INTRODUCCIN AL CULTIVO CELULAR

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Inicialmente fue considerada inicialmente como una tcnica particularmente difcil de aprender. Sin embargo, hoy en da estas dificultades estn superadas gracias a factores como los medios de composicin definida, la disponibilidad de antibiticos, las instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores estriles, etc), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc).

1.- Introduccin histrica

El cultivo de tejidos se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como una continuacin de las tcnicas de la embriologa. Wilhem Roux mantuvo en el ao 1885 clulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das. Se considera al zologo americano R. G. Harrison como el iniciador de los cultivos de tejidos animales. En 1907, Harrison fu el primer cientfico que emple tcnicas in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableci que el axn se formaba por expansin a partir del cuerpo neuronal y no por fusin de una cadena de clulas. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cmara sellada. La primera limitacin para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) emple plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se revel mucho mejor que los anteriormente probados, lo que le permiti observar el crecimiento del tejido nervioso, corazn y piel. Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embrin. Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparicin de mltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos mtodos de manipulacin en condiciones de asepsia que an hoy da se utilizan. En 1913 Carrel demostr la posibilidad de mantener en cultivo clulas extradas de un animal, embrin de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de ste. Mantuvo en cultivo clulas de pollo durante 34 aos. Gran parte del xito en el mantenimiento de los cultivos se debi al desarrollo del denominado frasco de Carrel. Entre los aos 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtencin de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estriles, pero sin grandes avances. A partir de los aos 40, con el aislamiento de los primeros antibiticos, se desarrollaron numerosas aplicaciones.

En 1948, Earle y col. aislaron clulas de la lnea celular L y mostraron que eran capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una clula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos. En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular continua, las clulas HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano. En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo. Este trabajo supuso el Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986. En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos nutritivos de las clulas en cultivo. En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duracin de los cultivos de fibroblastos era finita: podan mantener estos cultivos durante 12 pases. No consiguieron establecer lneas estables. En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas clulas de mamfero en cultivo indefinidamente. En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera lnea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecan procesos nerviosos y que eran elctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares diferenciadas. En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera lnea celular productora de anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnologa de obtencin de anticuerpos monoclonales les vali el Premio Nobel. En la dcada de 1980 se empiezan a conocer los mecanismos de la transformacin. En la dcada de 1990 empezaron a producirse medicamentos a escala industrial en biorreactores. Se desarrolla la biotecnologa. En 1998 se produce cartlago mediante ingeniera de tejidos y en 2003 se experimenta el auge de esta nueva disciplina. En 2007 se reprograman clulas adultas para convertirlas en clulas pluripotenciales inducidas.

2.- Tipos de cultivo celular

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Se distinguen varios tipos de cultivos celulares.

Cultivo de rganos
Se coloca el rgano sobre una rejilla situada en la interfase lquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura caracterstica del tejido in vivo. Se conservan las interacciones histolgicas y, gracias a ello, este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que representan una buena rplica del tejido de origen. Sin embargo, no crecen mucho (la proliferacin celular se limita a las clulas embrionarias de la periferia) y no se pueden propagar. Se necesita un nuevo explante par cada experimento lo que supone mucho ms trabajo y una limitada reproducibilidad de la muestra. Cuantificar es difcil y la cantidad de material que se puede cultivar es reducida.

Explantes primarios
Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interfase slido-lquido de un soporte de vidrio o de plstico. Las clulas se adhieren a la superficie y las clulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.

Cultivo celular primario

Es el tipo de cultivo ms utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de clulas disgregadas. La disgregacin celular se realiza por mtodos enzimticos o mecnicos. En estos cultivos se pierden las interacciones clula-clula y las interacciones de la clula con la matriz extracelular. Sin embargo, las clulas son capaces de proliferar y la poblacin celular crece notablemente. Cuando las clulas ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las clulas establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferacin y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las clulas a un nuevo soporte. Esta operacin se denomina subcultivo o pase.

Existen dos tipos de cultivo celular primario: Cultivos en monocapa: las clulas crecen adheridas sobre un soporte slido (plstico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferacin celular. Es el mtodo utilizado para la mayora de las clulas excepto para las hematopoyticas. Cultivos en suspensin: las clulas se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las clulas hematopoyticas, clulas madre, lneas celulares transformadas y clulas tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el nmero de clulas es grande y los nutrientes son insuficientes.

Subcultivos y lneas celulares Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos enzimticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en suspensin, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as formados se denominan una lnea celular. La formacin de una lnea celular a partir de un cultivo primario implica que: aumenta el nmero de clulas obtenidas acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento la poblacin celular se hace uniforme y homognea sus caractersticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitrgeno lquido, de forma indefinida

Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de clula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las clulas entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telmeros, y mueren. Sin embargo, algunas clulas (como las clulas de roedores y las clulas tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a lneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas clulas pueden surgir de forma espontnea (exposicin a radiaciones ionizantes o a carcingenos qumicos) o inducida (infeccin vrica o transfeccin de ADN) y son el resultado de un cambio genotpico denominado transformacin.

Las clulas transformadas se caracterizan porque: Son inmortales: crecen indefinidamente Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibicin por contacto, la limitacin de la densidad celular durante la proliferacin y la dependencia del anclaje Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores Son genticamente inestables: son heteroploides (vara el nmero de cromosomas) y presentan aberraciones cromosmicas

En 1952 se obtuvo la primera lnea celular continua humana. Son las denominadas clulas HeLa, clulas extradas a partir de un tumor de cuello del tero de una paciente afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks.

Cultivos histotpicos y organotpicos

Los cultivos histotpicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los cultivos organotpicos constan de varios tipos celulares que interaccionan entre s de una forma que intenta parecerse lo ms posible a la original. El objetivo final de este tipo de cultivos es la creacin in vitro de tejidos u rganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en transplantes. Los cultivos organotpicos constituyen la base de una nueva disciplina denominada ingeniera de tejidos.

3.- Biologa de las clulas en cultivo

Al establecer un cultivo celular se seleccionan las clulas que van a crecer en funcin de numerosos criterios: slo formarn parte del cultivo aquellas clulas que sean capaces de superar el proceso de disgregacin, de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en forma de monocapa, bien en suspensin). El crecimiento en monocapa significa que las clulas se adherirn al sustrato y en esa forma inician la proliferacin. Muchas lneas celulares son anclaje-dependientes, es decir, no inician la proliferacin hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo normal de proliferacin de la mayor parte de las clulas, con excepcin de las clulas hematopoyticas maduras. El crecimiento en suspensin es propio de aquellas clulas capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje. Es propio de las clulas hematopoyticas, algunas lneas celulares transformadas y de clulas procedentes de tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fraccin o tipo celular que es capaz de crecer en suspensin. A pesar de que su origen no est claro se cree que se trata de clulas madre ("stem cells") indiferenciadas. Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva seleccin: aumentan en nmero aquellas clulas que tienen una mayor tasa de crecimiento. As pues, hay que considerar al cultivo como un ente dinmico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos que lo forman varan en el tiempo en funcin de la presin selectiva a la que estn sometidos. En general, se alcanza la confluencia de las clulas, stas detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos celulares neoplsicos que sigan duplicndose hasta desplazar a los otros tipos celulares del cultivo. Al alcanzar la confluencia en el cultivo es cuando muchas lneas celulares expresan sus aspectos ms caractersticos. Es en este estado cuando su morfologa y fisiologa son ms parecidas a su estado original. Es tambin el momento en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las clulas. A partir del tercer replaqueo, el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo, desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se establecen condiciones selectivas, las clulas del tejido conjuntivo (especialmente los fibroblastos) sern las seleccionadas. Para evitar que las clulas ms especializadas del cultivo se vean desplazadas de ste por los fibroblastos o por otras clulas de rpido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos. En los cultivos primarios, las clulas crecen durante un cierto nmero de pases que depende, sobre todo, del tipo celular y de las condiciones de cultivo. As, los hepatocitos de adultos slo se mantienen como cultivo primario, las clulas endoteliales de cordn umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases y los fibroblastos drmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo, al final todas ellas entran en una fase de senescencia en la que se acumulan numerosas anormalidades y se pierden las funciones especializadas, lo que conduce a la muerte del cultivo.

Slo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante ms generaciones de las esperadas. Es debido a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas clulas forman lneas estables o cultivos celulares permanentes. En la mayora de los casos se desconoce la razn de la aparicin de clulas inmortales pero se ve favorecida por infecciones virales y por tratamientos con mutgenos, lo que podra estar relacionado con la prdida, espontnea o inducida, de las vas de control celular. La capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como lnea estable est relacionada directamente con su variabilidad gentica. Las lneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides, como es el caso de fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo y la glia humana. Las lneas que, con frecuencia, se convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en lneas celulares estables, como es el caso de las clulas epidrmicas. En general, una lnea celular ser tanto ms fcil de establecer o cultivar cuanto ms indiferenciada sea, con las excepciones de las lneas tumorales de clulas diferenciadas. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las clulas pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de dividirse. Esta prdida de algunas de sus propiedades caractersticas puede deberse a desdiferenciacin o a desadaptacin. La desdiferenciacin implica una prdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. Por ejemplo, un hepatocito en cultivo puede perder algunas anzimas (como la arginasa o las aminotransferasas), o ser incapaz de almacenar glucgeno o de sintetizar las protenas del suero. En la desadaptacin, la prdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algn tipo e seal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta con recuperar esa seal para que la caracterstica se vuelva a expresar. Por ejemplo, cuando crecen sobre una matriz de colgeno, los hepatocitos de rata pueden volver a expresar la enzima tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona).

4.- Aplicaciones del cultivo celular

Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigacin bsica como en la aplicada. En la investigacin bsica, permiten estudiar fenmenos complejos como, por ejemplo: la actividad intracelular: transcripcin de DNA, sntesis de protenas, metabolismo energtico, ciclo celular, diferenciacin, apoptosis, etc. el flujo intracelular de biomolculas: procesamiento del ARN, el movimiento del ARN desde el ncleo hacia el citoplasma, el movimiento de las protenas hacia diversos orgnulos, el ensamblaje y desensamblaje de los microtbulos, etc. genmica y protemica: anlisis gentico, infeccin, transformacin celular, inmortalizacin, senescencia, expresin gnica, rutas metablicas, etc. ecologa celular: el estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular y de su diferenciacin, el estudio de las necesidades nutricionales, la cintica de la poblacin celular, etc.

las interacciones celulares: morfognesis, proliferacin celular, adhesin celular, interacciones con la matriz, invasin celular, etc.

En la investigacin aplicada, las tcnicas de cultivo celular utilizan en reas tan diversas como: Virologa: Cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas, etc. Biotecnologa: produccin industrial de frmacos en biorreactores (interfern, insulina, hormona de crecimiento, etc.) Inmunologa. Produccin fenmenos de inflamacin. de anticuerpos monoclonales, sealizacin,

Farmacologa: Efecto de diversos frmacos, interacciones con el receptor, fenmenos de resistencia, etc. Ingeniera de tejidos. Produccin de tejidos artificiales (piel, cartlagos) para el tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciacin y diferenciacin inducida, etc. Toxicologa: citotoxicidad, mutagnesis, carcinognesis, etc.

5.- Ventajas e inconvenientes de los cultivos celulares

Como ventajas podemos citar: a) Permiten un control preciso y fino del medio ambiente En un cultivo se pueden controlar las condiciones fsico-qumicas (pH, temperatura, presin osmtica, presin parcial de O2 y CO2), y fisiolgicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc.). Para algunas lneas celulares se han definido medios definidos. Un medio definido es aqul en el que se conocen todos y cada uno de los componentes que lo forman y su concentracin exacta. Para establecer un medio definido hay que conocer con precisin las necesidades nutritivas de las clulas en cuestin. Sin embargo en el caso de muchas lneas celulares, estas necesidades no se conocen. En estos casos se utilizan medios que se suplementan con disoluciones complejas (suero, extractos de embrin, etc.) que contienen factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. b) Caracterizacin y homogeneidad de la muestra Una muestra de tejido es siempre heterognea. Sin embargo, al cabo de uno o dos pases, las lneas celulares cultivadas son homogneas, es decir, su morfologa y su composicin son uniformes. La presin selectiva de las condiciones de cultivo da lugar a un cultivo homogneo del tipo celular ms vigoroso. A partir de ese momento se pueden obtener rplicas idnticas en cada subcultivo y las caractersticas de la lnea celular se conservan durante varias generaciones o de forma indefinida si la lnea celular se conserva en nitrgeno lquido. Esto facilita mucho el tratamiento estadstico de los resultados. c) Economa En los cultivos celulares se emplean disoluciones con una concentracin mucho menor que en el caso del animal completo. Adems, se garantiza el acceso directo de la sustancia a las clulas sin que se diluya y sin que sufra ningn tipo de modificacin metablica. El coste de los ensayos clnicos se reduce considerablemente y se puede hacer un mayor nmero de pruebas. Tambin se reducen los costes relacionados con la fabricacin del posible nuevo medicamento: en lugar de fabricar cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) basta con que se sinteticen unos pocos miligramos. d) Cuestiones ticas La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa vlida en muchas situaciones. Para obtener un cultivo celular primario es posible que haya que sacrificar algn animal, pero con ellos se pueden ensayar un elevado nmero de condiciones experimentales que, en otras circunstancias, supondran el sacrificio de decenas o cientos de animales de experimentacin.

Los cultivos celulares tambin pueden suponer algunas desventajas: a) Tcnica sensible El crecimiento de las clulas animales se tiene que realizar en estrictas condiciones de asepsia porque su crecimiento es mucho ms lento que el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas, etc.). Adems, las clulas animales son incapaces de mantenerse vivas en ausencia de la compleja mezcla de nutrientes presente en el plasma o en el fluido intersticial. Todo esto condiciona en gran medida el instrumental requerido y el grado de preparacin del personal encargado de los cultivos. b) Cantidad y coste Producir 1 gramo de clulas en cultivo cuesta 10 veces menos que obtenerlas a partir del tejido de un animal. En un laboratorio normal se pueden conseguir hasta 10 gramos de clulas sin que se resienta mucho el presupuesto de investigacin. Para producir hasta 100 gramos de clulas hay que incrementar tanto el instrumental como el personal. Para producir cantidades mayores se necesitan instalaciones de tipo industrial. c) Inestabilidad Muchas lneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotacin cromosmica aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para diferenciarse. Es posible, por tanto, encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran cada determinado tiempo o despus de un determinado nmero de generaciones a partir de un stock congelado.

d) Desdiferenciacin e identificacin de las clulas Al propagarse la lnea celular, las clulas pierden las caractersticas fenotpicas propias del tejido de procedencia. Este fenmeno se denomina desdiferenciacin y, entre otras, cosas se hacen mviles e inician su proliferacin. La relacin entre las clulas cultivadas y las clulas originales del tejido puede perderse. En este caso se necesitan marcadores estables que permitan identificar la procedencia de las clulas. En algunos casos es posible revertir la desdiferenciacin, bien por procedimientos de diferenciacin inducida por hormonas, bien por compuestos qumicos (steres de forbol) pero no est claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciacin in vivo.

e) Validez del modelo 'in vitro' En realidad, un cultivo celular es un disgregado celular de un tejido y se diferencia de ste en que: se ha perdido la organizacin espacial tridimensional propia del tejido ya que stas se propagan en dos dimensiones. se han perdido las interacciones entre los distintos tipos celulares y entre las clulas y la matriz extracelular. Adems, al formarse una lnea celular slo se conservan uno o dos tipos celulares (los que proliferan a mayor velocidad). carece de los componentes sistmicos implicados en la regulacin de la homeostasis in vivo, especialmente los sistemas nervioso y endocrino.

La presin parcial de O2 es reducida, ya que no hay un transportador de oxgeno como la hemoglobina. Por tanto, la energa se obtiene principalmente a travs de la glicolisis, ya que el ciclo de Krebs juega un papel muy reducido.

Por tanto, hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos in vitro porque pueden diferir de lo que pueda observarse in vivo.