Bacterias oxidantes de arsenito y reductoras de arsenato asociadas con aguas subterráneas ricas en arsénico en

Taiwán

Vivian Hsiu-Chuan Liao a, ⁎, Yu-Ju Chu a , Yu-Chen Su a , Sung-Yun Hsiao a , Chia-Cheng Wei a , Chen-Wuing Liu a ,
Chung-Min Liao a , Wei-Chiang Shen b , Fi-John Chang a

a Department of Bioenvironmental Systems Engineering, National Taiwan University, 1 Roosevelt Road, Sec. 4,
Taipei 106, Taiwan b Department of Plant Pathology and Microbiology, National Taiwan University, 1 Roosevelt
Road, Sec. 4, Taipei 106, Taiwan

Liao, VH-C., Chu, Y.-J., Su, Y.-C., Hsiao, S.-Y., Wei, C.-C., Liu, C.-W.,… Chang, F.-J. (2011). Bacterias
oxidantes y reductoras de arsenito asociadas con aguas subterráneas ricas en arsénico en
Taiwán. Revista de hidrología contaminante, 123 (1-2), 20-29. doi: 10.1016 / j.jconhyd.2010.12.003 

https://sci-hub.se/https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0169772210001531

Abstracto

Beber agua subterránea altamente contaminada con arsénico es una causa probable de la enfermedad del pie
negro en Taiwán, pero los microorganismos que potencialmente controlan la movilidad del arsénico en el subsuelo
siguen sin estudiarse. El objetivo de este estudio fue investigar la comunidad microbiana que oxida y reduce el
arsenito que existe en las aguas subterráneas altamente contaminadas con arsénico en Taiwán. Cultivamos e
identificamos bacterias transformadoras de arsénico, analizamos la resistencia y transformación del arsénico y
determinamos la presencia de marcadores genéticos para la transformación de arsénico. En total, se aislaron 11
cepas bacterianas transformadoras de arsénico con diferentes morfologías de colonias y diferentes capacidades de
transformación de arsénico, incluidas 10 bacterias anaerobias facultativas reductoras de arsenato y una bacteria
oxidante de arsenito estrictamente aeróbica. Todos los aislamientos exhibieron altos niveles de resistencia al
arsénico con concentraciones inhibitorias mínimas de arsénico que variaban de 2 a 200 mM. La cepa AR-11 pudo
oxidar rápidamente el arsenito a arsenato en concentraciones relevantes para muestras ambientales de agua
subterránea sin la adición de donantes o aceptores de electrones. Proporcionamos evidencia de que la actividad de
reducción del arsénico puede ser conferida por el o los operones ars que no fueron amplificados por los cebadores
diseñados actualmente en uso. El análisis de la secuencia de ARNr 16S agrupó los aislados en los siguientes
géneros: Pseudomonas, Bacillus, Psychrobacter, Vibrio, Citrobacter, Enterobacter y Bosea. Entre estos géneros,
presentamos el primer informe del género Psychrobacter involucrado en la reducción del arsénico. Nuestros
resultados apoyan aún más la hipótesis de que las bacterias capaces de oxidar el arsenito o de reducirlo coexisten y
son ubicuas en las aguas subterráneas contaminadas con arsénico.

1. Introducción

El arsénico (As), un carcinógeno humano conocido, se distribuye ampliamente en los alimentos, el agua, el suelo y
el aire. Es un elemento omnipresente de origen tanto natural como antropogénico y, a menudo, es responsable de
contaminar los suministros de agua. En la mayoría de los casos, la contaminación de las aguas subterráneas con
arsénico se deriva naturalmente de los sedimentos de los acuíferos ricos en arsénico. Los dos estados de oxidación
biológicamente relevantes del arsénico inorgánico son el arsenito [As (III)] y el arsenato [As (V)]. En general, el As
(III) es más peligroso para los organismos que el As (V) (Hughes, 2002). Ciertos microorganismos han desarrollado
los componentes genéticos necesarios que les confieren mecanismos de resistencia, lo que les permite sobrevivir y
crecer en ambientes que contienen niveles de arsénico que serían tóxicos para la mayoría de los demás
organismos. En las bacterias, el operón de resistencia al arsénico (ars) confiere un alto nivel de resistencia al
arsénico. El operón bacteriano ars se compone de tres a cinco genes (arsR, -D, -A, -B y -C), que se encuentran en
plásmidos (Owolabi y Rosen, 1990) o cromosomas (Diorio et al., 1995) . arsR y arsD son genes reguladores,
mientras que arsA y arsB forman una bomba de eflujo transmembrana que exporta As (III) del citoplasma, lo que
reduce las concentraciones intracelulares de arsénico tóxico (Mukhopadhyay et al., 2002). El gen arsC codifica la
enzima As (V) reductasa, que es responsable de la biotransformación de As (V) en As (III). Además de los
mecanismos de desintoxicación, se sabe que algunas bacterias poseen mecanismos para oxidar el As (III) o reducir
el As (V), incluida la transformación vinculada a la generación de energía (Oremland y Stolz, 2005). Los genes As (V)
reductasa respiratoria (arr) codifican la As (V) reductasa periplásmica que funciona en la respiración anaeróbica
usando As (V) como aceptor terminal de electrones, mientras que los genes aox codifican la As (III) oxidasa
periplásmica que transforma As (III) en As (V (Silver y Phung, 2005). Recientemente, se identificó un nuevo gen de
arsenito oxidasa, arxA, en la secuencia del genoma del aislado de Mono Lake, Alkalilimnicola ehrlichii MLHE-1, un
quimiolitoauto roph que acopla la oxidación del arsenito a la reducción de nitratos ( Zargar et al., 2010).

Varios estudios utilizaron con éxito marcadores genéticos para estudiar los mecanismos de transformación del
arsénico, como los genes arsB y arsC en el operón ars para la resistencia al arsénico (Achour et al., 2007; Sun et al.,
2004), el gen arrA para As disimilatorios (V) respiración (DAsR) (Kulp et al., 2007; Malasarn et al., 2004; Song et al.,
2009), y el gen aoxB para la oxidación de As (III) (Hamamura et al., 2009; Rhine et al., 2007). Sin embargo, según
varios estudios, no se encontraron genes ars en cepas categorizadas dentro del mismo género (Cai et al., 1998;
Chang et al., 2007; Saltikov y Newman, 2003; Saltikov et al., 2003). Además, varios estudios observaron que a pesar
de la clara evidencia de la actividad transformadora de As por parte de los microorganismos, no se logró ningún
amplicón para la arsenito oxidasa (aoxB) o la As (V) reductasa respiratoria (arrA) utilizando los cebadores y
protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) informados. (Handley et al., 2009; Kulp et al., 2008;
Song et al., 2009).

El arsénico natural en las aguas subterráneas que se utiliza como fuente de agua potable representa un importante
problema de salud humana que ocurre sobre todo en partes de Bangladesh (Tareq et al., 2003), Bengala Occidental
(Nag et al., 1996), China (Sun, 2004 ), Estados Unidos (Robertson, 1989) y Taiwán (Lu, 1990). En Taiwán, el área de
la costa suroeste se ha asociado históricamente con casos endémicos de la enfermedad del pie negro (BFD), una
enfermedad vascular periférica causada por la ingestión prolongada de agua subterránea contaminada con
arsénico. Además de la pigmentación de la piel, se encontró una incidencia muy alta de queratosis y cánceres de
piel, pulmón, vejiga y otros cánceres entre las personas que vivían en el área costera suroeste y que bebían agua de
pozo contaminada con arsénico natural antes de la década de 1990 (Chen et al., 1986; Huang et al., 2003; Tseng,
1977). En la actualidad, aunque la mayoría de los residentes de la zona no ingieren directamente el agua de pozo,
todavía se utiliza ampliamente para satisfacer las necesidades domésticas, de riego, acuícolas e industriales. Las
altas concentraciones de arsénico bioacumulable en peces de piscifactoría se asociaron con concentraciones de
arsénico en las aguas de los estanques de esta área (Huang et al., 2003). Además de la región histórica de BFD,
también se encontraron altos niveles de arsénico en las aguas subterráneas en varias otras regiones de Taiwán,
incluidos los condados de Ilan, Yunlin, Chiayi y Tainan. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar
tecnologías eficientes y de bajo costo para limpiar el arsénico del agua subterránea en estas regiones con alto
contenido de arsénico. Sin embargo, todavía existe un intenso debate sobre la etiología de la BFD, así como las
fuentes de arsénico.
A pesar de la considerable investigación realizada durante los últimos 30 años sobre la presencia y distribución de
arsénico en las aguas subterráneas de la región, se realizaron pocos estudios para investigar los procesos
geoquímicos y microbiológicos que influyen en la especiación y movilidad del elemento en este acuífero. Con este
fin, es importante comprender todos los factores abióticos y bióticos relevantes que contribuyen a la movilidad y el
secuestro de arsénico en dichos entornos. Está bien establecido que el ciclo redox del arsénico por parte de los
microorganismos juega un papel importante en el control de la especiación y la movilidad del arsénico en
ambientes con alto contenido de arsénico (Oremland y Stolz, 2003, 2005). Hasta ahora, las especies microbianas
con capacidad de biotransformación de arsénico no se han investigado en las regiones de Taiwán contaminadas
con arsénico. El objetivo de este estudio fue investigar las comunidades microbianas oxidantes de As (III) y
reductoras de As (V) que existen en el agua subterránea altamente contaminada con arsénico en Taiwán. Dichos
estudios mejorarán nuestra comprensión de la movilización e inmovilización del arsénico en tales entornos y nos
ayudarán a comprender mejor cómo los microbios metabolizan el arsénico. Cultivamos e identificamos bacterias
transformadoras de arsénico, analizamos la resistencia y transformación del arsénico y determinamos la presencia
de marcadores genéticos para la transformación de arsénico. Los resultados de este estudio proporcionarán
información valiosa sobre las especies microbianas que median en las transformaciones redox del arsénico que
pueden contribuir a la liberación de arsénico sedimentario a las aguas subterráneas de la región.

2. Materiales y métodos

2.1. Descripción del sitio y recolección de muestras

El nivel de arsénico del agua subterránea es alto (0,12 ± 0,14 mg / L) en los pozos de monitoreo poco profundos del
abanico aluvial del río Choushui (Wang et al., 2007) que incluye el condado de Yunlin, en el centro oeste de Taiwán.
Se recolectaron muestras de agua subterránea contaminada con arsénico del pozo AG1 (20 m de profundidad) en
el sur del condado de Yunlin, que está cerca de las áreas costeras y vecinales hiperendémicas de BFD, un área que
se sabe que tiene concentraciones elevadas de arsénico presente en aguas subterráneas poco profundas (Fig.1) .
Los valores de pH de la muestra oscilaron entre 7,0 y 7,6 y las temperaturas variaron entre 22 y 27 ° C.

Fig. 1. Mapa del sitio del área de estudio y sitio de muestreo aproximado ( ▲). El agua subterránea contaminada
con arsénico se recolecta del pozo AG1.
2.2. Aislamiento y crecimiento de bacterias resistentes al arsénico.

Las muestras de agua subterránea se inocularon en un medio químicamente definido (CDM) (MgSO4 8,12 mM,
NH4Cl 18,7 mM, Na2SO4 7 mM, K2HPO4 0,0574 mM, CaCl2 0,457 mM, lactato de Na 44,6 mM, Fe2SO4 0,012 mM y
NaHCO3 9,5 mM, con el pH ajustado a 7,2) como describen Weeger et al (1999) para enriquecer poblaciones
bacterianas con o sin 2 mM de As (III) o 10 mM de As (V) bajo incubación óxica y anóxica, respectivamente. A
continuación, las muestras se incubaron a 25 ° C durante 24 h. Después de la incubación, las muestras se diluyeron
en serie y se extendió una suspensión celular sobre placas CDM con o sin 2 mM de As (III) o 10 mM de As (V) para
obtener colonias individuales. Se obtuvo un cultivo puro mediante el aislamiento sucesivo de colonias a 25 ° C en
medio suplementado con As (III) o As (V). Los cultivos bacterianos se incubaron en un agitador rotatorio o se
colocaron en una cámara anaeróbica (Ruskinn Technology, Leeds, Reino Unido) para incubación óxica y anóxica,
respectivamente. La resistencia al arsénico se definió como la capacidad de las bacterias para crecer en placas de
agar CDM que contienen As (III) 2 mM o As (V) 10 mM a 25 ° C.

2.3. Ensayo de transformación de arsénico

Las capacidades de las bacterias resistentes al arsénico obtenidas para oxidar el As (III) y / o reducir el As (V) se
ensayaron tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Los cultivos aeróbicos se incubaron con agitación
constante. Los cultivos anaeróbicos se colocaron en una cámara anaeróbica. Los aislamientos se probaron primero
utilizando un método de cribado cualitativo de AgNO3 como lo describen Simeonova et al. (2004) con una ligera
modificación. Brevemente, se centrifugó el cultivo en fase estacionaria y luego se lavó dos veces con medio salino
mínimo (MSM) (Macy et al., 2000). Los sedimentos bacterianos recogidos se resuspendieron en MSM que contenía
glucosa 10 mM y As (III) o As (V) 1 mM. Las suspensiones bacterianas (con una densidad óptica a 600 nm de 0,3,
DO600 = 0,3) se incubaron a temperatura ambiente durante 72 h. Posteriormente, se centrifugaron los cultivos
bacterianos y se mezclaron 100 μL de la fase líquida con 100 μL de una solución de AgNO3 0,1 M. Los precipitados
resultantes que contienen arsénico se colorearon de amarillo claro de Ag3AsO3 (ortoarsenita de plata) debido al As
(III) al rojo marrón claro de Ag3AsO4 (ortoarsenato de plata) debido a As (V). Las capacidades de los aislados
bacterianos para oxidar el As (III) y / o reducir el As (V) se determinaron además cuantitativamente. Los aislados
bacterianos se cultivaron como se describe para el método de cribado de AgNO3. Después de 72 h de incubación,
se centrifugaron los cultivos bacterianos y se midieron las especies de arsénico en los sobrenadantes mediante un
ensayo espectrofotómico de azul de molibdeno (Johnson y Pilson, 1972).

También usamos la cepa que respira As (V), Shewanella sp. cepa ANA-3 (un amable obsequio de la Dra. Dianne
Newman, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE.UU.), como cepa de referencia para el
ensayo de tasa de reducción de As (V). Las cepas AR-7 y ANA-3 se cultivaron como se describió anteriormente, y las
suspensiones bacterianas (DO600 = 0,3) se incubaron en MSM que contenía glucosa 10 mM y As (V) 0,25 mM en
condiciones aeróbicas o anaeróbicas. La cepa AR-11 se cultivó como se describió anteriormente, y la suspensión
bacteriana (DO600 = 0,3) se incubó en MSM que contenía glucosa 10 mM y As (III) 0,25 mM en condiciones
aeróbicas. Se extrajeron muestras periódicamente y se midieron las especies de arsénico. Además, se probó la
capacidad de la cepa AR-11 para transformar el arsénico en concentraciones relevantes para el agua subterránea
ambiental. La cepa AR-11 se cultivó y analizó como se describió anteriormente, excepto que el medio se reemplazó
con una muestra de agua subterránea ambiental que se autoclavó previamente hasta que estuvo estéril sin la
adición de ningún donante o aceptor de electrones. El agua subterránea ambiental recolectada contenía 780 μg L −
1 As (III).

2.4 Determinación de concentraciones mínimas inhibitorias (CIM)

La resistencia al As (III) y As (V) de los aislados bacterianos se evaluó mediante pruebas de CMI en condiciones
aeróbicas y anaeróbicas. Las CMI de las cepas aisladas se evaluaron como se describió anteriormente (Achour et al.,
2007; Escalante et al., 2009; Lim y Cooksey, 1993). Se cultivaron alícuotas de cultivos bacterianos (DO600 = 0,3) en
placas de agar MSM que contenían diferentes concentraciones de As (III) (2–20 mM) o As (V) (2–200 mM) y luego
se incubaron a 25 ° C en oxic o condiciones anóxicas. La CMI se define como las concentraciones más bajas de As
(III) o As (V) que inhibieron completamente el crecimiento bacteriano en medio de agar después de 72 y 120 h de
incubación para condiciones de crecimiento aeróbico y anaeróbico, respectivamente.

2.5. Caracterización fisiológica de las cepas

Se examinaron las capacidades de las cepas AR-4, AR 5 y AR-11 para crecer bajo un rango de temperaturas y
valores de pH en medio CDM. Las cepas AR-4, AR 5 y AR-11 se caracterizaron adicionalmente utilizando el sistema
API ZYM para un análisis enzimático y el sistema API 50CH para un análisis de utilización de carbohidratos siguiendo
las instrucciones del fabricante (bioMérieux Vitek, Hazelwood, MO, EE. UU.).

2.6. Aislamiento de ADN genómico

Se preparó ADN genómico bacteriano como describe Wilson (1997) con una ligera modificación. Brevemente, se
recolectaron sedimentos bacterianos de 1.5 mL de cultivos bacterianos y se resuspendieron en 564 μL de tampón
de ácido Tris-etilendiamina tetraacético (EDTA) (pH 8.0), 30 μL de dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) y 6 μL de 10
mg / mL de proteinasa K, y se incubó a 37 ° C durante 1 h. La solución se mezcló con 100 μL de NaCl 5 M y luego se
mezcló a fondo con 80 μL de una solución de NaCl / bromuro de cetiltrime hilamonio (CTAB). La solución se incubó
a 65 ° C durante 10 min. El ADN genómico se extrajo con cloroformo / alcohol isomílico (1: 1) y fenol / cloroformo /
alcohol isoamílico (25: 24: 1). El ADN se precipitó con un volumen igual de isopropanol, se lavó con etanol al 75% y
se resuspendió en 50 μL de H2O destilada.

2.7. Amplificación por PCR de ARN ribosómico (r) 16S y genes marcadores relacionados con el arsénico

La amplificación por PCR del ARNr 16S y los genes marcadores de arsénico se realizó utilizando ADN genómico
bacteriano como plantilla. Las secuencias de los cebadores de PCR para los genes marcadores de rRNA 16S y
arsénico se presentan en la Tabla 1. Se utilizaron cebadores universales para amplificar el rRNA 16S. Los cebadores
degenerados utilizados para amplificar los genes marcadores de arsénico se diseñaron, respectivamente,
especialmente para arsB, arsC, arrA y aoxB. Las condiciones de la PCR siguieron las descripciones de la literatura
correspondiente (Tabla 1). Los productos de PCR amplificados se purificaron usando un kit BioMan (Taipei, Taiwán).
La presencia de genes 16S rRNA, arsB, arsC, arrA y aoxB en el producto de PCR se confirmó mediante secuenciación
con un analizador de ADN ABI Prism 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.).
 Iniciador o cebador - Un iniciador o cebador es
una secuencia corta de ADN de cadena simple
que se utiliza en una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). En el método PCR se
Tabla 1. Cebadores de oligonucleótidos utilizados en este estudio emplea un par de cebadores para hibridar con
el ADN de la muestra y definir la región del
Iniciador o cebador de ADN que será amplificada. También se les
Iniciador o cebador
Gen objetivo secuencia conoce como oligonucleótidos.

2.8. Análisis de datos de secuencia

Se utilizó el programa NCBI BLAST para respaldar la identificación genérica de ARNr 16S de aislados y secuencias de
genes marcadores de arsénico amplificadas. Para el análisis filogenético, las secuencias de ARNr 16S de los aislados
bacterianos y las secuencias de referencia relacionadas recuperadas de la base de datos GenBank se alinearon
utilizando el software ClustalX (Thompson et al., 1997). El análisis de distancia y la construcción de árboles
filogenéticos se realizaron utilizando el método de unión de vecinos (NJ) de MEGA vers. 4 (Tamura et al., 2007). En
total, se calcularon 1000 réplicas de bootstrap. El árbol estaba desarraigado.

2.9. Números de acceso de secuencia

Las secuencias obtenidas en este estudio se depositaron en la base de datos de GenBank. Los números de acceso
para las secuencias de nucleótidos del ARNr 16S son: FJ888371 (cepa AR-1), FJ888372 (cepa AR-2), FJ888373 (cepa
AR-3), FJ888374 (cepa AR-4), FJ888375 (cepa AR-5) , FJ888376 (cepa AR-6), FJ888377 (cepa AR-7), FJ888378 (cepa
AR-8), FJ888379 (cepa AR-9), FJ888380 (cepa AR-10) y FJ888381 (cepa AR-11).

3. Resultados

3.1. Aislamiento de bacterias resistentes al arsénico

El pozo AG1 ha sido monitoreado activamente por la contaminación por arsénico por la Oficina de Desarrollo
Industrial de Taiwán del Ministerio de Asuntos Económicos durante los últimos 15 años. Se informó que el pozo
estaba contaminado principalmente con concentraciones de arsénico que oscilan entre 0.3 y 0.78 mg / L. En total,
se aislaron 11 cepas bacterianas transformadoras de arsénico con diferentes morfologías de colonias y diferentes
capacidades de transformación de arsénico, incluidas 10 bacterias anaerobias facultativas reductoras de As (V) y
una bacteria oxidante de As (III) estrictamente aeróbica (Tablas 2 y 3). . El aislamiento de estas cepas bacterianas
fue posible sobre la base de su capacidad para crecer en presencia de As (III) 2 mM o As (V) 10 mM y según los
 criterios de diferentes morfologías de colonias. Los 10 aislamientos bacterianos mostraron un crecimiento
anaeróbico facultativo, excepto el AR-11, que presentó estrictamente un crecimiento aeróbico (Tablas 2 y 3).

Cuadro 2. Identificación del género de cepas bacterianas y tolerancia al arsénico

Número de Identificación del

aislamientos género de ARNr 16S
bacterianos

a
MIC se define como las concentraciones más bajas de As (III) o As (V) que inhibieron completamente el
crecimiento bacteriano en medio de agar después de 72 y 120 h de incubación para condiciones de crecimiento
aeróbico y anaeróbico, respectivamente.

Cuadro 3. Transformación de arsénico y detección de genes marcadores de arsénico de cepas bacterianas

Número de cepas Gen marcador de arsénico
bacterianas

a
Se analizó la reducción de As (V) después de 120 h de incubación en condiciones aeróbicas o
anaeróbicas.
b
No se generó producto de PCR positivo.
c
Se confirmó la presencia del gen marcador y el producto de PCR con secuenciación.
d La oxidación de As (III) se analizó después de 72 h de incubación en condiciones aeróbicas
condición.
e
Sin crecimiento en las condiciones evaluadas.
3.2. Caracterización fenotípica

Las tolerancias de los 11 aislados bacterianos a As (III) y As (V) se evaluaron mediante pruebas de CMI en
condiciones de crecimiento aeróbico y anaeróbico. Todos los aislamientos fueron resistentes a As (III) o As (V). En
condiciones de crecimiento aeróbico, todos los aislamientos bacterianos exhibieron resistencia a As (V) con MIC
superiores a 100 mM (Tabla 2). Seis aislamientos (AR-3, AR-4, AR-6, AR-8, AR-9 y AR-10) fueron incluso resistentes a
As (V) a 200 mM (Tabla 2). Se encontraron MIC (hasta 5 mM) para As (III) para cinco cepas bacterianas (AR-5, AR-7,
AR-8, AR-9 y AR-10), mientras que las cepas restantes mostraron MIC para As ( III) de 2,0-2,5 mM (Tabla 2). En
condiciones de crecimiento anaeróbico, los aislados bacterianos mostraron diferentes grados de sensibilidad al
arsénico. Cinco aislamientos (AR-2, AR-7, AR-8, AR-9 y AR-10), en condiciones de crecimiento anaeróbico,
mostraron CMI de 100-200 mM de As (V), mientras que los aislamientos restantes mostraron niveles bajos. de
resistencia a As (V), con MIC de 2 mM. La mayoría de los aislamientos bacterianos exhibieron resistencias similares
a As (III) (CMI de 2.0-2.5 mM) como lo hicieron en condiciones de crecimiento aeróbico, excepto para las dos
Pseudomonas sp. cepas (AR-2 y AR-3) que mostraron tolerancias mucho más altas a As (III) (CMI de 5 y 2.5 mM,
respectivamente) que en condiciones de crecimiento aeróbico. Se ensayaron adicionalmente las capacidades de las
bacterias aisladas para oxidar el As (III) y reducir el As (V) en condiciones de crecimiento aeróbicas y anaeróbicas.
Todos los aislamientos, excepto AR-11, pudieron reducir el As (V) a As (III) tanto en condiciones aeróbicas como
anaeróbicas (Tabla 3). El único oxidante de As (III), la cepa AR-11, presentó un crecimiento estrictamente aeróbico y
oxidó As (III) a As (V) en condiciones aeróbicas (Tabla 3). Las tasas de transformación de arsénico de las cepas AR-7
y AR-11 se examinaron más a fondo, ya que mostraban las tasas de reducción de As (V) y oxidación de As (III) más
rápidas, respectivamente, entre los aislamientos. Para evaluar la tasa de reducción de As (V) de AR-7, utilizamos la
cepa que respira arsenato bien estudiada, Shewanella sp. cepa ANA-3 (Saltikov y Newman, 2003) como cepa de
referencia y compararon las eficiencias de reducción de As (V) de AR-7 y ANA-3 en las mismas condiciones de
cultivo. En condiciones aeróbicas, la cepa AR-7 redujo rápidamente alrededor del 56% de As (V) a As (III) (0,14 mM)
después de 1,5 h de incubación.

La reducción casi completa de As (V) a As (III) por AR-7 se había producido con 3 h de incubación (Fig. 2A). Por el
contrario, Shewanella sp. la cepa ANA-3 había reducido completamente el As (V) a As (III) después de 23 h de
incubación (Fig. 2A). En condiciones anaeróbicas, la cepa AR-7 exhibió una tasa de reducción de As (V) más lenta
que en condiciones aeróbicas. Se observó un grado de 76% de reducción de As (V) a As (III) por AR-7 después de 9 h
de incubación. La reducción completa de As (V) a As (III) por AR-7 se observó después de 23 h de incubación (Fig.
2B). Shewanella sp. La cepa ANA-3 había reducido rápidamente As (V) a As (III) (84%) después de 3 h de incubación,
mientras que la reducción casi completa de As (V) a As (III) por ANA-3 se observó después de 7.5 h de incubación
(Fig. 2B). La Fig. 2C muestra la oxidación de As (III) a As (V) por la cepa AR-11. La cepa AR 11 oxidó rápidamente
aproximadamente un 72% de As (III) (0,25 mM) a As (V) (0,18 mM) después de 6 h de incubación. La oxidación
completa de As (III) a As (V) por AR-11 se observó después de 12 h de incubación (Fig. 2C).

Fig. 2. Transformación de arsénico por bacterias. Reducción de As (V) a As (III) por la cepa AR-7 y Shewanella sp.
cepa ANA-3 en condiciones aeróbicas (A) y anaeróbicas (B). Oxidación de As (III) a As (V) por la cepa AR-11 en
condiciones aeróbicas (C). Cada cepa bacteriana (con una densidad óptica de 0,3 a 600 nm) se incubó en medio
salino mínimo que contenía glucosa 10 mM y As (III) o As (V) 0,25 mM a 25ºC. Las muestras se retiraron
periódicamente. Las concentraciones totales de arsénico ([As total] = [As (III)] + [As (V)]) permanecieron casi
constantes durante cada experimento. Los datos se presentan como la media ± DE; los símbolos sin barras de error
aparentes tienen estimaciones de error demasiado pequeñas para verlas o que están ocultas por el símbolo. Las
barras de error representan el error estándar de tres experimentos repetidos.
 Además, se probó la capacidad de la cepa AR-11 para transformar el arsénico en concentraciones relevantes para
el agua subterránea ambiental sin la adición de ningún donante o aceptor de electrones. Se seleccionó AR-11, el
único oxidante de As (III), ya que el arsénico en el agua subterránea ambiental en el sitio de muestreo actual existe
principalmente en forma de As (III) inorgánico (780 μg L-1, ~ 10.5 μM). La Fig. 3 muestra que AR-11 había oxidado
rápidamente el 65% de As (III) a As (V) después de solo 30 min de incubación. La oxidación casi completa de As (III)
a As (V) en el agua subterránea ambiental por AR-11 se observó después de 50 min de incubación.

Fig. 3. Oxidación de arsenito por la cepa AR-11 utilizando agua subterránea ambiental. El AR-11 (con una densidad
óptica de 0,3 a 600 nm) se incubó aeróbicamente a 25 ° C en una muestra de agua subterránea ambiental que
previamente se autocultivó hasta que estuvo estéril sin la adición de ningún donante o aceptor de electrones. El
agua subterránea ambiental recolectada contenía 780 μg L − 1 As (III). Las muestras se retiraron periódicamente.
Las concentraciones totales de arsénico ([As total] = [As (III)] + [As (V)]) permanecieron casi constantes durante cada
experimento. Los datos se presentan como metan ± SD; Los símbolos sin barras de error aparentes tienen
estimaciones de error demasiado pequeñas para verlas o que están ocultas por el símbolo. Las barras de error
representan el error estándar de tres experimentos repetidos.

3.3. Caracterización fisiológica básica

Seleccionamos 2 bacterias anaeróbicas facultativas reductoras de As (V) (AR-4 y AR-5) y una bacteria aerobia
oxidante de As (III) (AR-11) para una caracterización fisiológica básica adicional. porque hasta ahora no se han
descrito como catalizadores de la oxidación y reducción del arsénico. Se seleccionó la cepa AR-11 por ser el único
oxidante de As (III) entre los aislados. Caracterizamos las cepas utilizando el sistema API ZYM para el análisis
enzimático y el sistema API 50 CH para el análisis de utilización de carbohidratos. Los datos detallados de API ZYM y
API 50 CH se presentan en Materiales suplementarios. Las cepas AR-4 y AR-5 pertenecen al género Psychrobacter.
Ambas cepas son gramnegativas, en forma de bastoncillo y no móviles. Las cepas AR-4 y AR-5 exhibieron un
crecimiento óptimo a 30 ° C, pero el crecimiento ocurrió a 4-37 ° C. Ambas cepas son neutrofílicas y crecieron mejor
a un pH de 6,0 a 8,0, pero no por debajo de 5,5 ni por encima de 9,0. AR-4 y AR-5 eran relativamente
bioquímicamente inertes según la prueba comercial API ZYM. AR-4 solo fue positivo para naftol-ASBI-fosfohidrola e
y parcialmente positivo para fosfatasa ácida y α-glucosidasa. AR-5 fue positivo para esterasa lipasa (C8), leucina
arilamidasa y naftol-ASBIfosfohidrolasa y parcialmente positivo para fosfatasa alcalina, esterasa (C4) y fosfatasa
ácida.

En la prueba de activación de carbohidratos, la cepa AR-4 fue positiva para glucosa, fructosa, manosa, manitol,
esculina, maltosa, sacarosa y trehalosa. AR-4 también fue parcialmente positivo para los siguientes carbohidratos:
glicerol, ribosa, D-xilosa, N acetil-glucosamina, rafinosa, almidón, D-turanosa, gluconato y 5-ceto-gluconato. La cepa
AR-5 utilizó D-xilosa, galatosa, glucosa, manosa, melibiosa, gentiobiosa y D-fucosa como fuentes de carbono. AR-5
también fue parcialmente positivo para L-arabinosa, ribosa y fructosa. La cepa AR-11 pertenece al género Bosea. Es
una bacteria gramnegativa, con forma de varilla, móvil y estrictamente aeróbica. AR-11 creció a 20–37 ° C y exhibió
un crecimiento óptimo a 37 ° C. AR-11 creció mejor a un pH de 7,4 a 8,4, pero no por debajo de 6,0 ni por encima
de 9,0. AR-11 fue positivo para fosfatasa alcalina, leucina arilamidasa, fosfatasa ácida, naftol-ASBI-fosfohidrola e, β-
galactosidasa y α-glucosidasa y parcialmente positivo para esterasa (C4), cistina arilamidasa y β-glucuronidasa. La
cepa AR-11 es autótrofa. También creció bien al utilizar los siguientes carbohidratos: glicerol, darabinosa, L-
arabinosa, ribosa, D-xilosa, galactosa, glucosa, fructosa, manosa, ramnosa, manitol, sorbitol, N-acetilglucosam ne,
lactosa, melibiosa, trehalosa, gluconato y 5-cetogluconato.

3.4. Detección de genes marcadores de arsénico

Varios estudios utilizaron marcadores genéticos para estudiar los mecanismos de transformación del arsénico
(Achour et al., 2007; Hamamura et al., 2009; Kulp et al., 2007; Malasarn et al., 2004; Rhine et al., 2007; Song et al. ,
2009; Sun et al., 2004). La presencia de un mecanismo genético para la resistencia al arsénico y la transformación
del arsénico en cada aislamiento bacteriano se examinó mediante la amplificación por PCR de genes marcadores de
arsénico, y cada producto de PCR se secuenció adicionalmente para confirmar la detección del gen diana. Los
cebadores presentados en la Tabla 1 corresponden a los genes arsB, arsC, arrA y aoxB. Se encontró que la mayoría
de las cepas bacterianas aisladas, excepto las cepas AR-2 y AR-3, eran positivas para al menos uno de los genes
marcadores de arsénico, pero diferían en términos de los genes que portaban (Tabla 3). Por ejemplo, Pseudomonas
sp. la cepa AR-1 portaba los genes arsB y arsC, mientras que la PCR no logró amplificar los genes marcadores de
arsénico para otras dos Pseudomonas sp. cepas (AR-2 y AR-3) (Tabla 3).

3.5. Análisis filogenético

Los géneros de las cepas bacterianas se identificaron analizando sus genes de ARNr 16S (Tabla 2). Las relaciones
filogenéticas se obtuvieron comparando las secuencias de ARNr 16S de los 11 aislamientos bacterianos con
secuencias de miembros de bacterias resistentes al arsénico, oxidantes de As (III) y reductoras de As (V) y
aislamientos bacterianos estrechamente relacionados. Las secuencias de ARNr 16S de firmicutes se utilizaron como
grupo externo (Fig. 4). Entre las 11 cepas aisladas, ocho se distribuyeron en cuatro clases de gamma-
proteobacterias, incluidas las familias Pseudomonada eae, Moraxellaceae, Enterobacteriac ae y Vibrionaceae. En el
clado de Pseudomonada eae, AR-1 estaba más estrechamente relacionado con Pseudomonas aeruginosa (100% de
similitud de secuencia), mientras que AR-2 y AR-3 estaban más estrechamente relacionados con Pseudomonas
rhizosphaerae (97% de similitud de secuencia). AR-4 y AR-5 pertenecían a Psychrobacter y compartían una similitud
de secuencia del 99% con el pariente más cercano, Psychro acter glacicola. Se identificó que AR-6, AR-7 y AR-8
estaban más estrechamente relacionados con Vibrio fluvialis (100% de similitud de secuencia), Citrobacter sp. (99%
de similitud de secuencia) y Enterobacter sp. (99% de similitud de secuencia), respectivamente. Se demostró que
dos aislamientos, AR-9 y AR-10, pertenecían al género Bacillus y compartían una similitud de secuencia del 99% con
el pariente más cercano Bacillus arseniciselenatis. -11, el único aislado capaz de oxidar el arsenito, se identificó en
el grupo de alfa-proteobacterias. AR-11 compartió una similitud de secuencia del 98% con Bosea sp.

Fig. 4. Árbol de unión de vecinos del gen 16S rRNA que muestra las relaciones filogenéticas de 11 aislamientos
resistentes al arsénico con bacterias resistentes al arsénico, oxidantes de As (III) y reductoras de As (V) o
aislamientos bacterianos estrechamente relacionados de GenBank. . La barra de escala representa el número de
sustituciones por sitio dentro del gen de ARNr 16S.
4. Discusión

Las especies microbianas que biotransforman el arsénico entre estados de oxidación con diferentes
comportamientos ambientales controlan la liberación de arsénico adsorbido por los sedimentos en las aguas
subterráneas y pueden potencialmente utilizarse para la biorremediación. Hasta la fecha, la mayoría de las
investigaciones de las comunidades bacterianas solo se enfocaron en analizar los cambios de población en
experimentos de incubación utilizando muestras ambientales de sedimentos contaminados en el sudeste asiático.
Aunque informes anteriores respaldaron la base biogeoquímica para la movilización de arsénico, tales
experimentos de incubación no lograron identificar las poblaciones microbianas in situ responsables (Islam et al.,
2004; Rowland et al., 2009). En este estudio, investigamos la comunidad microbiana relevante que oxida el As (III) y
reduce el As (V) que existe en el agua subterránea altamente contaminada con arsénico que fue recolectada de la
zona vadosa del acuífero. Recientemente, Sutton et al. (2009) mostró que la comunidad bacteriana identificada en
el agua subterránea de pozos entubados poco profundos en Bangladesh mostró similitudes con las identificadas en
sedimentos contaminados con As. Esto apoya que los microbios aislados en el presente estudio sean
representativos de los sitios de campo.

Se evaluaron condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas debido a que el agua subterránea contaminada con
arsénico en este estudio fue recolectada de la zona vadosa. Aislamos 11 cepas bacterianas con diferentes
morfologías de colonias que crecieron en presencia de altas concentraciones de As (III) y As (V). Por ejemplo, la
cepa AR-8 creció en presencia de altas concentraciones de As (III) (hasta 5 mM) y As (V) (hasta 200 mM). Esta
característica permite a estas bacterias hacer frente a las altas concentraciones de arsénico en el agua subterránea
nativa. Las bacterias aisladas se agruparon en los siguientes géneros: Pseudomonas, Bacillus, Psychrobacter, Vibrio,
Citrobacter, Enterobacter y Bosea. Las gamma-proteobacterias estuvieron particularmente bien representadas en
este estudio con 7 de los 11 aislamientos correspondientes a miembros de este grupo. Esto no es sorprendente, ya
que anteriormente se han encontrado gamma-proteobacterias en ambientes contaminados con arsénico (Achour
et al., 2007; Chang et al., 2008). Pseudomonas y Bacillus están ampliamente representados entre las cepas
bacterianas resistentes al arsénico aisladas de otros sitios contaminados con arsénico (Anderson y Cook, 2004;
Chang et al., 2008; Pepi et al., 2007). Hasta donde sabemos, Psychrobacter no se informó previamente en la
literatura como un género resistente al arsénico o transformador de arsénico. En un estudio reciente, se identificó
que las bacterias resistentes al arsénico aisladas de un estuario pertenecían a seis grupos bacterianos principales
(Jackson et al., 2005). Además, se identificó que las bacterias resistentes al arsénico aisladas de los suelos
pertenecían a 22 grupos bacterianos principales (Achour et al., 2007). Esos resultados anteriores, junto con las
cepas bacterianas aisladas en el presente estudio, indican que las bacterias resistentes al arsénico parecen estar
ampliamente distribuidas en ambientes naturales y son filogenéticamente diversas.

Todos los aislamientos en el presente estudio fueron resistentes a As (III) o As (V), y algunas de las bacterias
exhibieron alta resistencia a As (V). La resistencia microbiana a concentraciones de As (V) superiores a 100 mM se
considera muy alta (Jackson et al., 2005). En particular, en condiciones de crecimiento aeróbico, todos los
aislamientos bacterianos exhibieron una alta resistencia al As (V) con MIC superiores a 100 mM. Varios factores,
como el método para determinar la resistencia y la composición del medio, pueden afectar la biodisponibilidad y la
toxicidad del arsénico, lo que resulta en discrepancias en los valores de CMI (Achour et al., 2007). Por lo tanto, las
CIM en el presente estudio no se compararon directamente con las informadas por otros. Se encontró que la
mayoría de las cepas bacterianas resistentes al arsénico aisladas en el presente estudio eran positivas para al
menos uno de los genes marcadores de arsénico, pero diferían con respecto a los genes que portaban (Tabla 3). Por
ejemplo, Psychrobacter sp. la cepa AR-4 codificaba el gen arsC, mientras que la otra Psychrobacter sp. cepa, AR-5,
contenía el gen arsB. arsB y arsC son parte del mismo operón y, por lo tanto, se regulan juntos. La ausencia de arsB
o arsC como se observa en nuestros aislamientos es probablemente indicativa de variaciones en el gen que
disminuyeron la homología de nuestros conjuntos de cebadores. La Pseudomonas sp. cepa, AR-1, codificaba los
genes arsB y arsC, mientras que la PCR no amplificó ningún gen marcador de arsénico para las dos Pseudomonas
sp. cepas AR-2 y AR-3 (Tabla 3). Esto no es sorprendente ya que varios estudios mostraron que no se encontraron
genes ars en Pseudomonas sp. (Cai et al., 1998; Chang et al., 2007; Saltikov y Newman, 2003; Saltikov et al., 2003),
lo que sugiere que el operón ars no es siempre el mismo, aunque las cepas se clasificaron en el mismo género. . Por
lo tanto, este tipo de diversidad debe tenerse en cuenta cuando los sistemas ars se examinan utilizando técnicas
basadas en PCR. Además, muchos factores, como los cebadores diseñados, las condiciones del ciclo térmico y la
composición de los tampones o agentes en un análisis de PCR, pueden influir en la amplificación de genes ars y
áreas cromosómicas ars desconocidas (Chang et al., 2007).

Todos los aislamientos excepto AR-11 pudieron reducir el As (V) a As (III) tanto en condiciones aeróbicas como
anaeróbicas. Esto podría deberse a que las muestras de agua subterránea se recolectaron de la zona vadosa del
acuífero donde el ambiente puede variar entre condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Cabe señalar que la reducción
de As (V) se puede lograr mediante un proceso de respiración anaeróbica utilizando As (V) como aceptor de

electrones terminales, o mediante un mecanismo de desintoxicación utilizando ArsC As (V) -reductasa. Esto implica
que los aislados (AR-1 a AR-10) que muestran capacidad de reducción de As (V) en este estudio contienen el gen de
la reductasa de As (V) respiratoria anaeróbica o el gen arsC o ambos en su genoma. La cepa AR-7 redujo As (V) a As
(III) más rápido que Shewanella sp. cepa ANA-3 en una condición aeróbica bajo nuestras condiciones
experimentales, mientras que Shewanella sp. La cepa ANA-3 exhibió una tasa de reducción de As (V) más rápida
que la de AR-7 en una condición anaeróbica. Anteriormente se demostró que ANA-3 reduce el As (V) a As (III) tanto
en condiciones aeróbicas como anaeróbicas (Saltikov et al., 2003). Sin embargo, los estudios demostraron que
ANA-3 no requiere el sistema de desintoxicación de ars para la respiración de As (V) (Saltikov et al., 2003). La cepa
AR 11 fue el único oxidante de As (III) en este estudio. AR-11 es un autótrofo, presentó un crecimiento
estrictamente aeróbico y fue capaz de oxidar rápidamente As (III) a As (V) en condiciones aeróbicas.
Particularmente, la cepa AR-11 exhibió una rápida tasa de oxidación de As (III) a concentraciones relevantes para la
muestra de agua subterránea ambiental sin la adición de ningún donante o aceptor de electrones. Además, existe
un buen acuerdo de la presencia del gen marcador aoxB en el genoma de la cepa AR-11. Entre nuestros
aislamientos, no hubo una relación clara entre los niveles de resistencia y la prevalencia de genes marcadores de
arsénico.

5. Conclusiones

Los procesos que controlan la liberación de arsénico en los sistemas de aguas subterráneas fueron ampliamente
estudiados durante la última década, pero aún siguen siendo objeto de intenso debate. Se propusieron varios
mecanismos de movilización, incluida la oxidación de pirita rica en arsénico (Das et al., 2004), la disolución
reductora de las fases de oxihidróxido de hierro (Harvey et al., 2002; Nickson et al., 2000), la competencia de
solutos por los sitios de sorción. sobre óxidos de hierro (Acharyya et al., 1999) y la reducción microbiana del As (V)
sorbido al As (III) potencialmente más móvil en condiciones anóxicas (Oremland y Stolz, 2003, 2005). En este
estudio, proporcionamos el primer vistazo a la comunidad microbiana que existe en un acuífero contaminado con
arsénico que históricamente está vinculado a la toxicidad extrema por arsénico en Taiwán. Nuestros resultados
indican que una comunidad relativamente diversa de microorganismos capaces de biotransformaciones de
arsénico ambientalmente significativas está presente de forma natural en el acuífero. Las bacterias identificadas
parecen estar bien adaptadas a concentraciones de arsénico que superan significativamente las encontradas en el
acuífero. Esta información es importante ya que la tecnología de biorremediación in situ eficaz depende
significativamente de la actividad de las comunidades microbianas indígenas en los sitios contaminados. Además,
este trabajo es el primer informe que describe la actividad reductora de As (V) por Psychrobacter que no se había
informado previamente en la literatura. Además, informamos aquí que los métodos de PCR no lograron amplificar
ningún gen marcador de arsénico para dos de las cepas de Pseudomonas aisladas, a pesar de que ambas cepas
redujeron el As (V) en cultivo, lo que sugiere que el operón ars puede variar dentro de las cepas del mismo género.
Esto tiene implicaciones de amplio alcance para otras localidades, lo que indica que los conjuntos de cebadores
actualmente disponibles no son realmente adecuados para detectar el ars. operón en todos los casos.

Además, la rápida oxidación de As (III) a As (V) menos tóxico y más absorbente por la cepa AR-11 abre el camino a
su posible aplicación en el tratamiento biológico de la contaminación por arsénico en este y otros sitios
contaminados con arsénico.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Dianne Newman, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, EE.
UU., Por la generosa donación de Shewanella sp. cepa ANA-3. Este trabajo fue financiado en parte por una
subvención (NSC95-2313-B 002-053-MY3) del Consejo Nacional de Ciencias de Taiwán a V.H.-C. Liao.

Apéndice A.

Datos complementarios Datos complementarios a este

El artículo se puede encontrar en línea en doi: 10.1016 / j.jco hyd.2010.12.003.