INSTITUTO TECNOLÓGICO DEL VALLE DE OAXACA

PRACTICA N° 1

Bioremediacion de suelos contaminados con gasolina y aceite de automóvil

ASIGNATURA: Microbiología Aplicada

DOCENTE:

M.C. Delia Anatolia Cuevas Aguirre

INTEGRANTES:

Barrita Bustamante Laura Ivette

Cansino Vera Laura Berenice
Fragoso Buenrostro Víctor Hugo
Mateos Salinas Irving

8º “B”

LIC. EN BIOLOGIA

2 marzo de 2017
 Introducción

En México existe una gran diversidad de suelos que puede explicarse por la
interacción de diversos factores, entre los que se encuentran la compleja
topografía originada por la actividad volcánica. Desde el punto de vista agrícola, el
suelo es la capa de material fértil que recubre la superficie de la Tierra y que es
explotada por las raíces de las plantas y a partir de la cual obtienen sostén,
nutrimentos y agua. Desde una perspectiva ambiental, existen varias definiciones
que incorporan su papel fundamental en los procesos ecosistémicos, debido a las
funciones y servicios que realiza tales como la regulación y la distribución del flujo
de agua o como amortiguador de los efectos de diversos contaminantes.

La entrada de contaminantes al medio ambiente va ligada tanto a procesos

naturales como antropogénicos. Como resultado de estos últimos (vertidos
accidentales, incineración de residuos…), cada año se liberan al medio, grandes
cantidades de compuestos químicos orgánicos e inorgánicos. La contaminación de
suelos es una consecuencia común de la actividad industrial. La gasolina como
principal factor contaminante forma parte de la fracción ligera del crudo de
petróleo, ya que se obtiene a entre 20 y 180ºC, aunque su producción es menos
directa que la del diésel y los fueles. Este hecho implica que los suelos
contaminados por gasolina son ricos en hidrocarburos, como en el caso de suelos
contaminados por otros derivados del petróleo. Los componentes más importantes
de la gasolina y, por lo tanto, los contaminantes más abundantes en suelos con
presencia de esta substancia son: nbutano, isopentano, pentano, mono y
dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetilhexanos, trimetilbenzenos,
metiletilbenzenos, naftalenos y heptano, estos dos últimos en menor grado. Entre
ellos, los BTEX generan una gran preocupación medioambiental debido a su
toxicidad y relativamente elevada solubilidad en agua. La importancia de la
bioremediacion de estos suelos afectados contribuirá en un equilibrio ya que si la
contaminación sigue acabara por obtenerse suelos infértiles y tóxicos de donde no
podrá sustentarse, la implementación de estudios de suelos ha contribuido a un
mejor entendimiento sobre la problemática que se ha causado debido a la
contaminación industrial.
Objetivo general:

Aplicar bioremediacion a suelos contaminados con gasolina y aceite

Objetivo específico:

Aplicar diferentes tipos de bioremediacion (bioaumentacion, composteo,

bioestimulacion, atenuación natural en suelos contaminados por gasolina)

Determinar las características fisicoquímicas del suelo contaminado

Evaluar las características del suelo con la aplicación de agentes bioremediadores

Determinar microorganismos heterótrofos, hongos, levaduras, bacterias

 Materiales Equipo Reactivo
Biopreparado Biopreparado Biopreparado
Suelo 3kg 1Probeta de 1000ml Melaza 440gr
Suero de leche 30ml 1bascula Levadura 10gr
Estiércol bovino 440gr Balanza analítica Sulfato de cobre
Cascara de piña 30gr
1050 ml de Agua
1 bandeja de platico o charola
1 bidón de 4 litros
1 manguera de 1 m
Bote de agua de 500ml

Bioestimulacion
Bioestimulacion Vaso de precipitado Bioestimulacion
Suelo 3kg Matraz 1.62g de NO3NH4
Probeta 0.067g de (NH4)2HPO4
Pipeta de 1ml 0.087G DE K2HPO4

Composteo Composteo
Suelo 3kg 1Bascula Composteo
240g de estiércol 1 balanza analítica 36g de levadura
120g de cascara de piña 96g de melaza
120g de cascara de naranja
120g de salvado de trigo
150g de hojarasca
Plástico negro
Pala de plástico
1 bandeja de platico o charola

Atenuación natural Atenuación natural

Atenuación natural
Suelo 3kg 1Bascula
Pala de plástico
1 bandeja de platico o charola
 Materiales Equipo Reactivos
40 pipetas (10,5,1,ml) Refrigerador 200ml de NaCl 0.85%
30 cajas Petri Estufa Agar LB (Luria Bertani)
Papel estraza 3 kilos Parrilla Triptona
Un rollo Climpack Termómetro Extracto de levadura
3 gradillas 3 mecheros Cloruro de sodio
4 asas de dygransky Agar bactereologico
2Marcador 950ml de agua destilada
Cinta masKing Agar nutritivo
Rosa bengala
Acido tartárico al 10%
Ácido láctico al 10%
Gasolina 1l
Aceite 1l
 Metodología

Preparación de los tratamientos

15 días antes de realizar esta práctica se inició con la elaboración de los
tratamientos a utilizar y la colecta de los suelos para su contaminación
Preparación del biopreparado
Para la preparación de este tratamiento se mezcla dentro de un bidón de 4 litros
se agregó previamente pesados en una báscula normal 30 ml de suero de leche,
440 g de estiércol, 440 g de melaza , 30 g de cascara de piña y con la ayuda de
una balanza analítica se pesó 10 g de levadura y 1050 ml de agua de la llave con
la ayuda de una probeta de 1000ml todo esto vertido dentro del bidón todo esto
se preparó en condiciones normales no hizo falta tener al alcance un laboratorio
solo de algunos materiales para precisar la cantidad a utilizar.
Elaboración del composteo
Para la realización de la composta como primer paso se escarbo un agujero en la
tierra como de 70 cm de fondo 70cm de ancho para almacenar hay nuestra
composta después dentro del agujero se vertió previamente pesados 240g de
estiércol, 36g de levadura, 120g de cascara de piña, 120g de cascara de naranja,
96g de melaza, 120g de salvado de trigo, 150g de hojarasca todo esto se mezcló
perfectamente para después cubrirlo con el plástico negro este se mezcló cada
tres días
Elaboración del bioestimulador
Para el caso del bioestimulador se pesó los nutrientes minerales a utilizar para
cada kg de suelo a utilizar con la ayuda de una balanza analítica se pesó 1062g
de NO3NH4, 0.067g de (NH4)2HPO4 y 0.087g de K2HPO4.
Preparación del suelo
Para la preparación del suelo se utilizaron 3kg de suelo se contaminaron de
manera artificial por aspersión al 4% en peso de gasolina a 80g de suelo todo esto
en una bandeja de plástico
Después se procede a contaminar 3kg de suelo con aceite para esto se utilizó el
mismo método de aspersión al 4% en peso de aceite a 80g de suelo
respectivamente en su bandeja de plástico
Por último se procede a elaborar el suelo testigo este suelo solo se pesó 3kg sin
tratamiento
Determinación de características fisicoquímicas
Por métodos fisicoquímicos se determinó los siguientes parámetros (textura, PH,
materia orgánica y % de N/C para el suelo contaminado en nuestro caso suelo con
aceite se le tomo todos estos parámetros
En la bandejas de plástico se instalara los tratamientos de 3kg por tratamiento en
nuestro caso se aplicó tratamiento a suelo contaminado por aceite
T1 Tratamiento Tipo de bioremediacion
T1 Suelo testigo
T2 Suelo con aceite Atenuación natural
T3 Suelo con aceite + Bioaumentacion
biopreprado
T4 Suelo con aceite Bioestimulacion
+nutrientes minerales
T5 Suelo con aceite Composteo
+composta

Cuenta de microrganismos heterótrofos en medio LB

Como primer paso se preparó el diluyente para esto se preparó 200ml de NaCl al
0.85% .De esta solución se coloca 90ml en un matraz de 250 ml de esta solución
en el matraz se toma 9ml de este diluyente con la ayuda de un pipeta y se vierte
en un tubo de ensayo con tapa se repite el procedimiento para obtener 5 tubos de
ensayo con 9ml de solución en cada uno.
Preparación del Agar LB
Para la preparación se pesó con la ayuda de una balanza analítica 10g de triptona,
5g de cloruro de sodio, 15g de agar bactereologico, esto para 950ml de agua
destilada en un matraz para después pasar a esterilización por autoclave
15LB/pulg2. Y para finalizar vaciarlo en cajas Petri.
Diluciones y siembra
Para la realización de esta dilución se comienza por pesar 10g de suelo
contaminado por aceite verterlo en un matraz para después adicionarle 90ml de
NaCl al 0.85% estéril agitarlo durante 5 minutos esta se vuelve la dilución 10-1
apartir de esta con la ayuda de una pipeta tomar 1 ml y adicionar a un tubo de
ensayo que contiene 9ml de NaCl al 0.85 % previamente preparados y agitar por 1
minuto esta se vuelve nuestra dilución 10-2 se repite este procedimiento hasta
llegar al 10-5
Siembra en medio LB
Para la siembra en el medio LB se tomó 0.1 ml de cada dilución de los tubos de
ensayo con NaCl al 0.85 %y se sembró por duplicado por extensión con la ayuda
de un asa de digransky en el medio LB se incubo a 27°C por dos días completos
para después observar la aparición de colonias
Cuenta bacteriana, hongos y levaduras
Preparación de agar nutritivo
Se preparó el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante se esterilizo el
medio a 15 lb/pulg2 se dejó enfriar hasta que alcanzara 35a40°C
Preparación de PDA
Este medio se prepara según las indicaciones del fabricante y como se extra se
adicionara rosa de bengala (5omg) esto se esterilizo a 15 LB/pulg2 y se enfrió a 45
°c se acidifico hasta obtener un pH de 3,5 con ácido tartárico estéril al 10% una
vez terminado se vacío en cajas Petri
Diluciones decimales seriadas a partir del suelo
Pesar 10g de suelo y verte en 90 ml de solución salina en un matraz y agitar
durante 3minutos a partir de la dilución 10-1 agregar 1ml de cada tubo hasta
hacer diluciones seriadas de10-6.
Microorganismos del suelo mediante técnica de extensión en placa de agar
nutritivo y PDA
Tomar 0.1ml de la dilución 10-6 y sembrar por extensión con asa de digransky en
los medios preparados agar y PDA nutritivo
Sembrar para las demás diluciones por el mismo método
Etiquetar e incubar en posición invertida las cajas Petri a 30°C de 1 a 3 días y las
de agar nutritivo a 28°C de 3 a 5 días estas se tendrán que observar diariamente
 Resultados
Comparación de los diferentes resultados de diferentes tratamientos realizados
por el grupo

Hongos PDA rosa Levaduras PDA rosa Bacterias medio LV Bacterias Agar nutritivo
bengala bengala
Tipos de 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 10-6 10-3 10-4 10-5 10-6
suelo
s. Limpio 3 0 0 1 0 0 Inc. 428 114 11.5 Inc. 23 64 23

0 0 2 Inc. 0 0 7 Inc. Inc. Inc. Inc. Inc. Inc. Inc.

S.
Gasolina
1 0 0 0 0 0 2 16 5 6 Inc. Inc. 10 2
s.
Gasolina
0 0 0 1 0 0 33 31 2 1 20 8 6 4
S. Aceite

2 0 0 0 0 0 Inc. 11 3.5 1 24 13 2 1
S. Aceite

Calculo de UFC
UFC/gss= N°de colonias x (1/dilución)
Peso del suelo seco

33x102 33x10² 11x103 11x103

31x103 310x10² 3.5x104 25x103
2x104 200x10² 1x105 100x103
1x105 100x10² 2.4x103 2.4x103
20x102 20x10² 13x103 13x103
8x103 80x10² 2x104 20x103
6x104 600x10² 1x105 100x103
4x105 400x10²
Hongos Levadura Bacterias
Suelo limpio 3x10² UFC 1x10² 947x103=9.47x105
Suelo con gasolina 100x10² 0 86.7x103
Suelo con aceite 2x10² 1x10² 59x103

Discusión de resultados
La biorremediación es una tecnología basada en la utilización de los
microorganismos y su potencial metabólico degradador para eliminar o transformar
los contaminantes del medio en productos inocuos. Tiene ciertas ventajas
respecto a los métodos físico-químicos (excavación, extracción química e
incineración), ya sea por su bajo coste económico, como por la no afectación de
otros compartimentos ambientales y la optimización de los recursos (Lladó
Fernández, 2012)
Concordamos con el autor ya que el método sale muy económico además de que
la aplicación es sencilla y para la preparación del tratamiento no fue tan necesario
un laboratorio como tal y al ser un medio natural este no tiene un impacto en el
suelo ya que son compuestos orgánicos
Entre las técnicas de biorremediación empleadas para el saneamiento de suelos
contaminados, la adición de composta presenta muchas ventajas técnicas y
económicas, que la hacen aplicable a nuestro medio. En este caso particular se
decide la adición de composta debido a que un suelo contaminado puede tener
características de una arcilla muy plástica, por lo que la adición de composta le da
una textura adecuada para facilitar la incorporación de oxígeno. (Perez, Palacios,
& Salva, 2010)
La adición de composta para un tratamiento se presenta con más ventajas como
lo menciona el autor ya que es una composta como tal un suelo contaminado con
la aplicación de la composta no afecta en lo más mínimo su composición adema
de que este llega obtener un grado más de asimilación ya que es un método de
aplicación directa el único detalle que este presenta es el tiempo que se tiene que
dedicar además de constantes revisiones del suelo.
La biorremediación es una tecnología aplicada en la limpieza de hidrocarburos del
petróleo derramados en el suelo, por ser una técnica de fácil construcción,
operación y mantenimiento, La biorremediación es una tecnología aplicada en la
limpieza de hidrocarburos del petróleo derramados en el suelo, por ser una técnica
de fácil construcción, operación y mantenimiento, La atenuación natural es un
método de remediación pasiva que depende de los procesos naturales para
degradar y disminuir los contaminantes en el suelo y el agua subterránea
(GÓMEZ, GAVIRIA, & CARDONA, 2009)
Este método se tomó en cuenta según la investigación previa ya que se ha
mencionado que la bioremediacion ha obtenido buenos resultados aunque cabe
mencionar que estos toman tiempo ya que dependen de los procesos naturales
como lo menciona en el autor la degradación de estos contaminantes depende
mucho de la técnica ya que no en todas se llega obtener resultado iguales
Conclusión
 Podemos decir que la práctica obtuvo en resultado favorable ya que se
comprendió y analizo los factores en la bioremediacion de suelo además de que
se pudo demostrar que un suelo incluso después de ser contaminado tiene
presencia mínima de microorganismos y que estos tratan de hacer una función de
estabilizarlo aunque esto tome más tiempo. Esto nos demuestra la actividades
comprendidas en un ecosistema en donde el mismo trata de sobrevivir, de igual
manera se pudo obtener un aprendizaje sobre el impacto causado por un
hidrocarburo en el suelo y como este afecta a diversos factores, y aunque solo se
ha realizado en este caso el estudio sobre el suelo aún nos falta ver impactos que
estos tienen sobre el agua que de igual manera podrá dar resultados
interesantes.
GÓMEZ, W., GAVIRIA, J., & CARDONA, S. (2009). EVALUACIÓN DE LA BIOESTIMULACIÓN FRENTE A
LA ATENUACIÓN NATURAL Y LA BIOAUMENTACIÓN EN UN SUELO CONTAMINADO CON UNA
MEZCLA DE GASOLINA - DIESEL (1st ed., pp. 8-11). Colombia. Retrieved from
http://www.scielo.org.co/pdf/dyna/v76n160/a08v76n160.pdf

Lladó Fernández, S. (2012). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos pesados y

caracterización de comunidades microbianas implicadas (doctoral). Facultad de biología.

Pérez, N., Palacios, S., & Saval, S. (2010). BIORREMEDIACIÓN EN CAMPO DE UN SUELO

CONTAMINADO CON GASOLINA Y DIESEL MEDIANTE ADICIÓN DE COMPOSTA (4th ed., p. 1).
México D.F. Retrieved from
http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/veracruz01/TRABAJOS/AREA_VI/CVI-53.pdf