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7 Inmunogenicidad de proteínas terapéuticas

Wim Jiskoot, Theo Rispens y Grzegorz Kijanka

INTRODUCCIÓN la respuesta inmune también se interpretó como una respuesta

a proteínas extrañas. La correlación entre los defectos del gen
Las proteínas se utilizaron por primera vez como medicamentos a
del factor VIII y el nivel de deficiencia con la respuesta inmune
finales del siglo XIX, cuando se introdujeron los antisueros de
en pacientes con hemofilia confirmó esta explicación
animales para el tratamiento de infecciones graves, como la difteria
(Fakharzadeh y Kazazian Jr.2000). Sin embargo, de manera
y el tétanos. Sin embargo, debido a que dichos antisueros estaban
similar a las insulinas derivadas de animales, los protocolos de
cargados con proteínas extrañas al sistema inmunitario de los
purificación mejorados llevaron a niveles reducidos de
pacientes, a menudo provocaban efectos secundarios graves y, a
inmunogenicidad para algunos de los productos de proteína
veces, incluso mortales. En general, las personas que habían sido
humana.
tratadas tenían una advertencia en sus pasaportes o tarjetas de
El verdadero avance en la disponibilidad de proteínas
identificación para alertar a los médicos sobre una posible reacción
terapéuticas se produjo en la década de 1980, cuando las
anafiláctica después de una nueva provocación con un antisuero.
tecnologías de ADN recombinante permitieron la producción a
gran escala de proteínas altamente purificadas. En 1982, la
En la década de 1920, se introdujeron productos de
insulina humana se comercializó como la primera proteína
insulina porcina y bovina para tratar la diabetes. Muchos
derivada de ADN recombinante para uso humano. Desde
pacientes que recibieron estas insulinas desarrollaron
entonces han entrado en el mercado decenas de proteínas
anticuerpos que neutralizan la proteína (anticuerpos antidrogas,
recombinantes y algunos de estos productos, como los
ADA). En un principio, esto se había explicado por el origen
interferones y las epoetinas, se encuentran entre los
animal de los productos. Sin embargo, la reducción de la
medicamentos más utilizados en el mundo. Sin embargo,
inmunogenicidad de estos productos tras las mejoras en los
aunque estas proteínas se desarrollaron como copias cercanas
métodos de producción y el aumento de la pureza indicaron
de proteínas endógenas humanas, casi todas ellas inducen ADA,
claramente que el origen animal de la proteína no era el único
a veces incluso en la mayoría de los pacientes (Tabla7.1). Es
factor que conducía a su inmunogenicidad. En la segunda mitad
importante destacar que la mayoría de estos productos se usan
del siglo XX, se introdujeron en la clínica una serie de proteínas
en pacientes que no tienen una deficiencia innata y, por lo tanto,
humanas de fuentes naturales, como los factores de
se puede suponer que desarrollaron tolerancia inmunológica a
coagulación derivados del plasma y la hormona del crecimiento
la proteína.
producida a partir de las glándulas pituitarias de los cadáveres.
La suposición inicial fue que la producción mediante
Estos productos se administraron principalmente a niños con
tecnología recombinante en células huésped no humanas y el
una deficiencia innata que, por lo tanto, carecían de la tolerancia
procesamiento posterior modificaron las proteínas y la
inmunológica natural.
respuesta inmunológica fue la respuesta clásica a una proteína
extraña. Sin embargo, en algunos casos, eludir la tolerancia de
las células B podría ser la base de la respuesta de anticuerpos a
W. Jiskoot (*) · G. Kijanka los homólogos humanos. Este fenómeno aún no se comprende
División de Bioterapéutica, Centro Académico de Investigación de por completo, pero parece ser diferente de la respuesta
Medicamentos de Leiden (LACDR), Universidad de Leiden, Leiden,
inmunitaria contra antígenos extraños utilizados en las vacunas.
Países Bajos
Email:w.jiskoot@ lacdr.leidenuniv.nl Por otro lado, para los anticuerpos monoclonales terapéuticos,
normalmente hay determinantes presentes en la molécula que
T. Rispens
son extraños para el receptor (consulte la sección “Cuestiones
Departamento de Inmunopatología,
Sanquin, Ámsterdam, Países Bajos relacionadas específicamente con los anticuerpos
Email:t.rispens@sanquin.nl monoclonales”).

© Springer Nature Suiza AG 2019

DJA Crommelin et al. (eds.),Biotecnología Farmacéutica,https://doi.org/10.1007/978-3-030-00710-2_7
140 W. JISKOOT Y AL.
Terapéutico inmunogenicidad
proteína Velocidad (%) Referencia
Hormona de crecimiento 7–22 Rougeot et al. (1991)
Factor VIII 3–35 Oldemburg et al. (2015)
14–44
Insulina Fineberg et al. (2007)
interferón beta 2–47 Bertolotto et al. (2004)
monoclonal 0–89 Harding et al. (2010)
anticuerpos
interleucina-2 20–100 Prümmer (1997)
Tabla 7.1 - Lista no exhaustiva de proteínas recombinantes
mostrando reacciones inmunes tras la administración
Las manifestaciones clínicas de ambos tipos de reacción son
muy diferentes. La típica respuesta similar a la de una vacuna a las
proteínas extrañas ocurre en días o semanas. A menudo, una sola
inyección es suficiente para inducir una respuesta sustancial de ADA.
En general, se inducen altos niveles de anticuerpos neutralizantes y
una nueva exposición conduce a una reacción de refuerzo, lo que
indica una respuesta de memoria.
Sin embargo, el desarrollo de una respuesta
inmunitaria contra ciertas proteínas humanas
recombinantes puede requerir meses, a veces años, de
tratamiento crónico. Además, los anticuerpos secretados a
menudo no neutralizan la proteína terapéutica inyectada y, a
veces, incluso no manifiestan ningún efecto clínico aparente.
Además, en algunos casos estos ADA, especialmente cuando
se producen en cantidades bajas o moderadas, tienden a
desaparecer al poco tiempo de suspender el tratamiento y,
en ocasiones, incluso durante el mismo (Perini et al. 2001).
Además, esta respuesta no parece generar memoria
inmunológica. En pacientes tratados con interferón β
humano recombinante (rhIFNβ) u hormona de crecimiento
humana recombinante, la terapia a menudo se puede
pausar para permitir que los niveles de ADA disminuyan y
luego reiniciarse sin aumentar los títulos de ADA
(Schellekens y Casadevall2004; Perini et al.2001).
Por el contrario, la respuesta de ADA frente a
anticuerpos monoclonales terapéuticos como
adalimumab e infliximab sigue un patrón más clásico
(Brandse et al. 2016; Bartelds et al.2011), detectándose
ADA a las 2 semanas de iniciado el tratamiento. Además,
la gran mayoría de estos ADA son neutralizantes (van
Schie et al.2015a,2017); y el tratamiento intermitente con
infliximab se asocia con una mayor inmunogenicidad
(Han y Cohen2004).
LA RESPUESTA INMUNE
Las proteínas terapéuticas actualmente disponibles cubren todo
el espectro, desde completamente extrañas (p. ej., asparaginasa
derivada de bacterias) hasta completamente humanas (p. ej.,
interferón humano recombinante α-2b (rhIFNα-2b)), así como
proteínas no naturales, como las proteínas de fusión.
(p. ej., etanercept), anticuerpos truncados (p. ej.,
fragmentos Fab, nanocuerpos) y proteínas PEGiladas
(p. ej., rhIFNα PEGilado con PEG definido como
polioxietilenglicol).
Las proteínas extrañas provocan anticuerpos por la vía
clásica, que incluye la ingestión y escisión de las proteínas
en péptidos por macrófagos y células dendríticas,
presentación de péptidos por el sistema MHC (complejo
mayor de histocompatibilidad)-II y activación de células B, y
maduración por afinidad y cambio de isotipo de las células B
por el auxiliar CD4+células T. Además, inducen células B de
memoria (ver cap.14para detalles).
Está mucho menos claro cómo se elude la tolerancia de las
células B. Una de las teorías para explicar la formación de
anticuerpos contra una proteína terapéutica propia (similar a) fue
que la proteína agregada inducía exclusivamente la activación de
células B independientes de las células T a través del
entrecruzamiento de los receptores de células B por agregados de
proteínas que se asemejan a estructuras bacterianas o virales
(Moore y Leppert1980; Bachman et al.1993). Tales estructuras
presentan epítopos repetitivos en un patrón muy regular, lo que
permite un rápido reconocimiento como sustancia extraña e induce
una respuesta sin involucrar a los CD4.+células T. Sin embargo,
desde que se propuso por primera vez este mecanismo, numerosas
observaciones preclínicas y clínicas han indicado la participación de
CD4+Células T en la respuesta de anticuerpos contra proteínas
terapéuticas propias. durante CD4+Se producen respuestas
independientes de células T, principalmente IgM de baja afinidad,
pero en pacientes y en modelos animales se han observado
principalmente IgG. El cambio de isotipo eficiente es una de las
características distintivas de un CD4+Respuesta de células T. Sin
embargo, la producción de anticuerpos no neutralizantes en parte
de los pacientes sugiere una maduración de afinidad alterada.
Otra indicación de un CD4+El mecanismo dependiente
de células T es la observación de que ciertos alelos HLA se
correlacionan con una mayor probabilidad de formación de
ADA contra, por ejemplo, rhIFNβ, epoetina y mAb anti-TNF
(factor de necrosis tumoral) (Barbosa et al.2006; Moss et al.
2013; Praditpornsilpa et al.2009; Fijal et al.2008). Además, en
varios modelos animales CD4+El agotamiento de las células T
resultó en la abolición casi completa de la producción de
anticuerpos (revisado por Jiskoot et al.2016). Sin embargo,
todavía faltan explicaciones completas sobre la ocurrencia
de inmunogenicidad en solo una parte de los pacientes que
reciben la proteína, la formación frecuente de anticuerpos
no neutralizantes y la aparente falta de memoria
inmunológica.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FORMACIÓN DE ANTICUERPOS
CONTRA LAS PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS
Figura7.1describe los diferentes factores que influyen en la
inmunogenicidad (Schellekens2002a; Hermeling et al. 2004).
Estos factores se discutirán a continuación.
 7 INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS 141

Variación de secuencia glicosilación

A A
L humano L no humano
C S
norte
k norte
k
A T A F
T k yo k
FK FK

inmuno-
genicidad

Contaminantes y Solicitud
impurezas ruta Dosis
Formulación

Longitud de Desconocido
tecnología de ensayo Características del paciente
tratamiento factores

Febrero

Figura 7.1-Factores que influyen

Schellekens, Nature Reviews Drug Discovery, 2002 en la inmunogenicidad

- Factores Estructurales Además, en ciertas poblaciones, los anticuerpos IgE

La similitud de la secuencia de una proteína terapéutica con
la de la contraparte humana es uno de los factores que
determinan la probabilidad de una respuesta de ADA contra
la proteína terapéutica. Sin embargo, el grado de no propio
que es necesario para inducir una respuesta de tipo vacuna
depende en gran medida de la proteína involucrada y del
sitio de divergencia de la secuencia natural de la proteína
endógena. Por ejemplo, mutaciones únicas en la inulina
pueden conducir a un nuevo epítopo y una respuesta ADA,
mientras que otras mutaciones no tienen ninguna influencia;
y el IFNα de consenso, en el que más del 10% de los
aminoácidos divergen del subtipo de IFNα natural más
cercano, no es más inmunogénico que el homólogo de
IFNα-2. Además, algunas proteínas no naturales, como
etanercept, son relativamente poco inmunogénicas.
La glicosilación es otro factor estructural importante para
la inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas. Hay pocas
pruebas de que la glicosilación modificada, por ejemplo,
mediante la expresión de glicoproteínas humanas en células
vegetales u otros huéspedes eucariotas no humanos, pueda
inducir una respuesta inmunitaria (Singh2011). Sin embargo, el
nivel de glicosilación tiene un efecto claro. Por ejemplo, el
rhIFNβ producido enE. coli(no glicosilado) es mucho más
inmunogénico que el rhIFNβ producido en células de mamífero.
Esto puede explicarse por la mayor hidrofobicidad, lo que
provoca mayores niveles de agregación en los no glicosilados.E.
coli-producto derivado.
preexistentes contra los glucanos no humanos presentes en
cetuximab provocaron reacciones anafilácticas graves (Chung et
al.2008).
- impurezas
Las impurezas se consideran factores de riesgo importantes para la
inmunogenicidad de los productos proteicos terapéuticos. Entre las
impurezas clínicamente relevantes, los agregados de proteínas han
recibido la mayor atención; la presencia de agregados es
ampliamente aceptada como uno de los factores de riesgo más
importantes para la inmunogenicidad. La agregación puede ser
provocada por una variedad de factores, como el estrés térmico, el
cambio de pH, la agitación, la congelación y la radiación ultravioleta.
Es importante destacar que los agregados pueden inducirse en cada
paso del proceso de producción, así como durante el
almacenamiento, el envío y la administración del producto (cf. Cap.5
). Se cree que la agregación es una de las principales causas de la
inmunogenicidad de, por ejemplo, la hormona del crecimiento
humana y el rhIFNβ-1b (Moore y Leppert1980; Bernard et al.2013).
Sin embargo, la agregación no es el único factor de riesgo y los
productos que contienen pequeñas cantidades de agregados
también pueden ser muy inmunogénicos.
La modificación química de las proteínas humanas, por ejemplo,
la oxidación, podría conducir a la formación de neoepítopos que podrían
ser reconocidos por el sistema inmunitario de un paciente y
desencadenar ADA. Además, como se ha demostrado en numerosos
estudios con animales, los anticuerpos inducidos por
 142 W. JISKOOT Y AL.
Las proteínas modificadas químicamente pueden reaccionar de forma
cruzada con proteínas no modificadas (Jiskoot et al.2016).
Además de los agregados y las proteínas modificadas
químicamente, las sustancias derivadas del proceso de
producción, como los componentes de la célula huésped, las
resinas de las columnas cromatográficas, las enzimas utilizadas
para activar el producto y los anticuerpos monoclonales
utilizados para la purificación por afinidad, pueden terminar en
el producto final. Los componentes de la formulación también
pueden introducir impurezas, pueden filtrarse del recipiente y
del sellado del producto o pueden introducirse durante los
pasos de llenado y acabado. Estas impurezas pueden ser
inmunogénicas por sí mismas y, por lo tanto, provocar una
respuesta inmunitaria diferente a la de la proteína terapéutica.
Además, los lipopolisacáridos de células huésped bacterianas y
el ADN de células huésped bacterianas ricas en GC son ejemplos
de impurezas que pueden actuar como adyuvantes. Los
anticuerpos inducidos por impurezas pueden provocar
reacciones inmunitarias generales, como reacciones cutáneas,
- Formulación
Las proteínas terapéuticas humanas recombinantes a menudo
son altamente biológicamente activas y las dosis pueden estar
en el nivel de μg, lo que hace que sea un desafío tecnológico
formular el producto y mantenerlo estable con una vida útil
razonable (cf. Cap.5). La importancia de diseñar una formulación
adecuada para evitar la inmunogenicidad se destaca en dos
casos históricos. En el caso de rhIFNα-2a, se observó una gran
diferencia en la inmunogenicidad entre las diferentes
formulaciones (Fig.7.2). Una formulación liofilizada, que
contenía albúmina sérica humana como estabilizador y que,
según sus instrucciones, podía conservarse a temperatura
ambiente, fue más inmunogénica en un estudio clínico que
otras formulaciones. Parecía que a temperatura ambiente, el
rhIFNα-2a se oxidaba parcialmente. Esto condujo a la formación
de agregados, que muy probablemente fueron los responsables
de la respuesta inmune (Ryff1997).
2000
1800
Liofilizado/almacenado a temperatura ambiente (n = 190)
1600
1400
Unidades neutralizadoras de IFN
1200
1000
800
600
400
200
0 inmunogenicidad entre formulaciones
0 1 2 3 4 5
Duración del tratamiento (meses)
Curiosamente, los estudios en modelos animales han confirmado
que los agregados inducidos por la oxidación son degradantes
particularmente inmunogénicos (Jiskoot et al.2016).
En el segundo caso, se produjo una forma grave de
anemia mediada por ADA (aplasia pura de glóbulos rojos; PRCA)
después de cambiar la formulación de un producto de epoetina-
α (Casadevall et al.2002). La albúmina de suero humano se
reemplazó por glicina y polisorbato 80. Todavía no se sabe con
certeza cómo este cambio de formulación condujo a una mayor
incidencia de inmunogenicidad, pero se ha postulado que la
nueva formulación es ligeramente menos estable, lo que da
como resultado la formación de agregados cuando el producto
no es manejado apropiadamente (Schellekens y Jiskoot2006).
- Ruta de administración
Históricamente, la vía subcutánea se consideraba la más
inmunogénica y la intravenosa la menos inmunogénica entre las
vías de administración utilizadas para las proteínas terapéuticas
(Schellekens2002b). Sin embargo, la comparación directa de las
vías de administración es un desafío, ya que el régimen de
tratamiento y/o la formulación deben ajustarse para compensar
la farmacocinética alterada y, por lo general, la biodisponibilidad
disminuida tras la inyección subcutánea (Richter et al.2012),
todo lo cual puede influir en el riesgo de una respuesta
inmunitaria. Las formulaciones subcutáneas generalmente
difieren de las intravenosas porque la administración
subcutánea generalmente requiere volúmenes de inyección más
bajos. En general, la influencia de la vía de administración sobre
la inmunogenicidad parece depender en gran medida del
producto. Mientras que para algunos productos la vía
subcutánea parece estar asociada con un mayor riesgo de
inmunogenicidad en comparación con la vía intravenosa, para
otros la influencia de la vía de administración parece ser
insignificante (Hamuro et al.2017). Sin embargo, la
inmunogenicidad puede ocurrir después de la administración de
una proteína terapéutica a través de cualquier vía de aplicación.
B (n = 86)
C (n = 110)
D (n = 81)
E (n = 74) Figura 7.2-Diferencias de
6 7 8 de rhIFNα-2a en pacientes (figura
adaptada de Ryff1997)

- Dosis
El efecto de la dosis no está del todo claro. Hay estudios con la
incidencia más baja de formación de ADA en el grupo de dosis
más alta (Maini et al.1999; Administración de Alimentos y
Medicamentos2002; Ross et al.2000). Sin embargo, tales datos
deben interpretarse con cautela. En el grupo de dosis más alta,
los niveles de proteína terapéutica más altos en la circulación
pueden interferir con el ensayo, o el nivel de ADA medido puede
ser más bajo debido a una mayor formación de
inmunocomplejos.
- Características del paciente
Varios factores relacionados con el paciente pueden influir en la
incidencia de formación de ADA. Por ejemplo, muchos de los
pacientes que reciben anticuerpos monoclonales están
inmunocomprometidos por enfermedades como el cáncer o por
un tratamiento inmunosupresor. Estos pacientes tienen menos
probabilidades de producir ADA que los pacientes con un estado
inmunitario normal. Puede ocurrir un efecto contrario en
pacientes que padecen infecciones crónicas (como hepatitis):
estos pacientes pueden ser más propensos a desarrollar ADA,
como se observó para rhIFNα-2 (Antonelli y Dianzani1999).
Hay varias indicaciones de que eludir la tolerancia
de las células B depende del tipo de HLA. Esto puede
explicar, al menos en parte, por qué algunas personas o
poblaciones producen ADA y otras no cuando se tratan
con el mismo producto. Por ejemplo, se informaron
asociaciones entre el tipo HLA y la formación de ADA
para infliximab (Billiet et al.2015).
En muchos pacientes tratados con proteínas terapéuticas,
los ADA se encuentran antes del inicio del tratamiento (Gorovits
et al.2016). Estos llamados ADA preexistentes podrían formarse
contra estructuras, por ejemplo, glucanos comunes que se
parecen mucho a los epítopos presentes en la proteína
terapéutica. En muchos de estos pacientes, la ADA preexistente
no parece tener ningún impacto en la seguridad o eficacia de la
terapia. Sin embargo, dado que algunos pacientes que dan
positivo en la prueba de ADA preexistente pueden ser más
susceptibles a los efectos secundarios agudos o al desarrollo de
títulos altos de ADA, los ADA preexistentes se consideran un
factor de riesgo de inmunogenicidad.
- Ensayos para anticuerpos
Los ensayos son probablemente un factor importante que
influye en la incidencia notificada de inducción de ADA por
proteínas terapéuticas. En los estudios publicados con rhIFNα-2
en pacientes con infecciones virales, la incidencia de inducción
de ADA varió del 0% a más del 60% de pacientes positivos. Se ha
observado una variación similar con rhIFNβ (van Beers et al.
2010). Esta variación debe estar relacionada con el ensayo. Las
evaluaciones del desempeño de diferentes laboratorios de
prueba con pruebas de panel ciego mostraron una diferencia de
más de 50 veces en los títulos encontrados en los mismos
sueros. Por lo tanto, cualquier comparación confiable entre
diferentes grupos de pacientes al buscar un efecto clínico de
7 INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS 143
La ADA o el estudio de factores que influyen en la inmunogenicidad
solo se puede realizar si la cuantificación de anticuerpos se realiza
con un ensayo bien validado en el mismo laboratorio.
Esta situación persistió para la evaluación de la formación
de anticuerpos contra los inhibidores del TNF (infliximab,
adalimumab), lo que resultó en tasas de incidencia que oscilaron
entre 0 y 87 % en el caso de adalimumab (Vincent et al.2013).
Varios factores explican estas grandes discrepancias entre los
estudios, pero se encontró que un factor en particular era de
suma importancia: la interferencia de fármacos. En particular,
para los anticuerpos monoclonales terapéuticos se usan altas
dosis que dan como resultado altas concentraciones del
anticuerpo terapéutico en la sangre. Entonces, las muestras de
suero contendrán cantidades considerables de proteína
terapéutica que pueden interferir con la detección de ADA. En
consecuencia, se han hecho muchos esfuerzos para diseñar
ensayos que superen esta interferencia, dando como resultado
ensayos que son "tolerantes a los fármacos" en grados variables
(Bloem et al.2015).
La relación entre las concentraciones de anticuerpos
terapéuticos y ADA es importante, no solo para la detección de
ADA, sino también para el impacto de ADA en la eficacia. A
menudo, la principal consecuencia de la formación de ADA es la
reducción de las concentraciones de proteínas "activas". Por lo
tanto, pequeñas cantidades de ADA sin un efecto notable en las
concentraciones de proteína pueden detectarse con un ensayo
moderno de tolerancia a fármacos, pero estos ADA no tienen
impacto en la eficacia (van Schouwenburg et al.2013a).
Recomendaciones para ensayos de anticuerpos
Hay una falta de estandarización de la metodología de ensayo, y
solo están disponibles unas pocas preparaciones de anticuerpos
de referencia y/o estándar. Sin embargo, aparecieron varios
artículos con recomendaciones para establecer y validar
inmunoensayos para pruebas de inmunogenicidad (Mire-Sluis et
al.2004; Shankar et al.2008,2014). A continuación se presenta
una breve discusión de estas recomendaciones.
Un solo ensayo puede no ser suficiente para evaluar la
inmunogenicidad de una nueva proteína terapéutica. Es posible que
se deba utilizar una serie de ensayos en conjunto. La mayoría de las
estrategias de análisis de anticuerpos se basan en un enfoque de
dos niveles: un análisis de detección + confirmación para identificar
los sueros positivos para ADA, seguido de una caracterización
adicional, por ejemplo, determinación del título, afinidad e isotipo de
ADA. La cuantificación puede ser especialmente útil, dado que los
niveles de ADA pueden variar ampliamente entre los individuos y el
impacto clínico potencial de una respuesta de ADA generalmente se
relaciona con el grado de formación de anticuerpos.
En general, el ensayo de detección es un ensayo de unión,
a menudo un tipo de ensayo puente (ya sea ELISA o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (cf. Cap.3) o
electroquimioluminiscencia) con la metodología radio-inmune-
precipitación como alternativa. Los ensayos de detección son
144 W. JISKOOT Y AL.
diseñado para una sensibilidad óptima para evitar falsos negativos
y, a menudo, el punto de corte (es decir, umbral positivo/negativo)
para el ensayo se establece en un nivel de falso positivo del 5 %
mediante el uso de un panel de sueros humanos normales y/o
sueros de pacientes no tratados representativa de los colectivos a
tratar. Los resultados tendrían que evaluarse junto con un ensayo de
confirmación que evalúe aquellas muestras que resulten positivas
en el ensayo de detección. El ensayo de confirmación puede ser el
mismo ensayo de cribado, en el que se añade un exceso de proteína
terapéutica no marcada para evaluar si se reduce la señal. Además,
se define un punto de corte de confirmación más estricto para
garantizar que solo las muestras positivas "verdaderas" se
identifiquen como tales.
Un tema que complica la determinación del punto de
corte es la posible existencia de anticuerpos preexistentes.
En casos raros (p. ej., cetuximab, véase más arriba), estos
pueden tener consecuencias clínicas. Más a menudo, los
anticuerpos preexistentes contra una proteína terapéutica
pueden detectarse en una fracción (pequeña) de individuos
sin un impacto clínico claro (Xue y Rup2013). Esto debe
tratarse caso por caso (Gorovits et al. 2016). Un tipo común
de anticuerpos preexistentes que se encuentra en la
mayoría de los pacientes con artritis reumatoide, pero
también en un pequeño porcentaje de la población general,
es el llamado "factor reumatoide", anticuerpos de baja
afinidad que se unen a la porción Fc de la IgG humana. No
hay evidencia de que estos anticuerpos sean relevantes en la
evaluación de la inmunogenicidad y se deben tomar
medidas para evitar su medición (van Schie et al.2015b). Los
anticuerpos contra los grupos PEG unidos a las proteínas
son otro fenómeno comúnmente observado, aunque su
medición precisa aún está en pañales, lo que dificulta la
evaluación de su riesgo potencial (Krishna et al.2015;
Schellekens et al.2013).
El ensayo para neutralizar anticuerpos es en general una
modificación del ensayo de potencia para el producto de
proteína terapéutica. El ensayo de potencia es en la mayoría de
los casos un in vitroensayo basado en células. Se añade una
cantidad predefinida de producto al suero y luego se evalúa una
reducción de la actividad en el bioensayo. Una alternativa
apropiada es el ensayo de unión de ligandos competitivos, que
evalúa la reducción en la unión al objetivo (Finco et al.2011). El
último tipo de análisis es mucho más fácil de configurar y
validar, y puede preferirse a menos que exista el riesgo de que
se formen anticuerpos contra la proteína terapéutica que
neutralicen su actividad a través de un mecanismo que no sea la
prevención de la unión al objetivo.
CUESTIONES ESPECÍFICAMENTE RELACIONADAS CON LOS ANTICUERPOS
MONOCLONALES
La primera generación de anticuerpos monoclonales fue de origen
murino. Indujeron una respuesta inmunitaria en la mayoría de los
pacientes, ya que las proteínas extrañas deberían desencadenar una
respuesta inmunitaria clásica de tipo vacuna. Este
la llamada HAMAresponse (anticuerpos humanos contra anticuerpos
murinos) fue una restricción importante en el éxito clínico de estos
anticuerpos murinos. Con el paso de los años, sin embargo, se
introdujeron métodos para humanizar (totalmente) los anticuerpos
monoclonales (cf. Cap.8). Se utilizó tecnología de ADN recombinante
para intercambiar las partes constantes murinas de las cadenas de
inmunoglobulina con sus contrapartes humanas, lo que resultó en
anticuerpos monoclonales quiméricos. El siguiente paso fue injertar
regiones determinantes de la complementariedad (CDR) murinas,
que determinan la especificidad, en un esqueleto de
inmunoglobulina humana creando anticuerpos monoclonales
humanizados. El paso final fue el desarrollo de animales
transgénicos, tecnologías de presentación de fagos y otros
desarrollos que permitieron la producción de anticuerpos
monoclonales completamente humanos. La suposición de que los
anticuerpos monoclonales humanos no tendrían inmunogenicidad
resultó errónea. Aunque la humanización ha reducido la
inmunogenicidad, incluso los anticuerpos monoclonales
completamente humanos pueden inducir anticuerpos, como se
ilustra en la Fig.7.3.
Como se discutió, múltiples factores pueden causar la
inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas humanas, incluidos
los anticuerpos monoclonales. Uno de ellos es la agregación. De
hecho, en estudios clásicos realizados hace más de 40 años, se
usaron preparaciones de inmunoglobulina agregada para romper la
tolerancia de las células B (Weigle1971). Más recientemente, varios
estudios preclínicos han indicado que los agregados mejoran la
inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales (revisado por
Jiskoot et al.2016). Sin embargo, también los productos mAb que
contienen cantidades muy bajas de agregados pueden ser
altamente inmunogénicos. A diferencia de otras proteínas humanas
recombinantes, los anticuerpos monoclonales, incluso cuando son
completamente humanos, pueden exponer epítopos extraños en
sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). De
hecho, el análisis de varios anticuerpos monoclonales confirmó que,
en la mayoría de los casos, los CD4 extraños+Los epítopos de células
T se encuentran principalmente dentro de la secuencia CDR (Harding
et al.2010).
Los anticuerpos monoclonales tienen propiedades que
pueden contribuir a su inmunogenicidad. Pueden activar las
células T por sí mismos y pueden estimular la respuesta
inmunitaria mediante sus funciones Fc, como la activación de
macrófagos y la activación del complemento. De hecho, la
eliminación o modificación de unidades de azúcar específicas de
las cadenas de glucosilo unidas a N de la parte Fc de la
inmunoglobulina puede reducir la función Fc y conducir a una
inmunogenicidad disminuida (Liu2015).
La molécula a la que se une un anticuerpo también
influye en su inmunogenicidad. Los anticuerpos monoclonales
dirigidos a antígenos unidos a células generalmente inducen un
nivel más alto de ADA que aquellos dirigidos a objetivos solubles
(Harding et al.2010). Los anticuerpos monoclonales dirigidos a
antígenos en las células inmunitarias con el fin de inducir la
supresión inmunitaria también suprimen una respuesta
inmunológica.
 7 INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS 145

a sin ADA b buen respondedor

Baja ADA Respondedor moderado

Figura 7.3-Impacto de
no respondedor inmunogenicidad en el nivel sérico
Alta ADA
12 100 y eficacia del tratamiento del
anticuerpo monoclonal
10 80 completamente humano
adalimumab. (a) La concentración
Adalimumab [mg/ml]

8 de adalimumab en suero se ve

Porcentaje
60 alterada por la presencia de ADA.
6 Título bajo corresponde
de ADA a
40 12 a 100 AU/mL, un título alto
4 de ADA corresponde a >100 AU/
mL de ADA. *p < 0,05, **p <
20 0,01. (b) En pacientes con títulos
2
altos de ADA, el tratamiento se
0 0 ve más dificultado que en
0 4 28 pacientes con ADA moderada o

A
dieciséis

A
AD

AD

AD
Tiempo [semana] nula (figura adaptada de

ja

ta
si
Bartelds et al.2011)

Ba

Al
Aunque para una serie de proteínas terapéuticas, más Ejemplos de terapéutica
inyecciones y dosis más altas se asocian con una mayor Consecuencia clínica proteinas
respuesta inmunitaria, para los anticuerpos terapéuticos esto Pérdida de eficacia • Insulina animal y humana
puede no ser aplicable. De hecho, las dosis más bajas y el recombinante (rh)
• Factor VIII (tanto natural como rh)
tratamiento episódico generalmente se asocian con una mayor
• Rh Interferón alfa 2
formación de anticuerpos (Han y Cohen2004). Aunque esto • Interferón Rh beta
puede deberse en parte a que los ensayos de ADA no detectan • Interleucina Rh 2
anticuerpos en presencia de altas concentraciones de proteínas • Gonadotropina coriónica humana
terapéuticas (consulte la sección anterior), se informó la • Anticuerpos monoclonicos

formación transitoria de anticuerpos tanto para infliximab como Neutralización de • Factor de crecimiento derivado de

para adalimumab, utilizando ensayos de tolerancia a fármacos proteína endógena megacariocitos Rh

• Epoetina
para medir la respuesta de ADA. (van de Casteele et al.2013; van
Schouwenburg et al.2013b). Podría estar operativo un No biológica aparente • hormona de crecimiento Rh

fenómeno llamado "tolerancia a dosis altas", en el que el consecuencia • insulina Rh

antígeno soluble supera al sistema inmunitario. Efectos inmunológicos generales • Varias proteínas terapéuticas
1. Alergia
Otro aspecto importante al estudiar la inmunogenicidad de
2. Enfermedad del suero
los anticuerpos monoclonales es el momento de la toma de
3. Anafilaxia
muestras de sangre de los pacientes. Estos productos pueden tener 4. Sitio de inyección
una vida media relativamente larga (hasta varias semanas) y el reacciones
producto circulante puede interferir con la detección de anticuerpos
inducidos y puede dar lugar a resultados falsos negativos. Puede ser Tabla 7.2 - Ejemplos de consecuencias clínicas de inmuno-
genicidad de las proteínas terapéuticas (adoptado de Schellekens
necesario tomar muestras de suero hasta 20 semanas después de
2002a; Malucchi y Bertolotto2008)
que el paciente haya recibido la última inyección para evitar la
interferencia de los anticuerpos monoclonales terapéuticos
circulantes. Además, los anticuerpos naturales, los receptores La complicación más dramática e indiscutible ocurre cuando
solubles y los complejos inmunitarios pueden interferir con los los anticuerpos contra el producto neutralizan de forma cruzada un
ensayos y dar lugar a resultados falsos positivos o falsos negativos. factor endógeno con una función biológica importante. Esto se ha
descrito para un factor de crecimiento y diferenciación de
megacariocitos que inducía anticuerpos que reaccionaban de forma
cruzada con la trombopoyetina endógena (ver Tabla7.2). Los
EFECTOS CLÍNICOS DE LOS ANTICUERPOS INDUCIDOS
voluntarios y los pacientes de un ensayo clínico desarrollaron una
La lista de productos proteicos con relevancia clínica trombocitopenia grave y necesitaron transfusiones de plaquetas.
los efectos secundarios relacionados con la inmunogenicidad están aumentando Debido a esta complicación, el producto
de un mayormás
fue retirado (Schellekens2002a; Malucchi y Bertolotto2008). La consecuencia desarrollo.
común es la pérdida de eficacia. A veces,
esta pérdida se puede superar aumentando la dosis o cambiando a otro Otro ejemplo es el aumento de PRCA (ver arriba)
producto.
asociado con un cambio de formulación de epoetin-α
comercializado fuera de los EE. UU. los anticuerpos
146 W. JISKOOT Y AL.

inducido por el producto neutralizó la eritropoyetina
endógena residual en estos pacientes, dando como
resultado una anemia severa que solo podía tratarse con
transfusiones de sangre.
ADA también puede influir en los efectos secundarios de las
proteínas terapéuticas. Las consecuencias dependen de la causa de
los efectos secundarios. Si los efectos adversos son el resultado de la
actividad intrínseca de la proteína, los anticuerpos pueden reducir
los efectos secundarios, como es el caso del rhIFNα-2. A veces, la
mitigación de los efectos secundarios es incluso el primer signo
clínico de la inducción de ADA.
Con algunos productos, los efectos secundarios son causados
por la formación de ADA. En general, este es el caso cuando el
producto se administra en dosis relativamente altas, como con
algunos anticuerpos monoclonales. Los síntomas causados por los
inmunocomplejos, como la hipersensibilidad de tipo retardado y la
enfermedad del suero, están relacionados con el nivel de
Por ejemplo, la inmunogenicidad más alta del interferón beta 1b
(Betaferon) que del interferón beta 1a (Avonex) probablemente
sea el resultado combinado de las diferencias en el régimen de
tratamiento y la calidad del producto (Bertolotto et al. 2004).
Además, los mecanismos inmunitarios que conducen a la
inducción de anticuerpos por parte de las proteínas terapéuticas
aún no se conocen por completo. En consecuencia, según
nuestro conocimiento actual, es imposible predecir
completamente la inmunogenicidad de un nuevo producto en
una población de pacientes, y mucho menos en pacientes
individuales. Sin embargo, las autoridades exigen una
evaluación del riesgo de inmunogenicidad y posibles estrategias
de mitigación para todos los productos nuevos. Las
herramientas más utilizadas para evaluar el riesgo relativo de
inmunogenicidad se resumen en la Tabla7.3.
- Herramientas para evaluar la inmunogenicidad

anticuerpos inducidos.
Los efectos generales causados por una reacción inmunitaria a
una proteína terapéutica, como anafilaxia aguda, hipersensibilidad,
reacción cutánea, enfermedad del suero, etc., son relativamente
comunes cuando se administran grandes cantidades de proteínas no
humanas. Estos efectos son relativamente raros para las proteínas
humanas recombinantes administradas en cantidades relativamente
bajas, pero aún son relativamente comunes durante el tratamiento con
altas dosis de anticuerpos monoclonales.
EVALUACIÓN Y REDUCCIÓN DEL RIESGO DE
INMUNOGENICIDAD
La aparición de inmunogenicidad rara vez es el resultado de un solo
factor de riesgo (cf. Fig.7.1). Por el contrario, varios factores que
funcionan sinérgicamente pueden desencadenar la inmunogenicidad.
Según los conocimientos actuales, CD4+Las células T son actores
clave en la inmunogenicidad. Por lo tanto, uno de los enfoques
más utilizados para evaluar el riesgo de inmunogenicidad es un
en silicoanálisis de CD4+Epítopos de células T, es decir, péptidos
cortos dentro de la secuencia proteica capaces de unirse a
moléculas MHC II. Se han desarrollado múltiples algoritmos
para este propósito (revisado por Jawa et al.2013). En términos
generales, los CD4 de mayor afinidad+Cuanto mayor sea el
número de epítopos de células T que contiene una proteína,
mayor es el riesgo esperado de inmunogenicidad. Los
desarrollos recientes en la comprensión del sistema
inmunológico permitieron mejoraren silicoalgoritmos de
predicción. En lugar de evaluar el número total/general de CD4+
Epítopos de células T, actualmente epítopos para CD4 efector y
regulador+Las células T se pueden discriminar (Cousens et al.
2014). anal combinado

Herramienta de evaluación ventajas Contras

en silico • CD4+Predicción de epítopos 1. Rápido y barato 1. Tendencia a ser demasiado predictivo

de células T
• Célula T reguladora
predicción de epítopos
in vitro • Captación y activación de
células dendríticas
• CD4+activación de células T
• Unión MHC II
En vivo • Roedores no transgénicos
• Roedores transgénicos
• Primates no humanos
2. Útil como primer paso de la evaluación de la
inmunogenicidad
3. Permite el diseño o la selección de variantes
de proteínas menos inmunogénicas
1. Relativamente rápido y barato
2. Habilitar el estudio de productos formulados
(evaluando factores distintos a la secuencia
primaria)
3. Algunos ensayos pueden permitir estudiar el
efecto biológico
1. (Por lo general) presencia de un sistema
inmunitario completo y funcional
2. Procesos inmunitarios similares a los de los
pacientes
3. Se pueden estudiar varios factores que
influyen en la inmunogenicidad.
4. En algunos modelos, es posible estudiar el
efecto biológico.
2. Resultados basados exclusivamente en la
secuencia primaria
3. La calidad de los resultados depende del grado de
comprensión del proceso estudiado
4. Poder de traducción limitado
1. La calidad de los resultados depende en gran medida del
formato del ensayo
2. Se requieren células de un gran conjunto de
donantes representativos
3. Centrarse en células inmunitarias aisladas
4. Poder de traducción limitado
1. Consume mucho tiempo y es costoso
2. El poder de traducción depende de la proteína y
el modelo animal.
3. El sistema inmunitario del modelo utilizado difiere del
del paciente en diversos grados (ratones no
transgénicos frente a ratones transgénicos)

Tabla 7.3-Herramientas utilizadas para evaluar la inmunogenicidad de las proteínas (adoptadas de Brinks et al.2013; Kijanka et al.2012)

ysis de efector y regulador CD4+El análisis de células T
puede ser más confiable que el análisis de CD4 total+
Epítopos de células T. Sin embargo, como estos enfoques se
basan exclusivamente en la secuencia primaria de la proteína y
no tienen en cuenta otros factores como el plegamiento de la
proteína, las modificaciones postraduccionales, la presencia de
impurezas y la complejidad de la interacción entre diferentes
células inmunitarias, su poder de predicción es limitado,
especialmente para Proteínas propias.
Otro enfoque está representado por una serie de in vitro
herramientas, como CD4+Pruebas de estimulación de células T y
unión a MHC II. Aunque, al igual queen silicoherramientas, estos
ensayos no representan completamente la complejidad del sistema
inmunológico, pero sí permiten evaluar el impacto de los factores
relacionados con la formulación en el riesgo de inmunogenicidad.
Por lo tanto, pueden ser utilizados para la validación deen silico
resultados y para medir la inmunogenicidad relativa de diferentes
variantes de proteínas o diferentes formulaciones de la misma
proteína.
Un tercer tipo de herramienta de evaluación de la
inmunogenicidad es un conjunto deen vivomodelos que van
desde ratones de tipo salvaje y transgénicos hasta primates no
humanos (Jiskoot et al.2016; Brink et al.2013). El principal
beneficio de en vivomodelos es que la complejidad del sistema
inmunológico de un animal es similar a la de los pacientes. Por
lo tanto, podrían usarse no solo para evaluar la
inmunogenicidad, sino también para estudiar los mecanismos
inmunitarios y proporcionar información sobre los posibles
efectos clínicos de la inmunogenicidad.
- Reducción de la inmunogenicidad
Se están aplicando varias estrategias para reducir la
inmunogenicidad. En una etapa temprana de desarrollo, se
puede alterar la secuencia de aminoácidos de la molécula
candidata líder para eliminar secuencias potencialmente
inmunogénicas o propensas a agregados (Griswold y Bailey-
Kellogg2016). Una vez que se ha elegido el principio activo, la
inmunogenicidad se puede reducir rediseñando la formulación
y/o el régimen de tratamiento. Como se discutió anteriormente,
la mejora en la calidad de los primeros productos proteicos
terapéuticos dio como resultado una reducción considerable de
la inmunogenicidad. Muchas terapias de proteínas,
especialmente mAbs, se usan en combinación con
medicamentos inmunosupresores. Medicamentos como el
metotrexato, la rapamicina o la aziotioprina pueden inhibir
fuertemente la formación de anticuerpos, pero los pacientes
pueden ser más propensos a infecciones o malignidad (de
Mattos et al.2015). Otra estrategia es una inducción de
tolerancia específica hacia la proteína. Se ha observado que la
administración de dosis altas de factor VIII puede inducir
tolerancia en pacientes hemofílicos con anticuerpos contra el
factor VIII (Aledort 1994). Otra estrategia propuesta
recientemente para la inducción de tolerancia específica es la
coadministración de péptidos reconocidos por las células T
reguladoras (Tregitopes) con el
7 INMUNOGENICIDAD DE LAS PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS 147
proteína de interés. Estos tregitopos activan las células T
supresoras (o reguladoras), lo que puede resultar en
tolerancia hacia la proteína terapéutica administrada
(Jawa et al.2013).
CONCLUSIONES
Los puntos más importantes de este capítulo se
resumen en los siguientes puntos:
• La inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas es
un fenómeno común
• Las consecuencias clínicas pueden variar ampliamente
• Los métodos de detección validados son esenciales para estudiar la
inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas
• La predicción de la inmunogenicidad en pacientes basada
en caracterizaciones fisicoquímicas y estudios en
animales no es fácil
• Todavía queda mucho por aprender sobre por qué y cómo los
pacientes producen anticuerpos contra las proteínas
terapéuticas
La creciente conciencia de la importancia de la
inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas se ilustra
con la adopción de un requisito estándar en los
expedientes regulatorios para nuevas proteínas y
biosimilares para evaluar su inmunogenicidad en
ensayos clínicos (cf. Cap.12).
PREGUNTAS DE AUTOEVALUACIÓN
- Preguntas
1. ¿Qué factores contribuyen a la inmunogenicidad no deseada
de las proteínas terapéuticas?
2. ¿Cuáles son las posibles consecuencias clínicas de la formación de
anticuerpos contra biofarmacéuticos en pacientes?
3. ¿Por qué los agregados de proteínas humanas recombinantes
inducen anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con la
proteína (no agregada)?
4. Explique la diferencia fundamental entre (a) la formación
de anticuerpos en niños con deficiencia de hormona de
crecimiento tratados con hormona de crecimiento
humana recombinante y (b) la formación de anticuerpos
contra epoetina en pacientes con insuficiencia renal
crónica.
5. Da un ejemplo de un caso que demuestre que la
formulación de un biofármaco puede afectar la
respuesta inmune.
6. Mencione al menos 3 enfoques que se pueden seguir para
reducir la inmunogenicidad de un producto biofarmacéutico.
7. ¿Por qué es importante la estandarización de los ensayos para la
detección de ADA?
8. ¿Por qué los títulos de ADA contra un anticuerpo monoclonal son
más difíciles de determinar con precisión que los anticuerpos
contra el interferón?
 148 W. JISKOOT Y AL.
- respuestas
1. Consulte la figura.7.1.
2. Reducción de la eficacia terapéutica, (rara vez) mejora
de la eficacia, reacciones anafilácticas, reactividad
cruzada con proteínas endógenas.
3. Los agregados pueden eludir la tolerancia de las células B frente a
epítopos nativos (similares); cuanto más 'similar al nativo' sea el
agregado, más probable será que se produzca una reactividad
cruzada de los anticuerpos provocados con el monómero.
4. (a) es la respuesta inmunitaria clásica frente a (b) eludir la
tolerancia de las células B.
5. Los ejemplos que se dan en el texto son la epoetina y el
interferón α.
6. Diseñe otra formulación, elimine los agregados, cambie el
patrón de glicosilación de la proteína o use mutantes de
aminoácidos, use versiones humanizadas de las
proteínas o seleccione otra vía de administración.
NÓTESE BIEN. Algunos de estos enfoques conducirán a
un nuevo fármaco, lo que tiene implicaciones en la forma
en que las autoridades juzgarán el procedimiento a
seguir para obtener la aprobación de comercialización.
7. Los diferentes formatos de ensayo y programas de muestreo
de sangre dan respuestas diferentes y, por lo tanto,
dificultan la comparación directa entre estudios. Por lo tanto,
es difícil comparar los resultados obtenidos con diferentes
productos cuya inmunogenicidad se prueba en diferentes
laboratorios.
8. Los anticuerpos monoclonales a menudo se administran en dosis
altas y tienen un tiempo de circulación prolongado (días/
semanas). Es probable que esto provoque interferencias con el
ensayo ADA por parte de los anticuerpos terapéuticos circulantes
(lo que dará como resultado falsos negativos o subestimación de
los títulos de anticuerpos). Otra posibilidad de interferencia es la
aparición de reactividad cruzada de los reactivos en la prueba
para el ADA y el anticuerpo monoclonal administrado. Con el
interferón se encuentra una situación diferente: los interferones
se eliminan rápidamente y se administran en dosis bajas (rango
de microgramos); por lo tanto, es menos probable que los
interferones interfieran con la medición de anticuerpos anti-IFN.
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