Enzimología – Cinética enzimática 1

Cinética enzimática

Una reacción química A Æ B ocurre cuando una cierta población de A

alcanza un estado de activación que la permite transformarse en B
estableciendo un nuevo enlace químico.
La diferencia entre la energía
del estado basal y la máxima
energía alcanzada se denomina
energía de activación. Un
catalizador disminuye la energía de

Energía
activación (Ea´ en la figura) y Ea
permite incrementar la velocidad
con que cursa la reacción a una A
E´a

temperatura constante. Los

catalizadores no cambian sin ΔG
B
embargo el cambio de energía que
acompaña la transformación de A
en B.
Cuando un sistema se deja Coordenada de reacción
reaccionar, la concentración de los componentes alcanza un valor fijo que
depende de la naturaleza de los reactantes. Esa situación se conoce como
equilibrio químico.
En el equilibrio, la variación de energía libre es 0.
Para un sistema de reacción A + B Æ C + D, el contenido de energía libre
viene dado por:
ΔG = ΔG 0 + RTln
[C][D]
[A ][B]
y está definido por una constante de equilibrio

K eq =
[C][D]
[A ][B]
Se puede definir la energía libre estándar de una reacción como

ΔG° = -2,3 RT log Keq

Cuando la reacción tienda a ir en el sentido de los productos C y D,

entonces [C] x [D] > [A] x [B], ([C] x [D] / [A] x [B]) > 1, log Keq > 0 y ΔG° < 0, se
está en presencia de una reacción exergónica, que libera energía, está
favorecida termodinámicamente. Si es a la inversa, ΔG° > 0, es endergónica,
no se da espontáneamente.
Enzimología – Cinética enzimática 2

Enzimas

Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que ocurran

reacciones químicas necesarias para la vida. Las enzimas no sólo permiten
que reacciones favorecidas ocurran, sino que catalizan procesos que requieren
de un influjo de energía para realizarse.
Químicamente son, en su gran mayoría, proteínas, pero hay también ARN
con actividad catalítica.
Las enzimas no afectan la ΔG ni la Keq de la reacción, pero aumentan la
velocidad con la que el equilibrio se alcanza. A veces, in vivo, el equilibrio no es
alcanzado, sino que se llega a concentraciones más o menos constantes de
productos y reactivos. Esto ocurre debido a que hay otras reacciones que
involucran a los reactivos y productos de una reacción catalizada
enzimáticamente, puede haer una producción continua de reactivos y un
consumo constante de productos. A esta situación se la conoce como estado
estacionario y es frecuente en reacciones intermedias de caminos metabólicos.
Una de las características de las enzimas es su especificidad. Las
enzimas poseen sitios de unión para los reactivos, llamados sustratos, y
productos, a los que generalmente no se unen otros compuestos, a menos que
sean muy parecidos estructuralmente.
Las enzimas se denominan en general con el nombre de la rección que
catalizan con el agregado de la terminación asa.
A modo de ejemplo se pueden citar:
• Deshidrogenasas: participan en la transferencia de equivalentes de
reducción
• Kinasas: participan en la transferencia de un grupo fosfato desde el
ATP
• Transferasas: transferencia de grupos
• Oxidasas: reacciones de oxidación
• Hidrolasas: hidrólisis de enlaces
• Fosfatasas: remoción de grupos fosfato
• Aldolasas: catálisis de una condensación aldólica
• Carboxilasas. Carboxilación de un sustrato

Se identifican además por un número asignado por la Enzyme

Commission, que consta de 4 elementos, por ejemplo 2.7.1.11.

El primer elemento designa a la clase:

1. oxidorreductasas
2. transferasas
3. hidrolasas
4. liasas
5. isomerasas
6. ligasas
El segundo elemento sitúa a la enzima en una subclase. Por ejemplo en
una oxidoreductasa indica el tipo de dador de electrones, o el grupo transferido
por una transferasa, o el enlace cortado por una liasa.
El tercer elemento identifica a la sus-subclase a que pertenece la enzima,
y se refiere por ejemplo al tipo de aceptor para un determinado dador de
Enzimología – Cinética enzimática 3

electrones, el tipo de grupo transferido con más especificidad (por ejemplo si un

grupo de 1 carbono transferido es un metilo o un carbonilo).
El cuarto y último elemento le asigna a la enzima un número de serie
dentro de la sub-subclase.
Tomemos como ejemplo estas dos reacciones catalizadas
enzimáticamente:

ATP + fructosa-6-P Æ ADP + fructosa-1,6-bisP

PPi + fructosa-6-P Æ Pi + fructosa-1,6-bisP

Ambas compartirán los tres primeros elementos 2.7.1, ya que pertenecen

a la clase de las transferasas (2), y dentro de estas a las que transfieren grupos
fosfato (7), siendo un grupo alcohólico el aceptor (1). Los números de serie son
el 56 para la primera y el 90 para la segunda.
En ambas se transfiere un grupo fosfato al grupo –OH situado en C1 de la
fructosa-6-P.
La primera enzima se denomina comúnmente fosfofructoquinasa
dependiente de ATP, la segunda fosfofructoquinasa dependiente de PPi o
pirofosfato:fructosa-6-fosfato 1-fosfotransferasa.
Enzimología – Cinética enzimática 4

Cinética enzimática

Las reacciones enzimáticas no escapan a las reglas generales de la

cinética química. Como se dijo antes, las enzimas no alteran la Keq ni la ΔG.
Sin embargo, las reacciones presentan características particulares. Así,
cuando se determina la actividad en función de la concentración de sustrato se
obtienen cinéticas de saturación. Este tipo de cinética se observa para la unión
de pequeños ligandos a macromoléculas, e implica una saturación de los sitios
disponibles para la unión a medida que se incrementa la concentración del
ligando. En forma análoga, lo que se observa en una reacción catalizada
enzimáticamente, es que la velocidad con que transcurre la reacción aumenta
con la concentración de sustrato pero tendiendo a alcanzar un valor máximo.
Este tipo de gráficos se puede describir matemáticamente mediante una
hipérbola, en la cual hay dos parámetros, el valor máximo al que tiende la
variable dependiente (en este caso v, la velocidad de la reacción, tiende a un
valor de Vmax), y el valor de la concentración de sustrato o ligando que produce
una velocidad semimáxima (en el gráfico KM).

Esta particularidad condujo al concepto de que la enzima interactuaba con

el S para formar un complejo.
Esta situación fue analizada por Leonor Michaelis y Maud Menten, con
base en postulados previos de Brown y Henri, para formar la primera teoría de
la cinética enzimática, perfeccionada luego por Briggs y Haldane.

Aproximación al equilibrio rápido de Michaelis y Menten

Consideremos la reacción sencilla:

SÆP
Catalizada por E. Según la teoría, E se une a S para formar un complejo
previo a la catálisis.
Enzimología – Cinética enzimática 5

k+1 k+2 k+3

E + S ∏ ES ∏ EP ∏ E + P (1)
k-1 k-2 k-3
ES y EP se denominan complejos centrales, y las constantes k son las
constantes de velocidad para cada reacción.

Para simplificar, se considera como una sólo y se considera a la velocidad

inversa de descomposición del complejo EP (k-2) insignificante. Queda
entonces:
k+1 kp
E + S ∏ ES Æ E + P (2)
k-1

La ecuación de velocidad se puede deducir de dos formas. La más

sencilla supone que la interconversión de E + S y ES es muy rápida comparada
con la velocidad con que se descompone en E + P, o sea que k+1 y k-1 >> kp. Al
asumir esta situación, se considera entonces que las concentraciones de E, S y
ES son las del equilibrio, hay una situación de equilibrio químico debido a que
ES se descompone muy lentamente en E + P.

De esta manera, la velocidad depende directamente de cuanto haya de

ES:

v = kp [ES] (3)

kp se denomina constante catalítica de velocidad.

Vale la pena destacar que para todo este tipo de análisis, se debe
considerar que se trabaja en condiciones iniciales, es decir que el tiempo
transcurrido es tal que la [S] permanece en el valor inicial, y además que la [P]
es = 0 cercana a 0, de modo que la conversión de ES en P es irreversible. Por
otra parte, estando en condiciones de equilibrio, la [ES] permanece constante y
v es constante (para una determinada concentración de sustrato).

La concentración de enzima total es:

[E]t = [E] + [ES] (4)

Dividiendo ambos términos de la ecuación de velocidad (3) por [E]t

tenemos que:

v k [ES ]
= p
[E]t [E] + [ES ] (5)

Deberíamos reemplazar [ES], que es una cantidad difícil de medir. Si

tenemos que el equilibrio químico está definido por una constante de
disociación Ks
El reemplazo se realiza
teniendo en cuenta que:
v+1 = k+1 [E][S]
Ks =
[E][S] = k − 1 ∴ [ES ] = [S] [E] (6) y
[ES ] k + 1 Ks
v-1 = k-1 [ES]
Enzimología – Cinética enzimática 6

Sustituyendo en (5) [ES] por su equivalente según (6):

kp
[S] [E]
v Ks (7)
=
[E]t [S]
[E] + [E]
Ks
Eliminando [E] por simplificación y pasando kp al primer miembro

[S]
v Ks
=
kp [E ]t
1+
[S] (8)
Ks

Si v = kp [ES] (Ec. 3), es decir que la velocidad está limitada por [ES],
entonces el límite máximo de velocidad se encontrará cuando toda la enzima
esté formando parte del complejo ES ([ES] = [E]t), por tanto
kp [E]t = Vmax
[S]
v
= Ks
Vmax
1+
[S] (9)
Ks
Reordenando

v
=
[S] (10)
Vmax Ks + [S ]

Para reacciones bimoleculares o más complejas que se desarrollen de

acuerdo al sistema de equilibrio rápido, se obtienen ecuaciones similares. La
ecuación nos da la velocidad instantánea para una concentración de S
determinada, y es válida dentro de un lapso de tiempo determinado en que no
varía significativamente [S], a esto llamamos condiciones iniciales.
Esta ecuación de velocidad, o su forma modificada

v=
[S] * Vmax
(11)
Ks + [S ]
al ser graficada tiene la forma de una hipérbola y explica por tanto la cinética de
saturación.

Aproximación al estado estacionario (Briggs y Haldane)

En este caso se analiza la situación en que la descomposición de ES es
rápida en comparación con la de interconversión entre E + S y ES, de forma tal
que no se alcanza un equilibrio químico. Si la enzima está presente en
Enzimología – Cinética enzimática 7

cantidades catalíticas, es decir que [S] >> [E]t, al combinar E y S se alcanza el

estado estacionario, en que ES permanece constante en el tiempo, aunque ni
las concentraciones de de E, S ni ES sean las del equilibrio. En este caso, si
bien se llega a una ecuación parecida, la deducción de la ecuación de
velocidad es diferente.
Consideremos entonces la ecuación (2)

kp
E + S ∏ ES Æ E + P (2)
k-1

al igual que antes,

v = kp [ES] (3)

v k [ES ]
= p
[E]t [E] + [ES ] (5)

Si [ES] es constante, entonces las velocidades de descomposición y

formación son iguales.
La formación está dad por:
k+1
E + S Æ ES (12)

Y la descomposición por:
k-1
ES Æ E + S (13)
y
kp
ES Æ E + P (14)

Por lo tanto la velocidad de formación de ES es:

vf = k+1 [E][S] (15)
vd = k-1 [ES] + kp [ES] (16)
= (k-1 + kp)[ES]

En el estado estacionario, esta velocidad es:

∂ [ES ]
=0
∂t
o bien

k+1 [E][S] = (k-1 + kp)[ES] (17)

despejando

[ES] = k + 1[E][S] (18)

(k + 1 + kp)
Enzimología – Cinética enzimática 8

Las tres constantes se reúnen en una única constante llamada de

Michaelis:

1 k +1 k − 1 + kp
⇒ = Km = (19)
Km k − 1 + kp k +1

sustituyendo en 18

[ES] = [E][S]
Km

sustituyendo en la ecuación de velocidad 5:

v k [ES ]
= p (5)
[E]t [E] + [ES ]
queda

kp
[S] [E]
v Ks (20)
=
[E]t [E] + [S] [E]
Ks

simplificando [E] y sustituyendo kp*[E]t = VMAX

VMAX
[S]
v= Km
1+
[S]
Km
Reordenando

v=
[S] * Vmax
Km + [S ]
Hay que notar que Km es una constante de seudoequilibrio, dado que acá
no hay equilibrio sino una concentración estacionaria de E, S y ES. Km refleja la
relación entre esas concentraciones.

En las ecuaciones de velocidad obtenidas por cualquiera de los dos

métodos, se aprecia que cuando la [S] es alta, v tiende a kp [E]t, es decir a una
constante. Es lo que se observa en los últimos tramos de la curva, cuando por
más que se incremente la [S] la velocidad prácticamente no se modifica, está
en un máximo. A esto se denomina condiciones saturantes. Cuando [S] es
baja, v tiende a V/Kx[S], es decir a una recta con pendiente V/K, son los
primeros tranos de la hipérbola.
Ks en especial pero también Km, dan una idea de la afinidad de la enzima
por el sustrato.
Enzimología – Cinética enzimática 9

Determinación de Km y VMAX

La ecuación de Michaelis y Menten permite predecir el comportamiento de

una enzima, pero la representación de v en función de [S] no permite mucha
certeza en la determinación de estos parámetros.
Se recurre a transformaciones.
Una de ellas es la de Lineweaver y Burke.

1
=
[S] + Km = 1 + Km * 1
v Vmax * [S ] Vmax Vmax [S ]

Graficando 1/v versus 1/[S] el gráfico se linealiza y los parámetros

cinéticos se determinan por extrapolación a los ejes.

1/v

1/Vmax
pendiente: Km/Vmax

1/[S]
-1/Km
Otra transformación es la de Eadie-Hofstee. Multiplicando la ec. anterior
por VMAX y rearreglando los términos queda:
v

Vmax
v
v = −Km + Vmax
[S] pendiente: -Km

Vmax/Km

v/[S]
Enzimología – Cinética enzimática 10

Tanto la abcisa como la coordenada no son independientes, dependen de

v, el error se distribuye en ambos ejes. Dicho de otra manera, se asigna el
mismo peso a los puntos obtenidos a distintas concentraciones de S y por tanto
con distinta v.

La transformación de Woolf y Hanes propone la utilización de la siguiente

ecuación:

[S] = [S]/v
1
[S] + Km
v Vmax Vmax

Km/Vmax
-Km

[S]
A valores extremos de [S] la recta se desvía de la siguiente forma:

[S]/v [S] muy alta

[S] muy baja

[S]
Por lo que se toman valores intermedios de [S] para determinar los
parámetros cinéticos.

El desarrollo de los diferentes métodos para la estimación de Km y VMAX

se debió a la necesidad de encontrar el método que presentara el menor error
en la determinación de estos parámetros. La transformación de Lineweaver-
Burke es en este sentido la menos confiable. A bajas [S], habrá mayor error en
la medida de la velocidad ya que esta será baja y los errores introducidos por el
instrumental y el propio método adquieren mayor relevancia. En los otros dos,
los datos son pesados contra la [S] o la velocidad, y de esa manera el error se
distribuye mejor entre los datos.
Por supuesto que la mejor manera de obtener los parámetros cinéticos
sigue siendo el uso de métodos estadísticos de ajuste no lineal a la ecuación
de Michaelis Menten.
En cualquier caso, la elección del rango de la [S] a usar para esta tarea es
de suma importancia. Los valores de [S] usados deben estar distribuidos
alrededor de la Km de la enzima, para lo cual puede ser necesario un
Enzimología – Cinética enzimática 11

experimento exploratorio para confirmar el rango aproximado de [S] en que se

encuentra la Km y luego elegir [S] que la flanqueen.
En esta figura se describen tres situaciones en un intento de determinar
Km y VMAX de una enzima hipotética con un Km aproximado de 10 mM y una
VMAX de 100. En el panel 1, se utilizaron concentraciones de S que están por
debajo de la Km real, y el valor obtenido en consecuencia para este parámetro y
para VMAX está afectado por un error considerable y se desvía además del valor
real. Si hubieramos hecho este experimento, veríamos que al obtener un valor
de Km de 15.8 mM y habiendo usado una concentración máxima de S de 20
mM deberíamos agregar medidas de actividad con concentraciones superiores.
En el panel 2 se hace evidente 100
que las concentraciones elegidas
son muy altas. Se obtiene una Km de 1
10. 42 mM pero se empieza a medir 80
recién en 10 mM, se deben agregar
puntos con concentraciones 60
menores de sustrato. Km = 15.8 ± 4.24 (error del 26%)
v
El tercer panel ilustra el Vmax = 136 ± 24.5 (error del 18 %)
40
experimento ejecutado en forma
correcta, con valores de [S] que
rodean a la Km. Se observa que el 20
error en la medición de ambos Km
parámetros es mucho menor que en 0
los otros dos casos. En el último 0 20 40 60 80 100

panel se han incluido también las barras de [S]

error que ilustran sobre el mayor 100
error que tienen los puntos obtenidos
a bajas concentraciones de sustrato. 80 2
60
v Km = 10.42 ± 0,91 (error del 8%)
Vmax = 100.9 ± 1.71 (error del 1.7 %)
40

20

Km
0
0 20 40 60 80 100
[S]
100

80
3
60

v Km = 9.96 ± 0,53 (error del 5.3%)

v

40 Vmax = 100 ± 1.44 (error del 1.43 %)

20
Km
0
0 20 40 60 80 100

[S]
[S]
Enzimología – Cinética enzimática 12

Forma integrada de la ecuación de Michaelis y Menten.

En muchos casos la determinación de Km y VMAX es difícil debido a que la

actividad presentada a bajas [S] incrementa mucho el error o hace imposible la
medida. En el caso de una enzima que posea una Km para el sustrato muy baja
con una alta actividad específica, va a ser muy difícil mantener las condiciones
iniciales al medir actividad, dado que cuando se mida actividad con [S]
menores a la Km, se partirá de una concentración baja que irá disminuyendo a
medida que pase el tiempo. Al no ser la actividad constante se pierden las
condiciones iniciales y el análisis según Michaelis y Menten no puede
realizarse.
Si se dispone de un buen
método para medir ya sea S o P Activ
y la reacción es irreversible,
entonces al medir actividad en
función del tiempo en una
cubeta se obtiene un gráfico
como el que se muestra. Al
avanzar la reacción, la actividad
disminuye al agotarse el
sustrato.
Dado que la actividad es la
tiempo
variación de la concentración de
sustrato o del producto con el tiempo, si se integra la ecuación de actividad con
respecto al tiempo se podría obtener una forma de calcular los parámetros
cinéticos midiendo la v en función de t.

∂[S ] [S ] * Vmax
v=− =
∂t Km + [S ]

Km + [S ]
Vmax * ∂t = − ∂ [S ]
[S]
Integrando:

Km + [S]
∂[S]
t S
Vmax ∫ ∂t = − ∫
to S0 [S]

∂[S]
Vmax ∫ ∂t = −Km ∫ − ∂[S]
[S] ∫

Vmax * t = −Km * ln
[S] − ([S] − [S ])
[S o ] o

Reordenando y tomando logaritmo decimal:

Enzimología – Cinética enzimática 13

[S] − [S o ] = − 2.3 Km * log [S 0 ] + V

t t [S] max
Reordenando nuevamente:

−
2 .3 [S ]
log 0 = −
1 [S 0 ] − [S] Vmax
+
t [S] Km t Km

Se grafica ahora −
2 .3 [S ] [S ] − [S]
log 0 vs. 0
t [S] t

Vmax/Km

2.3 log [S0]/[S]

t
pendiente: -1/Km

Vmax

[S0]-[S]
t

La ventaja de este ensayo es que en una sola cubeta se pueden obtener

tanto Km como VMAX usando todas las concentraciones desde la concentración
inicial (S0), que es conocida, hasta la final, en que es 0.