DNA ADENINA METILASA (Dam) REGULA LA

PRODUCCIÓN DE BIOPELÍCULA EN Salmonella

enterica Serovar Enteritidis.

María del Rosario Aya C, Sebastián Hernán Sarnacki, Adriana Lopez Guerra y María
Cristina Cerquetti

Instituto de Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM)

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas-CONICET.
Universidad de Buenos Aires, Facultad de Medicina.
Septiembre, 2013
Biopelícula: estrategia de supervivencia
 Cepas Atenuadas de Salmonella spp
Vacunas contra Herramientas biológicas
salmonelosis para el estudio de la
patogénesis de la
enfermedad

Mutantes Dam, propuestas como cepas vacunales

en modelos aviares y murinos

Proteína Dam (ADN adenina

metilasa)
Metila residuos de adenina
en sitios 5’-GATC-3’
de cadena doble
 Objetivo General
Estudiar la participación de la enzima Dam, en la
regulación de formación de biopelícula en
Salmonella Enteritidis.
 1. Generar una cepa mutante carente del gen dam en S. Enteritidis a
través de mutagénesis dirigida de reemplazo.

Mutagénesis dirigida de reemplazo (Datsenko y Wanner, 2000)

Salmonella enterica serovariedad Enteritidis #5694
FRT FRT

Cassette de resistencia
pKD3/46

Gen A Gen interés Gen c

Gen A Gen c

Primer 2068: TTCTCCACAGCCGGAGAAGGTGTAATTAGTTAGTCAGCATGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

Primer 2069: GGCAATCAAATACTGTTTCATCCGCTTCTCCTTGAGAATTACATATGAATATCCTCCTTAG
 Pérdida de la capacidad de formar biopelícula en
interfase aire-liquido en ausencia de Dam

N 0 1 2 3 4

S.E dam S.E 5694 N

4

3
Intensidad
2

0
S.E 5694 S.E ∆dam S.E
S.Edam S.EArJEG S.ESI3060
ArJEG S.E SI3060

Latasa C, García B, Echeverz M, Toledo-Arana A, Valle J, Solano C y Lasa I. 2012. J. Bacteriol. 2012, 194(14):3708
 Ensayo semi-cuantitativo de formación de biopelícula

Placa de 96 pozos de
Wt dam Wt Wt plástico de policloruro
de vinilo

250
S.E 5694
S.E 5694
200
S.Edam
S.E ∆dam
DO a / DO d (%)

150
S.EArJEG
S. E
100 ArJEG
S. E
S.E SI3060
50 SI3060

0
48 hs 72 hs
Genevaux P, Muller S, Bauda P. 1196. FEMS Microbiol Lett. 1996 Aug 15;142(1):27-30,
 Cambio en la expresión de los componentes de la matriz
extracelular en la cepa S.Edam respecto de las cepas
salvajes.

S.E 5694 S.E dam S.E ArJEG S.E SI3060

S.E dam

S.E 5694

Barnhart MM y Chapman MR. 2006. Annu Rev Microbiol. 60: 131–147,

 Curli

Serra y col. 2013 mBio 4(2):doi:10.1128/mBio.00103-13.

Barnhart MM y Chapman MR. 2006. Annu Rev Microbiol. 60: 131–147

-Los curli pertenecen a la clase de fibrillas tipo amiloides, las cuales actúan como
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) que activan la respuesta
inmune inflamatoria del huésped mediada por reconocimiento vía TLR2, y
posterior producción de citoquinas inflamatorias, entre ellas IL-17.
-Intervienen en procesos que pueden alterar la integridad de células de la
mucosa intestinal
- Adherencia a superficies y en la adhesión, agregación e invasión a tejidos del
huésped.
 Reducción en los niveles relativos de mRNA del gen csgD,
punto control de regulación de la formación de biopelícula, en
la cepa S.Edam respecto de la cepa salvaje.
Biopelícula Plantónico
3,00
*
Cantidad Relativa de mRNA

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50 *
*
0,00
S.ES.E
5694
5694 S.E dam
S.E Ddam S.EArJEG
S.E ArJEG S.E 5694
S.E 5694 dam
S.EDdam
S.E
(*p<0,05 respecto a S.E 5694)

S.E 5694 S.E dam S.E ArJEG

Identificación de potenciales sitios de metilación por
Dam, en el operon csgDEFG y en su contexto
genético

Los análisis in silico se desarrollaron con el software Vector NTI. El

diagrama se basa en la secuencia Refseq NC_011294 de S. enterica
serovar Enteritidis. Las líneas verticales marcadas con asterisco
indican la ubicación de motivos GATC. Los genes correspondientes a
un operon están indicados en el mismo color (csgDEFG, púrpura,
csgBA azul). Genes grises con línea punteada codifican proteínas
potenciales.
 Conclusiones
 Evidencia de la participación del regulador global de genes
Dam, en la regulación de la formación de biopelícula en S.
Enteritidis.
 Efecto directa o indirectamente en el gen csgD.
 Descripción de las vías de regulación en la producción de
biopelícula, relacionado con la capacidad de virulencia, la
expresión de factores de patogenicidad y la persistencia en
diferentes nichos ecológicos de S. Enteritidis.
 Cepas atenuadas mutantes dam de Salmonella,
propuestas como vacunas en aves y ganado, con deficiente
producción de biopelícula persistirían menor tiempo en el
ambiente y serían más susceptibles al efecto de antibióticos
y desinfectantes.
Dam parece ser un nuevo foco de estudio para modelos
de erradicación e ingeniería de biopelículas.
Compleja red de regulación génica por dilucidar
GRACIAS!