Crecimiento celular

Docentes
Bioprocesos I
Carlos Omar Parra Ingeniería Química
María Victoria Acevedo
2
 ¿Que es el crecimiento?

✘ Es la respuesta ESENCIAL al ambiente fisicoquímico externo

✘ Definición: Aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras
celulares de un organismo (PHB?)
Tipos:
a) Crecimiento individual. Sin división celular: Aumenta el tamaño y el
peso de la célula

b) Crecimiento poblacional. Con división celular: Aumento del número

de células
3
✘ Nutrición ✘ Energía
✘ Crecimiento y reproducción
✘ Formación de productos

𝑆𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 + 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 → 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠 + 𝑚𝑎𝑠 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑞𝑢𝑒 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠

Σ𝑆 + 𝑋 → Σ𝑃 + 𝑛𝑋

4
División celular:
Fisión binaria

Corte transversal de una célula procariota durante la fisión binaria en etapa 4

5
¿Que implica?

6
7
¿Que implica?
𝑑𝑋
≈𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝑋
= 𝜇𝑋
𝑑𝑡
𝜇 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎
𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜

𝑑𝑋
= 𝜇𝑋
𝑑𝑡
Ley de Malthus

8
 𝑑𝑥
= 𝜇𝑥 𝑙𝑛𝑋 − 𝑙𝑛𝑋𝑜 = 𝜇𝑡
𝑑𝑡
𝑋
𝑑𝑥 𝑙𝑛𝑋𝑜
𝑒 = 𝑒 𝜇𝑡
= 𝜇𝑑𝑡
𝑋
𝑋
= 𝑒 𝜇𝑡
𝑋
𝑑𝑥 𝑡 𝑋𝑜
න = න 𝜇𝑑𝑡
𝑋𝑜 𝑋 0
𝑥 𝑡 𝑋 = 𝑋𝑜 𝑒 𝜇𝑡
ln 𝑥ቚ = 𝜇 𝑡ቚ
𝑥0 0

9
 Ejercicio
✘ Supongamos que se inocula 1 litro de un medio sintético con 200
bacterias inicialmente y que al cabo de 3 h hay 900 bacterias.
✘ A) ¿Cuántas bacterias habrá al transcurrir 10 h?
✘ B) ¿Cuánto tiempo pasará para que hayan 20.000 bacterias?

10
 𝑐𝑒𝑙
✘ 𝑋0 = 200
𝐿

✘ 𝑡 = 3 → 𝑋 = 900
𝑐𝑒𝑙 ✘ A)
𝐿
✘ 𝑋 = 200𝑒 0,5∗10
✘ 𝑋 = 𝑋𝑜 𝑒 𝜇𝑡
𝑐𝑒𝑙
✘ 900 = 200𝑒 3𝜇 ✘ 𝑋 = 30088
𝐿
900
✘ = 𝑒 3𝜇
200
900 ✘ B)
✘ ln = 𝑙𝑛 𝑒 3𝜇
200 ✘ 20000 = 200𝑒 0,5𝑡
900
✘ 𝜇=
ln
200 ✘ 𝑡 =9ℎ
3
✘ 𝜇 = 0,5 ℎ−1

11
 Cuantificación de la concentración celular

✘ Métodos Directos: Cálculo directo de la biomasa presente en la muestra

✘ Métodos Indirectos: Cuantifican el consumo de sustratos y la formación
de productos durante el crecimiento
- Conteo en cámara
- Conteo en placa
Cantidad de células [N]
- Cantidad y Tamaño
- Resistencia eléctrica
Directos
- Peso seco
- Volumen de paquete
Cantidad de masa [X]
celular (centrífugas)
Métodos - Densidad óptica

- Seguimiento de CO2
Cambios en las producido
Indirectos propiedades del fluído - Cambios de pH
12 - Cambios de viscosidad
 Cuantificación de
Biomasa

Métodos Conteo
MO viables MO Totales

Recuento
Conteo en placa NMP Turbidimetría
microscópico

- Vaciado o - Breed
extendido en
placa - Neubauer
- Filtración - Petroff Hausser

13
 Método conteo en placa MO Viables

# De MO dependiendo del # de colonias que forma UFC/ unidad de Vol o peso

14
 Filtración

Filtro de celulosa de 0,25 a 0,45 µm en tamaño de poro

15
 Recuento microscópico

+ Tinción permite
diferenciar viables
de no viables

16
Turbidez, densidad óptica

17
 Peso seco
✘ Estufa a 105 °C
✘ Método sencillo
✘ Baja precisión y demorado

18
Métodos indirectos. Ejm producción CO2

19
 Patrones de
crecimiento

20
 Cinética en cultivo por lotes (Batch)

✘ Sistema cerrado
✘ Volumen constante
✘ Estado estable
✘ Diferentes patrones de crecimiento con el
paso del tiempo

𝑑𝑋
= 𝜇𝑋
𝑑𝑡
Ley de Malthus
21
 Fase 0: Activación

✘ Fase previa al cultivo

✘ Los MO se almacenan en
refrigeración para disminuir
las funciones metabólicas.
✘ Se utiliza un medio
suplementado para activar el
microorganismo.
✘ Duración de 8-12 h
22
 Fase 1: Adaptación (Lag)
✘ Fase de adaptación al medio
✘ Depende de la concentración de
lnX
✘ 𝑋 = 𝑋𝑜 𝑒 𝜇𝑡
nutrientes y factores de ✘ 𝑙𝑛𝑋 = 𝜇𝑡 + 𝑙𝑛𝑋𝑜
crecimiento
✘ No hay crecimiento de biomasa
✘ 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏
✘ Entre mas corta mejor
✘ Disminuye considerablemente su
duración si el medio de
1
activación es similar al medio de
proceso. t
23
 Fase 2: Crecimiento Exponencial
✘ Las concentración de biomasa
aumenta de manera exponencial lnX
✘ Periodo de crecimiento balanceado
✘ Crecimiento balanceado: El
metabolismo esta definido y se
mantiene estable mientras las
µm
condiciones del medio lo permitan.
✘ 𝜇 = 𝑐𝑡𝑒 = 𝜇𝑚𝑎𝑥
2
✘ Tiempo de duplicación mínimo 1

24
25
Tiempo de duplicación (td)
𝑋 = 2𝑋0
Reemplazando en Malthus:

2𝑋0 = 𝑋0 𝑒 𝜇𝑚 𝑡𝑑

𝑙𝑛2 = 𝜇𝑚 𝑡𝑑

𝑙𝑛2
𝑡𝑑 =
𝜇𝑚
26
 Fase 2,5: Desaceleración
✘ Empieza a haber inhibición
por sustratos y/o productos lnX
✘ Crecimiento desbalanceado
✘ Activación de mecanismos de
represión para asegurar la
supervivencia celular. µm

✘ Fase de muy corta duración

1 2

27
 Fase 3: Estacionaria
✘ La concentración de nutrientes es
mínima, los MO detienen su
crecimiento. lnX
✘ 𝜇≅0
✘ Activación de rutas metabólicas
alternas.
✘ Formación de nuevos productos µm
debido a la desregulación
metabólica.
1 2 3
✘ Las células viables empiezan a
disminuir t

28
29
 Clasificación de los productos microbianos
✘ Metabolito primario ✘ Metabolito Secundario
✘ Se producen de manera simultanea ✘ Se producen como consecuencia de
con el crecimiento la desregulación metabólica
✘ Se producen principalmente en la ✘ Se producen principalmente en la
fase de crecimiento exponencial fase estacionaria
✘ Ej. Producción de Enzimas ✘ Ej. Penicilina

30
 Fase 4: Muerte
✘ Las células mueren al no poder
mantener su energía de
lnX
mantenimiento
✘ Metabolismo Endógeno: La célula
cataboliza sus reservas
𝑑𝑋
✘ = −𝑘𝑑 𝑋 µm
𝑑𝑡
✘ Se puede presentar una fase leve
de crecimiento debido a los 1 2 3 4
productos de la lisis celular
t

31
¿El sustrato solo se utiliza para crecer?

Δ𝑋
𝑌𝑋/𝑆 =−
Convertir en X Δ𝑆
Energía de crecimiento
Δ𝑃
Energía de mantenimiento 𝑌𝑃/𝑆 =−
Δ𝑆
Convertir en P

La glucosa, por ej., se usa como fuente de C y de energía

32
 Rendimiento

✘ Parámetro estequiométrico que permite describir la cinética del

proceso más apropiadamente y son específicos para cada
microorganismo.
✘ Los coeficientes de rendimiento se miden con base en la cantidad
de consumo o formación de un material, con respecto a la de otro
material.

Δ𝑋 𝑋 − 𝑋0 Δ𝑋
𝑌𝑋/𝑆 =− =− 𝑌𝑋/𝑂2 =−
Δ𝑆 𝑆 − 𝑆0 Δ𝑂2
33
34
35
36
 Ejercicio
Una cepa de un hongo se hace crecer en un a) Calcule la velocidad específica de
reactor batch con glucosa, para el cual se crecimiento máxima
recogieron los siguientes datos:
b) Calcule el rendimiento biomasa
Tiempo [h] [Biomasa] [g/L] [Glucosa] [g/L] sustrato
0 1,25 100 c) ¿Cuál seria la concentración
9 2,45 97 máxima de biomasa que se podría
16 5,1 90,4 esperar si se usan 150 g de glucosa
23 10,5 76,9
con el mismo inóculo?
30 22 48,1
34 33 20,6
36 37,5 9,38
40 41 0,63
37
 Recomendaciones para hallar µmax
✘ Calcular µ usando la aproximación
estadística:
1 ∆𝑋
𝜇= ∗
𝑋ത ∆𝑡
✘ Analizar cuales valores de µ se
mantienen relativamente
constantes, estos definen la fase de
crecimiento exponencial.
✘ Sacar ln𝜇 y graficarlo contra el a) 𝜇𝑚 = 0,104 ℎ−1
tiempo 𝑔𝑋
b) 𝑌𝑋ൗ𝑆 = 0,4
✘ La pendiente de la recta es µmax. 𝑔𝑆
c) 𝑋𝑚𝑎𝑥 = 60,25 𝑔/𝐿
38
Formación de Producto
𝑑𝑃
✘ ≈𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝑃
✘ = 𝑞𝑝 𝑋
𝑑𝑡
✘ 𝑞𝑝 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜

✘ La manera en la que se puede estimar el

valor de qp depende de que tipo de
metabolito es el producto.

39
✘ Metabolito primario ✘ Metabolito secundario

✘ 𝑞𝑝 =
1 𝑑𝑃 ✘ Al ser no asociado al crecimiento no
𝑋 𝑑𝑡
se puede utilizar el modelo anterior
1 𝑑𝑃 𝑑𝑋
✘ 𝑞𝑝 = ✘ 𝑞𝑃 = 𝛼𝜇 + 𝛽
𝑋 𝑑𝑋 𝑑𝑡

✘ 𝑞𝑝 = 𝜇
∆𝑃
✘ Con 𝛼 𝑦 𝛽, constantes empíricas que
∆𝑋
dependen del MO
✘ 𝑞𝑝 = 𝜇𝑌𝑃ൗ𝑋
✘ En fase estacionaria: (𝜇 ≈ 0)
✘ En fase de crecimiento exponencial:
✘ 𝑞𝑝 = 𝛽 = 𝑐𝑡𝑒
✘ 𝑞𝑝 = 𝜇𝑚 𝑌𝑃ൗ𝑋 = 𝑐𝑡𝑒

40
 Estimación de Producto
𝑑𝑃
✘ = 𝑞𝑃 𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝑃 𝑑𝑋
✘ = 𝑞𝑃 𝑋
𝑑𝑋 𝑑𝑡
𝑑𝑃 𝑞
✘ = 𝑃
𝑑𝑋 𝜇
𝑞
✘ 𝑑𝑃 = 𝑃 𝑑𝑋
𝜇
𝑃 𝑞𝑃 𝑋
✘ ‫׬‬0 𝑑𝑃 = ‫𝑋𝑑 ׬‬
𝜇 𝑋0
𝑞𝑃
✘ 𝑃= (𝑋 − 𝑋0 )
𝜇

41
 Estimación por rendimiento
✘ Sustrato ✘ Producto

𝑋−𝑋0 𝑃−𝑃0
✘ 𝑌𝑋ൗ𝑆 = − ✘ 𝑌𝑃ൗ𝑆 = −
𝑆−𝑆0 𝑆−𝑆0

✘ 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑆 − 𝑆0 = 𝑋0 − 𝑋 ✘ 𝑃 = 𝑌𝑃ൗ𝑆 𝑆0 − 𝑆
𝑋0 −𝑋
✘ 𝑆 − 𝑆0 =
𝑌𝑋ൗ
𝑃−𝑃0
𝑋0 −𝑋
𝑆
✘ 𝑌𝑃ൗ𝑋 =
𝑋−𝑋0
✘ 𝑆= + 𝑆0
𝑌𝑋ൗ
𝑆 ✘ 𝑃 = 𝑌𝑃ൗ𝑋 𝑋0 − 𝑋

42
 Muerte celular
✘ Las células no solo mueren debido a ✘ De manera general:
falta de sustrato. 𝑑𝑋
✘ = 𝜇𝑋 − 𝑘𝑑 𝑋
✘ Pueden morir también por 𝑑𝑡
𝑑𝑋
condiciones ambientales, ej: calor; o ✘ = (𝜇 − 𝑘𝑑 )𝑋
𝑑𝑡
envejecimiento o mal desarrollo 𝑑𝑋
fisiológico. ✘ = 𝜇𝑛𝑒𝑡𝑎 𝑋
𝑑𝑡
✘ En condiciones normales de
crecimiento la muerte celular suele ✘ Si 𝑘𝑑 es relevante al proceso,
ser no significativa. entonces se debe ajustar su valor en
✘ Suele tomar relevancia en procesos el calculo de 𝜇:
de esterilización y en procesos donde 1 ∆𝑋
el producto genera inhibición. ✘ 𝜇= + 𝑘𝑑
𝑋ത ∆𝑡
43
 Efecto de la temperatura
✘ La temperatura es un factor
importante que afecta el desempeño
de las reacciones biológicas.
✘ La velocidad de crecimiento
especifica aumenta con la
temperatura hasta llegar al optimo,
después disminuye.
✘ La velocidad de muerte aumenta
después del optimo y aumenta con la
temperatura.

44
 Efecto de la temperatura
✘ Tanto µ como kd varían con la ✘ A y A´ son los factores de frecuencia
temperatura de acuerdo a la ✘ R es la constante de los gases
ecuación de Arrhenius: ideales, R = 1,9872 cal/mol*K
−𝐸𝑎
✘ 𝜇 = 𝐴𝑒 ൗ𝑅𝑇
✘ Para aproximar el efecto de la
−𝐸𝑑 temperatura es necesario conocer Ea
✘ 𝑘𝑑 = 𝐴´𝑒 ൗ𝑅𝑇
y A.
✘ Ea y Ed son las energías de activación 𝐸𝑎 1
para crecimiento y muerte, ✘ 𝑙𝑛𝜇 = 𝑙𝑛𝐴 − ∗
𝑅 𝑇
respectivamente.
✘ 10 < Ea < 20 Kcal/mol
✘ 60 < Ed < 80 Kcal/mol

45
 ejercicio
✘ Los siguientes datos fueron obtenidos para evaluar el efecto de la
temperatura en la producción de acido láctico, mediante el uso de
Lactobacillus delbrueckii:
a) Estime los parámetros de Arrhenius.
b) Cual es la velocidad especifica de
crecimiento a 35°C
c) Si a 35°C se inocula un litro de medio
sintético con 0,1 g de biomasa, cuanta
biomasa habrá al cabo de 48 h?
46
 Crecimiento Limitado por el Sustrato
✘ En una reacción biológica son varios Modelo de Monod
los sustratos que participan en ella
✘ Para describir detalladamente las ✘ Se basa en que la producción de
reacciones es necesario usar biomasa depende exclusivamente
modelos segregados y estructurados del sustrato limitante
que son muy complejos
✘ Una manera mas sencilla pero que Σ𝑆 + 𝑋 → Σ𝑃 + 𝑛𝑋
funciona muy bien fue descubierta en
1942 por Monod
𝛼𝑆 → 𝛾𝑋

47
 Modelo de Monod
𝜇𝑚 ∗ 𝑆 µ
𝜇=
𝑘𝑠 + 𝑆 µm
✘ Con ks = constante de saturación

✘ Cuando: µm/2
𝑆 → ∞ ; 𝜇 → 𝜇𝑚

𝑆 →0; 𝜇 →0
ks S
𝜇𝑚
𝑆 → 𝑘𝑠 ; 𝜇 → 1 𝑘𝑠 1 1
2 = +
𝜇 𝜇𝑚 𝑆 𝜇𝑚
48
 Ejercicio
✘ La formación de etanol a partir de glucosa es realizada en un cultivo
en batch de Saccharomyces cerevisiae, para el cual se obtuvieron
los siguientes datos:

tiempo [h] Glucosa [g/L] Biomasa [g/L] Etanol [g/L]

0 100 0,5 0 a) Determine µm y ks
2 95 1 2,5
5 85 2,1 7,5 b) Determine Yx/s y Yp/s
10 58 4,8 20
15 30 7,7 34 c) Determine qp
20 12 9,6 43
25 5 10,4 47,5
30 2 10,7 49

49
 Modelo final de crecimiento
✘ Despejando S del rendimiento:
𝑋0 −𝑋
✘ 𝑆= + 𝑆0
𝑌𝑋ൗ
𝑑𝑋
✘ 𝑙𝑒𝑦 𝑑𝑒 𝑀𝑎𝑙𝑡ℎ𝑢𝑠 →
𝑆
= 𝜇𝑋
𝑑𝑡 ✘ Reemplazando S en el modelo de
𝜇𝑚 𝑆
✘ 𝑀𝑜𝑑𝑒𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑀𝑜𝑛𝑜𝑑 → 𝜇 = Monod:
𝑘𝑠 +𝑆
𝑋0 −𝑋
𝑋−𝑋0 𝜇𝑚 +𝑆0
✘ 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 → 𝑌𝑋ൗ𝑆 = − 𝑌𝑋
ൗ𝑆
𝜇𝑚 𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑆−𝑆0 ✘ 𝜇= 𝑋0 −𝑋 = 𝑆
𝑘𝑠 + +𝑆0 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑌𝑋 𝑆 𝑆
ൗ𝑆

✘ Reemplazando µ en la ley de Malthus:

𝜇𝑚 𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0 𝑋
𝑑𝑋
✘ = 𝑆
𝑑𝑡 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑆 𝑆
50
 Modelo final de crecimiento
𝜇𝑚 𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0 𝑋
𝑑𝑋
✘ = 𝑆
𝑑𝑡 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑆 𝑆
𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
✘ 𝑆 𝑆
𝑑𝑋 = 𝜇𝑚 𝑑𝑡 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 −𝑋
𝑋 𝑋0 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑆
✘ 𝑆 𝑆
𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 −𝑋 𝑋
𝐴
=𝑋+
𝐵
𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 −𝑋
𝑆 𝑆
𝑌 𝑘 +𝑋 −𝑋+𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑋 𝑋ൗ𝑆 𝑠 0
✘ ‫ 𝑋 𝑋 𝑋׬‬−𝑋+𝑌 𝑆 𝑆 𝑑𝑋 =
𝑡
‫׬‬0 𝜇𝑚 𝑑𝑡 ✘ 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑘𝑠 + 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑆0 + 𝑋0 − 𝑋 = 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑆0 + 𝑋0 𝐴 − 𝐴𝑋 + 𝐵𝑋
0 0 𝑋ൗ 0
𝑆
✘ 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑘𝑠 + 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑆0 + 𝑋0 = 𝑌𝑋ൗ𝑆 𝑆0 + 𝑋0 𝐴; −1 = −𝐴 + 𝐵
𝑋 𝑑𝑋 𝑋 𝑑𝑋 𝑡
✘ 𝐴 ‫𝑋׬‬ + 𝐵 ‫𝑋׬‬ = ‫׬‬0 𝜇𝑚 𝑑𝑡 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠 +𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 𝑌𝑋ൗ 𝑘𝑠
0 𝑋 0 𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 −𝑋
𝑆 ✘ 𝐴= 𝑆
𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0
𝑆
;𝐵 = 𝑌 𝑆
𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0
𝑆 𝑆
𝑌𝑋ൗ 𝑆0
𝑋
✘ 𝐴𝑙𝑛 + 𝐵𝑙𝑛 𝑆
= 𝜇𝑚 𝑡
𝑋0 𝑌𝑋ൗ 𝑆0 +𝑋0 −𝑋
𝑆
𝑌𝑋 𝑘𝑠 𝑌𝑋 𝑘𝑠 𝑌𝑋 𝑆0
ൗ𝑆 𝑋 ൗ𝑆 ൗ𝑆 𝑋0 − 𝑋
1+
𝑌𝑋 𝑆0 +𝑋0
𝑙𝑛
𝑋0
+
𝑌𝑋 𝑆0 +𝑋0
𝑙𝑛
𝑌𝑋 𝑆0 +𝑋0 −𝑋 𝑆= + 𝑆0
ൗ𝑆 ൗ𝑆 ൗ𝑆 𝑌𝑋ൗ
✘ =𝑡 𝑆
𝜇𝑚
51