Residuos de Medicamentos Veterinarios

RESIDUOS DE
MEDICAMENTOS
VETERINARIOS
MASTER EN CALIDAD Y SEGURIDAD

ALIMENTARIA 2013-14
Carmen Igualada. Abril 2014

RESIDUOS DE MEDICAMENTOS VETERINARIOS
•Definición
•Establecimiento de los LMRs
•Origen
•Toxicidad
•Legislación
•Consideraciones generales en el Análisis de
Residuos de Medicamentos Veterinarios.
Métodos de Screening
Métodos de Confirmación
•Análisis de los distintos grupos de Residuos de
Medicamentos Veterinarios.
Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

PRINCIPALES PELIGROS PARA LA
SALUD HUMANA ORIGINADOS POR LOS
PRODUCTOS ALIMENTICIOS
¾Contaminación microbiana
¾Toxinas naturales
¾Aditivos alimentarios
¾Contaminantes ambientales/industriales
¾Residuos de plaguicidas
¾Residuos de medicamentos veterinarios
¾Residuos químicos procedentes del envasado

DEFINICIÓN DE RESIDUOS DE
MEDICAMENTOS VETERINARIOS
Son todas las sustancias farmacológicamente

activas, expresadas en mg/kg o µg/kg, sobre la
base del peso en fresco, ya sean sustancias
activas, excipientes o productos de degradación, y
sus metabolitos que permanezcan en los alimentos
obtenidos a partir de animales. (Reglamento
nº470/2009 de la CE).

ESTABLECIMIENTO DE LOS LÍMITES
MÁXIMOS DE RESIDUOS
¾Reglamento de la CE nº 470/09, de 6 de mayo.

¾Reglamento de la CE nº 37/2010, de 22 de diciembre de 2009.
¾Concepto de LMR
Concentración máxima de un residuo de una sustancia
farmacológicamente activa que puede permitirse en los alimentos
de origen animal.

ESTABLECIMIENTO DE LOS LMRS cont.
Committee for Veterinary

Medicinal Products (CVMP)
European Medicines
Evaluation Agency
(EMEA)
Ingesta diaria admisible

INGESTA DIARIA ADMISIBLE
Concepto
Ingesta diaria de un residuo a lo largo de la vida
que se considera que no va a suponer un riesgo
para la salud del consumidor
Cálculo
Estudios toxicológicos a corto plazo Estudios de efectos mutagénicos
Estudios toxicológicos a largo plazo Estudios de efectos carcinogénicos
Estudios de reproducción Estudios de efectos inmunológicos
Estudios de efectos teratogénicos Estudios de efectos microbiológicos

Estudios en los seres humanos

ORIGEN
¾ Uso legal o ilegal de medicamentos

veterinarios para:
1. Prevenir y tratar enfermedades de
animales
2. Promotores del crecimiento
3. Anabolizantes: Aumento masa proteica
4. Tranquilizantes: Favorecer manejo y
transporte.
Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014.

TOXICIDAD
Intoxicaciones crónicas
Precoz desarrollo sexual niños
Italia y Puerto Rico relacionado con
sustancias con efecto estrogénico. (años 80)
Intoxicaciones agudas
Intoxicación por consumo de
hígado con Clenbuterol en España y
Francia.(Principios 90)

LEGISLACIÓN
•Directiva 86/469/CE
•R.D. 1262/1989
•Reglamento nº 2377/90/CE (ya derogado)
•R.D. 1749/1998
•Decisión 657/2002/CE
•Reglamento nº 470/09/CE
•Reglamento nº 37/2010/CE

Directiva 86/469/CE
Reguló los controles de determinadas

sustancias en los animales de
explotación, en la carne o en sus
productos derivados.
R.D. 1262/1989
Aprueba el Plan Nacional de

Investigación de Residuos en los
Animales y en las Carnes Frescas

Reglamento nº 2377/90(ya derogado)
Establece un procedimiento comunitario de fijación

de LMRs de residuos de medicamentos veterinarios
en los alimentos de origen animal.
Anexo I: Lista de sustancias farmacológicamente activas
para las que se establecen LMRs.
Anexo II: Lista de sustancias que no están sujetas a un
LMR.
Anexo III: Lista de sustancias farmacológicamente activas
utilizadas en los medicamentos veterinarios para las que se
han establecido LMRs provisionales.
Anexo IV: Lista de sustancias farmacológicamente activas
para las que no puede establecerse límite máximo alguno.

SUSTANCIAS PROHIBIDAS
Cuadro 2 (actual Directiva 96/22 :

Reglamento 37/2010/CE): •Sustancias de efecto hormonal
•Cloranfenicol . Estilbenos y derivados.
•Cloroformo •Sustancias de efecto

tireostático.
•Clorpromacina
•Sustancias ß-agonistas.
•Colchicina
•Dapsona
•Con fines distintos a los
•Dimetridazol terapéuticos allí establecidos
•Metronidazol
•Nitrofuranos
•Ronidazol

DIRECTIVA 96/22/CE del Consejo, de 29
de abril
Por la que se prohibe utilizar determinadas

sustancias de efecto hormonal y tireostático
y sustancias β-agonistas en la cria de
ganado.

Directiva 96/23/CE del Consejo, de 29 de
abril
Relativa a las medidas de control aplicables

respecto de determinadas sustancias y sus
residuos en los animales vivos y sus
productos.
En su Anexo I clasifica las sustancias en dos
grupos.

GRUPO A : Sustancias con efecto
anabolizante y sustancias no
autorizadas.
1. Estilbenos, derivados de los estilbenos,

sus sales y ésteres.
2. Agentes antitiroidianos.
3. Esteroides.
4. Lactonas del ac.resorcílico(incluido el
zeranol)
5. ß-agonistas
6. Sustancias incluidas en el Anexo IV del
Reglamento nº 2377/90 actual Cuadro 2
del Reglamento nº 37/2010/CE.

GRUPO B : Medicamentos veterinarios y
contaminantes.
1. Sustancias antibacterianas, incluidas las
sulfamidas y quinolonas.
2. Otros medicamentos veterinarios.
a) Antihelmínticos.
b) Anticoccidianos, incluidos nitroimidazoles.
c) Carbamatos y piretroides.
d) Tranquilizantes.
e) Antiinflamatorios no esteroideos (AINES)
f) Otras sustancias que ejerzan una actividad
farmacológica.
3. Otras sustancias y contaminantes
medioambientales.
a) Compuestos organoclorados, incluidos los PCBs.
b) Compuestos organofosforados.
c) Elementos químicos.
d) Micotoxinas
e) Colorantes.
f) Otros.
Directiva 96/23/CE
Laboratorios Comunitarios de Referencia
§ Rijkinstituut voor de Volksgezondheid en
Milieuhygiëne (RIVM) Bilthoven (The Netherlands).
Grupo A 1,2,3,4 (Estilbenos, antitiroidianos, esteroides y
lactonas del ac. Resorcílico). Grupo B 2d y 3d
(tranquilizantes y Micotoxinas).
§ Laboratoires des Médicaments veterinaires
(CNEVADO-LMV) Fougères (Francia). Grupo B 1 y 3e
(antibacterianos y colorantes; carbadox y olaquindox).
§ Bundesgesundheitsamt für Gesundheitlichen
Verbrancherschutz und Veterinarmedizin (BGVV) Berlín
(Alemania). Grupo A 5 (ß-agonistas) y Grupo B 2a, 2b y
2e (antihelmínticos, anticoccidianos y AINES).
§ Istituto Superiore di Sanità. Roma (Italia). Grupo
B 2c, 3a, 3b y 3c (carbamatos y piretroides,
organoclorados, organofosforados y elementos químicos).

RED DE LABORATORIOS EUROPEA
EU-RLs
NLRs
Laboratorios de
rutina

R.D. 1749 /1998 de 31 de julio
Establece las medidas de control aplicables a

determinadas sustancias y sus residuos en los
animales vivos y sus productos.
•Finalidad: Llevar a efecto la transposición de la Directiva
96/23/CE del Consejo.
•Creación de Comisión Nacional de Coordinación de
Investigación y Control de Residuos o Sustancias en
Animales Vivos y sus Productos.
•Regula aspectos relativos a las infracciones y sanciones
aplicables en caso de incumplimiento.(Administración ilegal
de sustancias a animales de abasto se considera un delito
contra la salud pública. Código Penal art. 364 del capítulo
III del título XVII).
•Designación de los Laboratorios Nacionales de Referencia
(LNR)
LABORATORIOS NACIONALES DE
REFERENCIA EN ESPAÑA
(modificación al RD 1749/1998 por el RD 731/2007)

•Centro Nacional de Alimentación y Nutrición (CENA) en Majadahonda.
Dependiente de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria (AESA).
Grupo A 1,3,4 y 5 (estilbenos y derivados, esteroides, lactonas del
ac.resorcílico y β-agonistas) y A6 (cloranfenicol y nitrofuranos). Grupo B
1,B2f (corticosteroides) B3c (elementos químicos en prod. Acuicultura) B3d
y B3e( micotoxinas y colorantes).
•Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Santa Fe (Granada)
. Grupos A2 (antitiroidianos), A6 (nitroimidazoles), B2a, B2b, B2c, B2d, B2e
y B2f (antihelmínticos, anticoccidianos, carbamatos y piretroides,
tranquilizantes y antiinflamatorios no esteroideos.
•Laboratorio Arbitral Agroalimentario. Grupo B 3a, B3b y B3c
(organoclorados, organofosforados y elementos químicos(excepto los prod.
De acuicultura)).
•Los grupos A6(anexo IV) y B3f serán responsabilidad de un LNR u otro
atendiendo a su acción farmacológica.

Reglamento nº 470/2009/CE de 6 de
junio
Se establecen procedimientos comunitarios para la fijación

de límites de residuos de las sustancias
farmacológicamente activas en los alimentos de origen
animal.
Deroga el Reglamento nº 2377/90

Modifica las Directivas 2001/82/CE y el Reglamento nº
726/2004

Reglamento nº 37/2010/CE de 22 de
diciembre de 2009
• Relativo a las sustancias farmacológicamente

activas y su clasificación por lo que se refiere
a los límites máximos de residuos en los
productos alimenticios de origen animal.
Anexo: Cuadro 1: Sustancias autorizadas

Cuadro 2: Sustancias prohibidas

ANÁLISIS DE RESIDUOS DE
MEDICAMENTOS VETERINARIOS.
CONSIDERACIONES GENERALES
Decisión de la Comisión 2002/657/CE de 12 de
agosto de 2002 por la que se aplica la Directiva 96/23/CE
del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos
analíticos y la interpretación de resultados.
Se derogan las Decisiones 90/515/CE(métodos de

referencia para metales pesados y arsénico) y las
Decisiones 93/256/CE y 93/257/CE (métodos para
detección de residuos).
Periodo adaptación: 2 años (Grupo A)
5 años (Grupo B)

MÉTODOS ADECUADOS PARA LA
IDENTIFICACION DE RESIDUOS
ORGÁNICOS O CONTAMINANTES.
Measuring technique Substances Annex I
96/23/EC
LC or GC with mass spectrometric Groups A and B
detection
LC or GC with IR spectrometric Groups A and B
detection
LC-full-scan DAD Group B
LC-Fluorescence Group B
2-D TLC-full-scan UV/VIS Group B
GC-Electron capture detection Group B
LC-immunogram Group B
LC-UV/VIS Group B

METODOS DE SCREENING
•Utilizados para detectar la presencia de una sustancia al

nivel de interés.
•Se utilizan para cribar grandes cantidades de muestras en

busca de posibles resultados no conformes.
•Están diseñados específicamente para evitar resultados

falsos conformes.
•Los resultados no conformes deben ser confirmados por

un método de confirmación.

METODOS DE SCREENING
1. Métodos microbiológicos.
•Se detecta la presencia de sustancias inhibidoras
del crecimiento bacteriano.
•Técnica microbiológica de difusión por agar. (Se
inoculan m.o. en medios de cultivo. El analito
difunde y produce aparición de halos de
inhibición.
•Placa Bacillus subtilis pH 6 (tetraciclinas), pH
7,4 (sulfonamidas a niveles altos) y a pH 8
(aminoglucósidos).
•Placa Micrococus luteus a pH 8 mejora la
detección de β-lactámicos y macrólidos.
•Placa de E. Coli a pH 8 (quinolonas)

MÉTODOS DE SCREENING
2. Métodos inmunológicos I
•Aplicables no solo a antibacterianos sino a otros grupos.
•Se basan en reacción antígeno-anticuerpo.
•El analito (antígeno) compite en su unión al anticuerpo con
un antígeno marcado radiactivamente (Técnica RIA) o
fluorescente o enzimáticamente activo (más importante
ELISA).
•Cuanto más antígeno está presente en la muestra menos
antígeno marcado reaccionará con el anticuerpo. Los métodos
se pueden hacer cuantitativos construyendo curvas de
calibrado con cantidades conocidas de antígeno no marcado.
•Más conocido es el ELISA:”Enzyme-linked inmunosorbent
assay”.Analito de la muestra y otro antígeno marcado con el
enzima compiten por unirse a un anticuerpo fijado.

MÉTODOS DE SCREENING
2.Métodos Inmunológicos II
Biosensores.
Aparato que combina mecanismo de reconocimiento
biológico con un transductor que genera una señal en
respuesta a cambios en la concentración de una molécula
en la superficie de un detector.
El transductor detecta la unión antígeno-anticuerpo.
Se detecta la unión por cambio de diferencia de
potencial, corriente, masa, calor u propiedades
ópticas(índice de refracción).
Ópticos, de masa, eléctricos y térmicos.
BIACORE® (Clenbuterol, Enrofloxacina, Sulfadimidina...)

MÉTODOS DE CONFIRMACIÓN
•Incluyen información sobre la estructura

química del analito.
•Métodos cromatográficos que prescinden de
la detección espectrométrica no convienen
por sí solos como técnicas de confirmación.
•Si una técnica por sí sola carece de
especificidad ésta se obtendrá por
procedimientos analíticos consistentes en
combinaciones de limpieza, separación
cromatográfica y detección espectrométrica.

ANÁLISIS DE RESIDUOS
MUESTRA
Tratamiento previo
MUESTRA
ANALÍTICA
Extracción del analito

EXTRACTO
Purificación
EXTRACTO
PURIFICADO
Determinación
RESULTADO
ANALÍTICO

TIPOS DE RESIDUOS
•Molécula intacta (“parent compound”). La

molécula no ha sido metabolizada.
•Metabolitos (oxidación, reducción de
grupos funcionales, epímeros). “Residuo
marcador”. Ej Azaperona. Dificultad:
disponibilidad de Standars de metabolitos.
•Conjugados a pequeñas moléculas
(glucurónidos...)
•Conjugados a macromoléculas
(proteinas, ac. Nucleicos...) de forma
covalente.”Bound residues”.

NIVELES ENDÓGENOS/EXÓGENOS
La distinción entre los niveles endógenos de

residuos de hormonas y los exógenos (debido
a su uso como promotores de crecimiento)
resulta problemática.
Ej. 17β-estradiol en orina. Límite de acción

establecido tras aislar y controlar un elevado
nº de animales.

ANABOLIZANTES SINTÉTICOS DE FORMA
NATURAL
Anabolizantes como la Nortestosterona se han

encontrado en orina de caballos, cerdos
sementales y en vacas y hembras preñadas de
otras especies.
Boldenona como 17α-boldenona ha aparecido
de manera natural en orina de ternero.
Zeranol posible origen en la zearalenona
(micotoxina que puede contaminar piensos).

VARIACIÓN DE CONTENIDO DE RESIDUO
DURANTE EL ALMACENAMIENTO.
• Conservación preferentemente a Tª ≤ -20 ºC.

•Descongelación inmediatamente antes del
análisis.
• Evitar ciclos de descongelación/congelación.
• Contacto analito con enzimas endógenos
matriz.

VARIACIÓN DEL CONTENIDO DE
RESIDUO DENTRO DE LA MUESTRA
•En caso de riñón existe diferencia en el

contenido del analito según se trate del córtex
o de la médula.
•En tiroides también hay diferencia si se

toma el istmo de la glándula o un lóbulo.

OTRAS CONSIDERACIONES ANALÍTICAS
•Diferencias muy grandes de recuperaciones dentro de un

mismo grupo de sustancias. Ej. Clenbuterol mejor que
Cimaterol o Salbutamol según la técnica de extracc/purif.
empleada.
•Sensibilidad de los equipos muy diferente dentro de un
mismo grupo de sustancias.
•Picaresca de los fabricantes de sustancias, distribuidores
y ganaderos. Utilizan bajas concentraciones de algunas
sustancias que tienen efectos sinérgicos. Ej. Cocktail
corticosteroides-β-agonistas. Utilizan sustancias conocidas
que se metabolizan considerablemente. Ej. Stanozolol.
•Utilizan compuestos de los que conocen que no son
controlados en un Estado miembro.

Muestra /Matriz
Orina Leche Bovino

Plasma Huevo Ovino
Suero Miel Porcino
Hígado Agua Caprino
Riñón Pienso Equino
Músculo Pelo Ave
Grasa Conejo
Tiroides Abeja
Ojo Pescado

EXTRACCIÓN
Separar analito/s de las

Objetivo
sustancias interferentes de la
matriz
• Con solventes
Métodos LE orgánicos
• Con agua o soluciones
acuosas tamponadas.
¿Hidrólisis previa?
EXTRACTO
Química Enzimática

PURIFICACIÓN
Aislamiento y separación del analito/s de

Objetivo
sustancias interferentes:
•Eliminación agua
•Eliminación de grasa
•Eliminación de proteinas
•Eliminación de otras sustancias
•Extracción Líquido-Líquido (L/L)

Métodos •Extracción en Fase Sólida (SPE)
•Cromatografía Permeación Gel (GPC)

PURIFICACIÓN
EXTRACCIÓN EN FASE SOLIDA
Base Sílica Base polimérica Inmunoafinidad

Poliestireno- Anticuerpos
Fase divinilbenceno co- inmovilizados
Fase polímeros
normal
reversa
Par
iónico Intercambio
ionico
Modo
mixto

SISTEMAS DE EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
Manual Automático

DETERMINACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE
GASES CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
CG-MS
HPLC-DAD
CG-MS/MS
HPLC-FL
LC-MS/UHPLC-MS
•Moléculas apolares Sólo sustancias

permitidas •LC-MSn (IT)
•Derivatización
•LC-MS/MS (QqQ)
•LC-Q-TOF
•UHPLC-HRMS
Equipo LC-MS/MS
Sustancias permitidas y
prohibidas

MÉTODO DESARROLLADO
Estudio de parámetros
cualitativos y cuantitativos
VALIDACIÓN
Demostrar que el
método es apto para
su uso
UNE-EN ISO/IEC
17025
ACREDITACIÓN Demostrar la
capacidad
técnica del
laboratorio

ANÁLISIS DE LOS DISTINTOS GRUPOS DE
RESIDUOS DE MEDICAMENTOS
VETERINARIOS
AGENTES ANTIINFECCIOSOS
Pueden ser utilizados con
•Efecto profiláctico.
•Promotores del crecimiento.
•Fines terapéuticos.
Pueden producir efectos nocivos como:
•Toxicidad aguda inherente por alteración de la flora intestinal.
•Efectos tóxicos sin relación dosis-respuesta. Ej.
Cloranfenicol:anemia aplásica. Hipersensibilidad a β-lactámicos.
•Efectos mutágenos y carcinógenos.
•Aparición de resistencias.

CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES
ANTIINFECCIOSOS POR GRUPOS QUÍMICOS
Sulfonamidas Tetraciclinas Quinolonas β-lactámicos Macrólidos Aminoglucósidos Otros
Penicilinas
Sulfatiazol Oxitetraciclina Danofloxacina Nafcilina Eritromicina Apramicina novobiocina
Sulfadimetoxina 4-epi OTC Difloxacina Oxacilina Espiramicina Gentamicina Bacitracina
Sulfametacina Clortetraciclina Enrofloxacina Penicilina G Tilmicosina Espectromicina Clavulánico
Sulfametoxipiridacina 4-epi CTC Ciprofloxacina Ampicilina Tulatromicina Estreptomicina Aviliamicina
Sulfapiridina Tetraciclina Flumequina Cloxacilina Tilosina Kanamicina Monensina
Sulfaquinoxalina 4-epi TC Ac.oxolínico Dicloxacilina Tilvalosina Neomicina Lasalocid
Sulfadiacina Doxiciclina Marbofloxacina Penicilina V Otros Otros
Sulfameracina Sarafloxacina Amoxicilina
Sulfacetamida Otras Cefalosporinas
Sulfadoxina Cefacetrile
Otras Cefalexina
Cefapirina
Cefalonium
Cefazolina
Cefoperazona
Ceftiofur

AGENTES ANTIINFECCIOSOS
AMINOGLICÓSIDOS
Estructura química
•pKa 8-9
•Son muy solubles en agua y poco solubles en
solventes orgánicos . Esto dificulta su
extracción de matrices biológicas.

ANÁLISIS DE AMINOGLICÓSIDOS
•Screening
Técnicas de inhibición del crecimiento microbiano
Inmunoensayos
•Confirmación: LC-MSn, LC-MS-MS
Extracción con disoluciones acuosas.
Purificación : EFS de intercambio catiónico y fases
combinadas de intercambio catiónico con C-18
Determinación: No tienen grupos cromóforos. No
determinación espectrofotométrica. LC-MS-MS por ESI y
APCI.

MACRÓLIDOS
•Estructuras químicas.
•Tienen un peso molecular muy elevado.

•Se comportan como bases débiles pKa 7,1-
8,8.
•Son solubles en agua y bastantes
disolventes de polaridad media como el
metanol, etanol, acetonitrilo....

ANALISIS DE MACRÓLIDOS
•Homogeneización del tejido con disolución

tamponada básica.
•Extracción con disolvente orgánico
•Purificación con EFS C18 o intercambio
catiónico.
•Determinación con LC-ESI-MS-MS usando
ac.trifluoroacético 1 %/ACN como fase móvil

ANFENICOLES
•Estructura química
•Tienen peso molecular bajo.

•Cloranfenicol aparece conjugado con glucurónido en
higado pero no en músculo.

ANÁLISIS DE CLORANFENICOL
En tejido:
•Extracción con acetato de etilo.
•Purificación con EFS de silica.
•Determinación por LC-ESI(-)-MS/MS o LC-ESI(-
)-MSn usando Agua/Acetonitrilo como fase móvil.

Espectro de LC-MS2 del Cloranfenicol

β-LACTÁMICOS
Estructura química de Penicilinas y Cefalosporinas
Son inestables en solución acuosa.

ANALISIS DE PENICILINAS y CEFALOSPORINAS
•Precipitación de proteinas con disolventes

orgánicos como metanol o acetonitrilo para
separar el residuo no-covalentemente unido a
macromoléculas.
•Extracción con disolventes orgánicos y
también con agua en presencia de sulfúrico y
tungstato sódico.
•Purificación por EFS con intercambio iónico,
inmunoafinidad y C18.
•Determinación por LC-MS/MS (ESI + y ESI -
)con ac.acético/ACN o ac. fórmico/ACN.

Cromatograma Penicilinas y Cefalosporinas. LC-MS/MS (ESI + y
ESI -)
RT: 0.00 - 35.01 SM: 7B
RT: 20.76 NL: 5.39E3
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PEN G 288.745-288.755] MS ICIS 2LMR_1
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0
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SN: 205
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0
RT: 15.62 NL: 3.02E5
AA: 5136650 m/z= 139.56-139.76 F: + c
SN: 3784 CFX ESI SRM ms2 348.080
100
[139.655-139.665,
157.575-157.585,
bundance
80 173.585-173.595] MS ICIS
LMR
60
elativeA
40
R
20
0
5 10 15 20 25 30 35
Time (min)

Muestra Músculo de porcino con 53 ppb de Ampicilina
PEN2A #5249 RT: 13.04 AV: 1 NL: 7.09E4

F: + c ESI SRM ms2 350.029 [105.695-105.705, 159.735-159.745, 191.635-191.645]
105.70 MUSCULO PORCINO
100
95
90
RT: 0.00 - 35.01 SM: 7B
85
RT: 13.04 AMP NL: 5.92E4
AA: 1145812 m/z= 105.60-105.80 F: + c 80
SN: 17025 ESI SRM ms2 350.029
100
MUSCULO PORCINO [105.695-105.705, 75
159.735-159.745,
Relative Abundance
80 191.635-191.645] MS ICIS 70
PEN2A
65
60
60
Relative Abundance
40
55
20 RT: 6.62 RT: 11.59 RT: 13.75 RT: 24.17

AA: 12552 50
AA: 582 AA: 6518 AA: 623
SN: 13 SN: 139 SN: 267 SN: 14 191.64
0 45
RT: 12.97 NL: 2.18E4
AA: 414670 m/z= 159.60-159.80 F: + c 40
SN: 4229 ESI SRM ms2 350.029
100 35 159.74
[105.695-105.705,
159.735-159.745,
Relative Abundance
80 191.635-191.645] MS ICIS 30
PEN2A
25
60 RT: 21.52
AA: 130241 20
SN: 1700
40
15
RT: 3.81
20 AA: 25384 RT: 16.59 RT: 34.49 10
SN: 363 AA: 2500 AA: 693
SN: 36 SN: 10 5
0
RT: 13.04 NL: 2.79E4
AA: 615353 m/z= 191.50-191.70 F: + c 0
SN: 7622 105.695 105.700 105.705 159.740 191.635 191.640
ESI SRM ms2 350.029
100 m/z m/z m/z
[105.695-105.705,
159.735-159.745,
Relative Abundance
80 191.635-191.645] MS ICIS
PEN2A
60
40 RT: 1.58 RT: 15.20 RT: 28.78

AA: 68169 AA: 65659 AA: 58620
20 SN: 1374 RT: 4.58 SN: 1324 RT: 21.55 SN: 1182
AA: 479 AA: 3710
m/z Intensity Relative

SN: 11 SN: 75
0
0 5 10 15 20 25 30 35
105.70 70920.5 100.00

Time (min)
159.74 23839.7 33.61

191.64 32130.9 45.31

NITROFURANOS

NITROFURANOS
•Son muy sensibles a la luz.

•Se metabolizan rápidamente por lo que hay que
buscar los metabolitos:AOZ (3-amino-
oxazolidinona), AMOZ(3-amino-5-
morpholinometil-2-oxazolidinona),SEM
(semicarbazida) y AHD (1-aminohidantoina).
•Una pequeña parte se unen a proteinas y
también sus metabolitos.

ANALISIS DE METABOLITOS DE
NITROFURANOS
•Hidrólisis en medio ácido y derivatización

con orto-nitrobenzaldehido(para conseguir
moléculas más grandes detectables por
MS) toda la noche a 37 ºC.
•Neutralización y extracción con acetato
de etilo.
•Determinación con LC-ESI-MS-MS con
ac.acético 10 mM/ACN como fase móvil.

ESPECTROS DE MS-MS DE METABOLITOS
DE NITROFURANOS.
AMOZ AOZ
SEM AHD

QUINOLONAS
ESTRUCTURAS QUÍMICAS
Debido a su estructura aromática absorben

al UV y presentan fluorescencia sin
necesidad de derivatizar.

ANALISIS DE QUINOLONAS
•Extracción con ASE con una mezcla de

ac.fosfórico/ACN
•Purificación con cartuchos Oasis ® HLB o C18 y
C8
•Determinación por HPLC-FL. Confirmación por
LC-ESI-MS-MS (ac.fórmico 0.2 %/ACN como
fase móvil.

SULFONAMIDAS
ESTRUCTURAS QUIMICAS
Son poco solubles en agua.

ANÁLISIS DE SULFONAMIDAS
•Extracción del tejido a pH 5 con diclorometano.

También se usa metanol y acetonitrilo y se ha
descrito el uso de microondas para ello.
•Purificación con EFS silica. También se pueden
utilizar cartuchos de intercambio iónico.
•Determinación por HPLC-DAD y confirmación
por LC-MS-MS con acetato amónico pH 4,6/ACN
como fase móvil o ac. fórmico/ACN.

TETRACICLINAS
ESTRUCTURAS QUÍMICAS

TETRACICLINAS
•Debido a sus dos grupos ceto en posición 1

y 11 pueden quelar iones metálicos e
interaccionar con grupos silanoles.
•Son compuestos anfóteros. Son solubles en
ácidos, bases, alcoholes y disolventes
polares.
•Presentan fluorescencia en presencia de
metales divalentes o en condiciones básicas.
•Son bastante inestables en medio ácido y
básico y forman epímeros a pH∼3 y anhidro-
TCs a pH~2.

ANALISIS DE TETRACICLINAS
•Extracción en medio acuoso conteniendo

EDTA y ac. Oxálico.
•Purificación con EFS C18 (pretratados con
solución de EDTA.Na2).
•Determinación por HPLC-FL, HPLC-DAD con
fases móviles conteniendo ac.oxálico y EDTA
(para evitar colas que se producen por la
reacción que ocurre entre estos compuestos y
los grupos silanoles de la fase estacionaria).
Confirmación por LC-ESI-MS/MS con columna
C8 y fase móvil con trifluoroacético/ACN.

HORMONAS NATURALES Y SINTÉTICAS
Uso y efectos adversos
•Son utilizados como promotores del crecimiento
produciendo un engorde ilegal .
•Se ha relacionado con procesos cancerígenos. Ej
Adenoma mamario en niñas cuya madre tratada
en embarazo con DES.
Clasificación de compuestos de acción
hormonal
1. Compuestos con efectos estrogénicos,
androgénicos y progestágenos.
2. β-agonistas
3. Hormona de crecimiento y análogos.
4. Tireostáticos o antitiroideos.
1. COMPUESTOS CON EFECTOS
ESTROGÉNICOS,ANDROGÉNICOS Y
PROGESTÁGENOS
Estructuras químicas de andrógenos
Nortestosterona
Testosterona
Trembolona Metiltestosterona

Estructuras químicas de los estrógenos
Estrona Estradiol Estriol
Equinelina
Etinilestradiol
Dietilestilbestrol Hexenestrol Dienestrol
Zeranol

Estructuras químicas de los progestágenos
Acetoxiprogesterona
Progesterona
Megestrol
Medoxiprogesterona
Melengestrol Clormadinona

COMPUESTOS CON EFECTOS ESTROGÉNICOS,
ANDROGÉNICOS Y PROGESTÁGENOS
•Se presentan como glucurónidos y sulfato

conjugados
•Esteroides son compuestos no polares.
•Esteroides pueden unirse al vidrio(se recomienda
silanizar el vidrio previo a su uso). Uso de
plásticos no se recomienda porque el material es
soluble en solventes orgánicos y la presencia de
ftalatos puede interferir en la determinación.

Análisis de comp.con efectos estrogénicos,
androgénicos y progestágenos
•Técnicas de Screening: RIA y ELISA

•Extracción de muestras líquidas: Hidrólisis
enzimática con glucuronidasa/sulfatasa a 37 ºC 2h. Para
desconjugar los conjugados glucurónido y sulfato.
•Tejidos: Se homogeneizan con agua o tampón.
•Grasa: Con hexano o acetonitrilo tras ser calentadas a
40 o 60 ºC
•Purificación: partición líquido-liquido o EFS ciano ,
amino, C8 o de inmunoafinidad. También HPLC
preparativa.
•Determinación: GC-MS (tras derivatización con
trimetilsilano) y LC-MS/MS (ac. Fórmico o acético/ACN)

β-AGONISTAS
Estructuras químicas

β-AGONISTAS
Clenbuterol forma niveles relativamente bajos

de conjugados de glucurónidos y sulfatos.
Salbutamol predominantemente conjugado.
ANALISIS
•Extracción: Hidrólisis previa con subtilisina en tejidos
(unión a proteinas) o hidrólisis ácida. También
extracción con solventes orgánicos:acetato de etilo,
cloroformo.
•Purificación:EFS C18 o columnas de inmunoafinidad.
•Determinación: GC-MS formando los trimetilsilano-
derivados.
LC-ESI-MS/MS o LC-ESI-MS3

Espectro de LC-MS3 del Clenbuterol

TIREOSTÁTICOS
Estructuras químicas
metimazol 4(6)-R-2-
tiouracil(R=H,metil,n-propil
o fenil)
Moléculas de pequeño tamaño y muy polares

ANALISIS DE TIREOSTÁTICOS
•Extracción : Metanol o acetato de etilo

•Purificación: EFS silica.
•Determinación: Por GC-MS tras derivatización
con MSTFA(N-trimetilsilil-
trifluoroacetamida).También por LC-APCI-MS
con metanol/HFBA(heptafluorobutírico) como
fase móvil.

ANTIPARASITARIOS
ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE BENZIMIDAZOLES

ANTIPARASITARIOS
ESTRUCTURA QUÍMICA DE IVERMECTINA

ANTIPARASITARIOS
Avermectinas no absorben bien la luz, no

fluorescen y no poseen grupos iónicos.
Benzimidazoles absorben la luz con un
máximo de 280 nm.
Análisis
•Extracción:Benzimidazoles: previa hidrólisis química o enzimática
con β-glucuronidasa/sulfatasa.Después extracción con ACN.
Avermectinas:ACN/Dimetilamina
•Purificación: EFS C18
•Determinación:Benzimidazoles: LC-MS/MS con
ACN/tetrahidrofurano/agua con acetato amónico. Avermectinas: Se
puede formar un compuesto fluorescente con 1-metil-imidazol,
anhidrido acético y metil formamida para detección por HPLC-
FL.También por LC-APCI-MS/MS y LC-ESI-MS/MS

Cromatogramas de avermectinas LC-MS-MS (ESI -)
RT: 0.00 - 13.03

RT: 2.65 NL: 3.17E5
AA: 2566352 m /z= 564.60-565.60 F: - c ESI
SN: 44771 EPR SRM m s 2 912.280
100
[269.955-269.965,
565.095-565.105,
830.145-830.155] MS ICIS
50 RT: 5.00 LMR1
AA: 1001
SN: 18
0
RT: 3.44 NL: 3.14E4
AA: 286939 m /z= 228.35-229.35 F: - c ESI
SN: 11933 ABM SRM m s 2 871.280
100
[228.845-228.855,
564.895-564.905,
789.035-789.045] MS ICIS
50 RT: 4.23 RT: 4.96 LMR1
AA: 2190 AA: 1039
SN: 75 SN: 37
0 NL: 9.21E4
RT: 3.55
AA: 930345 m /z= 564.60-565.60 F: - c ESI
SN: 13833 SRM m s 2 884.330
Relative Abundance
EMA
100
[241.895-241.905,
565.095-565.105,
802.135-802.145] MS ICIS
50
LMR1
0
RT: 4.29 NL: 7.01E4
AA: 693986 m /z= 590.52-591.52 F: - c ESI
SN: 17032 DOR SRM m s 2 897.280
100
[228.695-228.705,
591.015-591.025,
814.895-814.905] MS ICIS
50 RT: 6.11 LMR1
AA: 6851
SN: 156
0
RT: 6.11 NL: 1.03E5
AA: 1202874 m /z= 228.40-229.40 F: - c ESI
SN: 12789 IVM SRM m s 2 873.250
100
[228.895-228.905,
566.895-566.905,
791.145-791.155] MS ICIS
50 RT: 3.42
LMR1
AA: 29686
SN: 490
0 NL: 4.70E4
RT: 4.85
AA: 445816 m /z= 527.54-528.54 F: - c ESI
SN: 14021 MOX SRM m s 2 638.250
100
[235.785-235.795,
261.795-261.805,
528.035-528.045] MS ICIS
50
LMR1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tim e (m in)

Cromatograma y Espectro de Ivermectina. LC-MS/MS (ESI-)
RT: 0.00 - 13.03

RT: 6.11 NL: 8.98E3
AA: 93423 m /z= 566.40-567.40 F: - c
SN: 5991 ESI SRM m s 2 873.250
100
[228.895-228.905,
90 566.895-566.905,
791.145-791.155] MS ICIS
80
LMR1
70
60
50
40 IVERMECTINA
30
20 RT: 3.42
AA: 874
10
SN: 147
0 NL: 1.03E5
RT: 6.11
AA: 1202874 m /z= 228.40-229.40 F: - c
SN: 12789 ESI SRM m s 2 873.250
100
[228.895-228.905, LMR1 #749 RT: 6.11 AV: 1 NL: 1.03E5
90 566.895-566.905, F: - c ESI SRM m s 2 873.250 [228.895-228.905, 566.895-566.905, 791.145-791.155]
791.145-791.155] MS ICIS 228.90
80 100
LMR1
Relative Abundance
70
60 95
50
90
40
30 85
20 RT: 3.42
AA: 29686
10 80
SN: 490
0 NL: 2.25E4
RT: 6.11 75
AA: 251920 m /z= 790.65-791.65 F: - c
SN: 6150 ESI SRM m s 2 873.250
100 70
[228.895-228.905,
90 566.895-566.905,
791.145-791.155] MS ICIS 65
80
LMR1
70
60
60
Relative Abundance
50 55
40
30 50
20 RT: 3.42
AA: 7430 45
10 SN: 256
0 40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tim e (m in) 35
30
25
791.15
20
15
10 566.90
0
228.895 228.900 566.900 566.905 791.150 791.155
m /z m /z m /z

ANTIINFLAMATORIOS ESTEROIDEOS
ESTRUCTURA QUÍMICA
Betametasona Dexamatasona Flumetasona
Fluprednisolona Isoflupredona Metilprednisolona

ANALISIS DE ANTIINFLAMATORIOS
ESTEROIDEOS
•Tratamiento previo con β-

glucuronidasa/sulfatasa en hígado y orina.
•Extracción con hexano-acetato de etilo.
•Purificación con EFS C18, fenil-sílice, oasis
HLB,columnas de inmunoafinidad.
•Determinación: LC-MS-MS con Acetato
amónico 5 mM /ACN/MeOH como fase móvil.

ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS
ESTRUCTURA QUÍMICA
Metil salicilato Diclofenaco sódico Naproxeno
Metamizol Ácido Tolfenalico Oxifenbutazona
Ácido acetilsalicílico Flunixin Indometacina
Sixibuzona Ketoprofeno Fenilbutazona

ANALISIS DE ANTIINFLAMATORIOS NO
ESTEROIDEOS
•Tratamiento previo de hidrólisis química o

enzimática.
•Extracción con solventes orgánicos como
Diclorometano, cloroformo...
•Purificación con EFS C18, Certify...
•Determinación: LC-ESI-MS-MS. Fase móvil:
Ac. Fórmico/ACN.

Espectro de LC-MS2 de OPBZ Y PBZ
OPBZ .Orina de equino
PBZ .Orina de equino

TRANQUILIZANTES
ESTRUCTURA QUÍMICA DE FENOTIAZINAS Y β-

BLOQUEANTES.
ACEPROMAZINA
CLORPROMAZINA PROPIONILPROMAZINA
PROPANOLOL
CARAZOLOL

ANALISIS DE TRANQUILIZANTES
•Ajuste previo de pH orina entre 5-7

•Purificación con columnas Bond-Elut certify®
preparadas para compuestos básicos.
•Determinación LC-MS/MS con fase móvil ac.
Trifluoroacético/ACN

Ejemplo Determinación Carazolol
UHPLC-HRMS
Confirmación Carazolol. 12C/13C
• Sin fragmentación
• Con fragmentación HCD 25 eV 1 inyección
100
299.17540
THEORETICAL ISOTOPIC
Relative Abundance
PATTERN
RT: 5.01
AA: 955476
100 300.17876
80 301.18211
60 m/z 299.17540
C18H23N2O2 without HCD 299.17595
40 EXPERIMENTAL
20 ISOTOPIC PATTERN
0
0 1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 C18H23N2O2
Time (min) ∆= 1.83761
300.17838
301.18292
299.0 299.5 300.0 300.5 301.0 301.5
12C m/z
IPs según 657/2002

13C
2 IPs por ión precursor 4 Puntos

identificación
1 IR
Ejemplo Determinación Carazolol
UHPLC-HRMS
Muestras no conformes. Confirmación Carazolol
RT: 5.01
• 2 IR
100
AA: 955476
• ∆m ≤ 5 ppm
80
m/z 299.17540
60
40 C18H23N2O2 without HCD • RT
20
0
RT: 4.99
100 AA: 91936
Relative Abundance
80
60 m/z 299.17540 with
40 2,0 IPs HCD 25eV C18H23N2O2
20
0 RT: 4.99
100
80
AA: 359738
7 Puntos
m/z 222.09134 with
60
40 2,5 IPs HCD 25eV
C15H12NO identificación
20
0
RT: 4.99
100 AA: 34999
80
m/z 168.08080 with
60
40
2,5 IPs HCD 25eV
C12H10N
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)

CARMEN IGUALADA CAÑAS
LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
e-mail: igualada_car@gva.es

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MASTER EN CALIDAD Y SEGURIDAD

Carmen Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Son todas las sustancias farmacológicamente

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

¾Reglamento de la CE nº 470/09, de 6 de mayo.

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Committee for Veterinary

Ingesta diaria admisible

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Estudios toxicológicos a largo plazo Estudios de efectos carcinogénicos

Estudios de reproducción Estudios de efectos inmunológicos

Estudios de efectos teratogénicos Estudios de efectos microbiológicos

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

¾ Uso legal o ilegal de medicamentos

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014.

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014.

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014.

Reguló los controles de determinadas

Aprueba el Plan Nacional de

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Establece un procedimiento comunitario de fijación

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Cuadro 2 (actual Directiva 96/22 :

•Cloroformo •Sustancias de efecto

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Por la que se prohibe utilizar determinadas

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Relativa a las medidas de control aplicables

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

1. Estilbenos, derivados de los estilbenos,

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Establece las medidas de control aplicables a

(modificación al RD 1749/1998 por el RD 731/2007)

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Se establecen procedimientos comunitarios para la fijación

Deroga el Reglamento nº 2377/90

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

• Relativo a las sustancias farmacológicamente

Anexo: Cuadro 1: Sustancias autorizadas

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Se derogan las Decisiones 90/515/CE(métodos de

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

•Utilizados para detectar la presencia de una sustancia al

•Se utilizan para cribar grandes cantidades de muestras en

•Están diseñados específicamente para evitar resultados

•Los resultados no conformes deben ser confirmados por

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

•Placa de E. Coli a pH 8 (quinolonas)

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

•Incluyen información sobre la estructura

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

Extracción del analito

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

•Molécula intacta (“parent compound”). La

Master en Calidad y Seguridad Alimentaria. C. Igualada. Abril 2014

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