Actividad Anual de Seguimiento II

“Engineering artificial genetic circuits in M. polymorpha for

processing of tissue and context specific auxin - cytokinin interplay”

Ariel Cerda Rojas

Alumno de Doctorado en Ciencias Biológicas
Mención Genética y Microbiología Molecular

Tutor: Dr. Fernán Federici

Biología Sintética…
Generar principios de diseño para construir funciones asequibles, escalables,
predecibles y robustas en sistemas biológicos.

Ingeniería Material o sustrato reprogramable

• Estandarización

• Caracterización

• Modularidad

• Abstracción

(Federici et al., 2013)

Biología Sintética…

• Morfogénesis: ‘Comportamiento concertado

de poblaciones celulares durante el desarrollo’

Retroalimentación entre procesos celulares y en todo el organismo Programa

(Tsukaya, 2003) Genético

Ingeniería Morfogenética Interacciones genéticas entre células (Bohn-Courseau, 2010). Fenotipo

o de ‘Estructuras’
Sistemas
Emergentes
Restricciones físicas transmitidas a través de los tejidos. Auto-Organizados
Morfogénesis Sintética… Formación de Patrones
(Isalan y Scholes, 2017: Ellis y Gilbert, 2018)
Morfogénesis Sintética…

Morphogenetic Engineering Bacterial Colonies

Self-Organized Fractal
(Nuñez et al., 2017)
(Rudge et al., 2013)
Morfogénesis Sintética…

Redes de 3 nodos para la formación de bandas Una red simple de 3 elementos que genera un output
(Schaerli et al., 2014) binario (Saka y Smith, 2007)
 Morfogénesis Sintética en plantas?

• Sistemas microbianos y eucariontes unicelulares.

• Técnicas y recursos para la construcción

rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos.

• Funciones regulatorias genéticas.

• Formalismos matemáticos para el desarrollo

de modelos predictivos.

• Modelo o ‘Chasis vegetal’ .

• Alta frecuencia de transformación

• Tamaño genoma (280 Mb)
• Haploide
• Fácil propagación
• Ciclo de vida corto
• Estructuralmente más simple (talo)
Bruce McCandless."untethered space walk"
Feb. 7, 1984. NASA
Hipótesis

“La caracterización ‘input/output’ de componentes genéticos permite la fabricación de

sensores ajustables en plantas para el procesamiento de información relacionada con la
interacción entre auxinas y citoquininas de forma tejido y contexto-especifica.”

“La caracterización ‘input/output’ de componentes genéticos permite la

fabricación de dominios multicelulares artificiales para su aplicación en
ingeniería morfogenética de Marchantia polymorpha ”

Objetivo General

Crear funciones elementales en plantas para el procesamiento de la interrelación de auxinas y citoquininas

de forma tejido y contexto-especifica durante escenarios de especificación de tipo celular.

Crear funciones elementales para la generación de dominios multicelulares a

partir de asimetrías internas de la distribución de auxinas y/o citoquininas en
Marchantia polymorpha.
 Objetivos Específicos

Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.
Estado Objetivo: Completo

Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

Estado Objetivo: Completo

Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in planta.

Estado Objetivo: En desarrollo

Objetivo 4: Desarrollo de modelos morfogenéticos de la interrelación de auxina y citoquininas.

Estado Objetivo: Por desarrollar

Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

Estado Objetivo: Completo

LOOP ASSEMBLY

RAPIDO ALTAMENTE OPEN

HIBRIDO EXPONENCIAL UNIVERSAL VERSATIL
Y SIMPLE EFICIENTE SOURCE
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

L1 L2 L3 L4…
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.
Ensamblaje de Unidades
Transcripcionales (TUs) mediante Loop
Assembly

Patron et al. (2015)

Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

Ensamblaje de Múltiples Unidades Transcripcionales mediante Loop Assembly

(Golden Gate)

Funcionalidad LV2 in planta (M. polymorpha)

Bernardo Pollak (Jim Haseloff Lab, University of Cambridge, UK)
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.
Ensamblaje de Múltiples TUs mediante Loop Assembly (Gibson Assembly)

pOdd1

pOdd2

pOdd3

pOdd4

pEven1

Expresión transitoria de Lv2 en protoplastos de A. thaliana

Ruby3
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

• Versatilidad: Ensamblaje de promotores sintéticos

• Ensamblaje de promotores sintéticos con secuencias repetidas.

• Considerando 7 sitios de unión a factores de

transcripción:

2.097.152 promotores distintos!

…
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

• Eficiencia de Loop Assembly.

Nivel Constructos (N°) TU (N°) Tamaño promedio (pb) Eficiencia Total (%) Eficiencia Promedio (%)

1 249 1 5895 91 92
1 83 1 5485 97 98 BsaI Opt.
2 67 2 10979 83 83
2 30 3 13456 82 82
2 82 4 16678 80 81
2 14 4 15456 74 75 Gibson

• Open Source

NO
ACCESO ATRIBUCION REUSO REDISTRIBUCION DISCRIMINACION
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

Estado Objetivo: Completo

Promotores
constitutivos, TAGs,
Terminadores.
 Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

Construcción de Lv0 (Ej. UBQ10) Gibson Assembly

UBQ10

pF-UBQ10
Parte Lv0 GGTCTC NGGAG 1
pUPD2 Sintaxis BsaI Sintax
Backbone pUPD2
GGTCTC NCATT
NAATG 6
5 pR-UBQ10
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

A) Reporteros Transcripcionales Fluorescentes.

Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en
plantas.

CITOPLASMA
A) Reporteros Transcripcionales Fluorescentes.
Transformación estable de esporas de M. Evaluación de transformación de talo de
polymorpha (Ishizaki et al., 2008) M. polymorpha (Kubota et al., 2013)

MEMBRANA
NUCLEO
CLOROPLASTO
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.
Barrido Espectral mRUBY
A) Reporteros Transcripcionales Fluorescentes.

RUBY Clorofila RUBY+Clorofila

577

617

632
Absorción/ Emisión

732
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.
A) Reporteros Transcripcionales Fluorescentes.
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

Gran cantidad de datos a analizar

(Alejandro Aravena, alumno de pregrado biología UC)

Open source image processing

library for Python
Foto Original
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.
A) Reporteros Transcripcionales Fluorescentes.
Adquisición de datos de forma automatizada en
todas las fotos de microscopia.
Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

B) Factores de Transcripción Modulares.

Activación Represión

Inducibles por DEX

Objetivo 2: Diseñar y construir funciones regulatorias genéticas en plantas.

C) Promotores Sintéticos

Caracterización
Funcional
Activadores.

Caracterización
Funcional
Represores.
Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in
planta.
Estado Objetivo: En desarrollo

• Modelos predictivos de la expresión génica en un contexto cis-regulatorio.

• Modelos de cis-regulación basados en conjunto de estados termodinámicos

(Sherman y Cohen., 2012).

1) Estados posibles de un promotor (Estado: Arreglo particular de FT unidos al promotor)

2) Constantes de unión de cada estado (Interacciones ADN-Proteína / Proteína-Proteína)
3) Capacidad de transcripción.
Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in
planta.
Estado Objetivo: En desarrollo

Vector b (Constantes de equilibrio macroscópicas)

Vector ‘t’
Vector funcional ‘s’ (estados) (Valores booleanos – Transcripción)
Matriz L (Lista de Estados)
 Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in
planta.
Estado Objetivo: En desarrollo

Funcion cis-regulatoria (ɸm)

• Solo se consideran las constantes de los estados

transcripcionalmente activos
Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in
planta.
Estado Objetivo: En desarrollo

Repressor-RNAP competition with activator release model.

Sequential binding model

Objetivo 3: Construir y caracterizar promotores sintéticos para el procesamiento de información in
planta.

• Sin efecto posicional

• Sin efectos de impedimento estérico
• Sin unión de FT = no hay transcripción

𝑘𝑝 [𝑅𝑁𝐴𝑃] [𝑇𝐹]𝑘𝑎 +1 n −1 Función cis-regulatoria (ɸm):

ɸm =
[𝑇𝐹]𝑘𝑎 +1 𝑛 𝑘𝑝 [𝑅𝑁𝐴𝑃+1

n = posiciones disponibles para la

unión de un factor de transcripción. dm: constante de velocidad de degradación
kt: concentración de transcritos de ARN por unidad de tiempo.
ɸm : Probabilidad de que el ADN realice transcripción.
Objetivo 4: Desarrollo de modelos morfogenéticos de la interrelación de auxina y citoquininas

Estado Objetivo: Por desarrollar

Asimetrías Internas

(Solly et al., 2017)

• Colaboraciones:

- uLOOP (Universal Loop): Dr. Peter von Dassow, Facultad Ciencias Biologicas, PUC.

- Ruta de Biosíntesis de Carotenoides: Dr Juan Camilo Moreno, Max Planck Institute of Molecular Plant
Physiology, Department of Plant Physiology, Alemania.

- Caracterización de Tags de Degradación, Alejandro Aravena, Estudiante Biologia, PUC.

Gracias por su atención!
ANEXOS
Repositorio de piezas colaborativo
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

• HIBRIDO

GOLDEN GATE GIBSON ASSEMBLY

Engler et al (2008) Gibson et al (2009)

https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-cloning/golden-gate-assembly
https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-cloning/gibson-assembly
 Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

Vectores Finales de Loop Assembly

pOdd receivers (KanR)

pEven receivers (SpecR)

Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

Multi-TUs
Golden Gate

Funcionalidad in planta
(M. polymorpha) de un
constructo LV2

Bernardo Pollak
(Jim Haseloff Lab, University
of Cambridge, UK)
Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

Tomando en cuenta Torella et al (2014)…

UNSes (40 pb) para ser utilizadas en plantas

(Tomas Moyano, Plant System Biology Laboratory, Universidad Católica )

• 500.000 secuencias al azar de 40 pb fueron analizadas.

Distribución nucleótidos: 45% <= Contenido GC <= 55% , extensión de secuencias repetidas de AT ó GC <
4 y 1-2 nucleótidos G/C en extremos.

Ausencia de codones de inicio: ATG/TTG/CTG

Ausencia de enzimas de restricción típicas de MCS: EcoNI, ClaI, XbaI, NcoI, BglII, SpeI, BamHI, NheI, PstI,
HindIII, NotI, XhoI, AvrII, BlpI, Bsu36I, AgeI, AflII.

Ausencia de enzimas de restricción utilizadas en Loop: AscI, SapI, MauBI, BbsI, MreI, AvrII, BpmI, BsaI.

Hairpin Tm < 40°C

Max score < 35.0 en BLASTn : Utilizando secuencia completa o extremos 5’ y 3’ de 14nt, BLAST contra
genoma de A. thaliana, E. coli y M. polymorpha
 Objetivo 1: Generar técnicas y recursos para la construcción rápida, modular y combinatorial de circuitos
genéticos para plantas.

• HIBRIDO

b) Consideraciones para Gibson Assembly…

Amplificación por partidores estandarizados o digestión enzimática

Uso de UNSes o ‘’biologically inactive unique nucleotide sequences’’

1 día
1 día
Ei: Eficiencia
Eo: Eficiencia total
Ea: Eficiencia promedio
np: Muestras positivas
nt: Muestras analizadas
N: Numero de constructos