PRÁCTICA 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes,
preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de
cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en
ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían
según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los
siguientes requisitos:
- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se
siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el
crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: Físicos y químicos. Entre los
primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos
se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y
determinados factores orgánicos de crecimiento.
-Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas.

Objetivos
Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo.

Tipos de medios de cultivo

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la
mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o
la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:

A) Por el estado físico en que se encuentran

1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos.

2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente
solidificante.El agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen
marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No
es degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos microorganismos
de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en estado líquido mientras
la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC. Además, una vez solidificado se puede
incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe. Generalmente el agar se añade, para solidificar
un medio líquido, en una concentración del 1,5%. Los medios con agar se envasan en tubo o en
placa de Petri.

3.-Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente
solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una
consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los
microorganismos.

B) Por su composición
1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos
tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos,
ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la
degradación parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son
fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes
son las peptonas o triptonas (proteínas animales digeridas enzimáticamente), el extracto de carne y
el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares
pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa.
Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de
carne.

2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos
químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que
permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería
contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H,
glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran
generalmente presentes como contaminantes de los productos químicos antes citados, en
cantidades suficientes para el crecimiento.

C) Por su utilización:
Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden
desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin
embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo
que se encuentre en un bajo número y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos
presentes en un número más elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo
que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan
el crecimiento de alguno de ellos.

Estos medios pueden ser:

1.-Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de

microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un
agente selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc. Entre los agentes
selectivos podemos citar el cloruro sódico, que en concentración elevada inhibe la mayoría de los
microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la
azida de sodio,que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la
porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este
sistema, así como otros Gram positivos. De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los
medios de cultivo a los que se añaden en selectivos para Salmonella ya que, además de inhibir a
los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben también a bacterias
Gram negativas fermentadoras de lactosa.
Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo
también inhibidor para la mayoría de las bacterias intestinales excepto para Salmonella. Este
colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a
partir de muestras fecales.

Los medios selectivos pueden serlo también por su pH, así el agar glucosado de Sabouraud
ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las
bacterias.

2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a
partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de
cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee.
Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un medio diferencial, ya
que permite reconocer aquellos microorganismos capaces de producir hemólisis. Otros medios
diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un
nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es
metabolizado, como en el caso del medio CLED.

Los medios diferenciales pueden ser además selectivos, si se añaden agentes que inhiben el cre-
cimiento de determinados microorganismos.En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos
microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. Así, el medio Levine
es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de
metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. Es también un medio diferencial,
porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no
fermentadoras.

La formación de ácidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de
las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E.
coli, las colonias presentan además un brillo metálico. El agar MacConkey es otro ejemplo de
medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento
de bacterias no entéricas; la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar
un indicador de pH incorporado en el medio.

Preparación de los medios de cultivo

La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de
medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las
debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad correcta de agua destilada
para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente
todos sus componentes en agua destilada. A continuación el caldo se envasa en los recipientes
adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos.
La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir agar
al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma elegida para
hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya
que el agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla
hasta 100ºC, para permitir que el agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes
disueltos.El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los
medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser
inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición
adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra.
Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un
matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como el que
proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas
ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se
fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas.
Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en
autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las
instrucciones del fabricante.
La conservación de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es
preferible conservarlos a 4ºC para retrasar su deshidratación.