METODOS GENERALES DE ANALISIS MICRIOBIOLOGICO DE LOS

ALIMENTOS.
I. Principios de garantía de la calidad microbiológica de los alimentos
Un análisis microbiológico de los alimentos se realiza para ver la cantidad de
microorganismos que hay, eso es lo que se consigue una inspección para valorar
la carga microbiana.
No sirve: para aumentar la calidad microbiológica de un alimento
Si sirve: para determinar los puntos de riesgo o puntos críticos del proceso de
elaboración y poder evitarlos siguiendo el código de BPED. (Buenas prácticas de
elaboración). El limite es 100 y porque es 100, porque siempre un alimento natural
tiene una cantidad de microorganismo que nosotros lo llamamos microbiota propia
o natural o inactiva. Siempre cuando se haga los análisis microbiológicos nos va a
dar una cantidad de microorganismos, si encontramos menor de 100 esta bien,
pero si pasa de 100 quiere decir que el alimento esta contaminado. Si tu te alejas,
es porque estas haciendo mal las buenas prácticas de manufactura.
La prevención está en evitar manufacturar productos de baja calidad
microbiológica y no comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados.
Porque se implanta el HACCP el Perú, esto comenzó cuando los astronautas
tenían que ir a espacio y tenían que tener buena calidad sus alimentos para que
no se enfermaran. Entonces la NASA ayudo en esto, cada empresa en la línea de
alimentos debe tener su HACCP.
En el desarrollo de las BPE se debe hacer un análisis de riesgo, consiste en;
determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en el
alimento. ¿Cómo poder reducirlo por métodos tecnológicos? Se debe análisis
como se contamino la muestra.
El riesgo depende de la DMI (Dosis Mínima Infecciosa), es la cantidad de
microorganismos que puede producir la toxina que nos va hacer daño o que
pueden ser la cantidad de microorganismo que nos va hacer daño a nosotros.
También es necesario valorar, la carga inicial del microorganismo cada una de las
raciones del alimento; También, el numero de raciones o partes consumidas por la
población en un determinado tiempo.
Aplicando las BPE las oscilaciones en la calidad microbiológica del producto y el
análisis microbiológico, es mas consistente porque permite detectar alejamientos
de las BPE o BPM.
II. GENERALIDADES EN LA TOMA DE MUESTRA Y ANALISIS
MICROBIOLOGICO DE LOS PRODUCTOS FINALES
 - Alimento es un sustrato dinamico, y si es dinamico no es estatico, siempre
esta propenso a cambios entonces entra a la actividad de agua, la
temperatura va cambiando, ph, etc.
- Distribución de los microorganismos en el alimento es heterogenea, nunca
vamos a encontrar que el microorganismo esta en todo lugar ni siquiera en
los lípidos, por eso siempre se debe agitar o moverlo, por lo tanto, nosotros
tenemos que ver en algunos programas como hacer la toma de muestra.
- En la búsqueda de microorganismos existen métodos adecuados para el
análisis microbiológico, por ejemplo, para analizar salmonella se hace un
método especifico para ella.
- Los criterios de análisis aplicados deben ser específicos de cada alimento.
Por ejemplo, el criterio que hago para analizar la leche no puede ser el
mismo para carnes, cada uno debe tener sus criterios.

a. Fundamentos de los procedimientos analíticos

a.1. heterogeneidad de la presencia de los microorganismos en los
alimentos.
el factor mas importante es el muestreo que incluye:
- Evaluación de la muestra, para evitar la distorsión producida por los
microorganismos que se encuentran en diferentes partes de las superficies.
- Determinación del modo óptimo de remoción del microorganismo de la
muestra a lugar de muestreo.
- Evitar la contaminación ambiental durante la toma de muestras o transporte
de muestras
a.2. transporte de muestras
- Evitar la multiplicación e inactivación de algún microorganismo presentes.
- Temperaturas de 0°C próximos (4°C) por un tiempo no superior de 24 h (6-
8 h) excepto gérmenes termotrofos.
a.3. confianza en los procedimientos
normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 del
microbiota normal del alimento.
- Utilizar medios selectivos para detectar microorganismos presentes en
proporciones tan bajas.
- Probar experimentalmente los medios, no usar medio diseñado para otro
producto diferente--------------distorsión de los resultados.
a.4. Fundamentos de los procedimientos analíticos
Tenemos un alimento que ha recibido ciertos tratamientos tecnológicos
(deshidratación, liofilización, o altas T°, etc.), puede ser que el microorganismo se
dañe en su pared celular, ribosomas, entonces son daños subletales en los
microorganismos y el microorganismo cuando esta dañado no se multiplica,
entonces hay que tener medios de recuperación (medios líquidos y solidos).
Ejemplo, Salmonella, en el alimento que esta la salmonella ha habido tratamientos
muy drásticos son dañadas, tienen que ser reactivadas o reanimadas. Ahí es
importante colocarlos en un medio de recuperación en este caso ponerlos en un
medio liquido como es el medio isotónico, para eso tenemos al caldo tripticasa
soya o agua peptonada por 6-8 horas con agitación (oxigenación) / T° Amb. O 35-
37 °C.
b. Análisis microbiológico de los alimentos
b.1. cantidad de muestra a analizar
se parte de un peso o volumen conocido según se trate de un alimento solido (10
gr) o liquido (1 ml o 10 ml) respectivamente. Según la ISO mínimo se debe tomar
10 gr de muestra, debe ser más.
- Para análisis de presencia / ausencia (25 gr) aunque dependerá de la
muestra.
- Muestra de superficie, 10 cm2, 20 cm2, según lo que se pida.
- Muestra de ambiente, 1 m3 es lo mínimo.
b.2. preparación preliminar de la muestra
se debe tener en cuenta el tipo de alimento:
- Alimentos con cantidad de grasa, diluir la grasa para eso utilizamos
sulfactantes timu80 o territol, se pone a estufa.
- Alimentos proteicos, se utiliza el citrato de sodio va hacer que los acumulos
de proteínas se disuelvan y van a poder sacar los microorganismos.
- Alimentos con pH bajo, utilizan bufferfield
- Alimentos con gas, las perlas de vidrio, se bota el gas
- Alimentos con espuma, antiespumante
- Alimentos congelados, se toma un helado blando, si es un helado duro se
deja descongelar en congelación no a temperatura ambiente.
b.3. uso de un diluyente
se ha recomendado como diluyente:
- Tampón fosfato de bufferfield
- Agua peptonada al 0,1%
- Solución Ringer ¼
- Solución tamponada (buffer fosfato pH 7,2) esta solucione disminuyen la
posibilidad de muerte de las bacterias durante la siembra. Este es el mas
utiliza y mas costoso.
- El agua destilada estéril es “bactericida”. No le aporta nutrientes
ICMSF adopto como diluyente al agua peptonada al 0,1% que es una solución
isotónica, y es un diluyente estandarizado para todos los alimentos con ciertas
excepciones.
b.4. materiales
En el análisis de muestras de alimentos se usan desde morteros,
homogeneizadores, licuadoras, hasta centrifugas estériles a 2 velocidades. (es
mejor utilizar el Stomacher)
En licuadoras ----- las muestras deben permanecer 1,5 a 2 min ------ calentamiento
de las cuchillas dañan a la célula bacteriana.
b.5. medios de cultivo
- Se usan una gran variedad de medios de cultivo.
- Algunos se seleccionan de acuerdo al alimento que se esta analizando, o
de acuerdo al microorganismo ejemplo: NMAV (Numeración de
Microorganismos Aerobios Viables) es decir, recuento total de
microorganismo, podemos utilizar agar plate count que es el que mas se
utiliza a excepción para la carne que se utiliza el agar cuenta gérmenes.
Vibrio parahaemolyticus se le coloca en un ambiente marino, el medio
TCBS (medio salino). Levaduras osmofilas se le coloca en un medio que
contenga 4 g de glucosa /L.
b.6. evaluación sistemática de los medios de cultivo
Debido a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, (medios
generales selectivos), necesito hacer controles periódicos que permitan comprobar
el crecimiento de las bacterias que uno busca o de las que la inhibición de
bacterias microbiota general
b.7. Frecuencia
 Los análisis microbiológicos de alimentos deben ser cualitativos y/o
cuantitativos.
 Reportar al microorganismo y su numero presente en el alimento, S. aureus
> 104/g.o
 Solo se reporta su presencia o ausencia con respecto a un determinado
peso o volumen.
Ejemplo: salmonella, presencia o ausencia en 25 g.
b.8. Búsqueda de toxinas
Para determinar la patogenicidad de algunos microorganismos se busca la toxina
o una determinada enzima. Ejemplo: S. aureus, tiene la Dnasa ---- enzima que
esta relacionada con su patogenicidad.
En alimentos procesados no se busca las enzimas sino la toxina que es mucho
mas resistente a los tratamientos.
b.9. Empleo de temperaturas seleccionadas para cada microorganismo
Conociendo las necesidades de T° de los microorganismos (psicrótrofos,
mesófilos, termófilos) se puede elegir la T° de incubación de acuerdo al tipo de
microorganismo que se quiere investigar. Ejm.
- Psicrotroficos: 7-10°C
- Mesófilos: 30 -32 °C, patógenos: 35-37°C
- Clostridium perfringens: 46°C
- Coliformes fecales: 44.5 – 45.5 °C

c. Necesidades de valores de referencia

Es necesario comparar los resultados con valores microbiológicos de referencia,
estos valores se refieren a los valores obtenidos cuando la producción del
alimento se ha ajustado a las Buenas Prácticas de Elaboración.
III. MUESTREO
- El muestreo consiste en separar una serie de muestras representativas del
lote para someterlas al análisis microbiológico.
- El numero de muestras depende de una serie de factores: tamaño del lote,
tipo de alimento, homogeneidad del mismo, variación normal de la
contaminación bacteriana, sensibilidad del método.
- Existen 2 factores fundamentales en la toma de muestras:
 Que las muestras sean representativas del lote fabricado.
 Que sean obtenidas en forma aleatoria.
- Es muy importante el muestreo en alimentos para interpretar los resultados.
Incluye: análisis organoléptico del alimento, los planes de muestreo para el
análisis microbiológico de alimentos y las normas para interpretar los
resultados.
A. Muestreo único
- En un muestreo de una partida única de alimentos, considerar que los datos
de mayor importancia los proporciona las normas de elaboración y
conservación de alimento. Esto es importante en partida de alimentos
importados, sobre todo los enlatados.
- Ningún muestreo único puede dar garantía total de calidad microbiología
del alimento. Ejm: si se analiza 30 muestras de una partida grande y no
aparece ninguna en malas condiciones microbiológicas, hay la probabilidad
que el 10 % del lote sea microbiológicamente defectuoso.
- Cuando se analiza una muestra única el mejor criterio de seguimiento son
las especificaciones del fabricante. Las muestras únicas están siempre
sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos.
 Métodos para el examen microbiológico de alimentos.
En el análisis microbiológico de los alimentos existen:
- Métodos convencionales o tradicionales
- Métodos alternativos
un método alternativo es aquel que demuestra o estima el mismo analito tal cual
se mide usando el método de referencia correspondiente para una categoría de
alimentos. Analito: componente (microorganismo numeración de un grupo de
microorganismo sea taxonómico o no) medido por los métodos.
Actualmente, hay en el mercado kits de métodos alternativos: detectar bacterias y
sus toxinas, parásitos, virus, priones, micotoxinas, biotoxinas, alergenos, metales
pesados, antibióticos, etc.
Métodos de referencia, son aquellos que son reconocidos y ampliamente
aceptados internacionalmente.
Algunos ejemplos de estos métodos son publicados por: APHA, ICMSF, AOAC,
ISO, AFNOR (organismo francés de normalización); etc.
1. Métodos tradicionales
- Métodos basados en el desarrollo de UFC en medios sólidos. Se
fundamenta ene le desarrollo de una colonia visible a partir de una unidad
viable (ufc)
- Métodos de dilución de tubos (NMP), Detección de crecimiento mediante
turbidez, producción de acido y/o gras.
- Método de presencia/ausencia, detección de microorganismos patógenos,
mediante el método de enriquecimiento.
Ventajas:
- Sensibilidad
- Simplicidad, fácil interpretación
- Bajo costo del equipo que utiliza
Desventajas:
- Demora en la obtención de datos
- Laboriosidad
- Requiere evaluar el tamaño de la muestra
- Bajo valor de pruebas aisladas
1.1. Recuento de microorganismos
Cuatro métodos generales se utilizan para el recuento de microorganismos y estos
son:
 - Recuento microscópico directo (RDM), donde se puede observar gérmenes
vivos y muertos
- Recuento metabólico: reducción del colorante, o prueba de la reductasa,
para aquellos gérmenes vivos que tienen capacidad reductora.
- Recuento estándar en placa (REP), para gérmenes vivos (viables).
- Numero mas probable (NMP), para una determinación estadística de las
células vivas.
Recuento directo al microscopio
- En portaobjetos corrientes o especiales, se extiende la muestra se tiñen con
colorante adecuado; se cuentan las células microbianas con un microscopio
óptico. Se calcula el numero de microorganismos por gramo o ml.
- Entre los métodos mas usados tenemos:
 Método breed
 Método de Howard, cuentan las hifas y de acuerdo a eso ves si esta
bueno o malo.
 Cámara de newbauer, se utiliza para levadura.

Técnica de tubos multiplex o NMP

Se prepara la muestra; si es solida se realizan diluciones seriadas, si es liquida a
partir de la muestra original se inocula en los 3 o 5 tubos según se este usando 9 o
15 tubos con medio adecuado.
El numero de microorganismos de la muestra original se conoce por las tablas
estándar de numero más probable (NMP).
Recuento por membrana filtrante
- Este método es utilizado cuando el numero de bacterias en la muestra es
bajo.
- Se utiliza una membrana filtrante con un poro de 0,45 µ de diámetro y un
equipo de filtración.
- La siembra se inicia humedeciendo la membrana filtrante con 5 ml de agua
destilada estéril.
- Luego se filtra 100 ml de la muestra.
- Se retira la membrana con una pinza y se deposita en una placa de Petri con
el medio adecuado para filtración de membrana, se incuba.
- Se realiza la lectura de las colonias después de transcurrido el tiempo de
incubación.
 2. Métodos alternativos
Ventajas:
- Rapidez: procesar elevado numero de muestras / tiempo en general.
- Facilidad de uso
- Límites de detección bajos
- Precisión (sensibilidad y especificidad)
Inconvenientes
- Inversión inicial (equipamientos)
- En general, no excluye la etapa de enriquecimiento
- A veces, necesidad de confirmación
- A veces, difícil traducción cuantitativa de resultados
Factores de elección de una técnica
- Precisión necesaria
- Nivel de resolución
- Facilidad de uso
- Tiempo de obtención de resultados
- Aceptabilidad / validación
- Coste analítico
- Amortización de la inversión
- Disponibilidad de espacios (en ocasiones)
- Soporte y mantenimiento técnico
- Versatilidad / evolución
Factores necesariamente exigibles
- Fiable
- Significativa
- Económicamente aceptable
Automatización de métodos convencionales
- Reducir el gasto de material
- Aumentan el numero de muestras a analizar, sin embargo, no disminuye el
tiempo necesario para completar cada ensayo
- El principal factor de elección será el numero habitual de muestras a
procesar
Las técnicas de análisis microbiológico de alimentos se basarán en:
- Técnicas de enumeración directa y de recuento de células viables
- Técnicas de medición de biomasa
- Sistemas miniaturizados y kits de diagnostico
- Métodos inmunológicos
- Métodos genéticos
- Automatización de procesos y rutinas laboratoriales
Método de la placa de contacto (método de la placa RODAC)
RODAC (Replicate Organisms Direct Agar Contacto), es un método de contacto
directo del agar con los microorganismos; empleando placas de Petri especiales,
en las cuales se ha vertido 15,5 – 16,5 ml de un medio especial para cultivos en
placa, obteniéndose de este modo una superficie de agar que sobresale del borde
las placas.
Laminas de siembra por inmersión y contacto (lisc)
- Los laminocultivos proporcionan un sistema adecuado, fácil de usar y
económico para el control de higiene microbiológico tanto de superficies
como de soluciones.
- Cada laminocultivos contiene dos caras con medio base agar, con una
superficie útil de 8 – 12 cm2 por cara. Las dos caras pueden tener distintos
medios, por lo que con un dispositivo se puede tener doble información de la
contaminación microbiana.
Para control de superficies:
Los resultados obtenidos serán cuantitativos. Cada colonia ha crecido a partir de
un microorganismo inicial. Por tanto, el número de colonias de cada cara indica el
numero de microorganismos que había en los 8 – 12 cm2 de superficie analizada
por cada medio. Con las tablas de resultados se facilita el recuento para los
valores altos: comparar la densidad de colonias de cada cara con las tablas de
resultados incluidas en cada caja de la prueba.
Clasificación
 Métodos rápidos
 Automatización de métodos convencionales
Clasificación según el tiempo empleado
 Métodos rápidos
 Métodos muy rápidos
Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria
Los métodos microbiológicos tradicionales o “convencionales”, empleados
actualmente en numerosos laboratorios de todo el mundo y establecidos en
muchos casos como métodos estándares (referencia) de análisis microbiológico
de los alimentos, se caracterizan por ser laboriosos, emplear grandes volúmenes
de medios de cultivo y requerir un tiempo considerable para la obtención y el
análisis de los resultados.
Métodos rápidos
Por lo contrario, los métodos rápidos requieren un tiempo reducido para la
obtención de los resultados y/o permiten procesar un numero elevado de muestras
por unidad de tiempo, y son en general fáciles de usar, precisos (sensibilidad y
especificidad adecuadas y límites de detección bajos) y económicamente
rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversión económica
inicial considerable.
Conviene destacar que, en la mayoría de los casos, el empleo de métodos rápidos
no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana ni la necesidad
de obtener cultivos puros, así como que los resultados positivos obtenidos con
métodos alternativos (distintos del método de referencia) deben ser confirmados.
Clasificación según tiempo empleado
 Métodos rápidos
Permiten obtener resultados en 6-12 horas, actúan amplificando los efectos del
crecimiento activo de los microorganismos.
 Métodos muy rápidos
Permiten obtener resultados incluso en menos de una hora.
Las técnicas de análisis microbiológico de alimentos se basarán en:
- Técnicas de enumeración directa y de recuento de células viables
 - Técnicas de medición de biomasa
- Sistemas miniaturizados y kits de diagnostico
- Métodos inmunológicos
- Métodos genéticos
- Automatización de procesos y rutinas laboratoriales
Métodos rápidos
Automatización de métodos convencionales
o Reducir el gasto material
o Aumentar el numero de muestras a analizar, sin embargo, no disminuye el
tiempo necesario para completar cada ensayo.
o El principal factor de elección será el número habitual de muestras a
procesar.
Toma y preparación de las muestras
Al igual que en los métodos tradicionales, es de suma importancia, una adecuada
toma y preparación de las muestras a analizar. Para ello se, destacan los
siguientes avances:
1. Para muestras solidas
- Instrumentos gravimétricos (que realizan automáticamente las diluciones
programadas) y
- Homogeneizadores que funcionan mediante ondas de choque y una
intensa agitación para transferir los microorganismos del alimento al
diluyente, produciendo una mínima destrucción de la muestra (Pulsifier,
microgen);
Preparación de medios de cultivo
Automatización para la preparación y distribución de medios de cultivos
Sistema automático de preparación de medio de cultivo. Presenta un núcleo de
control de temperatura de alta presión, y un sistema de mezclado de alta
eficiencia, puede preparar 60 litros de medio de cultivo en 90 minutos.
Métodos rápidos
Los métodos rápidos utilizados en microbiología de los alimentos pueden dividirse
en cinco grandes grupos:
 Recuento de células viables
 Mediación de la biomasa
 Sistemas miniaturizados y kits de diagnostico
 Métodos inmunológicos
 Métodos genéticos
1. Técnicas de enumeración directa y de recuento de células viables
1.1. Técnicas de enumeración directa
Método isogrid
Método de filtración
- Malla hidrofóbica colocada en un medio de cultivo e incubada.
1.2. Recuento de células viables
El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las
superficies que entran en contacto con ellos y del aire de las salas de
proceso de las industrias alimentarias, es uno de los parámetros mas
importantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los
alimentos.
Métodos de siembra
- Sembradores automáticos en espiral que reducen o eliminan la
necesidad de realizar diluciones seriadas de la muestra.
- Empleo de contadores automáticos de colonias.
2. Medida de la biomasa microbiana (método muy rápido)
El principio en el que se basan estos sistemas es que dichas señales (niveles de
ATP, enzimas específicas, pH, impedancia, conductancia y capacitancia eléctrica,
etc.) se modifican paralelamente con el crecimiento microbiano. Conviene
destacar que para que las mediciones sean significativas es necesario establecer
la correlación entre estos parámetros y el recuento de células viables.
Medición de la actividad metabólica (identificación rápida automatizada)
 REDUCCION DE COLORANTES: modificación del color
 MICROCALORIMETRIA: cantidad de calor debida al catabolismo
microbiano
 RADIOMETRIA: CO2 en el metabolismo
 IMPEDANCIA: resistencia al flujo de una corriente eléctrica (BACTOMETER
y MALTHUS)
- Metabolismo microbiano: altera la composición química de los
medios de cultivo (variación en la impedancia del medio).
- Reduce de 2 a 15 veces el tiempo de análisis.
Bioluminiscencia (método muy rápido)
Un complejo enzimático empleado en la técnica, denominado luciferin (sustrato)
luciferasa (enzima), convierte la energía química del ATP (microbiano y no
microbiano) en luz a través de una reacción de oxido-reducción.
La cantidad de luz generada mediante la reacción es directamente proporcional a
la cantidad de ATP presente en la muestra que se pretende evaluar. La luz emitida
es posteriormente cuantificada usando un aparato llamado iluminómetro, que
expresa el resultado medido en unidades relativas de luz (URL).
 también se utiliza en las
membranas de filtro
Ventajas:
 Rapidez en obtención de los resultados: hasta en 11 segundos.
 Fácil menejo: equipos portátiles
 Técnica sencilla
 Resultados estimulantes
 Posibilidad de medidas correctoras
 Elevada sensibilidad: detección de muy bajos niveles de ATP
Desventajas:
 Fungible de costo elevado
 Resultados no extrapolables a ufc/g o ml
 No especifica tipo de microorganismo
 Interferencias por ATP no microbiano
 Interferencias por detergentes y desinfectantes
3. Sistemas miniaturizados y Kits de diagnóstico (identificación rápida
automatizada)
La bacteria de pruebas API es un sistema de identificación rápida para bacterias,
mohos y levaduras. Consta de pruebas bioquímicas estandarizadas y
miniaturizadas, y una base de datos.
Este sistema tiene las ventajas de ser: rápido, eficaz y de permitir realizar
numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API contiene un numero determinado
de microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Ejem. API20E
Sistema miniaturizado API
API sistema miniaturizado y estandarizado de identificación, que asocia una
galería de pruebas bioquímicas (10-20 sustratos9 y una base de datos. (manual o
digital)
Fue creada en 1970, y con el tiempo la gama de galerías API se ha ido ampliando
rápidamente, en colaboración con los grandes centros de referencia
internacionales en USA, Japón, Australia y Europa.