CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA II

ING. BIOQUIMICO

4° SEMESTRE

ENERO – JUNIO 2021

Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE: QUIMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

BIOQUIMICA II

INDICE DE PRÁCTICAS

PRACTICA NOMBRE DE LA PRACTICA

Determinación cuantitativa de la actividad de amilasa en líquidos
1
biológicos.
2 Determinación de glucosa en sangre total.
Producción de piruvato durante la fermentación de glucosa por
4
levaduras
5 Fermentación alcohólica
Cromatografía en capa fina de pigmentos fotosintéticos y determinación
7ª
de su espectro de absorción (Primera parte)
Cromatografía en capa fina de pigmentos fotosintéticos y determinación
7b
de su espectro de absorción (Segunda parte)
8 Aislamiento de glucógeno hepático

Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 PRÁCTICA No. 1

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA EN LÍQUIDOS BIOLÓGICOS

OBJETIVO (S)

Determinar cuantitativamente la actividad de amilasa en líquidos biológicos mediante el método

amiloclástico yodométrico.

INTRODUCCIÓN

La amilasa, producida en el páncreas exócrino y en las glándulas salivales, escinde los enlaces alfa-1 4
glucosídicos de los polisacáridos (almidón y glucógeno). Se encuentra elevada en el suero de pacientes
con pancreatitis aguda, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al
ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. También
se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5
días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales. También es posible encontrar
valores aumentados en cualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en regiones
próximas al páncreas.
El fundamento de la práctica es el siguiente: el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la
muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. Ésta se detiene agregando reactivo de yodo, que al
mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color
respecto de un sustrato colorido sin muestra (sin amilasa) es la medida de la actividad enzimática, que se
expresa en Unidades Amilolíticas (Smith & Roe)/ 100 mL (UA/dL), comparables con las Unidades
Sacarogénicas (Somogyi)/100 mL.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL REACTIVOS
Baño de agua Suero sanguíneo u orina
Tubos de ensayo Solución de almidón 500 mg/L, tamponada a pH 7
Micropipetas con buffer fosfatos 0.1 M en NaCl 0.15 M
Espectrofotómetro Reactivo de yodo (0.10 eq/L de yodo en ácido
Pipetas serológicas clorhídrico 0.02 M)

PROCEDIMIENTO

1. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y otro como desconocido (d).
2. Agregar 1 mL de sustrato a cada tubo.
3. Dejar 5 min en baño de agua a 37 °C
4. Agregar 0.02 mL de la muestra al tubo marcado como desconocido.
5. Incubar a 37 °C por 7.5 min.
6. Agregar 1 mL del reactivo de yodo a cada uno de los tubos.
7. Mezclar y agregar 8 mL de agua destilada a ambos tubos.
8. Mezclar por inversión y leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 640 nm ajustando a cero con
agua destilada.
Nota: El color a medir deberá ser amarillo y tal vez muy ligeramente azulado, ya que el almidón está muy diluido. El color de la
reacción es estable durante 1 hora. Si la temperatura ambiente es superior a 25 °C, la lectura deberá efectuarse dentro de
los 20 min siguientes.

1 Código: FO-121500-20
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Emisión: 16/06/2009
RESULTADOS

1. Cálculo de los Resultados:

Actividad de Amilasa ( )UA ( c−d )

dL
=
c
×1,000

Definición de Unidad Amilolítica (UA): Una UA es la cantidad de enzima contenida en 100 mL de muestra, que puede hidrolizar
10 mg de almidón en 30 min, en las condiciones de la reacción. En esta técnica se incuban 0.02 mL de muestra con 0.5 mg
de almidón contenidos en 1 mL de sustrato durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 mL de suero con 10,000
mg de almidón durante 30 min. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de 1000
UA/dL. Para las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por 1000.

Tabla 1.1. Valores de Referencia:

Condición clínica Suero (UA/dL) Orina (UA/hora)

Normal <120 <260
Pancreatitis aguda 300 a 12,000 Más de 900
Pancreatitis crónica hasta 200 Más de 300
Parotiditis 200 a 350 350 a 750
Parotiditis c/complicación pancreática más de 350 más de 750
Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis) normal normal

CUESTIONARIO

1. Describa dos unidades de actividad de amilasa y dos fundamentos de técnicas para medirlas que
sean diferentes a la técnica empleada en esta práctica.
2. Describa con dibujos, figuras y texto relevante el fundamento de la técnica de esta práctica.
3. Describa qué es la malta, para qué se usa, y explique por qué es rica en amilasas.
4. Describa tres tipos diferentes de amilasas, donde se encuentran, y sus características bioquímicas
principales (sustratos que atacan, enlaces que rompen, productos que generan, etc.)

2 Código: FO-121500-20
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 PRÁCTICA No. 2

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE TOTAL

OBJETIVO (S)

Que el estudiante comprenda el metabolismo de la glucosa en sujetos sanos en diferentes condiciones

metabólicas.

INTRODUCCIÓN

La glucosa es el proveedor de energía más importante del organismo junto con los ácidos grasos y los
cuerpos cetónicos. El principal aporte proviene del intestino (glucosa alimentaria), el hígado y los riñones.
En los animales superiores el metabolismo de los carbohidratos está sujeto a mecanismos de regulación
complejos en los que participan las hormonas, los metabolitos y las coenzimas.

El cerebro, la médula suprarrenal y los eritrocitos son los que más dependen del suministro continuo
de glucosa, porque no disponen de ninguna reserva importante de la misma. El sistema nervioso
requiere de aproximadamente 150 gr de glucosa al día para realizar sus funciones normales.

La principal función bioquímica de la glucosa es la de proporcionar energía para los procesos de la

vida. El adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente de energía universal para las reacciones biológicas. La
oxidación de la glucosa por las vías glucolítica y del ácido cítrico es la fuente principal de energía para la
biosíntesis del ATP. El exceso de glucosa es almacenado en las células como el polímero glucógeno
para demandas posteriores de energía.

El papel de la insulina es desviar la glucosa extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular

en la forma de macromoléculas (como el glucógeno, lípidos y proteínas). Es así que la glucosa es
almacenada en tiempos de abundancia para los momentos de necesidad. Algunos minutos después de
la ingesta de una comida, los niveles de insulina sanguínea aumentan. La glucosa y los aminoácidos de
la dieta tales como la leucina, isoleucina y lisina, son estimulantes potentes de las células beta del
páncreas haciendo que éstas segreguen insulina.

La mayor parte de las células periféricas responden al aumento de la glucosa sanguínea con un
aumento rápido del transporte de la glucosa dentro de las células. De esta manera, los niveles de
glucosa sanguínea aumentan solamente de un 20% a un 40% en los individuos no-diabéticos. Sin
embargo, aproximadamente el 80% de la entrada de glucosa no es insulino - dependiente, ya que el
cerebro, los glóbulos rojos, el hígado y los intestinos no requieren de insulina para la entrada creciente
de glucosa cuando está presente glucosa sanguínea elevada.

El músculo es el tejido dependiente de insulina más importante. Los niveles crecientes de insulina y
glucosa sanguíneas inhiben la lipólisis así como a aproximadamente el 60% de la liberación normal de
glucosa hepática.

Se han realizado estudios del comportamiento de la glucosa en sangre en sujetos normales en el

cual se puede observar que de los 30 a 60 minutos posteriores a la ingesta de alimentos, la
concentración de glucosa alcanza su máximo y a las dos horas vuelve a su estado basal. Algunos
minutos después de la ingesta de una comida, los niveles de insulina sanguínea aumentan. La
concentración de glucosa en el suero es aproximadamente 15% más elevada que la concentración de
glucosa en la sangre total esto es debido a que la glucólisis continúa en los eritrocitos.
El uso del glucómetro es de mucha utilidad en el autocontrol de pacientes diabéticos, lo que ayuda a
medir una glucosa en sangre casual. El valor calórico total diario de los alimentos deberá ser entre 25 y
30 Kcal/Kg/día, para las personas sedentarias y de 30 a 40 Kcal/Kg/día para una persona físicamente
activa o que realiza ejercicio de manera regular.

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 En cuanto a las determinaciones de glucosa, actualmente en el comercio están disponibles una
serie de productos que permiten cuantificar analitos de una forma rápida y con un adecuado valor de
veracidad. Tal es el caso de las tiras reactivas que constituyen la llamada química seca; suele recibir este
nombre debido a que sólo se pone en contacto directo con sangre completa, suero, plasma, saliva u
orina, efectuándose una reacción en la cual se cuantifican productos secundarios que pueden ser
coloridos y que son proporcionales a la concentración del analito a medir.

La química seca es en su gran mayoría muy específica, ya que utiliza enzimas inmovilizadas
específicas para un sustrato de interés. Se pueden encontrar presentaciones comerciales que involucran
la química seca, cromatografía y técnicas inmunológicas (reacciones antígeno-anticuerpo). La valoración
de las tiras reactivas puede efectuarse mediante reflectómetros, o por valoración visual-manual frente a
una escala colorida que especifica concentraciones.

El método de la glucosa oxidasa consiste en un preparado comercial de dos enzimas, glucosa

oxidasa y peroxidasa, con un cromógeno. Estas enzimas catalizan la siguiente reacción:

Glucosa + O2 Gluconolactona + H 2O2

Glucosa oxidasa

El agua oxigenada producida en la reacción es titulada por descomposición por medio de una
peroxidasa; el oxígeno formado por esta descomposición se fija a un sustrato aceptor de oxígeno para
dar un compuesto colorido.

MATERIALES Y REACTIVOS

1 gradilla Muestra de sangre obtenida por punción venosa

1 tubo rojo Kit comercial para determinación de glucosa por
1 micropipeta de 1000 μl química húmeda
1 micropipeta de 20 μl
1 micropipeta de 10 μl
Espectrofotómetro
Torundas
Torniquete
Vacutainer
Agujas

PROCEDIMIENTO

1.- Se necesitan seis personas:

Persona 1: en ayuno prolongado (12 – 14 hrs).

Persona 2: en ayuno temprano (8 hrs).
Persona 3: que haya desayunado dos horas antes de la prueba.
Persona 4: que haya consumido alimentos 30 minutos antes de la prueba.
Persona 5: haber consumido una carga de glucosa 30 minutos antes de la prueba.
Persona 6: haber realizado ejercicio por lo menos 20 min, cinco minutos antes de la prueba.

Dietas:
En profesor las asignará en la práctica anterior.

2.- A cada uno de los sujetos en cualquiera de las condiciones y consumo de dietas se les determinará la
concentración de glucosa en sangre total por medio de química húmeda, solo a la persona cinco se le

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tomara de la siguiente forma: 0 minutos (antes de ingerir la carga de glucosa), 30 minutos, 60 minutos y
120 minutos, después de la ingestión.

RESULTADOS

Con los datos obtenidos completar las tablas 1 y 2, y hacer una gráfica de todas las
Variantes.

Tabla 1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad:
Sexo:
Sedentario:
Actividad física constante:
[Glucosa mg/dl]

Tipo de dieta
Tiempo (min.) [Glucosa mg/dl]

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es el rango de la concentración de glucosa en sujetos normales?

2.- ¿Por qué existe un incremento de glucosa en sangre en sujetos después de haber
consumido alimentos? ¿Cuál es el rango máximo de concentración de glucosa?
3.- ¿De qué forma y cuál es el órgano principal de almacenar glucosa en humanos?
4.- ¿En que se basa el mecanismo de detección de glucosa utilizado en esta práctica?
5.- ¿Explique qué es el tipo de diabetes I y II?
6.- ¿Cuál es la principal fuente de energía en los deportistas y en que órgano se encuentra?

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 PRÁCTICA No. 4

PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN DE GLUCOSA POR LEVADURAS

OBJETIVO (S)

Generales

1. Cuantificar la producción de piruvato mediante la fermentación de la glucosa por levaduras.

2. Determinar el efecto del pH de cultivo de las levaduras sobre la acumulación de piruvato.

Particulares

1. Preparar un sistema fermentativo de la glucosa para la producción de piruvato.

2. Elaborar una curva patrón de piruvato de sodio por espectrofotometría a una absorbancia de 505 nm.
3. Determinar cualitativamente la producción de piruvato mediante la reacción con nitroprusiato de sodio.
4. Determinar cuantitativamente la producción de piruvato mediante 2,4-dinitrofenilhidrazina.

INTRODUCCIÓN

La primera etapa del metabolismo de la glucosa en levaduras es la producción de piruvato. Este proceso
se efectúa mediante una serie de reacciones que involucran un número considerable de intermediarios, lo
que en conjunto se conoce como fermentación. La reacción total podría considerarse como la
transferencia de dos pares de átomos de hidrógeno de una glucosa a un NAD. Puesto que la coenzima
se encuentra en cantidades limitadas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda; el
NADH2 formado es convertido a NAD por el oxígeno molecular a través de la cadena respiratoria. Esto no
es posible en condiciones anaerobias y en este caso la reoxidación se efectúa cuando se convierte el
piruvato a acetaldehído y luego éste a etanol.
Los metabolitos del piruvato y acetaldehído se encuentran presentes en muy bajas
concentraciones. Por lo tanto, para demostrar su presencia como intermediario en el cambio metabólico
es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho
cuando se investigan cambios metabólicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversión del
compuesto que se está investigando mediante condiciones o compuestos que la inhiben. También se
pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo
de su actividad máxima, es decir, que se pueda usar un agente que atrape el intermediario y que forme
un compuesto que no pueda metabolizarse. Por ejemplo: la piruvato descarboxilasa no es activa con
soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede
demostrarse por la reacción del nitroprusiato de sodio ó la 2,4-dinitrofenilhidrazina. Otro ejemplo es el
añadir a la muestra en incubación sulfito de sodio, que atrapa al acetaldehído y que se demuestra por
varios métodos colorimétricos al reaccionar con diferentes compuestos.
Los aldehídos y cetonas son sustancias muy reactivas; se pueden polimerizar y formar derivados
de adición; se pueden reducir y los aldehídos se oxidan con mucha facilidad. Los aldehídos y cetonas se
condensan con la hidrazina y sus derivados, lo mismo con la semicarbazida, tiosemicarbazida y la
hidroxilamina; formando compuestos sólidos con puntos de fusión definidos, los cuales son empleados
para identificarlos.
El grupo carbonilo de los aldehídos se oxida fácilmente y el de las cetonas no se oxida. La
oxidación de los alcoholes produce aldehídos o cetonas, dependiendo de la naturaleza de éstos. Los
puntos de ebullición de los aldehídos o cetonas son más bajos que los de alcoholes de peso molecular
similar. Debido al grupo carbonilo, los aldehídos y cetonas de bajo peso molecular pueden formar enlaces
de tipo puente de hidrógeno con el agua y por lo tanto, ser solubles en ella.

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 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL REACTIVOS
Micropipetas Fosfato de sodio dibásico 0.5 M (20 mL)
Tubos de ensaye 20 mL (Ligeramente alcalino: pH 8-9)
Cronómetros Fosfato de potasio monobásico 0.5 M (20 mL)
Pipetas de 1, 5 y 10 mL (Ligeramente ácido: pH 4-5)
Centrífuga Suspensión de levadura (100 g/L) en Na 2HPO4 0.5
Baño de agitación M.
Termómetro Suspensión de levadura (100 g/L) en KH2PO4 0.5
Balanza M.
Gradillas Glucosa al 10%
Baño María Nitroprusiato de sodio 5%
Hidróxido de amonio (amoníaco) concentrado
Sulfato de amonio (2 g; dárselos ya pesado a los
estudiantes para ahorrar tiempo).
Hidróxido de sodio 0.4 N
Solución de clorhidrato de 2,4-dinitrofenilhidrazina
Ácido tricloroacético 20%
Solución patrón de piruvato a 150 g/mL

PROCEDIMIENTO

A. Formación de Piruvato a Partir de Glucosa

1. Dos equipos trabajarán con levadura ligeramente alcalina (A: en Na 2HPO4) y dos con levadura
ligeramente ácida (B: en KH2PO4).
2. En un tubo de ensaye, agregar 5 mL de solución de glucosa, denominándolo como A ó B, según el
equipo.
3. Al tubo A agregar 5 mL de suspensión de levadura ligeramente alcalina y al tubo B 5 mL de
suspensión de levadura ligeramente ácida.
4. Llevar a cabo la fermentación a 32ºC durante 45 min.
5. Después de la hora agregar 4 mL de ácido tricloroacético al 20%, mezclando vigorosamente (lisis
celular).
6. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 min en centrífuga clínica, o a velocidad máxima por 5 min en
microcentrífuga.
7. Recuperar el sobrenadante para determinar el piruvato por los siguientes métodos:

B. Determinación Cualitativa de Piruvato Mediante Nitroprusiato de Sodio

1. Agregar a un tubo de ensaye 2 mL del sobrenadante y 1 g de sulfato de amonio sólido, calentar en

baño maría hasta disolución.
2. Añadir dos gotas de solución de nitroprusiato de sodio y mezclar cuidadosamente.
3. Dejar reposar por 1 min.
4. Agregar por las paredes del tubo hidróxido de amonio (amoníaco) concentrado hasta que se formen
dos fases.
5. Si hay piruvato se formará un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos. La presencia de un
anillo rosado en la interfase indica la presencia de los grupos tioles y con frecuencia se observa
antes de la coloración azul o verde.

C. Determinación Cuantitativa de Piruvato con 2,4-Dinitrofenilhidrazina

1. Para llevar a cabo la cuantificación de piruvato es necesario elaborar una curva patrón con piruvato de
sodio a una concentración conocida y medir su absorbancia mediante espectrofotometría a 505
nm.

7 Código: FO-121500-20
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 Tabla 4.1. Curva patrón de piruvato
Patrón de piruvato de Agua destilada Concentración final de piruvato
Tubo
sodio (mL) (mL) (g/mL)
1 0.0 1.2 0
2 0.1 1.1 12.5
3 0.2 1.0 25.0
4 0.3 0.9 37.5
5 0.4 0.8 50.0
6 0.5 0.7 62.5

2. Adicionar a cada tubo 1 mL de 2,4-dinitrofenilhidrazina y mezclar; enseguida agregar 10 mL de

hidróxido de sodio 0.4 N y mezclar.
3. Leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 505 nm utilizando el tubo 1 como
blanco.
4. Para las muestras problemas, agregar en dos tubos las cantidades siguientes: tubo uno 0.5 mL, y tubo
dos 0.75 mL, y ajustarles a un volumen de 1.2 mL con agua.
5. Adicionar a cada tubo 1 mL de 2,4-dinitrofenilhidrazina y mezclar, enseguida agregar 10 mL de
hidróxido de sodio 0.4 N y mezclar.
6. Leer las muestras siguiendo los pasos antes mencionados.
7. La formación de un color café rojizo indica la presencia de piruvato.

RESULTADOS

1. Registre las observaciones entre los dos tratamientos (ácido y alcalino) en cuanto a la producción de
piruvato por ambos métodos.
2. Complete los valores de la absorbancia de la curva patrón y obtenga una tabla y una gráfica de los
mismos.
Concentración final de piruvato Absorbancia a
Tubo
(g/mL) 505 nm
1 0
2 12.5
3 25.0
4 37.5
5 50.0
6 62.5

Extracto (mL) Ácido Básico Ácido Básico

0.50
0.75

3. De la gráfica obtenida, trazar la curva de regresión lineal y extrapolar con los valores de la
absorbancia de las diluciones de los extractos.
4. Obtener el valor de la producción de piruvato en mg/g de levadura, por los dos tratamientos.
5. Reportar los resultados de las pruebas cualitativas del piruvato.

CUESTIONARIO

1. Explique lo que ocurre a nivel molecular en la estructura de la enzima piruvato descarboxilasa en

condiciones alcalinas.
2. Defina la reacción química que ocurre cuando el piruvato reacciona con el nitroprusiato de sodio y con
el 2,4-dinitrofenilhidrazina.
3. Proponga alguna técnica para caracterizar acetaldehídos.
8 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 PRÁCTICA No. 5

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

OBJETIVO (S)

Conocer la biología de las levaduras como responsables de la fermentación alcohólica; observar un

proceso fermentativo; estudiar las reacciones de la fermentación alcohólica y comprobar la formación de
etanol y CO2 como productos finales de la fermentación.

INTRODUCCIÓN

Las levaduras son organismos anaeróbicos facultativos, lo que significa que pueden vivir sin oxígeno.
Cuando hay oxígeno lo utilizan para la respiración, es decir para oxidar la glucosa completamente y así
obtener ATP.
En condiciones de anaerobiosis, las cepas de Saccharomyces cerevisiae (levaduras de la
panificación) y otras especies de levaduras transforman la glucosa en ácido pirúvico, siguiendo la
secuencia de reacciones de la glucólisis. Este proceso es común a la mayoría de los seres vivientes.
Pero aquí radica lo específico de estas levaduras: son capaces de proseguir la degradación del ácido
pirúvico hasta etanol, mediante el siguiente proceso:

Esto es una ventaja adaptativa para las levaduras, que pueden sobrevivir en anaerobiosis. Pero
solamente lo utilizan cuando no hay oxígeno disponible y ello en relación con el bajo rendimiento
energético de la fermentación alcohólica, en comparación con el de la degradación oxidativa de la
glucosa.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL REACTIVOS
4 Matraces Erlenmeyer de 50 mL Glucosa
Tapón de corcho Maltosa
Tubos de vidrio Dicromato potásico
Levaduras de la panificación Ácido sulfúrico diluido
Tubos de ensayo Reactivo de Fehling A y B
Gradilla NaOH 0.5 M
Vasos de precipitado BaCl2 1 M
Pipetas HCl 0.2 M
Manguera de hule

9 Código: FO-121500-20
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Emisión: 16/06/2009
PROCEDIMIENTO

Experimento 1

1. Preparar 40 mL de una solución de glucosa al 3% (p/v) y el mismo volumen de una solución de

maltosa al 3% (p/v) y colocar cada una en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. Algunos equipos de
alumnos pueden trabajar con un carbohidrato y otros equipos con el otro.
2. Separar 3 mL de cada solución en un tubo de ensayo. Estas muestras servirán para realizar la
reacción de Fehling y comprobar su poder reductor.
3. Suspender 0.8 g de la cepa de panificación de Saccharomyces cerevisiae en el resto de la solución de
glucosa e igualmente para la de maltosa.
4. Colocar en el extremo de la salida del tubo una manguera que vaya unida a un matraz en el que se
hallan contenidos 12 mL de NaOH 0.5 M, con el fin de atrapar el CO2 producido.
5. Inmediatamente colocar el matraz con la solución de fermentación a 37 °C por un tiempo de 45 min.

Experimento 2: Análisis de la Fermentación Mediante la Prueba de Fehling

1. En este experimento se comprueba que al principio había glucosa (ó maltosa) y al final del proceso
desaparece la glucosa (ó maltosa) y se produce etanol.
2. Tomar el tubo de ensayo en el que se colocó la muestra de glucosa ó maltosa sin levaduras.
3. Realizar la prueba de Fehling a ambas muestras.
4. Tomar 2 mL de la muestra de fermentación y realizar la prueba de Fehling. Se esperaría que la
reacción sea negativa, ya que la glucosa ó maltosa se ha consumido por las levaduras y se ha
transformado en etanol, como se ve en la reacción de fermentación. ¿Es ése el caso para ambos
carbohidratos? Responda y discuta esto en Resultados y Discusiones (Reporte Complementario).

Experimento 3: Análisis de la Producción de Etanol

1. Colocar en tres tubos de ensaye lo siguiente: 1) 2 mL de la suspensión de fermentación (problema); 2)

2 mL de agua destilada (control negativo); y 3) 2 mL de agua destilada más 10 gotas de etanol
(control positivo).
2. Añadir a cada tubo un cristal muy pequeño de dicromato potásico (suficiente para dar un color amarillo
pálido) y 2 mL de ácido sulfúrico diluido.
3. Calentar al baño María durante 5 min. Debe formarse un compuesto aromático característico, y se
pone de manifiesto porque cambia de color de amarillento a azul. Es una reacción que nos indica
que existe etanol. Los controles negativo y positivo deberán dar negativa y positiva la prueba,
respectivamente.

Experimento 4: Análisis de la Producción de CO2 Durante la Fermentación

1. Para verificar la cantidad de CO 2 producido durante la fermentación, es necesario tomar 10 mL del

NaOH el cual atrapó al CO2 durante el proceso fermentativo.
2. Agregar 5 mL de BaCl2 1 M y realizar una titulación con HCl 0.2 M, usando fenolftaleína como
indicador.

RESULTADOS

1. Describe la reacción química de la fermentación para cada una de los carbohidratos utilizados.
2. De los carbohidratos utilizados, ¿cuál de ellos fue el que dio mejor rendimiento y por qué?
3. ¿Qué función tiene el dicromato de potasio en el análisis de la producción de etanol?
4. Mediante la titulación, ¿cuál fue la cantidad de CO 2 obtenida y cómo se compara con la cantidad
esperada de CO2? Muestre sus cálculos en detalle.

10 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
5. Explica cómo cuantificarías la producción de etanol mediante una técnica diferente a la usada en esta
práctica.

CUESTIONARIO

1. Describa con fórmulas, nombres de compuestos, enzimas y organelos participantes las reacciones de
la glicólisis anaerobia desde la glucosa hasta el etanol, y las reacciones de la respiración aerobia
desde glucosa hasta CO2 y H2O.
2. Explique en un cuadro comparativo las diferencias entre la fermentación alcohólica y la fermentación
láctica. ¿En qué organismos y/o tejidos animales se llevan a cabo una y la otra?
3. Compare detalladamente el rendimiento energético (ATP) de la fermentación alcohólica, láctica y la
respiración aerobia, explicando por qué los rendimientos son diferentes.

11 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 PRÁCTICA No. 7ª

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Y DETERMINACIÓN DE SU

ESPECTRO DE ABSORCIÓN (PRIMERA PARTE)

OBJETIVO (S)

Extraer y separar los pigmentos fotosintéticos de hojas verdes de plantas mediante cromatografía en
capa fina.

INTRODUCCIÓN

Dentro de los cloroplastos de todas las plantas superiores se encuentran dos tipos de pigmentos
fotosintéticos capaces de absorber la energía de la luz. El primer grupo está conformado por los
pigmentos verdes llamados clorofilas (a y b son las más comunes), mientras que el segundo lo conforman
los carotenos y sus derivados oxigenados, las xantofilas. El color de estos pigmentos es amarillo, naranja
y rojo. Las clorofilas a y b poseen una estructura tipo porfirina, compuesta por cuatro anillos pirrol con un
átomo de Mg quelado en su centro, además de un grupo fitol unido a uno de los anillos pirrol. La
diferencia entre la clorofila a y b radica en un sustituyente en el anillo 3. La clorofila a tiene un grupo
metilo, mientras que la clorofila b posee un grupo aldehído. En la mayoría de las plantas la proporción
clorofila a / clorofila b es de 2-3 / 1.
Los carotenoides son compuestos de 40 carbonos (tetraterpenoides) y se conoce un elevado
número de ellos. Los carotenos verdaderos son hidrocarburos, contienen únicamente carbono e
hidrógeno, mientras que las xantofilas contienen oxígeno en sus anillos terminales. Los carotenoides no
son invariablemente amarillos, naranja o rojos. Algunos pueden ser verdes, rosados o incluso negros. Las
clorofilas y los carotenoides se presentan íntimamente asociados entre ellos y con las proteínas y los
lípidos de la membrana del tilacoide.

Tabla 7.1. Picos de absorción característicos de los pigmentos fotosintéticos, excluyendo los de
bacterias fotosintéticas.
Picos de absorción (nm) Ocurrencia
Pigmento En solventes En células
orgánicos
Clorofilas
Clorofila a 420, 660 435, entre 670 y 700 Universal
en formas diferentes
Clorofila b 453, 643 480, 650 Plantas superiores, algas verdes
Clorofila c 425, 625 645 Algas cafés, diatomeas
Clorofila d 450, 690 740 Algunas algas rojas
Carotenos
-Caroteno 420, 440, 470 Plantas superiores, algas rojas,
algunas otras algas
-Caroteno 425, 450, 480 Caroteno principal de la mayoría de
las plantas
Xantofilas
Luteol 425, 445, 475 Plantas superiores, algas verdes y
rojas
Violaxantol 425, 450. 475 Plantas superiores
Fucoxantol 425, 450, 475 Algas cafés, diatomeas
Ficobilinas
Ficoeritrinas 490, 546, 576 Algas rojas, algunas algas azul-verde
Ficocianinas 618 Algas azul-verde, algunas en algas
rojas

12 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 Clorofila a (en éter)
Clorofila b (en éter)
Absorbancia

400 500 600 700

Longitud de Onda (nm)
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Figura 1. Espectro de absorción de clorofilas.

-caroteno (en hexano)

Absorbancia

400 500 600 700

Longitud de onda (nm)
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Figura 2. Espectro de absorción de carotenoides.

13 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 Luteína (en etanol)
Fucoxantina (en hexano)
Absorbancia

400 500 600 700

Longitud de onda (nm)
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Figura 3. Espectro de absorción de xantofilas.

-Ficoeritrina
Ficocianina
Aloficocianina
Absorbancia

400 500 600 700

Longitud de onda (nm)
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Figura 4: Espectro de absorción de ficobilinas.

14 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 Clorofila a (en éter)
Clorofila b (en éter)
-caroteno (en hexano)
Luteína (en etanol)
Fucoxantina (en hexano)
-Ficoeritrina
Ficocianina
Aloficocianina
Absorbancia

400 500 600 700

Longitud de onda (nm)
Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Figura 5: Espectro de absorción de miembros seleccionados de los cuatro grupos de pigmentos

fotosintéticos: clorofilas, carotenoides, xantofilas y ficobilinas.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL REACTIVOS
Micropipetas Hojas verdes de plantas recién cortadas
Morteros Acetona
Tubos para microcentrífuga Cloroformo
Papel filtro Hexano
Embudo Éter dietílico
Placas de sílica gel Sulfato de sodio

PROCEDIMIENTO

A. Extracción de los Pigmentos Fotosintéticos

1. Homogeneizar 5 g de hojas verdes frescas finamente picadas en 20 mL de acetona en un mortero con

mano.
2. Añadir 0.4 g de Na2SO4 e incorporar al homogenado.
3. Filtrar el homogenado a través de papel filtro y recuperar el extracto (pigmentos solubilizados).
4. Evaporar la acetona en placa caliente en campana de extracción de humos, cuidando que no le caiga
agua al extracto.
5. Redisolver los pigmentos secos en 1 mL de cloroformo.

B. Separación de los Pigmentos Fotosintéticos Mediante Cromatografía en Capa Fina

1. Preparar una placa de 20 cm × 10 cm con sílica gel G de un grosor aproximado de 0.25 mm. Dejar
secar perfectamente.
15 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
2. Marcar muy tenuemente y con lápiz el origen cerca de uno de los extremos de la placa y colocar otra
marca 15 cm más arriba. Esta última al ser alcanzada por el frente determinará el momento de
detener la corrida.
3. Con ayuda de una micropipeta o tubo capilar, colocar alícuotas de la muestra, dejar secar y añadir
más muestra, esto por unas 5 ó 6 veces, de modo que la mancha alcance 1.5 cm de ancho
(cromatografía preparativa). No tocar la placa con la punta de la micropipeta, para no raspar la
sílica.
4. Dejar secar por completo las muestras.
5. Colocar la placa con las muestras en la cámara previamente preparada con hexano:éter
dietílico:acetona (60:30:20, v/v/v); la muestra no debe quedar sumergida en el solvente.
6. Observar el desarrollo del proceso, y cuando el solvente alcance la marca de los 15 cm, sacar la placa
y dejarla secar por completo.
7. Elaborar un esquema a escala del cromatograma (y/o tomarle una fotografía) y obtener los datos
necesarios para el cálculo de los Rf de cada pigmento.
8. Raspar con una navaja limpia las manchas obtenidas en el cromatograma. No mezclarlas. Colocar la
sílica de cada mancha en un tubo de centrífuga separado y guardar en el congelador para su
posterior análisis (segunda parte de la práctica).

RESULTADOS

Presentar el esquema a escala del cromatograma, la fotografía, y los Rfs de los pigmentos separados.

CUESTIONARIO

¿Por qué los diferentes pigmentos absorben luz de diferentes longitudes de onda (diferentes nanómetros)
en diferentes cantidades (mayor o menor absorbancia)? Explique los detalles moleculares del fenómeno
usando figuras, diagramas y texto pertinente.

16 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 PRÁCTICA No. 7b

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Y DETERMINACIÓN DE SU

ESPECTRO DE ABSORCIÓN (SEGUNDA PARTE)

OBJETIVO (S)

Determinar el espectro de absorción de cada uno de los pigmentos extraídos y separados por
cromatografía en capa fina en la sesión anterior.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL REACTIVOS
Micropipetas y puntas Acetona
Tubos para microcentrífuga
Microcentrífuga y espectrofotómetro
Vasos de precipitados
Cubetas para espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO

A. Determinación de los Espectros de Absorción de los Pigmentos Fotosintéticos

1. Agregar 1.5 mL de acetona a cada tubo conteniendo la sílica gel con el pigmento raspado en la
práctica anterior, y agitar 2 min en vortex para eluir el pigmento.
2. Centrifugar 5 min a 3000 rpm y colectar el sobrenadante.
3. Determinar el espectro de absorción de cada pigmento haciendo un barrido en espectrofotómetro
entre 400 y 700 nm. Ajustar a 0 de absorbancia con acetona.
4. Graficar el espectro de absorción de cada pigmento.

RESULTADOS

1. Presentar las gráficas de los espectros de absorción de cada pigmento analizado.

2. Con base en los Rfs, espectros de absorción y color, identificar la mayor cantidad posible de los
pigmentos separados y mencionar su identidad (nombre del pigmento) como parte de las
conclusiones.

CUESTIONARIO

1. En su desempeño profesional, usted requiere montar una técnica espectrofotométrica para cuantificar
el analito X en muestras biológicas. Cuenta con el protocolo, el equipo y los reactivos para
desarrollar el color en sus estándares y en sus muestras problema. Sin embargo, el protocolo no le
indica a qué longitud de onda debe leer sus estándares y muestras en el espectrofotómetro.
Explique cómo utilizaría la capacidad del espectrofotómetro de realizar barridos de longitud de
onda contra absorbancia, obteniendo espectros de absorción, para determinar la longitud de onda
exacta a la que debe leer sus estándares y muestras.
2. Describa la función bioquímica principal de las clorofilas, explicando los detalles moleculares del
fenómeno.
3. ¿Qué funciones biológicas y bioquímicas desempeñan los carotenoides y otros pigmentos accesorios
del aparato fotosintético? Explique los detalles moleculares de manera sencilla usando figuras,
diagramas y texto pertinente.

17 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 PRÁCTICA No. 8
AISLAMIENTO DE GLUCOGENO HEPATICO

OBJETIVO (S)

1. Aislar glucógeno mediante digestión alcalina y precipitación alcohólica, a partir de hígados de rata
alimentadas normalmente y de rata en ayuno.
2. Llevar a cabo la hidrólisis ácida del glucógeno aislado para el posterior análisis de la glucosa, en la
práctica siguiente.
3. Determinar el efecto del estado de alimentación o ayuno de las ratas sobre la concentración de
glucógeno en hígado.

INTRODUCCIÓN

Los seres vivos almacenan hidratos de carbono en forma de polisacáridos, que sirven como materiales
de reserva. El almidón, la inulina y otros glicanos en los vegetales superiores, y el glucógeno en los
animales.

El glucógeno consta de unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa(1 -4) y cada 8 ó 10
unidades de glucosa se ramifica mediante un enlace glicosídico alfa(1-6).

El glucógeno es especialmente abundante en el hígado y en músculo, donde su concentración está

determinada por el estado de alimentación del animal, su actividad física, y otros factores. El glucógeno
puede ser aislado de dichos tejidos por digestión con álcalis fuertes y concentrados, en virtud de la
estabilidad de los enlaces glicosídicos a dichas condiciones, para luego ser precipitado con etanol.

Esta práctica consiste en el aislamiento de glucógeno hepático de rata por digestión alcalina,
seguido por precipitación etanólica e hidrólisis ácida que despolimeriza al glucógeno y genera una
disolución ácida de glucosa (hidrolizado). El hidrolizado obtenido será analizado en la siguiente práctica
para cuantificar la glucosa liberada, y determinar el efecto del estado de alimentación de las ratas de
donde se obtuvo el glucógeno.

MATERIAL REACTIVOS
Una rata alimentada ad libitum KOH al 30%
Una rata en ayuno durante 24 horas Na2SO4 al 15%
Equipo y material de disección Etanol absoluto
2 Tubos graduados de 14 mL, de plástico H2SO4 5 N
1 Gradilla y 1 pinzas para tubos Agua destilada
2 Pipetas Pasteur con bulbos de látex Fenolftaleína
1 Pipeta de 1 mL y 1 de 5 mL NaOH 5 N
4 Tubos Eppendorf de 2 mL H2SO4 1 N
Papel indicador de pH Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7
Balanza analítica
Baño de agua hirviendo
Campana de extracción de humos
Centrífiga clínica o microcentrífuga
Baño de hielo

PROCEDIMIENTO

I. Extracción del glucógeno de una muestra hepática

1. Pesar aproximadamente 1 g de hígado de rata (alimentada o en ayuno) en una balanza analítica. En
el caso del hígado de rata en ayuno, se cuidará que el peso sea de aprox. 1.5 g.
18 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
 Dato Nº 1: PESO EXACTO DE LA MUESTRA DE HÍGADO (gramos)

2. Se coloca la muestra en un tubo de ensayo de 10-14 mL, de vidrio o de plástico translúcido. Usando
guantes de látex y lentes de seguridad, añadir 2 mL de KOH al 30% y calentar en un baño de agua
hirviendo durante 10 min con agitación ocasional, en una campana de extracción de humos, hasta
la completa digestión del tejido (que no queden partículas en suspensión).
3. Centrifugar 5 min a 3000 rpm en una centrífuga clínica o en una microcentrífuga, para eliminar los
restos de tejido no digerido.
4. Pasar cuidadosamente el sobrenadante por decantación, a un tubo de plástico graduado, al que se le
añaden 0.2 mL de Na 2SO4 al 15%, y 4 mL de etanol absoluto. Agitar cuidadosamente la mezcla para
poner en contacto a todos los componentes. Dejar reposar el tubo en baño de hielo por 10 min, para
provocar la precipitación del glucógeno extraído.
5. Centrifugar 5 min a 3000 rpm para sedimentar el glucógeno. Desechar con sumo cuidado el
sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrón-blanco, puesto que esto es el
glucógeno.
Nota.- La purificación completa del glucógeno implicaría tres o cuatro precipitaciones alcohólicas y una
precipitación ácida, pero en esta práctica haremos sólo una precipitación alcohólica.

II. Hidrólisis ácida del sedimento de glucógeno

1. Al sedimento de glucógeno obtenido en el tubo graduado, se le añade 1 mL de H 2SO4 5 N (usar
guantes y lentes de seguridad) para proceder a su hidrólisis ácida y para ello se calienta la
disolución cuidadosamente a 100°C durante 45 min, en una campana de extracción de humos.
Como el ácido puede saltar en la ebullición, es conveniente poner en la parte superior del tubo papel
filtro enrollado, para que absorba el ácido si éste salta y evitar riesgos. Tener en cuenta que en este
tratamiento es donde se está obteniendo la glucosa que después se va a valorar, por lo cual no
conviene perder muestra.
2. Aforar a 2 mL con agua destilada y añadir 2-3 gotas de fenolftaleína para que actúe de indicador en la
posterior neutralización.
3. NEUTRALIZACIÓN: Usando guantes y lentes de seguridad, añadir gota a gota NaOH 5 N y agitar
bien hasta que aparezca un color rosa, indicativo de un pH próximo a 9. Añadir entonces, gota a gota
H2SO4 1 N, agitando después de cada adición, hasta que se pierda el color rosa anterior, lo que
indicará que la muestra está neutralizada, a pH próximo a 7. Aquí se debe comprobar el pH de la
muestra con papel indicador.
4. A continuación se añade 1 mL de buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7. Aquí se debe de anotar el volumen de
la disolución (hidrolizado de glucógeno), puesto que es la disolución problema donde se va a
determinar la concentración de glucosa proveniente del glucógeno extraído.
5. Guardar los hidrolizados en el congelador hasta su análisis en la próxima práctica.

Dato Nº 2: VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN PROBLEMA (mL)

RESULTADOS
Reportar:
1. Describa sus observaciones de cada paso de la obtención del glucógeno, anotando apariencia y color
de las muestras, hidrolizados, precipitados, etc.
2. Reporte el peso exacto de hígado utilizado, si fue de rata alimentada o en ayuno (Experimento I).
3. Reporte el volumen final de hidrolizado de glucógeno (solución problema del Experimento II)

CUESTIONARIO

1) ¿Cuál es la función del KOH 30% en esta práctica? ¿Cómo afecta este reactivo a las proteínas, a los
lípidos y a los polisacáridos? Explique detalladamente con texto y usando estructuras y reacciones
bioquímicas.
2) ¿Cuál es la función del H2SO4 5 N en esta práctica? ¿Cómo afecta este reactivo a los polisacáridos en
general, y al glucógeno en particular? Explique detalladamente con texto y usando estructuras y
reacciones bioquímicas.
19 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
3) ¿Por qué es necesario neutralizar el hidrolizado antes de determinar la cantidad de glucosa?
Investigue y explique detalladamente.
4) Utilizando texto y figuras, describa en detalle las estructuras bioquímicas del glucógeno, de la amilosa,
de la amilopectina, y de la celulosa. Explique sus similitudes y sus diferencias, y mencione en qué
tejidos y organismos se encuentra cada uno de dichos polisacáridos.

20 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009