Un estudio in vitro de ApxI de 

Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 10 e

inducción de muerte celular dependiente del inflamasoma NLRP3

04 de octubre de 2021

INTRODUCCIÓN
Uno de los componentes de virulencia más relevantes asociados con la inducción de
heridas por AP es la producción de las exotoxinas formadoras de poros ApxI, ApxII y
ApxIII. Los serotipos 1, 5, 9 y 11 generan ApxI y ApxII. Los serotipos 2, 3, 4, 6, 8 y 15
generan ApxII y ApxIII. Los serotipos 7, 12 y 13 producen solo ApxII, en lo que los
serotipos 10 y 14 producen solo ApxI. Se enseñó que 4 ApxI tiene actividad citotóxica
sobre macrófagos alveolares y neutrófilos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares, cepas bacterianas y reactivas

En este análisis se usaron la línea celular de macrófagos alveolares porcinos 3D4 / 21

(ATCC CRL-2843) y una línea celular endotelial aórtica porcina informada antes 12 en
este análisis. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma, # R8755)
suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco, 16000044) y una mezcla de
antibióticos que tenía dentro 10 U / ml de penicilina, 10 miligramo / ml de estreptomicina
(Gibco, # 15140122), 100 miligramo / L de gentamicina (Gibco, # 15750060) y 2,5
miligramo / ml de anfotericina B (Gibco, # 15290018).
Para la inhibición de caspasa-1, se usaron los inhibidores Z-VAD-FMK (InvivoGen, # tlrl-
vad) y Ac-YVAD-cmk (InvivoGen, # inh-yvad). Para la inhibición de NLRP3, se utilizaron
gliburida (Sigma, # G0639), MCC950_1 (TOCRIS, # 5479) y MCC950_2 (Sigma, #
PZ0280) 30 minutos anterior a la aumento de ApxI. Para remover el impacto de
lipopolisacárido contaminante (LPS) a lo largo del extracto de toxina, se usó el antibiótico
polimixina B (InvivoGen, # tlrl-pmb) simultáneamente que el procedimiento con ApxI.

Aislamiento y cultivo de PAM

La suspensión de PBS se centrifugó a 95 gy el sedimento que tenía dentro PAM se lavó 3
veces con PBS que tenía dentro antibióticos. En el último lavado, las células se
reemplazaron con un medio de cultivo o medio de congelación (medio de cultivo ajustado
al 20% de FBS más dimetilsulfóxido al 10%) en caso de congelación en nitrógeno líquido.
Extracción de la toxina ApxI del serotipo 10 de AP
La concentración de proteínas a lo largo del extracto que tiene la toxina ha sido de cerca
de 1 miligramo / ml medido por el ensayo de proteínas de Bradford. La concentración del
extracto que tiene ApxI usado para los experimentos se basó en la citotoxicidad en PAM,
con una dilución 1/4 con en torno al 50% de muerte celular evaluada por el ensayo de
liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Detección de caspasa-1 por inmunofluorescencia

Se incubaron células PAM 3D4 / 21 con o sin los inhibidores del inflamasoma NLRP3 30
minutos previo a la exposición a ApxI a lo largo de 1 h. Luego de lavar con PBS, las
células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% a lo largo de 5 minutos y después se
incubaron con solución de bloqueo, PBS con albúmina de suero bovino al 5% a lo largo
de 30 minutos.

Resultados
Muerte celular inducida por ApxI en PAM
Como se muestra en la Figura 1a , hubo muerte celular que incrementó de una forma
dependiente de la concentración. Utilizando la concentración de toxina que produjo en
torno al 50% de el deceso celular (dilución 1/4) en el experimento anterior, se localizó que
el deceso celular en PAM inició, desde los 15 min luego de la exposición a la toxina e
incrementó de forma dependiente del tiempo
Se asumió que la sustracción de toxinas originarios de las repeticiones de el núcleo
familiar de toxinas puede conducir a la contaminación con LPS y que la inactivación por
calor es un procedimiento de control apropiado para enseñar la bioactividad de las toxinas
en un extracto completo. Esto sugirió que cualquier LPS contaminante en el extracto de
toxina no contribuyó al impacto citotóxico. Además, el deceso celular se anuló por
completo una vez que la toxina se inactivó por calor a 96 ° C a lo largo de 30 minutos, lo
cual indica que la bioactividad de la toxina perdida por inactivación por calor es
responsable de la citotoxicidad

Inhibición de caspasa-1 y NLRP3 y efecto sobre la muerte celular inducida por ApxI
Para evaluar el mecanismo de muerte celular en PAM desafiados con ApxI, añadimos Z-
VAD-FMK o KCl (para bloquear el flujo de potasio) a las células anteriormente del
procedimiento con ApxI. En la Figura 1d , se muestra que en las dos situaciones hubo
una disminución semejante en el nivel de muerte celular inducida por la toxina en 1 h.
Utilizando la línea celular de macrófagos alveolares 3D4 / 21 y una línea celular endotelial
porcina, observamos elevados niveles de liberación de LDH en 1 h de procedimiento con
ApxI. Hubo una disminución significativa en el deceso celular de las dos líneas celulares
una vez que se utilizaron dichos inhibidores, lo cual sugiere que la caspasa-1 por medio
del inflamasoma NLRP3 ha sido parcialmente responsable del deceso celular total
generada por ApxI en este instante temprano

DISCUSIÓN
El propósito primordial de este análisis ha sido evaluar el papel del inflamasoma NLRP3
en el deceso celular inducida por ApxI en PAM y células endoteliales. Utilizamos Z-VAD-
FMK, un inhibidor de caspasas que se ha usado extensamente para inhibir la caspasa-1
por medio del inflamasoma NLRP3; pudimos encontrar una disminución leve, empero
significativa, en el deceso celular total inducida por ApxI en PAM. 11 Pudimos encontrar
bloqueando el K + eflujo por medio de la suma de KCl al medio simultáneamente que el
procedimiento ApxI que una disminución estadísticamente significativa semejante en el
deceso celular como la producida con el inhibidor de caspasa-1.
Explicamos, hasta donde entendemos, por primera ocasión que ApxI induce piroptosis en
macrófagos alveolares y células endoteliales, una forma de muerte celular que es
dependiente de la activación de la caspasa-1 por medio del inflamasoma NLRP3. Esto
puede tener repercusiones clínicas, ya que la caspasa-1 podría ser fundamental en el
deceso celular que puede estar vinculada con los procesos hemorrágicos vigilados en la
pleuroneumonía porcina y además en las respuestas inflamatorias similares con la
neumonía, que se observa luego de la contestación respiratoria en la etapa aguda.