
temperatura, entre 15 y 45ºC (condiciones mesófilas), decreciendo la biodegradación
por desnaturalización de las enzimas a temperaturas superiores a 40ºC e inhibiéndose
a inferiores a 0ºC (León, 2008).
 Humedad: los microorganismos requieren unas condiciones mínimas de humedad
para su crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como
medio de transporte a través del cual los compuestos orgánicos y nutrientes son
movilizados hasta el interior de las células. Un exceso de humedad inhibirá el
crecimiento de las bacterias al reducir la concentración de oxígeno en el suelo (León,
2008).
 Estructura química del hidrocarburo: la biodegradación de un hidrocarburo depende,
en gran medida, de su estructura molecular. Siendo los parámetros que más van a
afectar la halogenación, la existencia de ramificaciones, la baja solubilidad en el agua
y el peso molecular, condicionando la susceptibilidad de los hidrocarburos para ser
degradados (León, 2008).

1.3. Biosurfactantes
Los biosurfactantes son compuestos anfifílicos, los cuales tienen una composición
molecular hidrofílica e hidrofóbica. La estructura de la parte polar de la molécula puede ser
un carbohidrato, un aminoácido, un grupo fosfato o algún otro compuesto. En muchos casos,
la síntesis de las estructuras moleculares hidrofílicas e hidrofóbicas deriva directamente del
metabolismo primario (León, 2008).
Los biosurfactantes son moléculas producidas por microorganismos y presentan una
alta actividad de superficie y propiedades emulsificantes, generalmente son metabolitos
secundarios excretados por los microorganismos, y su principal papel fisiológico es el de
permitir crecer a los microorganismos en sustratos inmiscibles en agua mediante la reducción
de la tensión superficial de la interfase (Sulbarán et al., 2005).

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 Las rutas metabólicas envueltas en la síntesis de precursores de biosurfactantes son
diversas y algunas dependen de la naturaleza y fuente de carbono. Cuando los surfactantes
son sintetizados a partir de un carbohidrato como sustrato, las principales rutas de síntesis en
el metabolismo de los microorganismos son la glicolítica y la lipogénica. Inversamente,
cuando se utiliza un hidrocarburo, el flujo del metabolismo microbiano es lipolítico y
glucogénico. Estos dos casos nunca podrían considerarse excluyentes y pueden realizarse
simultáneamente (León, 2008).
Según su composición química y su origen microbiano los biosurfactantes se
clasifican en: aniónicos (grupo activo con carga negativa), con grupos carboxilos como
porción hidrófila, y no aniónicos (ésteres), y según su naturaleza bioquímica, los
biosurfactantes se clasifican en: glicolípidos, lipopéptidos y lipoproteínas, fosfolípidos y
ácidos grasos, surfactantes poliméricos y partículas surfactantes (León, 2008).
En cuanto a la aplicación biotecnológica de los biosurfactantes, la utilización de estos
compuestos parece tener más potencial que los tensioactivos de síntesis química, debido a la
mayor diversidad estructural, biodegradabilidad y biocompatibilidad que estos poseen. La
biodegradación de hidrocarburos por comunidades microbianas nativas es el mecanismo
primario por el cual los hidrocarburos contaminantes son removidos del ambiente. No
obstante, se ha demostrado que la adición de estimulantes y/o precursores de biosurfactantes
a las poblaciones bacterianas endógenas, aumenta la tasa de degradación de hidrocarburos
más que adicionándole nutrientes (León, 2008). Los surfactantes microbiológicos al igual que
los surfactantes químicos son agentes tensioactivos que dispersan el hidrocarburo en agua,
parte de los surfactantes microbiológicos tienen esta propiedad, pero además tienen
numerosas ventajas, ya que ofrecen alternativas en los sistemas de superficie activa que son
biodegradables, más económicos, menos tóxicos y altamente resistentes a ser cambiados en el
medio ambiente (León, 2008).
Los grupos de biosurfactantes más comúnmente aislados y mejor estudiados son los
de compuestos de glucolípidos y fosfolípidos. Los ramnolípidos son compuestos de
glicolípidos producidos por Pseudomonas sp. que podría reducir la tensión superficial del
agua y emulsionar el aceite. Estos compuestos son biodegradables y tienen una potencial
aplicación industrial y ambiental (El-Sheshtawy y Doheim, 2014).
Los rhamnolípidos son un grupo de biosurfactantes de naturaleza glicolípida,
compuestos de una cabeza hidrofílica formada por una o dos moléculas de ramnosa,
conocidas respectivamente como mono ramnolípidos y di ramnolípidos, y una cola

5
hidrofóbica que contiene uno o dos ácidos grasos (Silva, Farias, Rufino, Luna y Sarubbo,
2010).

1.4. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa es una cepa de uso frecuente para la producción de
biosurfactantes como glicolípidos y la degradación del petróleo crudo. Esta es una cepa gram-
negativa que ha reportado potencial de producción de biosurfactantes (Zhang et al., 2010).
Muchos biosurfactantes se han producido y aplicado a la degradación de hidrocarburos,
especialmente los ramnolípidos producidos por estas bacterias (Silva et al., 2010). Los tipos
de ramnolípidos producidos dependerán de la cepa, la fuente de carbono utilizada y las
condiciones de cultivo (Silva et al., 2010).

1.5. Genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa

La producción de ramnolípidos sigue siendo una característica de P. aeruginosa.
Entre las especies de P. aeruginosa, la cepa PAO1 es el productor mejor estudiado hasta la
fecha con un genoma completamente secuenciado (Winsor et al., 2009; Müller, Hörmann,
Syldatk, y Hausmann, 2010).
La biosíntesis de ramnolípidos de Pseudomonas spp. está determinada por varios
componentes que se muestran en la Figura 1. Dos síntesis de ramnolípidos reguladores de
sistema de quórum sensing (QSS) están presentes en dos regiones diferentes del cromosoma.
La formación de mono y di ramnolípidos está mediada a través de dos transferasas diferentes,
estas son las ramnosiltransferasa I y II. Además, la síntesis de ramnolípidos se combina con
limitaciones de nitrógeno en la célula. Las condiciones limitantes de fosfato mejoran la
biosíntesis de biosurfactantes. También se han informado estudios sobre la estructura de la
ramnosiltransferasa I, que contiene cuatro genes, estos son rhlA, rhlB, rhlR, y rhlI. Los
plásmidos que codifican cuatro genes son suficientes para producir ramnolípidos en
huéspedes heterólogos. Los genes rhlA y rhlB (ver Figura 2) se encuentran aguas arriba,
mientras que rhlR y rhlI se encuentran aguas abajo de los genes estructurales (Satpute,
Bhuyan, Pardesi, Mujumdar, Dhakephalkar, et al., 2010), como se muestra en la Figura 1.
Los genes rhlA y rhlB codifican para la ramnosiltransferasa I activa y se transcriben
juntos como un ARN bicistrónico. Las proteínas estructurales están codificadas por rhlB y
están presentes en el periplasma. Las proteínas de membrana interna requeridas para la
síntesis, transporte o solubilización de la ramnosiltransferasa están codificadas en rhlA. En el
primer QSS, los genes rhlA y rhlB están regulados positivamente por rhlR. El activador

6
transcripcional y el autoinductor están codificados por rhlR y rhlI respectivamente. RhlI
produce dos moléculas de señal, estas son N-butanoil-Lhomoserina (PAI-2) y hexanoil-l-
homoserina lactona. El activador transcripcional producido por rhlR se une al autoinductor
PAI-2 y este complejo activo provoca la activación transcripcional de rhlA y rhlB que
codifican la ramnosiltransferasa I. El segundo QSS contiene dos genes, estos son lasR y lasI.
En este sistema, el autoinductor está codificado por lasI, es decir, la proteína reguladora RhlR
N-(3-oxododecanoil)-l-homoserina-lactona (PAI-1) requiere autoinductores N-butiril-HSL y
el autoinductor N-(3-oxohexanoil)-HSL para su actividad (Satpute, et al., 2010).

Figura 1. Síntesis de ramnolípidos en Pseudomonas spp. por dos sistemas de detección de

quórum: Representación de dos sistemas de detección de quórum sensing (QSS) presentes en
diferentes regiones de cromosoma Pseudomonas spp. Flechas gruesas negras en negrita:
genes en el cromosoma de Pseudomonas; Flechas negras: síntesis de proteínas del gen; Óvalo
punteado: indica la proteína reguladora inactiva; Óvalo continuo: complejo activo de proteína
reguladora y autoinductor. Extraído de: Satpute, et al., (2010).

7
(a)

(b)

Figura 2. (a) Pseudomonas aeruginosa PAO1, PA3479 (rhlA), (b) Pseudomonas aeruginosa
PAO1, PA3478 (rhlB). Extraído de: (a) Pseudomonas Genome Database1, (b) Pseudomonas
Genome Database2.

Tanto el operón rhlAB como el gen rhlC están bajo el control de la detección de
quórum sensing (QS) dependiente del crecimiento, y se ha demostrado que la producción de
ramnolípidos está directamente relacionada con el sistema rhl-QS a través del regulador RhlR
(Medina, Juárez y Soberón, 2003). Sin embargo, varios otros factores además de la densidad
celular parecen influir tanto en la expresión de rhlAB como en la expresión de rhlC y se ha
observado que todo el sistema QS en sí mismo y, de esta manera, la síntesis de ramnolípidos
están sujetos a capas adicionales de regulación (Schuster y Greenberg 2006), ya que la
mayoría de los genes controlados por QS muestran un patrón de expresión retrasada y
también rhlAB. El operón rhlAB también depende parcialmente del factor sigma alternativo
RpoS (σ38 o σS; Medina et al., 2003). Otros estudios relacionan la síntesis de ramnolípidos
con condiciones nutricionales, como el agotamiento de nitrógeno y el factor sigma alternativo
para la limitación de nitrógeno, RpoN (σ54), ha demostrado estar involucrado en la
regulación de rhlAB, así como en la expresión de rhlR y rhlC (Medina et al., 2003).
Sin embargo, se ha demostrado que el promotor rhlAB en sí mismo es independiente
de RpoN. La dependencia de la expresión de rhlAB en este factor sigma podría ocurrir
indirectamente a través de RhlR, cuyo gen alberga un sitio de inicio de la transcripción

1
Pseudomonas Genome Database. (2020). Pseudomonas aeruginosa PAO1, PA3479 (rhlA). Disponible en:
https://www.pseudomonas.com/feature/show?id=109777 (Revisado: 15 de julio de 2020).
2
Pseudomonas Genome Database. (2020). Pseudomonas aeruginosa PAO1, PA3478 (rhlB). Disponible en:
https://www.pseudomonas.com/feature/show?id=109775 (Revisado: 15 de julio de 2020).

8
dependiente de RpoN (Medina et al., 2003). Esto permite la expresión coordinada y, por lo
tanto, la producción de di ramnolípidos solo cuando sus precursores, los mono ramnolípidos,
están presentes. Se han descrito y revisado varios otros mecanismos de regulación
transcripcional relacionados y no relacionados con el QS, así como los mecanismos de
regulación postranscripcional que influyen en la síntesis de ramnolípidos (Schmidberger et
al., 2013).
En la literatura se ha reportado la utilización de otros microrganismos como
Pseudomonas putida (Cha et al., 2008) que dieron como resultado rendimientos de producto
relativamente bajos que estaban muy por debajo de los logrados por su productor natural. Se
han demostrado la producción de ramnolípidos usando P. putida genéticamente optimizado
KT24C1 pVLT31_rhlAB cultivado en glucosa como fuente de carbono (Wittgens et al.,
2011).

1.6. Justificación
El uso de bacterias como P. aeruginosa para la producción de biosurfactantes y
degradación del petróleo crudo, es debido a su presencia generalizada en ambientes
contaminados, crecimiento rápido (donde el período de crecimiento para alcanzar la fase
exponencial en cultivos por lote alimentado es de aproximadamente 8-10 horas), la facilidad
de aislamiento y el cribado, así como la alta producción de biosurfactantes y la capacidad de
degradación del petróleo crudo. Por otra parte, debido al hecho de que los miembros del
género Pseudomonas, incluida P. aeruginosa, incluyen bacterias patógenas condicionales, se
han realizado esfuerzos para la detección selectiva de bacterias no patógenas (Zhang et al,
2010), que puedan ser utilizadas a nivel de biorremediación. En contraste, P. putida es una
bacteria gramnegativa no patógena, que representa un organismo modelo con un metabolismo
versátil con aplicaciones industriales importantes (Wittgens et al., 2011; Tiso et al., 2016).
Aunque es un pariente cercano evolutivo de P. aeruginosa, su genética simplificada, y la falta
de redes reguladoras complejas encontradas en P. aeruginosa y la presencia de vías
necesarias para la síntesis de precursores de ramnolípidos han hecho de P. putida las
bacterias ideales para realizar este estudio. En la literatura se ha reportado que el
biosurfactante ramnolípido producido por la cepa BS2 de P. aeruginosa se utiliza para
eliminar cadmio (Cd) y plomo (Pb) del suelo artificialmente contaminado (Sharma et al.,
2015).
Las propiedades emulsionantes de los ramnolípidos producidos por estas bacterias, los
convierten en una herramienta ideal para la biorremediación de derrames de petróleo. Los

9
ramnolípidos son extremadamente efectivos para ayudar a eliminar el petróleo del suelo
contaminado y facilitar su descomposición y dispersión en ambientes acuosos (Chen et al.,
2013). Debido a su baja toxicidad, alta biodegradabilidad y compatibilidad con el medio
ambiente, los ramnolípidos se usan de manera efectiva en la recuperación mejorada del
petróleo y son una herramienta importante en las tareas de biorremediación (Amani, 2015).
En este trabajo, exploramos las técnicas utilizadas por Wittgens et al. (2011) y Tiso et al.
(2016) al introducir los genes rhlA y rhlB de P. aeruginosa para reconstruir un modelo
genéticamente modificado de P. putida.

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
El objetivo general de este estudio es utilizar un microorganismo conocido como P.
putida para examinar su poder en un mecanismo de biorremediación de un ecosistema
terrestre contaminado con petróleo mediante el uso de P. aeruginosa y su capacidad de
producción de biosurfactantes, utilizando modelos moleculares, metabólicos y biosintéticos.

2.2. Objetivos específicos

Los objetivos específicos son:
 Proponer un medio de cultivo eficaz para la obtención de los genes de interes
rhlA y rhlB con potencial de producción de biosurfactantes de P. aeruginosa.
 Determinar una metodología de trabajo para la obtención de los genes de
interés de P. aeruginosa que tienen potencial de producción de
biosurfactantes.
 Utilizar el potencial de producción de biosurfactantes de P. aeruginosa en
otros microorganismos no patógenos como P. putida, y generar un protocolo
de trabajo para el uso de estos microorganismos en un proceso de
biorremediación.

3. MÉTODOS

3.1. Plan de trabajo

En la Figura 3 se encuentra el protocolo de trabajo propuesto para este estudio, donde
se resumen las fases del método experimental a seguir.

10
Figura 3. Protocolo de trabajo de este estudio. Extraído de: Elaboración propia.

3.2. Recolección de las muestras

Se recolectarán muestras de agua de 1 L y muestras de suelo de 10 g, de un suelo
contaminado donde ha ocurrido un vertido de petróleo en el suelo del ecosistema. Se ha
reportado que en la zona donde ocurrió el vertido de petróleo, la composición del crudo es
abundante de alcanos de peso molecular medio a alto.

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 Las características físicas de las muestras de suelo se medirán en cuanto a los valores
de pH y su variación, el contenido de agua (%), el contenido de sal (%), y el contenido de
aceite (%), determinados utilizando métodos estándar.

3.3. Diseño del medio de cultivo y condiciones de cultivo

- Activación de bacterias. Se utilizará una solución de caldo nutritivo (CN) para
el crecimiento de los microorganismos en las muestras de suelo contaminado. El CN estará
compuesto de agua desionizada en g/L: peptona 10, extracto de carne de res 5 y NaCl 5. Para
la preparación de placas de agar nutritivo (AN), 15.0 g/L de agar serán añadidos. El medio de
agar sangre se realizará con medio de AN más 5% (p/p) de sangre de oveja desfibrada, como
se describe en Qingmei et al. (2016).
- Aislamiento de bacterias. Los microorganismos utilizados en los experimentos
se aislarán mediante la técnica de enriquecimiento selectivo descrita por Verma et al. (2006).
Se preparará un medio de sal mineral (MMS) con una composición (g/l) de NH 4Cl 2.0,
KH2PO4 5.0, Na2HPO4 4.0, MnSO4 0.2, MgSO4 0.2, FeCl3 0.05, CaCl2 0.001; extracto de
levadura, 0,01; y 0.05 ml/l de la siguiente solución de oligoelementos: B (0.026%), Cu
(0.05%), Mn (0.05%), Mo (0.006%) y Zn (0.07%) con pH 7.2 de acuerdo con Al-Thani et al.
(2009).
Se agregarán 50 ml de MMS en matraces de agitación de 250 ml y se modificarán con
0,25 g de petróleo crudo como única fuente de carbono (medio de degradación del petróleo).
Todos los matraces se cerrarán con películas de sellado de plástico.
- Aislamiento de bacterias productoras de biosurfactantes . Se prepararán placas
de agar de petróleo mediante los siguientes procedimientos: se empaparán papeles de filtro de
aproximadamente 85 mm de tamaño con 2 ml de solución de petróleo crudo Petrolether (100
g/L), se secarán al aire y se colocarán en la placa de agar MMS (1,5 % de agar) en una placa
de Petri de 90 mm en condiciones estériles.

3.4. Aislamiento bacteriano

Se añadirá 1 g de la muestra de suelo contaminado a 100 ml de MMS estéril y se
incubará durante 7 días a 30 °C en un agitador orbital a 180 rpm. Las colonias de las placas se
tomarán como sub-cultivos aleatorios para obtener colonias de aislamientos puros, que luego
se utilizaron para el mantenimiento de cultivos de aislamientos.

3.4.1. Selección de P. aeruginosa mediante medios de cultivo específicos

12
- Crecimiento en agar cetrimida
El medio de agar cetrimida es un medio selectivo para P. aeruginosa. Cuando se
incuba a 42 °C, las colonias aparecen de color verde y apariencia de mucosa (Joffin y Lyeral,
2006).
- Crecimiento en medios King (King A y King B)
Los medios King A y King B permiten la diferenciación entre especies de
Pseudomonas al demostrar sus pigmentos específicos. La producción de pigmentos se ve
favorecida por la composición del medio.
 El medio King A promueve la producción de piocianina, un pigmento que permite la
identificación de Pseudomonas aeruginosa. Los cultivos típicos son de color verde
azulado.
 El medio King B promueve la síntesis de pyoverdina, un pigmento verde fluorescente
producido por Pseudomonas aeruginosa y otras especies de Pseudomonas (P.
fluorescens, y P. putida). La pyoverdina se manifiesta por una tinción verde
fluorescente del medio de cultivo.

3.4.2. Caracterización bacteriana de P. aeruginosa

- Caracterización morfológica
El color, la forma, la transparencia y el margen de las cepas aisladas se examinarán y
registrarán como características morfológicas de la colonia según lo expuesto por Al-
Dhabaan (2019). Las características microscópicas se registrarán para todos los aislamientos
mediante el protocolo de tinción de Gram.

- Caracterización bioquímica
• Prueba de oxidasa
Las colonias bacterianas aisladas se inocularán sobre el papel de filtro previamente
saturado con un reactivo de oxidasa recién preparado. Se registrará una prueba de oxidasa
positiva si hay un desarrollo de color azul-violeta en un periodo de 10 segundos (Al-
Dhabaan, 2019).
• Prueba de catalasa
Detección de burbujas de gas en un periodo de los 10 segundos después de agregar el
cultivo bacteriano purificado en 5 ml de solución de peróxido de hidrógeno, será considerado
como una prueba catalasa positivo (Al-Dhabaan, 2019).

13
 • Prueba de ureasa
Se inclinarán 2 ml de medio de urea y se colocarán en viales, y se incubarán a
temperatura ambiente. El color rojo-rosado del medio se considerará un resultado positivo
para la inducción de ureasa (Al-Dhabaan, 2019).
• Prueba de indol
La aparición de un color rojo y amarillo brillante que consiste después de agregar 0,5
ml de reactivo de Kovac a un cultivo bacteriano incubado a 35 °C durante 24 h en medio
MMS indicará resultados positivo y negativo respectivamente (Al-Dhabaan, FA.2019).
• Prueba de citrato de Simmons
La prueba de citrato de Simmons se realizará inoculando la superficie de las placas de
agar de citrato de Simmons con el cultivo bacteriano, luego se incubará a 37 °C durante 48 h.
Cambios de coloración de verde a azul brillante indica una reacción positiva.
• Prueba de rojo de metilo
Después de agregar la solución indicadora de rojo de metilo al medio de cultivo
inoculado con el cultivo bacteriano, se incubarán a 35 °C durante hasta 4 días. Si el color
cambia a rojo, esto indica que la prueba tiene resultado positivo (Atlas de colores y libro de
texto de Microbiología diagnóstica, 2016).
• Hidrólisis de gelatina
El método de hidrólisis de gelatina se aplicará de acuerdo con Edison et al., (2012).
La prueba de inóculo de una bacteria se llevará a cabo en tubos que contienen gelatina
nutritiva (Anexo), la licuefacción de esta última es un resultado positivo de la hidrólisis de la
gelatina bacteriana.

3.5. Medición de producción de biosurfactantes

Se inocularán los cultivos seleccionados en 20 ml de MMS en un matraz de 100 ml y
se incubará en un agitador rotatorio a 30 °C y 180 rpm durante 10 horas. Luego se
transferirán 2,5 ml (5%) de inóculo a 50 ml de medio productor de biosurfactantes en
matraces de agitación de 250 ml. Después de 3 días de fermentación a 30 °C y 180 rpm, el
caldo se centrifugará a la velocidad de 9000 rpm durante 20 min y, de esta manera, la
capacidad de producción de biosurfactantes se medirá por el método de dispersión de aceite
de Techaoei (2011) y las mediciones de tensión superficial reportados por Xiangsheng et al
(2010).

14
 3.5.1. Dispersión de aceite
Se determinará la dispersión de aceite al agregar una capa de agua destilada a una
placa de Petri pequeña con 20 μL de aceite crudo a la superficie del agua, luego de
homogenizar el aceite se agregarán 10 μL de cultivo bacteriano a la superficie del aceite. La
prueba se realizará por duplicado para cada una de las cepas bacterianas. Se visualizará una
zona clara (halo) bajo la luz, y se medirá el diámetro de la zona clara en la superficie del
aceite. El área del círculo se medirá y calculará para el Área de Desplazamiento del Aceite
(ODA) usando la siguiente ecuación (Techaoei, 2011): ODA = 22/7 (radio)2 cm2.

3.5.2. Tensión superficial

La tensión superficial del sobrenadante de caldo de cultivo de las cepas seleccionadas
anteriormente (diluido en un factor de 100), se medirá con un instrumento de tensión
superficial JYW-200 como describe Xiangsheng et al (2010).

3.6. Identificación de aislamientos

La identificación de microorganismos productores de biosurfactantes de las muestras
anteriores permitirá la identificación y aislamiento de bacterias de los géneros Pseudomonas,
Achromobacter (Al-Thani et al., 2009), entre otras, como resultados esperados. Los
aislamientos bacterianos que mostraron una mayor capacidad de producción de
biosurfactantes mediante los estudios anteriores se seleccionarán e identificarán mediante
RNA ribosómico parcial 16S (rRNA) utilizando los primer de secuencia forward (5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') y primer de secuencia reverse (5'-
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3') (Sharma et al., 2015) y las pruebas bioquímicas
convencionales que se mencionaron anteriormente (agar de petróleo, agar sangre).

3.7. Producción de biosurfactantes de interés (ramnolípidos)

Se plantea la realización de un protocolo para la producción de ramnolípidos
utilizando P. aeruginosa PAO1 en una escala de biorreactor de 30 L, debido a que en la
literatura se ha mostrado su poder de producción de este tipo de compuesto por parte de P.
aeruginosa. Para la fermentación por lotes, se utilizará un biorreactor de tanque agitado de 42
L, con una capacidad de trabajo de 30 L. El biorreactor contendrá un sistema de control de
proceso integrado para pH, temperatura, oxígeno disuelto mínimo (pO 2), flujo de aire y
regulación del nivel de espuma. El cultivo se realizará a 37 °C bajo una pO 2 constante del 5%

15
a una velocidad de agitación de 400 rpm. La pO 2 se controlará variando la velocidad de
aireación (L×min) de acuerdo al protocolo de Schmidberger et al. (2013).

3.8. Aislamiento de RNA y trascripción inversa

Se pretenden generar perfiles de expresión de diferentes factores que previamente han
sido descritos como involucrados en la regulación de la síntesis de ramnolípidos, en este caso
los genes rhlA y rhlB. Para la expresión de los genes involucrados en la síntesis de
ramnolípidos en P. aeruginosa PAO1 se utilizarán los biorreactores antes mencionados.
Luego se realizará un análisis de la expresión de estos dos genes de interés involucrados en la
síntesis de ramnolípidos, como se vio en el apartado teórico de este trabajo. Esto se hará, por
aislamiento de RNA y transcripción inversa.
El RNA total se aislará después de la estabilización del RNA mediante extracción con
fenol/cloroformo utilizando el reactivo de lisis en combinación con el Mini Kit RNeasy®. El
DNA genómico se digerirá posteriormente y luego se evaluará la digestión utilizando una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida de la carga de productos eventuales en un
gel de agarosa. Para controlará la integridad y la calidad del RNA mediante
fotoespectrometría y el RNA aislado se cargará adicionalmente en geles de agarosa. Luego se
medirán las concentraciones de 250 ng de RNA para la síntesis de cDNA. La transcripción
inversa cebada al azar se realizará utilizando los reactivos de transcripción inversa Taqman
MultiScribe® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El perfil de temperatura fue de
acuerdo con el protocolo de Schmidberger et al. (2013) (25 °C, 10 min; 48 °C, 30 min; 95 °C,
5 min; 4 °C). Después de la transcripción inversa, las muestras se usarán directamente para
PCR en tiempo real (ver Tabla 1) o se almacenaron de otra manera a -20 °C.

3.9. Análisis de expresión génica

La expresión de los genes de interés se realizará mediante PCR cuantitativa en tiempo
real. Antes de la PCR, el RNA se transcribirá primero en cDNA como se describió en el paso
anterior. Los primer usados para la PCR en tiempo real se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Primers usados en la PCR en tiempo real.

Primers o target Secuencia Tamaño del amplicón (pb)
algR F 5′-ATCAGTGCACGGACCCGCAA-3’ 95

16
 R 5′-GCATGGCGCAAGGTCACGTA-3′
fabD F 5′-GCATCCCTCGCATTCGTCT-3′ 163
R 5′-GGCGCTCTTCAGGACCATT-3′
gacA F 5′-ATATCAGCCCGCAGATCGCCCA-3′ 166
R 5′-TTCGGCGACAGGCACAGCTT-3′
lasI F 5′-GCCCCTACATGCTGAAGAACA-3′ 62
R 5′-CGAGCAAGGCGCTTCCT-3′
lasR F 5′-GTGGAGCGCCATCCTGCAGA-3′ 144
R 5′-CGGTCGTAATGCTCGCGCCA-3′
lipC F 5′-ACTACACCCGCACGCGCTAT-3′ 155
R 5′-GTTGCTGTTCACCGGCGACT-3′
pqsE F 5′-GCGCTTGAACCGGCAACTGT-3′ 185
R 5′-GGCGTCGCACGTCGTAGAAA-3′
pvdS F 5′-AGATGTGGTCCAGGATGCGT-3′ 232
R 5′-GTGTTCGAGGGTCGCGTAGT-3′
qscR F 5′-AAGCAATGTGCGCCTGACCG-3′ 111
R 5′-TTCACCGTGCGCTGGTCGAT-3′
rhlA F 5′-GATCGAGCTGGACGACAAGTC-3′ 95
R 5′-GCTGATGGTTGCTGGCTTTC-3′
rhlC F 5′-ATCCATCTCGACGGACTGAC-3′ 159
R 5′-GTCCACGTGGTCGATGAAC-3′
rhlI F 5′-AGCTGGGACGCTACCGGCAT-3′ 136
R 5′-TGGCGGCTCATGGCGACGAT-3′
rhlR F 5′-GAGGAATGACGGAGGCTTTTTG-3′ 255
R 5′-CTTCTTCTGGATGTTCTTGTGG-3
rpoD F 5′-GGGCGAAGAAGGAAATGGTC-3′ 178
R 5′-CAGGTGGCGTAGGTGGAGAA-3′
rpoN F 5′-ACCCGTAGTAGTGGATGGTGC-3′ 128
R 5′-TATGGCCTGTTGCAGCTGCG-3′
rpoS F 5′-CTCCCCGGGCAACTCCAAAAG-3′ 198
R 5′-CGATCATCCGCTTCCGACCAG-3′
rsaL F 5′-AGCCCCAAAACATGGCCTTCCG-3′ 113
R 5′-CTCGAAACGACTGCCGCAGGAT-3′
Fuente: Schmidberger et al. (2013).

3.10. Expresión génica de rhlA y rhlB en P. putida

17
FALTA!!!

3.11. Análisis estadísticos

Todos los experimentos se realizarán por triplicado. Los resultados serán evaluados
para la significación estadística utilizando la prueba estadística ANOVA y el programa
estadístico SPSS.

4. RESULTADOS ESPERADOS

4.1. Recolección de muestras

FALTA!!!

4.2. Aislamiento bacteriano

4.2.1. Selección de cepas de P. aeruginosa mediante medios de cultivo
específicos
FALTA!!!

4.2.2. Caracterización bacteriana de P. aeruginosa

- Caracterización morfológica
Las especies del género Pseudomonas que se logren identificar presentarán las
características descritas en la Tabla 2 y la vista desde el microscopio por tinción de Gram
tendrá la visualización similar a la presentada en la Figura 4.

Tabla 2. Características morfológicas de las especies del género Pseudomonas identificadas.

Características morfológicas Resultado
Identificación Nº
Forma Bacilos
Movilidad +
Modo de respiración Aerobio
Tinción de Gram -
Temperatura de crecimiento 25-30 ºC
Endospora No

18
Figura 4. Vista desde el microscopio de especies de P. aeruginosa. Extraído de: NCBI3.

- Caracterización bioquímica

4.2.3. Identificación manual de especies de P. aeruginosa

FALTA!!!

4.2.4. Identificación confirmatoria

FALTA!!!

4.3. Medición de producción de biosurfactantes

4.3.1. Dispersión de aceite
FALTA!!!

4.3.2. Tensión superficial

FALTA!!!

4.4. Identificación de aislamientos con producción de biosurfactantes

4.5. Producción de biosurfactantes de interés

FALTA!!!

4.6. Análisis de expresión génica

3
NCBI. Pseudomonas aeruginosa. Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/static/GP_IMAGE/Pseudomonas.jpg (Revisado: 21 de julio de 2020).

19
 FALTA!!!

4.7. Expresión génica de rhlA y rhlB en P. putida

FALTA!!!

4.8. Análisis estadísticos

FALTA!!!

5. DISCUSIÓN

El análisis combinado de la caracterización morfológica, bioquímica y fisiológica, y

los resultados de secuenciación de 16S rRNA planteado pretende identificar cepas de P.
aeruginosa en una muestra de un ecosistema de suelo contaminado, para luego utilizar estas
cepas para la producción en el laboratorio de biosurfactantes como ramnolípidos que han
demostrado su poder de biorremediación de este tipo de ecosistemas contaminados. De forma
generalizada, los ramnolípidos se han convertido cada vez más en el foco de atención como
una alternativa a los componentes de superficie activa petroquímicos ecotóxicos tradicionales
(Banat et al., 2000).
Se plantea que la primera respuesta de la célula a los estímulos externos y la
adaptación más inmediata a los cambios en el entorno ocurre a nivel del RNA. Evaluar
cambios en el nivel de RNA también puede ser más sencillo en lugar de evaluar la
productividad de ramnolípidos. Debido a que monitorear la actividad de la célula en el nivel
transcripcional puede proporcionar información más precisa sobre el estado real de la célula
en comparación con los métodos analíticos convencionales para mostrar el estado del cultivo,
es decir, la determinación de la biomasa, el escape de CO2 o los niveles de pH del sistema
(Schmidberger et al., 2013). Basado en una red reguladora de genes bien caracterizada, se
pueden desarrollar estrategias para el control selectivo de procesos de producción de
biosurfactantes que serán usados para su capacidad de biorremediación en el ecosistema de
interés.
Debido a que estudios como el realizado por Schmidberger et al. (2013) se ha
observado que el perfil de expresión génica de los genes para la síntesis de ramnolípidos,
rhlA y rhlC, estaban fuertemente regulados durante el proceso de fermentación por lote
(usado en los métodos de este trabajo como experimento de expresión de genes rhlA y rhlB,
por parte de P. aeruginosa extraída de las muestras de suelo contaminado), al final de la fase
de desaceleración, tanto rhlA como rhlC alcanzan la tasa de expresión relativa más alta. Se

20
considerará el uso de este protocolo para la utilización de cepas con capacidad productora ya
evaluada. En estas condiciones particulares, se ha demostrado que la tasa de producción
específica de ramnolípidos alcanza su máximo en la fase de crecimiento estacionaria
temprana (Schmidberger et al., 2013).
La extracción de las cepas bacterianas con una alta capacidad de producción de
biosurfactantes, y la eficiencia de eliminación de petróleo crudo de las muestras ambientales
contaminadas con hidrocarburos de petróleo, identificadas mediante pruebas selectivas de
placa de agar de sangre y petróleo crudo, y por medición de tensión superficial y evaluación
de la degradación de hidrocarburos de petróleo en pruebas de degradación aeróbica. Se
plantea este enfoque ya que los resultados de otros trabajos como el realizado por Zhang et al.
(2012) muestran que este enfoque representa un método eficiente para la detección de cepas
productoras de biosurfactantes capaces de hacer frente a contaminantes orgánicos hidrófobos.
En el estudio de Zhang et al. (2012) se ha observado que con la optimización de la
composición del caldo de fermentación y las condiciones ambientales mediante un diseño
ortogonal o una metodología de superficie de respuesta (Najafi et al., 2010), el rendimiento
de producción de biosurfactantes podría aumentar aún más. El mejoramiento por mutación,
por medio del haz de iones ultravioleta y de baja energía, es otra alternativa para la mejora de
la tensión superficial de los biosurfactantes. El rendimiento de biosurfactantes producido por
un mutante de la cepa Z41 de P. aeruginosa aislado del trabajo de Najafi et al. (2010), y
usando aceite de freír como única fuente de carbono ascendió a aproximadamente 19 g/L, lo
que también se asoció con un aumento de la eficiencia de biodegradación aeróbica del
petróleo crudo a más del 50% (Xia et al., 2012). Esto demuestra la aplicación de métodos
para mejorar la capacidad de producción de biosurfactantes en el laboratorio, que luego
pueden ser usados mediante esta metodología planteada como aplicación para la
biorremediación de ecosistemas contaminados con petróleo.

6. CONCLUSIÓN

FALTA!!!

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abdulsalam, S., Bugaje, I. M., Adefila, S. S., y Ibrahim, S. (2011). Comparison of

biostimulation and bioaugmentation for remediation of soil contaminated with spent motor
oil. International Journal of Environmental Science & Technology, 8(1), 187-194.

21
 Al-Thani, R. F., Abd-El-Haleem, D. A., y Al-Shammri, M. (2009). Isolation and
characterization of polyaromatic hydrocarbons-degrading bacteria from different Qatari soils.
African Journal of Microbiology Research, 3(11), 761-766.
Banat, I. M., Makkar, R. S., y Cameotra, S. S. (2000). Potential commercial
applications of microbial surfactants. Applied microbiology and biotechnology, 53(5), 495-
508.
Cha, M., Lee, N., Kim, M., Kim, M., y Lee, S. (2008). Heterologous production of
Pseudomonas aeruginosa EMS1 biosurfactant in Pseudomonas putida. Bioresource
Technology, 99(7), 2192-2199.
Chen, Q., Bao, M., Fan, X., Liang, S., y Sun, P. (2013). Rhamnolipids enhance
marine oil spill bioremediation in laboratory system. Marine pollution bulletin, 71(1-2), 269-
275.
El-Sheshtawy, H. S., y Doheim, M. M. (2014). Selection of Pseudomonas aeruginosa
for biosurfactant production and studies of its antimicrobial activity. Egyptian journal of
petroleum, 23(1), 1-6.
Landa-Acuña, D., Acosta, R. A. S., Cutipa, E. H., de la Cruz, C. V., y Alaya, B. L.
(2020). Bioremediation: A Low-Cost and Clean-Green Technology for Environmental
Management. In Microbial Bioremediation & Biodegradation (pp. 153-171). Springer,
Singapore.
León, Y. (2008). Caracterización funcional y molecular de una comunidad
bacteriana asociada a ripios base agua impregnado en crudo pesado con énfasis en el
potencial de producción de biosurfactantes. Tesis de Licenciatura. Universidad Central de
Venezuela. Caracas, Venezuela.
Medina, G., Juárez, K., Valderrama, B., y Soberón-Chávez, G. (2003). Mechanism of
Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter. Journal of
Bacteriology, 185(20), 5976-5983.
Medina, G., Juárez, K., y Soberón-Chávez, G. (2003). The Pseudomonas aeruginosa
rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of
its activator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserine lactone. Journal of
bacteriology, 185(1), 377-380.
Najafi, A. R., Rahimpour, M. R., Jahanmiri, A. H., Roostaazad, R., Arabian, D., y
Ghobadi, Z. (2010). Enhancing biosurfactant production from an indigenous strain of
Bacillus mycoides by optimizing the growth conditions using a response surface
methodology. Chemical Engineering Journal, 163(3), 188-194.

22
 Pao-Wen, L. G., Chang, T. C., Whang, L. M., Kao, C. H., Pan, P. T., y Cheng, S. S.
(2011). Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil: effects of strategies and
microbial community shift. International Biodeterioration & Biodegradation, 65(8), 1119-
1127.
Qingmei, L., Hang, Y., Jun, W., Guohong, G., Wei, Z., Yonghong, F., ... y Zengliang,
Y. (2006). A mutant of bacillus subtilis with high-producing surfactin by ion beam
implantation. Plasma Science and Technology, 8(4), 491.
Satpute, S. K., Bhuyan, S. S., Pardesi, K. R., Mujumdar, S. S., Dhakephalkar, P. K.,
Shete, A. M., y Chopade, B. A. (2010). Molecular genetics of biosurfactant synthesis in
microorganisms. In Biosurfactants. Springer, New York, NY. p. 14-41.
Schmidberger, A., Henkel, M., Hausmann, R., y Schwartz, T. (2013). Expression of
genes involved in rhamnolipid synthesis in Pseudomonas aeruginosa PAO1 in a bioreactor
cultivation. Applied microbiology and biotechnology, 97(13), 5779-5791.
Sharma, D., Ansari, M. J., Al-Ghamdi, A., Adgaba, N., Khan, K. A., Pruthi, V., y Al-
Waili, N. (2015). Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa DSVP20 isolated
from petroleum hydrocarbon-contaminated soil and its physicochemical characterization.
Environmental Science and Pollution Research, 22(22), 17636-17643.
Silva, S. N. R. L., Farias, C. B. B., Rufino, R. D., Luna, J. M., y Sarubbo, L. A.
(2010). Glycerol as substrate for the production of biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa
UCP0992. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 79(1), 174-183.
Sulbarán, M. Bahsas, A. Velásquez, W., y Otoniel, J. (2005). Caracterización de
Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes aisladas de emulsiones de
petróleo pesado. CIENCIA, 13(2), 228-239.
Tiso, T., Sabelhaus, P., Behrens, B., Wittgens, A., Rosenau, F., Hayen, H., y Blank, L.
M. (2016). Creating metabolic demand as an engineering strategy in Pseudomonas putida–
rhamnolipid synthesis as an example. Metabolic engineering communications, 3, 234-244.
Verma, S., Bhargava, R., y Pruthi, V. (2006). Oily sludge degradation by bacteria
from Ankleshwar, India. International biodeterioration & biodegradation, 57(4), 207-213.
Winsor, G. L., Van Rossum, T., Lo, R., Khaira, B., Whiteside, M. D., Hancock, R. E.,
y Brinkman, F. S. (2009). Pseudomonas Genome Database: facilitating user-friendly,
comprehensive comparisons of microbial genomes. Nucleic acids research, 37(suppl_1),
D483-D488.
Wittgens, A., T. Tiso, T.T. Arndt, P. Wenk, J. Hemmerich, C. Müller, R. Wichmann,
B. Küpper, M. Zwick, S. Wilhelm, R. Hausmann, C. Syldatk, F. Rosenau, y L.M. Blank.

23
(2011). Growth independent rhamnolipid production from glucose using the nonpathogenic
Pseudomonas putida KT2440. Microb Cell Fact, 10(80).
Xiangsheng, Z., Miao, L., y Tingsheng, X. (2010). Genetic modification of MEOR
bacterium Bacillus licheniformis H strain by low energy ion beam irradiation. The Open
Biotechnology Journal, 4(1).
Youssef, N. H., Duncan, K. E., Nagle, D. P., Savage, K. N., Knapp, R. M., y
McInerney, M. J. (2004). Comparison of methods to detect biosurfactant production by
diverse microorganisms. Journal of microbiological methods, 56(3), 339-347.
Zhang, X., Xu, D., Zhu, C., Lundaa, T., y Scherr, K. E. (2012). Isolation and
identification of biosurfactant producing and crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa
strains. Chemical Engineering Journal, 209, 138-146.

24